CN1665832A - 含有天冬酰胺糖链的糖肽制造方法以及该糖肽 - Google Patents

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Abstract

至少含有1个以上天冬酰胺糖链的糖肽、其制造方法以及用上述方法可以得到的糖肽，其特征在于，(1)使带有羟基的树脂(resin)的羟基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酯化反应，(2)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，(3)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸或天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，(4)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，(5)将上述(3)和(4)工序重复1次以上，(6)用酸将树脂(resin)切去。

Description

含有天冬酰胺糖链的糖肽制造方法以及该糖肽
技术领域
本发明涉及到含有天冬酰胺糖链的糖肽制造方法以及利用该制造方法可获得的糖肽。
背景技术
近年来，作为继核酸(DNA)、蛋白质之后的第三个链状生命分子，糖链分子引人注目。人体是由约60兆个细胞构成的一大细胞社会，所有的细胞表面都被糖链分子覆盖。例如，ABO式血型就是由细胞表面糖链的不同决定的。
糖链具有参与细胞间识别和相互作用的功能，成为构成细胞社会的要素。细胞社会的紊乱与癌、慢性疾病、感染病、老化等有关。
例如，已知细胞如果癌化，就会引起糖链的结构変化。另外也知道霍乱弧菌或流感病毒等通过识别、结合某一特定糖链，侵入、感染细胞。
糖链功能的阐明，预期会带动依据新的原理的医药品和食品的开发等，对疾病的予防、治疗有贡献等广泛的应用。
糖链由于单糖的序列、结合样式以及部位、链长度以及分支样式、整体的高级结构等的多样性，所以与核酸或蛋白质的结构相比，是非常复杂的结构。因此，来自其结构的生物学信息与核酸和蛋白质相比，多种多样。现状是虽然人们认识到糖链研究的重要性，但由于其结构复杂和多样性，与核酸和蛋白质相比，研究进展缓慢。
象上述那样存在于细胞膜表面或血清等的很多蛋白质都结合着糖链。糖链与蛋白质共价结合的分子称为糖蛋白质，由于糖和蛋白质的结合样式不同，可以分为2类。一类是天冬酰胺(Asn)侧链的氨基与糖链结合的天冬酰胺结合型糖链(N-糖苷键型)。另一类是在丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的羟基处结合了糖链的粘蛋白结合型糖链(O-糖苷键型)。所有的天冬酰胺结合型糖链带有由5个糖残基构成的基本骨架，由于结合的糖链的非还原末端的糖残基种类不同分为高甘露糖型、复合型、杂合型亚类。另外粘蛋白结合型糖链根据基本骨架(core)的不同又分为4类。
作为肽合成法现在广泛使用的方法是1963年由R.B.Merrifield开发的固相合成法。固相合成法是在称为树脂(resin)的固相上连接氨基酸，使肽链延伸下去。肽链延伸一结束，就将肽链从固相上切下，得到目的物。作为应用，在肽链延伸时通过搀入结合了糖链的氨基酸，可以进行糖肽链的合成。
其中，在肽合成中应用在Asn或Ser(Thr)处结合了糖链的带糖链氨基酸，就可以不断地进行糖肽链的合成。然而，尽管化学合成技术进步，但化学合成带有大的糖链的肽链的例子还很少。
其中的一个问题就是与天冬酰胺残基结合的糖链的绝对量不足。作为获得糖链的手段，有只将糖链从存在于生物体内的糖蛋白质分离的方法。然而将糖链从糖蛋白质切出时使用的肼危险，要大量合成糖链有困难。另外生物体内存在很多结构酷似的糖链，要只获得单一糖链很难。另外由于通过肼分解使糖链与天冬酰胺残基解离，游离的糖链一定要与天冬酰胺残基再结合，结果分离步骤数增加。
而通过化学合成合成糖链时，虽然有合成连接了10个左右糖残基的糖链的例子，但其中很多例子是，花费1年时间只能合成目的物糖链数毫克左右。因此通过化学合成获得糖链很困难。
第二个问题是用于在肽固相合成后将肽链从固相切下的TFA(三氟乙酸)处理。例如，由于糖链非还原末端存在的唾液酸在酸性条件下容易水解，所以通过TFA处理，唾液酸有可能从合成的糖肽被切下。由于这个原因，在固相合成中使用含有唾液酸的糖链的例子几乎没有。作为该问题的解决方法，在肽合成后通过唾液酸转移酶将唾液酸转移到糖链的方法已有报道。然而，该方法作为导入唾液酸的方法虽然有用，但由于糖转移酶价格高，仍然存在着糖肽大量合成困难的问题。
然而，象如下所述那样，在本发明由于可通过人工方式容易、大量地合成糖肽，上述利用唾液酸转移酶导入唾液酸或其衍生物也可以应用于工业上。
另外虽然天然存在着结合着唾液酸的糖链，但天然中不存在结合着唾液酸衍生物的糖链，为了将唾液酸衍生物导入糖链，不管怎样只有使用唾液酸转移酶的方法。
本发明的课题在于提供通过人工方式容易地、大量地合成在肽链的任意位置至少含有1个以上天冬酰胺糖链或粘蛋白结合型糖链的糖肽制造方法。
本发明课题还提供容易地获得唾液酸糖肽的方法，其中即使是含有唾液酸的天冬酰胺糖链，经酸处理，唾液酸也不会从糖肽被切下。
另外，本发明课题还提供糖肽制造方法，其中，通过人工方式可以容易地、大量地合成在肽链的任意位置至少含有1个以上的任意除去糖残基的各种新的天冬酰胺糖链。
另外本发明的课题提供导入了唾液酸或其衍生物的糖肽制造方法，通过使用唾液酸转移酶将唾液酸或其衍生物导入糖肽。
本发明的课题提供通过上述各种糖肽制造方法获得的糖肽。
发明内容
本发明涉及到在肽链的任意位置至少含有1个以上天冬酰胺糖链的糖肽制造方法，其特征是：
(1)使带有羟基的树脂(resin)的羟基与氨基氮被脂溶性保护基保护了的氨基酸的羧基进行酯化反应，
(2)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(3)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酰胺化反应，
(4)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(5)将上述(3)和(4)步骤重复1次以上，
(6)与氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，
(7)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(8)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酰胺化反应，
(9)将上述(7)和(8)步骤重复1次以上，
(10)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(11)用酸将树脂(resin)切去。
本发明涉及到适当追加(6)与氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，(7)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基步骤的在肽链任意位置至少含有2个以上天冬酰胺糖链的糖肽制造方法。
本发明涉及到在最后步骤进行(6)与氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，(7)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基步骤的在肽链上至少含有1个以上天冬酰胺糖链的糖肽制造方法。
本发明涉及到取代(6)的步骤或除了(6)的步骤之外，再使(1)带有羟基的树脂(resin)的羟基与氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酯化反应的糖肽制造方法。
本发明涉及到(6)的天冬酰胺糖链含有6个以上糖残基的糖肽制造方法。
本发明涉及到(6)的天冬酰胺糖链含有9～11个糖残基的糖肽制造方法。
本发明涉及到(6)的天冬酰胺糖链含有6个以上糖残基，并且结合2分叉糖链的糖肽制造方法。
本发明涉及到(6)的天冬酰胺糖链是天冬酰胺二唾液酸糖链或天冬酰胺单唾液酸糖链，该唾液酸的羧基被保护基保护的糖肽制造方法。
本发明涉及到(6)的天冬酰胺糖链是天冬酰胺脱唾液酸糖链的糖肽制造方法。
本发明涉及用粘蛋白结合型糖链取代天冬酰胺糖链的一部或全部的糖肽制造方法。
本发明涉及到一种在肽链的任意位置至少含有1个以上通过上述制造方法可获得的天冬酰胺糖链或粘蛋白结合型糖链的糖肽。
本发明涉及到天冬酰胺糖链或粘蛋白结合型糖链含有6个以上糖残基，并且结合2分叉糖链的糖肽。
本发明涉及到是结合了从天冬酰胺二唾液酸糖链和天冬酰胺单唾液酸糖链选择的至少1种以上糖链作为天冬酰胺糖链的糖肽。
本发明涉及到一种在肽链任意位置至少含有1个以上天冬酰胺糖链，而且在末端带有唾液酸或其衍生物残基的糖肽制造方法，其特征是：
(1)使带有羟基的树脂(resin)的羟基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酯化反应，
(2)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(3)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酰胺化反应，
(4)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(5)将上述(3)和(4)步骤重复1次以上，
(6)与氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，
(7)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(8)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酰胺化反应，
(9)将上述(7)和(8)步骤重复1次以上，
(10)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(11)用酸将树脂(resin)切去，
(12)利用唾液酸转移酶使唾液酸或其衍生物转移到得到的糖肽上。
本发明涉及到在上述步骤(11)的用酸切去树脂(resin)前，使标记试剂反应的糖肽制造方法。
本发明涉及到标记试剂是丹酰卤化物的糖肽制造方法。
本发明涉及到一种5-乙酰胺基-3，5，7-三脱氧-7-氟-D-甘油基-β-D-乳糖-2-吡喃壬酮糖酸(nonulopyranosidonicacid)的制造方法，其特征是使N-乙酰基-4-脱氧-4-氟-D-甘露糖胺、丙酮酸钠、牛血清白蛋白、唾液酸醛缩酶进行反应。
本发明涉及到一种5-乙酰胺-3，5，7-三脱氧-7-氟-D-甘油-β-D-乳糖-2-吡喃壬酮糖酸的制造方法，其特征是在乙酸酐存在下，对苄基2-叠氮-2，4-双脱氧-4-氟-β-D-甘露吡喃糖苷加氢，得到N-乙酰基-4-脱氧-4-氟-D-甘露糖胺，然后使他与丙酮酸钠、牛血清白蛋白、唾液酸醛缩酶进行反应。
本发明人在先前申请的专利2001-185685号(以下、称为先前申请专利)中开发了与以往相比可以非常容易而且大量地获得各种分离的天冬酰胺糖链衍生物的天冬酰胺糖链衍生物、天冬酰胺糖链、糖链的制造方法，以及结合了任意缺失糖残基的糖链的新的天冬酰胺糖链衍生物、天冬酰胺糖链、糖链。
该先前申请的方法，例如包括：
(1)包括以下工序的来自天冬酰胺糖链的天冬酰胺糖链衍生物的制造方法：(a)将脂溶性保护基导入到在含有1种或2种以上天冬酰胺糖链的混合物中所含有的该天冬酰胺糖链中，获得天冬酰胺糖链衍生物混合物的工序，
以及
(b)将该天冬酰胺糖链衍生物混合物或该天冬酰胺糖链衍生物混合物含有的天冬酰胺糖链衍生物水解后得到的混合物进行层析，对各天冬酰胺糖链衍生物进行分离的工序。
(2)上述(1)所述的天冬酰胺糖链衍生物制造方法，其中还包括(b’)用糖水解酶对工序(b)中分离的天冬酰胺糖链衍生物进行水解的工序。
(3)上述(1)或(2)所述天冬酰胺糖链衍生物制造方法，其中含有1种或2种以上天冬酰胺糖链的混合物是含有下述式(A)化合物和/或在该化合物中缺失1个以上糖残基的化合物的混合物。
(4)上述(1)～(3)任一项所述天冬酰胺糖链衍生物制造方法，其中脂溶性保护基是芴甲氧羰基(Fmoc)基。
(5)上述(1)～(3)任一项所述天冬酰胺糖链衍生物制造方法，其中工序(a)是向含有在非还原末端带有唾液酸残基的1种或2种以上天冬酰胺糖链的混合物中所含的该天冬酰胺糖链导入Fmoc基，而且向唾液酸残基导入苄基后得到天冬酰胺糖链衍生物混合物的工序。
(6)包括以下工序的天冬酰胺糖链制造方法：
(a)将脂溶性保护基导入到在含有1种或2种以上的天冬酰胺糖链的混合物所含的该天冬酰胺糖链中，获得天冬酰胺糖链衍生物混合物的工序，
以及
(b)将该天冬酰胺糖链衍生物混合物或该天冬酰胺糖链衍生物混合物含有的天冬酰胺糖链衍生物水解后得到的混合物进行层析，对各天冬酰胺糖链衍生物进行分离的工序，以及
(c)除去工序(b)中分离的天冬酰胺糖链衍生物的保护基后，得到天冬酰胺糖链的工序。
(7)上述(6)所述天冬酰胺糖链制造方法，还包括：
(b’)用糖水解酶对在工序(b)中分离的天冬酰胺糖链衍生物进行水解的工序和/或
(c’)用糖水解酶对在工序(c)中得到的天冬酰胺糖链进行水解的工序。
(8)上述(6)或(7)所述天冬酰胺糖链制造方法，其中含有1种或2种以上天冬酰胺糖链的混合物是含有下述式(A)化合物和/或在该化合物中缺失1个以上糖残基的化合物的混合物。
(9)上述(6)～(8)任一项所述天冬酰胺糖链制造方法，其中脂溶性保护基是Fmoc基。
(10)上述(6)～(8)任一项所述天冬酰胺糖链制造方法，其中工序(a)是向在含有在非还原末端带有唾液酸残基的1种或2种以上天冬酰胺糖链的混合物中所含该天冬酰胺糖链中导入Fmoc基，而且向唾液酸残基导入苄基后，得到天冬酰胺糖链衍生物混合物的工序。
其中，上述天冬酰胺糖链衍生物例如可以用式(6)表示。
Figure A0381595000132
式中、R1和R2是氢原子、式(2)～(5)表示的基团，可以相同，也可以不同。但是除去R1和R2都是式(3)的情形。
Figure A0381595000133
另外，上述另一个天冬酰胺糖链衍生物例如可以用式(7)表示。
Figure A0381595000142
式中，RX和RY，一方是式(8)表示的基团，另一方是氢原子、式(8)、或式(2)～(5)表示的基团。
Figure A0381595000143
另外上述天冬酰胺糖链例如可以用式(1)表示。
Figure A0381595000151
式中、R3和R4是氢原子、式(2)～(5)表示的基团，可以相同，也可以不同。但是除去R3和R4都是式(2)或式(3)的情形。
有关这些天冬酰胺糖链衍生物以及天冬酰胺糖链的制造的详细描述由于在上述先前申请中已叙述，所以引用该申请。如果讲到若干先前申请的内容，先前申请的天冬酰胺糖链衍生物制造方法其一大特征是例如向在由来自天然糖蛋白质的天冬酰胺糖链、优选是天冬酰胺结合型糖链得到的天冬酰胺糖链的混合物中含有的该天冬酰胺糖链导入(结合)脂溶性保护基，得到天冬酰胺糖链衍生物的混合物，然后将该混合物分离为各天冬酰胺糖链衍生物。需说明的是在本说明书中，所谓「天冬酰胺糖链」指的是结合了天冬酰胺状态的糖链。而所谓「天冬酰胺结合型糖链」指的是存在于还原末端的N-乙酰葡糖胺通过N-糖苷键与蛋白质多肽中天冬酰胺(Asn)的酰胺基连接的糖链，以Man(β1-4)GlcNac(β1-4)GlcNac作为母核的糖链组。所谓「天冬酰胺糖链衍生物」指的是在天冬酰胺残基结合了脂溶性保护基状态的天冬酰胺糖链。在化合物的结构式中、「AcHN」表示乙酰胺基。
如上所述，来自天然糖蛋白质的糖链是随机缺失了非还原末端糖残基的糖链混合物。本发明人意外地还发现了通过向来自天然糖蛋白质的糖链、具体来说天冬酰胺糖链混合物中含有的该天冬酰胺糖链导入脂溶性保护基，利用众所周知的层析手法，可以很容易地将导入该保护基的天冬酰胺糖链衍生物混合物分离为各个天冬酰胺糖链衍生物。通过这样操作可以分别大量制备具有各种结构的天冬酰胺糖链衍生物。例如，以往分离困难的类似结构的天冬酰胺糖链衍生物之间的分离变为可能，可以容易而且大量地分别制备这些化合物。另外，以得到的天冬酰胺糖链衍生物作为起始原料，例如通过使糖水解酶依次作用，除去糖残基，也可以进一步合成各种各样的天冬酰胺糖链衍生物。
因此通过向天冬酰胺糖链导入脂溶性保护基，衍生化，各个天冬酰胺糖链衍生物的分离成为可能，认为这是由于通过导入脂溶性保护基，天冬酰胺糖链衍生物整体的脂溶性高，例如，与适合使用的反相层析类柱的相互作用显著提高，其结果可更敏锐地反映糖链结构差别，能够分离各个天冬酰胺糖链衍生物的缘故。
另外按照先前申请，通过除去得到的天冬酰胺糖链衍生物的保护基，可以人工容易而且大量地获得各种天冬酰胺糖链。
在本发明中，使用在上述先前申请中得到的各种天冬酰胺糖链，通过本发明的上述方法，得到目的糖肽。
在本发明的方法中，首先，(1)使带有羟基的树脂(resin)的羟基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酯化反应。
此时由于用脂溶性保护基对氨基酸的氨基氮进行了保护，所以可以防止氨基酸之间的自身缩合，树脂的羟基与氨基酸的羧基反应，发生酯化。
然后(2)将上述得到的酯的脂溶性保护基脱去，形成游离氨基，
(3)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的任意氨基酸的羧基进行酰胺化反应，
(4)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(5)将上述(3)和(4)步骤重复1次以上，可获得连接任意数目的任意氨基酸的末端结合在树脂上，另一端带有游离氨基的肽。
(6)然后使上述游离的氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，
(7)再脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(8)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的任意氨基酸的羧基进行酰胺化反应，
(9)将上述(7)和(8)步骤重复1次以上，
(10)通过脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，可获得连接了任意数目的任意氨基酸的末端结合在树脂上，另一端带有游离氨基，中间有天冬酰胺糖链的糖肽。
(11)然后通过用酸将树脂(resin)切去，可以制造在肽链的任意位置含有天冬酰胺糖链的糖肽。
另外，本发明涉及到通过适当追加(6)的使氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基与上述游离氨基进行酰胺化反应的工序，可以制造在肽链任意位置带有至少2个以上天冬酰胺糖链的糖肽。而此时通过使用不同的天冬酰胺糖链，也可以制造在肽链的任意位置带有2种以上天冬酰胺糖链的糖肽。
另外，也可以将该天冬酰胺糖链导入肽链的端部。
另外也可以用粘蛋白结合型糖链取代天冬酰胺糖链这样的天冬酰胺结合型糖链的一部分或全部。
本发明中作为带有羟基的树脂(resin)，只要是通常固相合成中使用的带有羟基的树脂(resin)就可以，例如可以使用Wang resin(Merk公司生产)、HMPA-PEGA resin(Merk公司生产)等。
作为氨基酸可以使用所有的氨基酸，例如丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)。
作为脂溶性保护基，例如9-芴甲氧羰基(Fmoc)基、叔丁氧羰基(Boc)基、苄基、烯丙基、烯丙氧羰基、乙酰基等碳酸盐系或酰胺系的保护基等。为了导入脂溶性保护基，例如要导入Fmoc基时，通过加9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺碳酸盐(9-fluorenylmethyl-N-succinimidylcarbonate)和碳酸氢钠进行反应，可以导入。反应于0～50℃、最好是室温下，进行约1～5小时左右。
作为用脂溶性保护基保护的氨基酸，通过上述方法可以制造上述氨基酸。另外也可以使用市售的。例如Fmoc-Ser、Fmoc-Asn、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Ile、Fmoc-Ala、Fmoc-Tyr、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys、Fmoc-Arg、Fmoc-His、Fmoc-Asp、Fmoc-Glu、Fmoc-Gln、Fmoc-Thr、Fmoc-Cys、Fmoc-Met、Fmoc-Phe、Fmoc-Trp、Fmoc-Pro。
酯化催化剂，例如可以使用1-磺酰基-3-硝基-1，2，4-三唑(MSNT)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)等脱水缩合剂。酯化反应，例如最好是通过将树脂充填到固相柱，用溶剂进行清洗，然后加氨基酸的溶剂溶液进行。作为清洗用溶剂，例如二甲基甲酰胺(DMF)、2-丙醇、二氯甲烷等。作为溶解氨基酸的溶剂例如二甲基亚砜(DMSO)、DMF、二氯甲烷等。反应于0～50℃、最好是在室温下进行约10分钟～30小时左右、优选进行15分钟～24小时左右。
此时优选是使用醋酸酐对固相上未反应羟基进行乙酰化，加帽(capping)。
脂溶性保护基的脱除，例如可以通过用碱处理进行。作为碱，例如哌啶、吗啉等。此时优选在溶剂存在下进行。作为溶剂可举出例如DMSO、DMF、甲醇等。
优选在活化剂和溶剂存在下使游离氨基和氨基氮被脂溶性保护基保护的任意氨基酸的羧基进行酰胺化反应。
作为活化剂，例如二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺·盐酸盐(WSC/HCl)、重氮磷酰二苯酯(diphenylphosphorylazide)(DPPA)、碳酰二咪唑(CDI)、二乙基氰基磷酸盐(DEPC)、三唑-1-基氧基(yloxy)-三吡咯烷基鏻(trispyrrolidinophosphonium)(DIPCI)、苯并三唑-1-基氧基(yloxy)-三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)、1-氢二(hydrodi)苯并三唑(HOBt)、羟琥珀酰亚胺(HOSu)、二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)、羟基酞酰亚胺(HOPht)、五氟苯酚(Pfp-OH)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲 六氟磷酸盐(HBTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲 六氟磷酸盐(HATU)、O-氮杂三唑-1-基-1，1，3，3-四甲基脲  四氟硼酸盐(TBTU)、3，4-二氢-3-氢二(hydrodi)-4-氧杂-1，2，3-苯并三嗪(Dhbt)等。
活化剂的使用量，对于氨基氮被脂溶性保护基保护的任意氨基酸为1～20当量、优选1～10当量、更优选1～5当量。
作为溶剂，例如DMSO、DMF、二氯甲烷等。反应于0～50℃、优选是在室温下进行约10～30小时左右、优选进行15分钟～24小时左右。此时优选是使用醋酸酐对固相上未反应羟基进行乙酰化，加帽。脂溶性保护基的脱除可以象上述那样进行。
为了将肽链从树脂(resin)切下，优选是用酸进行处理。作为酸例如三氟乙酸(TFA)、氟化氢(HF)等。
在本发明，通过适当追加上述(6)的与氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，(7)将上述脂溶性保护基脱去后使游离氨基形成的工序，可以制造在肽链的任意位置至少含有2个以上天冬酰胺糖链的糖肽。
另外通过在最终工序进行上述(6)的与氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，(7)的脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基的工序，可以制造在肽链至少含有1个以上天冬酰胺糖链的糖肽。
另外在本发明中通过取代上述(6)的工序，或除了(6)之外，再使(1)带有羟基的树脂(resin)的羟基和氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酯化反应，可以制造在端部含有天冬酰胺糖链的糖肽。
在本发明中使用的天冬酰胺糖链可以使用带有任意数目糖残基的天冬酰胺糖链，特别是也可以使用以往没有的带有6以上糖残基的天冬酰胺糖链或粘蛋白结合型糖链，构成本发明特异的特征。特别是也可以使用带有9～11糖残基的天冬酰胺糖链。
另外也可以使用带有6个以上糖残基，结合了2分叉型糖链的天冬酰胺糖链。例如天冬酰胺糖链也可以使用天冬酰胺二唾液酸糖链或天冬酰胺单唾液酸糖链。这样的结合了天冬酰胺二唾液酸糖链或天冬酰胺单唾液酸糖链的糖肽是本发明优选的糖肽。
天冬酰胺糖链为天冬酰胺二唾液酸糖链或天冬酰胺单唾液酸糖链，也可以使用该唾液酸的羧基被保护基保护的糖链。
在本发明使用的天冬酰胺糖链或粘蛋白结合型糖链也可以对该糖链的羟基进行保护。作为保护基，例如乙酰基、三乙基甲硅烷基等。优选是在从合成的糖肽切下之际同時可用酸进行处理的保护基。例如三乙基甲硅烷基。
天冬酰胺糖链为天冬酰胺二唾液酸糖链或天冬酰胺单唾液酸糖链时，由于担心该唾液酸被酸切断，所以象上述那样的该唾液酸的羧基通过保护基保护可以防止该唾液酸被切断，所以优选。作为该保护基，例如苄基、烯丙基、二苯基甲基等。
向唾液酸羧基导入保护基的反应可以通过众所周知的方法、例如参照Protective groups in Organic Chemistry，John Wiley& Sons INC.，New York 1991，ISBN 0-471-62301-6进行。
在本发明中，作为唾液酸的衍生物，可以举出如唾液酸的7位、8位或9位碳结合的羟基被氢原子或卤素原子置换的产物。作为卤素原子可以举出如氟、氯、溴等，优选是氟。
在本发明中，作为唾液酸转移酶，一般可以使用市售的唾液酸转移酶，可以按照要转移的唾液酸或唾液酸衍生物的种类、结合样式适当选择。具体来说，如来自Rat Recombinant的酶，来自Rat Liver的酶。另外通过使用唾液酸酶，调整pH等使平衡错开，也可以使唾液酸或唾液酸衍生物转移。
本发明的糖肽在医药品开发等领域非常有用。例如，作为在医药品开发中的应用例子，如癌的疫苗合成。已知细胞如果癌化，会发现体内原来没有的糖链。另外，对该糖链进行化学合成，作为疫苗投给个体，可以抑制癌的增殖。因此如果利用本发明能够制造所期望的糖肽，就可以进行对癌症治疗有效的疫苗的合成。另外将通过本发明得到的糖肽再与化学反应以及糖转移酶催化的反应等组合，使其结合新的糖残基，进行衍生化，也可以进行新的疫苗的合成。
糖肽与没有结合糖的肽相比，对水的溶解度增高，另外，在水溶液以及血中等中的稳定性也提高了。
非还原末端的唾液酸的衍生化可以防止糖链自身的分解，通过这样修饰可以进一步提高糖肽的稳定性。
另外由于非还原末端的唾液酸衍生化是非天然型糖链，有时对疫苗制造也有效。
实施发明的最好方式
以下举出实施例，进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
以下使用的Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Leu-Opfp、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala-Opfp、Fmoc-Val-Opfp、Fmoc-Ser(Bzl)-OH、Fmoc-Ser(OtBu)是众所周知的物质，使用购买的产品。其中例如所谓Leu-Opfp的Opfp指的是亮氨酸(Leu)的羧基被五氟苯(pfp)基保护的产物、Ser(Bzl)-OH是丝氨酸(Ser)的羟基被苄基(Bzl)基保护的产物、Ser(OtBu)-OH是丝氨酸(Ser)的OH基被叔丁(tBu)基保护的产物。
参考例1
天冬酰胺二唾液酸糖链(10)的合成
使粗纯化的SGP(唾液酸糖肽，sialylglycopeptide)500mg和叠氮钠10mg(319μmol)溶解于25ml Tris-HCl·氯化钙缓冲液(TRIZMA BASE 0.05mol/1、氯化钙0.01mol/l、pH＝7.5)。向该溶液中加在Tris-HCl·氯化钙缓冲液5ml的溶液中溶解了肌动蛋白酶-E(蛋白质分解酶、科研制药)50mg的溶液，于37℃下静置。115小时后，将该溶液冷冻干燥。将该残留物通过凝胶过滤柱层析纯化2次，得到252mg目的天冬酰胺二唾液酸糖链10。
1H-NMR(30℃)δ5.13(s，1H，Man 4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.5Hz，Glc NAc 1-H-1)，4.95(s，1H，Man 4-H-1)，4.77(s，1H，Man 3-H-1)，4.61(d，1H，J＝7.6Hz，Glc NAc 2-H-1)，4.60(d，2H，J＝7.6Hz，Glc NAc 5，5-H-1)，4.44(d，2H，J＝8.0Hz，Gal 6，6-H-1)，4.25(bd，1H，Man 3-H-2)，4.20(bdd，1H，Man 4-H-2)，4.12(bd，1H，Man 4-H-2)，2.94(dd，1H，J＝4.5Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.85(dd，1H，J＝7.0Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.67，2.66(dd，2H，J＝4.6Hz，12.4Hz，Neu Ac7，7-H-3eq)，2.07(s，3H，Ac)，2.06(s，6H，Ac×2)，2.02(s，6H，Ac×2)，2.01(s，3H，Ac)，1.71(dd，2H，J＝12.4Hz，12.4Hz，Neu Ac7，7-H-3ax.
参考例2
用Fmoc基对天冬酰胺的氨基氮进行保护的天冬酰胺二唾液酸糖链(11)的合成
使参考例1得到的天冬酰胺二唾液酸糖链(10)80mg(0.034mmol)溶解于蒸馏水2.7ml和丙酮4.1ml的混合溶液中，向该混合液中加9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺碳酸盐(Fmoc-OSn)34.7mg(0.103mmol)和碳酸氢钠11.5mg(0.137mmol)，于室温下搅拌2小时。用TLC确认反应结束后，对该溶液进行减压浓缩、除去丙酮。将残渣加到充填了结合十八烷基硅基的硅胶的柱子中(ODS柱)进行纯化，得到目的Fmoc-天冬酰胺二唾液酸糖链(11)60.1mg，产率68％。
1H-NMR(30℃)
8.01(2H，d，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.80(2H，d，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.60(2H，dd，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.53(2H，dd，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.23(1H，s，Man 4-H1)，5.09(1H，d，J＝9.4Hz，Glc NAc 1-H1)，5.04(1H，s，Man 4’-H1)，4.86(1H，s，Man 3-H1)，4.70～4.66(m，Glc NAc 2-H1 Glc NAc 5，5’-H1)，4.54(2H，d，J＝7.9Hz，Gal 6，6’-H1)，4.44(1H，d，FmocCH)，4.34(1H，bd，Man 3-H2)，4.29，(1H，bd，Man 4’-H2)，4.20(1H，bd，Man 4-H2)，2.77(2H，dd，Neu Ac 7，7’-H3eq)，2.80(1H，bdd，Asn-βCH)，2.62(1H，bdd，Asn-βCH)，2.14(18H，s×6，-Ac)，1.80(2H，dd，NeuAc7，7’-H3ax)
参考例3
天冬酰胺的氨基氮用Fmoc基保护，而唾液酸的羧基用苄基保护的天冬酰胺二唾液酸糖链(12)的合成
使Fmoc-天冬酰胺结合型2分叉糖链(20mg)的冷水溶液流过冷至4℃的Dowex-50Wx8(H+)柱(φ0.5cm×5cm)，将洗脱的水溶液冷冻干燥。
将得到的Fmoc-天冬酰胺结合型2分叉糖链溶解于4℃的冷水中，加入Cs2CO3水溶液(2.5mg/1ml)，将水溶液的pH调整到5～6，然后将糖链水溶液冷冻干燥。将冷冻干燥后的Fmoc-二唾液酸糖链样品溶解于干燥DMF(1.3ml)中，加苄基溴化物(5.1μl)，于氩气流下，在室温搅拌45小时。用TLC确认反应终止后、将反应溶液冷却至0℃，加乙醚10ml，使目的物析出。用滤纸过滤。向剩下的目的物加蒸馏水，洗脱获得滤液，然后对滤液进行减压浓缩。将得到的残渣加到ODS柱，进行纯化，得到目的二苄基Fmoc-天冬酰胺二唾液酸糖链(12)18.2mg(收率85％)。
Figure A0381595000241
1H-NMR(30℃)，
7.90(d，2H，Fmoc)，7.70(d，2H，Fmoc)，7.53-7.40(m，9H，Bn，Fmoc)，5.36(d，2H，J＝11.6，Hz，CH2)，5.30(d，2H，J＝11.6Hz，CH2)，5.12(s，1H，Man 4-H1)，4.99(d，1H，J＝9.7Hz，Glc NAc l-H1)，4.93(s，1H，Man 4’-H1)，4.75(s，1H，Man3-H1)，4.57(m，3H，Glc NAc 2-H1，Glc NAc 5，5’-H1)，4.32(d，2H，Gal 6，6’-H1)，4.24(d，1H，Man 3-H2)，4.18(d，1H，Man 4’-H2)，4.10(1H，d，Man 4-H2)，2.72(bd，1H，Asn-βCH)，2.67(dd，2H，NeuAc 7，7’-H3cq)，2.51(bdd，1H，Asn-βCH)，2.06(s，3H，Ac)，2.03，2.01(each s，each 6H，Ac×2)，1.89(s，3H，Ac)，1.83(2H，dd，J＝12.2，12.2Hz，NeuAc 7，7’-H3ax)HRMS Calcd for C117H165N8Na2O66[M+Na+]2783.9597，found 2783.9501
参考例4
根据专利申请2001-185685号得到天冬酰胺单唾液酸糖链。
参考例5
HOOC-Val-Leu-Leu-Ala-NH2(13)的合成
I  向树脂(resin)导入
将Wang树脂1.6g加到固相合成用柱中，用亚甲基氯、接着用甲醇充分洗涤，使其干燥。使Fmoc-Val 409.2mg(1.2mmol)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBt·H2O)121.5mg(0.9mmol)溶解于N，N-二甲基乙酰胺(DMA)4.5ml中，加二环己基碳二亚胺(DCC)247.5mg(1.2mmol)，于0℃搅拌15分钟，得到氨基酸溶液。用DMF使树脂膨润。将上述氨基酸溶液加到固相合成用柱，于室温下搅拌17小时。搅拌后，对树脂按照亚甲基氯、异丙醇、甲醇的顺序进行清洗，使其干燥。
用DMF使干燥的树脂在柱内膨润后，加20％哌啶/DMF溶液约10ml，于室温搅拌15分钟，脱除Fmoc基，得到树脂-Val-Leu-NH2。然后用DMF清洗，使其干燥。
II  肽链的延伸
用DMF使干燥的树脂(树脂-Val-NH2)在柱内膨润后，加Fmoc-Leu318.6mg(0.9mmol)、HOBt·H2O 121.5mg(0.9mmol)，再加DMF直至没过树脂。加二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)138.5μl(0.9mmol)，于室温搅拌2小时。搅拌后、用DMF清洗，使其干燥。
用DMF使干燥的树脂在柱内膨润后，加20％哌啶/DMF溶液约10ml，于室温搅拌15分钟，脱除Fmoc基，得到树脂-Val-Leu-NH2。然后用DMF清洗，使其干燥。
用DMF使干燥的树脂在柱内膨润后，加Fmoc-Leu 318.6mg(0.9mmol)、HOBt·H2O 121.5mg(0.9mmol)，再加DMF直至没过树脂。加DIPCDI 138.5μl(0.9mmol)，于室温下搅拌2小时。搅拌后、用DMF清洗，使其干燥。
用DMF使干燥的树脂在柱内膨润后，加20％哌啶/DMF溶液约10ml，于室温下搅拌15分钟，脱除Fmoc基，得到树脂-Val-Leu-Leu-NH2。然后用DMF清洗，使其干燥。
用DMF使干燥的树脂在柱内膨润后，加Fmoc-Ala 293.4mg(0.9mmol)、HOBt·H2O 121.5mg(0.9mmol)，再加DMF，直至没过树脂。加DIPCDI 138.5μl(0.9mmol)，于室温下搅拌2小时。搅拌后、用DMF清洗，使其干燥。
用DMF使干燥的树脂在柱内膨润后，加20％哌啶/DMF溶液约10ml，于室温搅拌15分钟，脱除Fmoc基，得到树脂-Val-Leu-Leu-Ala-NH2。然后用DMF清洗，使其干燥。
III  从固相上切下
HOOC-Val-Leu-Leu-Ala-NH2的合成
向干燥的树脂加TFA 5％水溶液，于室温下搅拌3小时。搅拌后、将溶液移到茄型瓶，于冰中中加乙醚，使目的物沉淀，过滤。
1H-NMR(30℃)
8.56(1H，d，J＝6.5Hz，Leu-2NH)，8.42(1H，d，J＝7.4Hz，Leu-1NH)，8.25(1H，d，J＝8.3Hz，Val NH)，4.34(1H，d，J＝6.7Hz，Val-a)，4.16(1H，d，J＝7.1Hz，Ala-α)，2.27(1H，ddd，Val-β)，1.69～1.58(m，11H，Leu-1，Leu-2)，1.59(3H，d，J＝7.2Hz，Ala-β)，1.01～0.96(m，25H，Leu-1，Leu-2，Val)
Figure A0381595000261
实施例1
将从参考例4的固相切下之前的由干燥的树脂-Val-Leu-Leu-Ala-NH2构成的树脂17mg取到Eppen管中。加参考例3中得到的二苄基Fmoc-天冬酰胺二唾液酸糖链(12)35mg(14.8μmol)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲 六氟磷酸盐(HATU)0.64mg(2.7μmol)，加DMF 150μl。加二异丙基乙基胺(DIPEA)0.31μl，于室温搅拌24小时。搅拌后、用DMF清洗，进行干燥。
在Eppen管内使干燥的树脂膨润后，加20％哌啶/DMF溶液约1ml，于室温搅拌15分钟，脱除Fmoc基，得到树脂-Val-Leu-Leu-Ala-Asn(Oligo)-NH2。然后用DMF清洗，使其干燥。这里的Asn(Oligo)是从参考例3中得到的二苄基Fmoc-天冬酰胺二唾液酸糖链(12)脱去Fmoc基的二苄基-天冬酰胺二唾液酸糖链。(从固相切下)
HOOC-Val-Leu-Leu-Ala-Asn(Oligo)-NH2的合成
向干燥的上述树脂中加三氟乙酸(TFA)95％水溶液，于室温下搅拌3小时。搅拌后、将溶液移到Eppen管，于冰中加乙醚，使目的物沉淀。将沉淀物溶解于0.1％TFA水溶液，通过反相柱层析进行纯化。(YMC-Pack ODS-A 250×3.0mm流速0.45ml/min使用展开溶剂A：0.1％TFA水溶液 B：0.1％TFA 乙腈∶水＝90∶10。
梯度 只是A 10分钟  A100％→B100％ 30分钟)，
上述Asn(Oligo)的结构如下所示。
Figure A0381595000271
1H-NMR(30℃)
7.59～7.55(m，10H，Bn)，5.45(4H，dd，Bn-CH2×2)，5.23(1H，s，Man 4-H1)，5.15(1H，d，GlcNAcl-H1)，5.03(1H，s，Man 4’-H1)，4.87(1H，s，Man 3-H1)，4.67(3H，d，Glc NAc 2-H1，Glc NAc 5，5’-H1)，4.42(2H，d，Gal 6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man 3-H2)，4.28(1H，d，Man 4’-H2)，4.20(1H，d，Man 4-H2)，2.82(2H，dd，J＝6.68Hz，NeuAc 7，7’-H3eq)，2.65(1H，dd，J＝16.69Hz，6.83Hz，Asn-βCH)，2.13(18H，s×6，-Ac)，1.94(2H，dd，J＝12.24Hz，NeuAc7，7’-H3ax)，1.41～1.26(m，25H，Leu-1，Leu-2，Val)
实施例2
HOOC-Ser-Ser-Asn(Oligo)-NH2的合成
I  向树脂(resin)导入
向固相合成用柱中加入PEGA树脂50mg，依次用亚甲基氯、甲醇进行充分清洗，使其干燥。
使Fmoc-Ser(Bzl)-OH 80mg(180μmol)、HOBt·H2O 19mg(135μmol)溶解于DMF 10ml，加DCC 37mg(180μmmol)，于0℃下搅拌15分钟，得到氨基酸溶液。用DMF膨润树脂。将上述氨基酸溶液加到固相合成用柱，于室温下搅拌17小时。搅拌后、对树脂依次用亚甲基氯、异丙醇、甲醇进行清洗，使其干燥。
用DMF使干燥的树脂在柱内膨润后，加20％哌啶/DMF溶液约2.0ml，于室温下搅拌15分钟，脱除Fmoc基，得到树脂-Ser-NH2。然后用异丙醇和DMF进行清洗，使其干燥。
II  肽链的延伸
用DMF使干燥的树脂在柱内膨润后，加Fmoc-Ser(Bzl)-OH 40.0mg(89.8μmol)、HOBt·H2O 12mg(89.8μmol)，加DMF 2.0ml。加DIPCDI 14μl(89.8μmol)，于室温搅拌2小时。搅拌后、用DMF清洗，使其干燥。
用DMF使干燥的树脂在柱内膨润后，加20％哌啶/DMF溶液约2.0ml，于室温搅拌15分钟，脱除Fmoc基，得到树脂-Ser-Ser-NH2。然后用异丙醇和DMF进行清洗，使其干燥。
将干燥的树脂于柱内用二甲基亚砜(DMSO)膨润后，将参考例3得到的二苄基-Fmoc-天冬酰胺二唾液酸糖链(12)13.5mg(5.7μmol)溶解于DMF，移到柱内。向柱内加HATU 1.6mg(6.8μmol)和DIPEA 0.83μl，于室温搅拌2 4小时。搅拌后、用异丙醇和DMF进行清洗，使其干燥。
将干燥的树脂于Eppen管内膨润后，加20％哌啶/DMF溶液约1ml，在室温下搅拌15分钟，脱除Fmoc基，得到树脂-Ser-Ser-Asn(Oligo)-NH2。然后用DMF清洗，使其干燥。其中Asn(Oligo)与实施例1的相同。
III  从固相切下
向干燥的树脂加TFA95％水溶液，于室温下搅拌3小时。将反应溶液通过反相柱层析进行纯化。(使用YMC-Pack ODS-A 250×3.0mm流速0.35ml/min 展开溶剂 A：0.1％TFA水溶液 B：0.1％TFA乙腈∶水＝90∶10。梯度A 100％→B100％ 120分钟)
1H-NMR(30℃)
7.60～7.45(m，20H，Bn)，5.35(4H，dd，J＝11.8Hz，Bn-CH2-)，5.21(1H，s，Man4-H1)，5.13(1H，d，J＝9.2Hz，Glc NAc 1-H1)，5.03(1H，s，Man4’-H1)，4.34(1H，d，Man 3-H2)，4.28(1H，d，Man 4’-H2)，4.20(1H，d，Man 4-H2)，2.82(2H，dd，J＝6.68Hz，Neu Ac 7，7’-H3eq)，2.13(18H，s×6，-Ac)，1.93(2H，dd，J＝12.24Hz，NeuAc7，7’-H3ax)
实施例3
HOOC-Ser-Ser-Asn(disialooligo)-Val-Leu-Leu-Ala-NH2的合成
上述目的糖肽中的Asn(disialooligo)指的是含有没有被苄基保护唾液酸的二唾液酸寡天冬酰胺。
向固相合成用柱中加入HMPA-PEGA树脂50mg，用CH2Cl2，DMF充分清洗，使其干燥。
将Fmoc-Ser(OtBu)-OH、1-磺酰-3-硝基-1，2，4-三唑(MSNT)，N-甲基咪唑溶解于CH2Cl2，搅拌5分钟后，加到装有树脂的固相合成用柱，于室温下搅拌3小时。搅拌后、用亚甲基氯、异丙醇、DMF清洗树脂，使其干燥。然后、使用20％醋酸酐DMF溶液，对固相上的未反应氨基进行乙酰化20分钟，加帽。用DMF清洗树脂后、通过用20％哌啶/DMF溶液搅拌20分钟，脱除Fmoc基，得到树脂-Ser-NH2。用DMF清洗后、使其干燥。
然后使用Fmoc-Ser(OtBu)-OH，通过HOBt·H2O和DIPCDI缩合。
然后将参考例3中得到的二苄基Fmoc-天冬酰胺二唾液酸糖链(12)溶解于DMSO、DMF 1比1的混合溶剂中，使用HATU和DIPEA，室温搅拌24小时使其缩合。用DMF清洗后，于10％乙酸酐/2-丙醇∶甲醇中搅拌20分钟，进行加帽。树脂用2-丙醇、DMF清洗后，于20％哌啶/DMF中搅拌20分钟，脱除Fmoc基，用DMF将树脂清洗。
在该树脂上同样对缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)进行缩合和Fmoc基的脱除，得到树脂-Ser-Ser-Asn(二苄基disialooligo)-Val-Leu-Leu-Ala-NH2。其中Asn(二苄基disialooligo)指的是含有被苄基保护唾液酸的二唾液酸寡天冬酰胺。
缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)的氨基酸使用对羧基进行pfp酯化的Fmoc-AA-Opfp(AA＝氨基酸)，通过3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪-3-基(Dhbt)使其缩合。所有的缩合都是在DMF溶液中进行的。
将缩合结束后的树脂充分干燥后、加95％TFA水溶液，于室温下搅拌3小时，切去树脂。过滤除去树脂，将反应溶液于室温下减压浓缩后、溶解于水，进行冷冻干燥。将冷冻干燥品溶解于pH11的氢氧化钠水溶液，对苄基酯进行水解，脱去苄基后、用醋酸中和，直接进行冷冻干燥。通过用HPLC对冷冻干燥品进行精制，得到目的HOOC-Ser-Ser-Asn(disialooligo)-Val-Leu-Leu-Ala-NH2。
(YMC-Pack ODS-A 250×3.0mm 展开溶剂 A：0.1％TFA水溶液 B：0.1％TFA 乙腈∶水＝90∶10 梯度A 100％ 0.35ml/min→B 100％ 0.40ml/min 90分钟 流速0.35ml/min到0.40ml/min)
1H-NMR(30℃)
δ5.22(s，1H，Man 4-H1)，5.11(d，1H，Glc NAc1-H1)，5.04(s，1H，Man 4’-H1)，4.86(1H，Asnα)，4.70(bd，3H，Glc NAc 2，5，5’-H1)，4.62-4.57(m，2H，Ser α×2)，4.53(d，2H，Gal 6，6’-H1)，4.52-4.48(m，2H，Leu α×2)，4.34(bs，1H，Man 3-H2)，4.28(bs，1H，Man 4-H2)，4.21-4.15(m，3H，Man 4’-H2，Valα，Alaα)，2.98(dd，1H，Asnβ)，2.86(dd，1H，Asnβ)，2.75(bdd，2H，Neu Ac 7，7’-H3eq)，2.16-2.10(Ac×6，Valβ)，1.82(dd，2H，Neu Ac 7，7’-H3ax)，1.76-1.68(bd，6H，LeuβCH2×2，LeuγCH×2)，1.60(d，3H，AlaβCH3)，1.03-0.97(m，18H，Leu-CH3×4，Va1-CH3×2)
实施例4
HOOC-Ser-Ser-Asn(disialooligo)-Val-Leu-Leu-Ala-Asn(asialooligo)-Val-Leu-Leu-Ala-NH2的合成
上述目的糖肽中的所谓Asn(asialooligo)是如下所示的天冬酰胺糖链。
Figure A0381595000321
对于从实施例3的固相切下前的树脂-Ser-Ser-Asn(二苄基disialooligo)-Val-Leu-Leu-Ala-NH2再使用Asn(asialooligo)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)使其缩合，然后与实施例3同样将肽链从固相切下，然后脱去苄基，得到由HOOC-Ser-Ser-Asn(disialooligo)-Val-Leu-Leu-Ala-Asn(asialooligo)-Val-Leu-Leu-Ala-NH2构成的糖肽。
缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)的氨基酸使用对羧基进行pfp酯化的Fmoc-AA-Opfp(AA＝氨基酸)，通过3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯三嗪-3-基(Dhbt)使其缩合。所有的缩合都在DMF溶液中进行。然后加20％哌啶/DMF溶液，于室温搅拌20分钟，脱除Fmoc基。
在将下一个氨基酸(Val)导入天冬酰胺糖链位置后，在20％乙酸酐/2-丙醇、甲醇1比1溶液中对天冬酰胺糖链的未反应氨基进行加帽后，进行脱除Fmoc基。用异丙醇和DMF将树脂清洗，干燥。Fmoc-天冬酰胺连脱唾液酸糖链的缩合与实施例3的二苄基Fmoc-天冬酰胺二唾液酸糖的缩合同样进行。
以下给出了由得到的HOOC-Ser-Ser-Asn(disialooligo)-Val-Leu-Leu-Ala-Asn(asialooligo)-Val-Leu-Leu-Ala-NH2构成的糖肽的1H-NMR(30℃)。
δ5.22，5.21(each s，each 1H，Man4-H1，Man D-H1)，5.11(d，2H，Glc NAc 1-H1，Glc NAc A-H1)，5.03，5.01(each s，each 1H，Man 4’-H1，Man D’-H-1)，4.86(2H，Asnα)，4.69-4.66(GlcNAc 2，B，5，5’，E，E’-H1)，4.61-4.48(Leuα×4，Serα×2，Gal 6，6’，F，F’-H1)，4.33(bs，2H，Man 3，C-H2)，4.28(bs，2H，Man 4，D-H2)，4.20(bs，2H，Man 4’，D’-H2)，4.20-4.17(Valα×2，Alaα×2)，3.00(dd，2H，Asnβ×2)，2.83(dd，2H，Asnβ×2)，2.76(dd，2H，Neu Ac7，7’-H3eq)，1.82(dd，2H，Neu Ac7，7’-H3ax)，2.16-2.10(Ac×10，Valβ)，1.70-1.60(m，Leuβ，γ)，1.60，1.49(each d，each 3H，Alaβ)，1.02-0.96(m，36H，Val-CH3×4，Leu-CH3×8)
参考例6
上述Asn(asialooligo)所示的天冬酰胺糖链根据专利申请2001-185685号的实施例合成。其NMR数据如下所示。
1H-NMR(30℃)
δ5.12(s，1H，Man 4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.7Hz，Glc NAc 1-H-1)，4.92(s，1H，Man 4’-H-1)，4.76(s，1H，Man 3-H-1)，4.62(d，1H，J＝8.0Hz，Glc NAc 2-H-1)，4.58(d，2H，J＝7.8Hz，Glc NAc 5，5’-H-1)，4.47(d，2H，J＝7.9Hz，Gal 6，6’-H-1)，4.24(bd，1H，Man 3-H-2)，4.19(bdd，1H，J＝3.2Hz，1.4Hz，Man 4’-H-2)，4.12(bdd，1H，J＝3.2Hz，1.4Hz，Man 4-H-2)，2.93(dd，1H，J＝4.5Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.93(dd，1H，J＝6.8Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.08(s，3H，Ac)，2.05(s，6H，Ac×2)，2.01(s，3H，Ac)
另外与参考例2同样合成Fmoc-天冬酰胺连脱唾液酸糖链。其NMR数据如下所示。
1H-NMR(D2O、30℃)
δ7.99(2H，d，Fmoc)，7.79(2H，d，Fmoc)，7.55(4H，m，Fmoc)，5.12(1H，s，Man 4-H1)，5.06(1H，d，Glc NAc 1-H1)，4.93(1H，s，Man 4’-H1)，4.82(1H，s，Man 3-H1)，4.69(1H，d，Glc NAc 2-H1)，4.67(2H，d，Glc NAc 5，5’-H1)，4.53(2H，d，Gal 6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man 3-H2)，4.27(1H，d，Man 4’-H2)，4.19(1H，d，Man 4-H2)，3.03(1H，bdd，Asn-βCH)，3.00(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(12H，s×4，-Ac)
参考例7
(苄基  3，6-二-O-新戊酰-β-D-吡喃半乳糖苷benzyl3，6-di-O-pivaloyl-β-D-galactopyranoside 18的合成)
Figure A0381595000341
(1)化合物17的合成
将乙酸钠(5g，69mmol)溶解于乙酸酐(60ml)中，向加热后溶液一点一点地加D-半乳糖(16)(10g，55mmol)。加热回流2小时后通过TLC(甲苯∶乙酸乙酯＝5∶1)确认反应结束。将反应溶液恢复到室温后，注入到冰水300cc中。过滤后收集沉淀物。将沉淀物溶解于乙醇(14ml)进行重结晶，得到9.0g化合物17(收率41％)。
(2)化合物18的合成
将化合物17(4.3g，11mmol)溶于二氯甲烷(120ml)后、于氩气流下冷却至-20℃。然后，向反应溶液中加四氯化锡(3.1g，12mmol)，搅拌20分钟后，加苄基醇(2.3g，22mmol)，将反应温度恢复到室温。用TLC(己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)确认反应结束后，将反应溶液注入到饱和碳酸氢钠水溶液中，用二氯甲烷进行萃取。二氯甲烷层经无水硫酸镁干燥后、进行过滤、减压浓缩。将残渣用干燥器干燥后，溶于蒸馏后的甲醇(80ml)中，加甲醇钠(431mg，5.5mmol)，氩气流下进行搅拌。用TLC(乙酸乙酯∶甲醇∶水＝10∶5∶1)确认反应结束后，用阳离子交换树脂IR-120(+)进行中和，使反应结束。将树脂过滤除去后，对滤液进行减压浓缩。残渣经干燥器干燥后，溶于吡啶(44ml)，将反应溶液冷却到0℃。向反应溶液中加新戊酰氯(4.6g，38.5mmol)后，恢复至室温，于氩气流下搅拌1小时。TLC(己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)确认反应结束后，冷却到0℃后，加甲醇，使反应终止。将反应溶液直接进行减压浓缩后，将残渣溶于乙酸乙酯，用饱和食盐水溶液、水进行清洗，用无水硫酸镁使乙酸乙酯干燥。将硫酸镁过滤除去后，对滤液进行减压浓缩。残渣通过硅胶柱层析(展开溶剂己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)精制，得到化合物18(2.8g，收率58％)。
参考例8
(苄基  2-O-氯乙酰-4-脱氧-4-氟-3，6-二-O-新戊酰-β-D-吡喃葡糖苷 ben z yl 2-O-chloroacetyl-4-deoxy-4-fluoro-3，6-di-O-pivaloyl-β-D-gulucopyranoside 20的合成)
Figure A0381595000351
(1)苄基  2-O-氯乙酰-3，6-二-O-新戊酰-β-D-吡喃半乳糖苷ben z yl 2-O-chloroacetyl-3，6-di-o-pivaloyl- β -D-galactopyranoside (19)的合成
将化合物18(200mg，0.455mmol)溶于二氯甲烷(7.8ml)和吡啶(1.3ml)中，加氯乙酸酐(155mg，0.91mmol)，于氩气流下-15℃边搅拌边反应15分钟。确认反应结束后，用甲醇(5ml)将氯乙酸酐骤冷，边用甲苯进行3次共沸，边进行减压浓缩。用乙酸乙酯对残渣进行萃取，用饱和食盐水进行清洗。用无水硫酸镁使有机相干燥、过滤后进行浓缩。残渣通过硅胶柱层析(乙酸乙酯∶己烷＝1∶4)精制，得到化合物19(产量172mg，收率73.5％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)
δ7.37-7.29(m，5H，Ph)，5.39(dd，1H，J1.2＝8.0Hz，J2.3＝10.4Hz，H-2)，4.89(dd，1H，J3.4＝3.4Hz，H-3)，4.89，4.62(2d，2H，J＝12.5Hz，OCH2Ph)，4.53(d，1H，H-1)，4.37(dd，1H，J6a，6b＝11.5Hz，J6a，5＝6.0Hz，H-6a)，4.32(dd，1H，J6b.5＝6.6Hz，H-6b)，4.00(m，1H，H-4)，3.92(s，2H，COCH2Cl)，3.75(dd，1H，H-5)，1.23，1.19〔2s，18H，COC(CH3)3〕
13C-NMR(400MHz，CDCl3)
δ178.33，177.57，165.92，(C＝O)，136.66，128.48，128.07，127.89(Ph)，99.16(C-1)，72.82(C-3)，72.35(C-5)，70.92(C-2)，70.49(OCH2Ph)，67.29(C-4)，62.30(C-6)，40.40(COCH2Cl)，38.95，38.80〔COC(CH3)3〕，27.14，26.98〔COC(CH3)3〕
1H-NMR、13C-NMR通过Bruker的AVANCE 400(表示为400MHz)进行测定。溶剂为重氯仿时，作为内部标准使用三甲基硅烷。使用其他的重溶剂时将溶剂峰作为基准。化学位移用δ(ppm)表示，结合常数用J(Hz)表示。硅胶柱层析使用Merck Silicagel60，70-230目或230-400目，球状硅胶使用关东化学公司生产的Silica Gel 60(Spherical)，作为反应检测用(以下TLC)使用E.Mer k公司生产DC-Platten Kieselgel 60 F254(Artl，05715)。高效液相色谱(HPLC)柱使用ナカライテスク公司生产的COSMOSIL 5C18-AR Packed Column(φ4.6×150mm)，分光荧光光度计使用J ASCO公司生产的FP-210 Spectrofluorometer。
(2)苄基  2-O-氯乙酰-4-脱氧-4-氟-3，6-二-O-新戊酰-β-D-吡喃葡糖苷  (20)的合成
将化合物19(300mg，0.583mmol)溶于二氯甲烷(5.8ml)中，于氩气流下、-15℃下，边搅拌，边加二乙基氨基磺胺三氟化物(diethylaminosulfatri fluoride)(DAST)。加DAST，10分钟后，恢复到室温，反应1小时。用TLC确认原料消失，用甲醇(3ml)将DAST骤冷后，进行减压浓缩。残渣通过硅胶柱层析(乙酸乙酯∶己烷＝1∶6)纯化，得到化合物20(收量211mg、收率70％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)
δ7.37-7.27(m，5H，Ph)，5.31(ddd，1H，J3，F＝14.3Hz，J3，4＝9.69Hz，J2，3＝9.63Hz，H-3)，5.04(dd，1H，J1，2＝7.93Hz，H-2)，4.86(d，1H，J＝12.2Hz，OCH2Ph)，4.60(d，1H，H-1)，4.59(d，1H，OCH2Ph)，4.44(ddd，1H，J4，5＝9.04Hz，J4，F＝50.6Hz，H-4)，4.43(ddd，1H，J6a，6b＝12.1Hz，J6a，s＝2.41Hz，J6a，F＝2.23Hz，H-6a)，4.24(ddd，1H，J6b， 5＝5.67Hz，J6b，F＝1.28Hz，H-6b)，3.93(s，2H，OCOCH2Cl)，3.75(m，1H，H-5)，1.25，1.18〔2s，18H，OCOC(CH3)3〕
13C-NMR(400MHz，CDCl3)
δ177.94，117.43，165.88(C＝O)，136.34，128.55，138.23，127.92(Ph)，98.68(C-1)，87.35(d，J4，F＝188.62Hz，C-4)，72.65(d，J2，F＝7.96Hz，C-2)，72.05(d，J3，F＝20.02Hz，C-3)，71.49(d，J5， F＝23.09Hz，C-5)，70.80(OCH2Ph)，62.12(C-6)，40.30(OCOCH2Cl)，38.87〔OCOC(CH3)3〕，27.17，26.92〔OCOC(CH3)3〕
参考例9
(苄基2-叠氮-2，4-双脱氧-4-氟-3，6-二-O-新戊酰-β-D-吡喃甘露糖苷 benzyl 2-azido-2，4-dideoxy-4-fluoro-3，6-di-O-pivaloyl-β-D-mannopyranoside 22的合成)
Figure A0381595000381
(1)苄基4-脱氧-4-氟-3，6-二-O-新戊酰-β-D-吡喃葡萄糖苷benzyl 4-deoxy-4-fluoro-3，6-di-O-pivaloyl-β-D-gulucopyranoside(21)的合成
将化合物20(625mg，1.21mmol)溶于甲醇(24.2ml)，于氩气流、-15℃下、边搅拌，边加甲醇钠(13.1mg，0.6mmol)。30分钟后，通过TLC确认原料消失后，用阳离子交换树脂IR-120(+)进行中和(pH6-7)，将树脂过滤后进行减压浓缩。残渣用硅胶柱层析(乙酸乙酯∶己烷＝1∶4)进行纯化，得到化合物21(产量395mg，收率74％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)
δ7.38-7.29(m，5H，Ph)，5.18(ddd，1H，J3，F＝14.8Hz，J3，4＝9.51Hz，J2，3＝8.99Hz，H-3)，4.90(d，1H，J＝11.7，OCH2Ph)，4.63(d，1H，OCH2Ph)，4.47(ddd，1H，J5，6a＝2.43Hz，J6a，F＝2.2Hz，H-6a)，4.47(d，1H，J1，2＝7.7Hz，H-1)，4.38(ddd，1H，J4，5＝8.96Hz，J3，4＝9.67Hz，J4，F＝50.8Hz，H-4)，4.23(ddd，1H，J6a，6b＝12.0Hz，J6b，5＝6.05Hz，J6b，F＝1.26Hz，H-6b)，3.75(m，1H，H-5)，3.54(m，1H，J2，OH＝2.70Hz，H-2)，1.27，1.26〔2s，18H，OCOC(CH3)3〕
13C-NMR(400MHz，CDCl3)
δ178.17，177.94(C＝O)，136.54，128.54，128.17，128.12(Ph)，101.31(C-1)，87.45(d，J4，F＝187.39Hz，C-4)，74.17(d，J3，F＝18.88Hz，C-3)，72.45(d，J2，F＝7.56Hz，C-2)，71.45(d，J5，F＝23.26Hz，C-5)，71.09(OCH2Ph)，62.44(C-6)，38.90，38.85〔OCOC(CH3)3〕，27.14，26.99〔OCOC(CH3)3〕
(2)苄基2-叠氮-2，4-双脱氧-4-氟-3，6-二-O-新戊酰-β-D-甘露吡喃糖苷(22)的合成
于0℃下向溶有吡啶(22.2μl，0.274mmol)的二氯甲烷(370μl)溶液滴加三氟甲烷磺酸酐(46μl，0.274mmol)，15分钟后，于0℃滴加溶有化合物21的二氯甲烷(1ml)的溶液。用TLC确认原料消失，用二氯甲烷将反应混合物稀释。用饱和碳酸氢钠水、饱和食盐水、水清洗有机相，用无水硫酸镁进行干燥后，浓缩。将残渣用真空泵进一步干燥后，溶于苯(1ml)，于氩气流下、在室温加叠氮钠(13mg，0.206mmol)、四氯化铵(57mg，0.206mmol)，于40℃下使其反应。2小时后用TLC确认原料消失后，进行减压浓缩。用乙酸乙酯对残渣进行萃取，用饱和食盐水、水清洗后，经无水硫酸镁干燥后，进行浓缩。残渣通过硅胶柱层析(乙酸乙酯∶己烷＝1∶4)纯化，获得化合物22(产量30.4mg，收率95％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)
δ7.39-7.32(m，5H，Ph)，4.99(ddd，1H，J3，F＝13.18Hz，J3，4＝9.27Hz，J2，3＝3.87Hz，H-3)，4.93(d，1H，J＝12.07Hz，OCH2Ph)，4.67(d，1H，J1，2＝1.18Hz，H-1)，4.63(d，1H，OCH2Ph)，4.51(ddd，1H，J6a，6b＝11.95Hz，J6a，5＝2.54Hz，J6a，F＝2.08Hz，H-6a)，4.23(ddd，1H，J6b，5＝6.14Hz，J6b，F＝1.14Hz，H-6b)，4.08(m，1H，H-2)，3.64(m，1H，H-5)，1.26〔2s，18H，OCOC(CH3)3〕
13C-NMR(400MHz，CDCl3)
δ178.01，177.68(C＝O)，136.06，128.63，128.31，128.14(Ph)，97.25(C-1)，85.51(d，J4，F＝183.97，C-4)，72.01(d，J5，F＝23.89，C-5)，71.73(d，J3，F＝18.98，C-3)
70.57(OCH2Ph)，62.42.(C-2，C-6)，39.08，38.90〔OCOC(CH3)3〕，27.18，26.95〔OCOC(CH3)3〕
参考例10
(N-乙酰基-4-脱氧-4-氟-D-甘露糖胺N-acetyl-4-deoxy-4-fluoro-D-mannosamine 24的合成)
Figure A0381595000401
(1)苄基  2-叠氮-2，4-双脱氧-4-氟-β-D-甘露吡喃糖苷Benzyl 2-azido-2，4-dideoxy-4-fluoro-β-D-mannopyranoside(23)的合成
将化合物22(180mg，0.387mmol)溶于甲醇(8ml)，加甲醇钠(922mg，9.67mmol)，搅拌，于40℃下使其反应。4.5小时后用TLC确认集中在1点，用阳离子交换树脂IR-120(+)中和后、进行过滤、浓缩。残渣经硅胶柱层析(乙酸乙酯∶己烷＝1∶1)纯化，得到化合物23(产量105.3mg，收率91.6％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)
δ7.40-7.31(m，5H，Ph)，4.96(d，1H，J＝12.13Hz，OCH2Ph)，4.71(d，1H，J1，2＝1.33Hz，H-1)，4.69(d，1H，OCH2Ph)，4.49(ddd，1H，J4，F＝51.06Hz，J4，5＝9.19Hz，J3，4＝9.20Hz，H-4)，4.02(m，1H，H-2)，3.93(dddd，1H，J6a，6b＝12.19Hz，J6a，5＝2.31Hz，J6a，F＝2.32Hz，J6a，OH＝6.20Hz，H-6a)，3.89-3.77(m，2H，H-3，H-6b)，3.39(m，1H，H-5)
13C-NMR(400MHz，CDCl3)
δ136.39，128.62，128.24，127.83(Ph)，98.63(C-1)，88.19(d，J4，F＝178.91Hz，C-4)，73.95(d，J5，F＝25.48Hz，C-5)，71.18(OCH2Ph)，71.16(d，J3，F＝19.69Hz，C-3)，64.48(d，J2，F＝8.42Hz，C-2)，61.39(C-6)
(2)N-乙酰基-4-脱氧-4-氟-D-甘露糖胺N-acetyl-4-deoxy-4-fluoro-D-mannosamine(24)的合成将化合物23(105mg，0.353mmol)溶于甲醇(7ml)，加乙酸酐(333μl，3.53mol)后、于氩气流下，加催化量10％ Pd/C，进行氢置换后，于室温进行搅拌。2小时后用TLC确认原料消失，活性炭过滤后进行浓缩。残渣经硅胶柱层析(乙酸乙酯∶甲醇＝5∶1)纯化，得到化合物24(产量57mg，收率72％)。
1H-NMR(400MHz，D2O)
δ5.23(dd，1H，J1，2＝2.69Hz，J1，F＝1.44Hz，H-1-α)，4.65(ddd，1H，J4，F＝50.94Hz，J3，4＝9.06Hz，J4，5＝9.58Hz，H-4-α)，4.47(m，1H，H-2-α)，4.43(ddd，1H，J3，F＝14.28Hz，J2，3＝4.9Hz，H-3-α)，4.16(m，1H，H-5-α)，3.95(m，2H，H-6a-α，H-6b-α)，2.14(s，3H，NHCOCH3-α)
13C-NMR(400MHz，D2O)
δ175.27(C＝O-α)，93.46(C-1-α)，88.30(d，J4，F＝177.00Hz，C-4-α)，69.91(d，J5，F＝24.41Hz，C-5-α)，67.60(d，J3，F＝18.74Hz，C-3-α)，60.36(C-6)，54.12(d，J2，F＝8.68Hz，C-2-α)，22.31(NHCOCH3-α)
参考例11
(5-乙酰胺-3，5，7-三脱氧-7-氟-D-甘油基-β-D-半乳糖-2-吡喃壬酮糖酸
5-acetamide-3，5，7-trideoxy-7-fluoro-D- glycero-β-D-galacto-2-nonulopyranosidonic acid 25的合成)
将化合物24(50mg，0.224mmol)丙酮酸钠(123mg，1.12mmol)和牛血清白蛋白(5mg)溶于磷酸钠缓冲液(100mM，pH7.5，3.4ml)，然后加唾液酸醛缩酶(50U)，于室温下开始反应。24小时后使反应溶液冷冻干燥，溶于少量水中，加到阴离子交换树脂柱(AG 1-X8，200-400目，formate form)中。使水300ml流过后、用1M甲酸将目的物洗脱，进行减压浓缩，用凝胶过滤柱(Sephadex G-15，水)纯化，得到化合物25(产量40mg，收率58.9％)。
1H-NMR(400MHz，D2O)
δ4.61(dd，1H，J7，8＝8.97Hz，J7，F＝45.56Hz，H-7)，4.18(dd，1H，J5，6＝10.63Hz，J6，F＝29.86Hz，H-6)，4.15(m，1H，H-4)，4.07(m，1H，H-8)，4.02(dd，1H，J4，5＝10.10Hz，H-5)，3.90(ddd，1H，J9 a9b＝12.18Hz，J9a，8＝2.77Hz，J9a，F＝2.86Hz，H-9a)，3.76(ddd，1H，J9b，8＝5.33Hz，J9b，F＝2.06Hz，H-9b)，2.40(dd，1H，J3eq，3ax＝13.00，J3eq，4＝4.88Hz，H-3eq)，2.15(s，3H，OCOCH3)，2.00(dd，1H，J3ax，4＝11.70Hz，H-3ax)
13C-NMR(400MHz，D2O)
δ175.17，173.68(C＝O)，96.01(C-1)，89.12(d，J7，F＝179.23Hz，C-7)，69.67(d，J6，F＝17.41Hz，C-6)，68.31(d，J8，F＝26.50Hz，C-8)，67.26(C-4)，62.70(C-6)，52.17(C-5)，39.19(C-3)，22.61(NHCOCH3)
参考例12
(5-乙酰胺-3，5，8-三脱氧-8-氟-D-甘油基-β-D-半乳糖-2-吡喃壬酮糖酸 5-acetamide-3，5，8-trideoxy-8-fluoro-D-glycero-β-D-galacto-2-nonulopyranosidonic acid 27的合成)
按照下述方案由唾液酸(26)合成5-乙酰胺-3，5，8-三脱氧-8-氟-D-甘油基-β-D-半乳糖-2-吡喃壬酮糖酸(27)。
Figure A0381595000441
(a)(1)Dowex 50-X8，dist.MeOH，(2)Acetone dimethyl acetal，Camphor sulfonicacid，MeCN，y＝73％；
(b)(1)BaO，Ba(OH)2，BnBr，DMF，(2)CH2N2，(3)60％ AcOH，y＝61.8％；
(c)(1)Dibutyltin oxide，toluene：MeOH＝5∶1，(2)tetra-n-butyl ammonium bromide，BnBr，toluene，y＝74.3％；
(d)(1)DMSO，Oxalyl chloride，TEA，CH2Cl2，(2)BH3NH3，MeOH，y＝73.2％；
(e)DAST，CH2Cl2，y＝29.8％；
(f)Pd/C，AcOH，y＝74.2％；
(g)(1)0.3N NaOH，(2)Amberlyst 15H(+)，0.016N HCl，y＝72.6％
(a)(1)将唾液酸(26)(1.02g，3.31mmol)溶于蒸馏过的甲醇(150ml)，加入阳离子交换树脂Dowex 50W-X8(2.0g)，加热回流下反应24小时。反应终点通过取出一部分反应溶液，用NMR确认。将反应溶液过滤，再向树脂加甲醇(100ml)，搅拌1小时，回收吸附在树脂上的化合物。将溶液再过滤，与先前的滤液合并，进行减压浓缩，得到化合物。
(2)将上述得到的化合物(5.05g，14.97mmol)溶于蒸馏过的乙腈(75ml)，于氩气流下室温下，边搅拌，边加莰烷一磺酸(498mg，2.14mmol)。然后一点一点地滴加丙酮二甲基缩醛(2.75ml，22.36mmol)，反应30分钟反应。确认反应结束后、加三乙基胺(2ml)终止反应，进行减压浓缩。残渣经硅胶柱层析(乙酸乙酯∶甲醇＝20∶1)纯化，得到丙酮化合物衍生物(α∶β＝1∶10、产量5.29g)。
(b)(1)将上述得到的丙酮化合物衍生物(3.2g，8.48mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(43ml)，加入氧化钡(9.3g，60.65mmol)和氢氧化钡8水合物(2.4g，7.61mmol)。然后加苄基溴化物(10ml，84.1mmol)，于室温下进行搅拌。用TLC确认原料消失后，用二氯甲烷稀释，用1％甲酸水溶液、水清洗后、用无水硫酸镁使有机相干燥。过滤无水硫酸镁除去后，对有机相进行减压浓缩。
(2)将残渣溶于乙醇(25ml)、苯(50ml)的混合溶剂，加溶解了重氮甲烷(42.5mmol)的乙醚溶液。此时，重氮甲烷是通过向乙醚和乙醇的混合溶液加对甲苯磺酰基-N-亚硝酰胺(p-toluenesulfonyl-N-nitrous amide)，滴加50％氢氧化钾产生的。加重氮甲烷后、于室温下反应10分钟。用TLC确认原料消失后，用醋酸(12ml)对过量的重氮甲烷骤冷，直接进行减压浓缩。
(3)然后，将残渣溶于60％醋酸水溶液，于60度下反应12小时。用TLC确认原料消失后，进行减压浓缩。残渣经硅胶柱层析(乙酸乙酯∶甲醇＝15∶1)纯化，得到化合物(α∶β＝1∶24、产量2.7g)。
(c)(1)将上述得到的化合物(1.08g，2.08mmol)溶于甲苯(30ml)和甲醇(6.5ml)中，加二丁基氧化锡(780mg，3.48mmol)，于85度反应2小时。然后对反应溶液进行减压浓缩，用充分脱水的甲苯共沸3次。
(2)将残渣再溶于甲苯(24ml)，加四丁基溴化铵(1.00g，3.48mmol)和苄基溴化物(977ml，10.4mmol)，于80度反应4小时。用TLC确认原料消失后，恢复到室温进行减压浓缩。残渣经硅胶柱层析(乙酸乙酯∶己烷＝4∶1)纯化，得到4，7，9-苄基体(α∶β＝1∶10、产量1.15g)。
(d)(1)向二氯甲烷(13ml)中加草酰氯(1.82g，14.3nnol)，冷却至-78度。15分钟后向该溶液加二甲基亚砜(1.3ml，17.9mmol)和二氯甲烷(5ml)的混合溶液，再于-78度进行搅拌。20分钟后，向其中慢慢地加溶于二氯甲烷(18ml)的上述得到的4，7，9-苄体(2.18mg，3.59mmol)。于-78度下搅拌20分钟搅拌后，加三乙基胺(4.00ml，28.7mmol)，搅拌10分钟后，将反应温度恢复到室温。用TLC确认原料消失后，用二氯甲烷稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水溶液清洗，用无水硫酸镁对有机相进行干燥。将无水硫酸镁过滤除去后，对有机相进行减压浓缩。
(2)将残渣不纯化直接溶于甲醇(16ml)，冷却至-15度后，加BH3NH3(122mg，3.95mmol)，使反应温度恢复到室温。用TLC确认原料消失后，对反应溶液直接进行减压浓缩。残渣经硅胶柱层析(乙酸乙酯∶己烷＝2∶1)纯化，得到8-差向异构体(产量1.05g)。
(e)将上述得到的8-差向异构体(533mg，0.87mmol)溶于二氯甲烷(13ml)，于氩气流下冷却至-15度。慢慢加二甲胺基磺胺三氟化物(580ml，3.51mmol)，搅拌30分钟后、将反应温度升高到40度，再搅拌16小时。加甲醇终止反应后，进行减压浓缩。残渣经硅胶柱层析(乙酸乙酯∶己烷＝2∶3)纯化，得到8-氟体(产量144mg)。
(f)将上述得到的8-氟体(120mg，0.197mmol)溶于醋酸(4ml)，于氩气流下，加10％Pd/C(120mg)，进行氢置换后，于室温进行搅拌。2小时后用TLC确认反应结束后，进行活性炭过滤，对滤液进行减压浓缩。残渣经硅胶柱层析(乙酸乙酯∶甲醇＝6∶1)纯化，得到化合物(产量57mg)。
(g)(1)将上述得到的化合物(50mg，0.147mmol)溶于甲醇(2ml)，加0.3N氢氧化钠水溶液(2ml)，于室温进行搅拌。用TLC确认反应结束后，用IR-120(+)中和反应溶液。对IR-120(+)过滤除去后，对滤液进行减压浓缩。
(2)将残渣直接溶于0.016N盐酸水溶液(5ml)，加Amberlystl5(H+)(150mg)，于75度反应24小时。通过NMR确认反应结束，对反应溶液进行减压浓缩。将残渣充填到AG1×X8(200～400目，formateform)，使水150ml流过后，用1M甲酸水溶液进行洗脱，得到8-氟-唾液酸(27)(产量33mg)。
以下给出了8-氟唾液酸的NMR数据。
1H-NMR(400MHz，D2O)
δ4.69(dddd，1H，J8，F＝48.7Hz，J8，9a＝5.0Hz，J8，9b＝3.5Hz，H-8)，4.03(ddd，1H，J4，5＝10.0Hz，J3ax.4＝11.1Hz，J3eq，4＝4.7Hz，H-4)，3.95(dd，1H，J4，5＝10.0Hz，J5，6＝9.9Hz，H-5)，3.94(ddd，1H，J6，7＝～0Hz，J7，8＝6.8Hz，J7，F＝14.0Hz，H-7)，3.88(ddd，1H，J9a，9b＝13.3Hz，J9a，8＝3.5Hz，J9b，F＝28.0Hz，H-9b)，3.86(dd，1H，J5，6＝9.9Hz，J6， 7＝～0Hz，H-6)，3.72(ddd，1H，J9a，9b＝5.33Hz，J9a，8＝5.0Hz，J9a，F＝30.6Hz，H-9a)，2.28(dd，1H，J3eq，3ax＝13.00，J3eq，4＝4.6Hz，H-3eq)，2.05(s，3H，Ac)，1.87(dd，1H，J3ax，4＝11.1Hz，J3eq，3ax＝13.00，H-3ax)
参考例13
(5-乙酰胺-3，5，9-三脱氧-9-氟-D-甘油基-β-D-半乳糖-2-吡喃壬酮糖酸 5-acetamide-3，5，9-trideoxy-9-fluoro-D-glycero-β-D-galacto-2-nonulopyranosidonic acid 28的合成)
按照下述方案，由唾液酸(26)合成5-乙酰胺-3，5，9-三脱氧-9-氟-D-甘油基-β-D-半乳糖-2-吡喃壬酮糖酸(28)。
Figure A0381595000481
(a) (1)Dowex 50W-X8，MeOH，reflux，(2)TrCl，pyridine，72％
(b) (1)BaO，Ba(OH)，(2)DMF，(3)CH2CN2，88％
(c)AcOH，100℃，78％
(d) (1)Tf2O，pyridine，CH2Cl2，(2)TASF，CH2Cl2，52％
(e)H2，Pd/C(10％)，AcOH，86％
(f)NaOHaq.
(g)0.02N HClaq.，Amberlyst 15(H+)，86％
上述反应根据下述文献进行。
T.Miyazaki，T.Sakakibara，H.Sato，Y.Kajihara；ChemoenzymaticSynthesis of the 9-Deoxy-9-fluoro-[3-13C]-NeuAc-a-(2，6)-[U-13C]-Gal-b-Sequence on An Intact Glycoprotein.J.Am.Chem.Soc.，121，1411-1412(1999).
参考例14
(CMP-7-氟唾液酸衍生物的合成)
Figure A0381595000491
(a) (1)Dowex 50-X8，MeOH，(2)Ac2O，60％HClO4；
(b) (1)1H-Tetrazole，CH3CN，(2)t-BuOOH，CH3CN，(3)DBU，CH3CN，(4)NaOMe，MeOH，H2O
将氟唾液酸衍生物化合物(25)(0.074mmol)溶于蒸馏甲醇(3ml)中，于氩气流、室温下边搅拌，边加Dowex-50W-X8(65mg)，反应3小时。确认反应结束后，过滤后减压浓缩。将残渣溶于乙酸酐(200μl)，于-20℃边搅拌，边加乙酸酐∶60％高氯酸＝15∶1溶液(22μl)，于10℃下反应40分钟。确认反应结束后，将反应溶液用乙酸乙酯稀释，用饱和碳酸氢钠水清洗。用无水硫酸镁干燥有机层，过滤后减压浓缩，得到含有化合物(29)的残渣。将残渣和CMP-5’-氨基磷酸酯衍生物(30)(136mg，0.23mmol)用苯分别进行3次共沸，分别溶于蒸馏的乙腈(100μl)，混合。于氩气流下、冰水中边搅拌，边加1H-四唑(17mg，0.23mmol)。5分钟后恢复到室温，再反应10分钟。确认反应结束后，溶液用乙酸乙酯稀释，用饱和碳酸氢钠水、饱和食盐水清洗。用无水硫酸镁使有机相干燥，过滤后于30℃以下浓缩后，再用甲苯进行2次共沸，除去水。向残渣加入蒸馏过的乙腈(400μl)，于氩气流下，一边冰冷，一边滴入2.5M的叔BuOOH甲苯溶液(290μl)。5分钟后恢复到室温，再搅拌20分钟。确认反应结束后，滴加二甲硫(53μl)，搅拌10分钟，对叔BuOOH进行骤冷。然后滴下DBU(18μl)，于室温搅拌20分钟。确认反应结束后、加甲醇(0.67ml)、水(1.35ml)、甲醇钠(360mg)，于室温反应16小时。确认反应结束后，用水提取，用二氨甲烷清洗。于25℃以下，将水层减压浓缩至8ml左右。该水溶液通过Sephadex G-15(1.8φ×90cm)凝胶柱层析(展开溶剂：20mM氨水、流速：0.3ml/分钟)纯化，得到CMP-氟-唾液酸衍生物(31)。
以下给出了CMP-7”-脱氧-7”-氟-唾液酸(31)的NMR数据。
1H-NMR(400MHz，50mM ND4DCO3 in D2O)，
δ8.04(d，1H，J5，6＝7.6Hz，H-6)，6.20(d，1H，J6， 5＝7.6Hz，H-5)，6.06(d，1H，J1’，2’＝4.5Hz，H-1’)，4.54(dd，1H，J7”，8”＝9.5Hz，J7”，F＝45.9Hz，H-7”)，4.42～4.20(m，7H，H-2’，H-3’，H-4’，H-5’a，H-5’b，H-6”，H-8”)，4.16(ddd，1H，J4”， 3”eq＝4.7Hz，J4”，3”ax＝11.3Hz，J4，5＝10.3Hz，H-4”)，4.03(dd，1H，J5”，4”＝J5”，6”＝10.3Hz，H-5”)，3.91(ddd，1H，J9”a，9”b＝12.2Hz，J9”a，8”＝2.8Hz，J9”a，F＝2.8Hz，H-9”a)，3.75(ddd，1H，J9”a，9”b＝12.2Hz，J9”b，8”＝5.4Hz，J9”b，F＝2.1Hz，H-9”b)，2.61(dd，1H，J3”eq，4”＝4.7Hz，Jgem＝13.3Hz，H-3”eq)，2.14(s，3H，Ac)，1.76(ddd，1H，J3”ax，4”＝11.5Hz，Jgem＝13.3Hz，J3”ax，P＝5.6Hz，H-3”ax)
参考例15
CMP-8”-脱氧-8”-氟-唾液酸的合成
除了使用化合物(27)代替化合物(25)以外，其他与参考例14同样，合成CMP-8”-脱氧-8”-氟-唾液酸。以下给出了NMR数据。
1H-NMR(400MHz，50mM ND4DCO3 in D2O)
δ8.08(d，1H，J5，6＝7.6Hz，H-6)，6.20(d，1H，J6.5＝7.6Hz，H-5)，6.09(d，1H，J1’，2’＝4.1Hz，H-1’)，4.90(m，1H，H-8”)，4.42(dd，1H，J3’，2’＝J3’，4’＝4.9Hz，H-3’)，4.39(dd，1H，J2’，1’＝4.1Hz，J2’，3’＝4.9Hz，H-2’)，4.31-4.28(m，3H，H-4’，H-5’a，H-5’b)，4.15(ddd，1H，J4”，3”eq＝4.4Hz，J4”，3”ax＝11.5Hz，J4，5＝10.5Hz，H-4”)，4.1O-3.90(m，5H，H-5”，H-6”，H-7”，H-9”a，H-9”b)，2.60(dd，1H，J3”eq，4”＝4.4Hz，Jgem＝13.1Hz，H-3”eq)，2.13(s，3H，Ac)，1.77(ddd，1H，J3”ax，4”＝11.5Hz，Jgem＝13.1Hz，J3”ax，P＝4.5Hz，H-3”ax)
参考例16
CMP-9”-脱氧-9”-氟-唾液酸的合成
除了使用化合物(28)代替化合物(25)以外，其他与参考例14同样，合成CMP-9”-脱氧-9”-氟-唾液酸。
实施例5
〔HOOC-Ser-Ser-Asn(asialooligo)-Val-Leu-Leu-Ala-NH-Dansyl的合成〕
将HMPA-PEGA树脂370mg填充到固相合成用柱，用CH2Cl2，DMF充分清洗，用于反应。
将Fmoc-Ser(OtBu)-OH、1-磺酰基-3-硝基-1，2，4-三唑(MSNT)、N-甲基咪唑溶解于CH2Cl2，搅拌5分钟后，填充到含有树脂的固相合成用柱中，于室温下搅拌3小时。搅拌后、树脂用亚甲基氯、异丙醇、DMF清洗，干燥。然后、使用20％乙酸酐DMF溶液对固相上未反应的羟基进行20分钟乙酰化，加帽。用DMF将树脂清洗后，通过使用20％哌啶/DMF溶液，搅拌20分钟，脱除Fmoc基，得到树脂-Ser-NH2。用DMF清洗后、干燥。
然后使用Fmoc-Ser(OtBu)-OH，通过HOBt·H2O和DIPCDI进行缩合。
然后将Fmoc-天冬酰胺连脱唾液酸糖链溶解于DMSO、DM F1比1的混合溶剂中，使用HATU和DIPEA，于室温搅拌2 4小时，进行缩合。用DMF清洗后，于10％乙酸酐/2-丙醇∶甲醇中搅拌20分钟，进行加帽。用2-丙醇、DMF将树脂清洗后，于20％哌啶/DMF中搅拌20分钟，脱除Fmoc基，用DMF将树脂清洗。
在该树脂上同样对缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)进行缩合和Fmoc基的脱除，得到树脂-Ser-Ser-Asn(asialooligo)-Val-Leu-Leu-Ala-NH2。
缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)的氨基酸使用对羧基进行pfp酯化的Fmoc-AA-Opfp(AA＝氨基酸)，通过3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪-3-基(Dhbt)进行缩合。所有缩合都是在DMF溶液中进行的。
然后为了进行荧光标记，使用丹酰氯和二异丙基乙基胺于DMF中反应30分钟。丹酰化结束后、用DMF，CH2Cl2将树脂清洗。
将树脂清洗后，加95％TFA水溶液，于室温下搅拌3小时，切下树脂。通过过滤将树脂除去，反应溶液于室温减压浓缩后，溶解于水，进行冷冻干燥。冷冻干燥品经HPLC纯化，得到目的HOOC-Ser-Ser-Asn(asialooligo)-Val-Leu-Leu-Ala-NH-Dansyl。
(YMC-Pack A-314 S-5 ODS 300×6.0mm 展开溶剂 A：0.1％TFA水溶液 B：0.1％TFA 乙腈∶水＝90∶10 梯度A 100％0.60ml/min→B 100％ 0.60ml/min 60分)
Figure A0381595000531
实施例6
〔HOOC-Ser-Ser-Asn(asialooligo)-Val-Leu-Leu-Ala-NH2的合成〕
除了省略实施例5中用于进行荧光标记的丹酰化以外，其他同样进行，合成HOOC-Ser-Ser-Asn(asialooligo)-Val-Leu-Leu-Ala-NH2。
实施例7
使用唾液酸转移酶使参考例14的唾液酸衍生物转移到实施例5中得到的丹酰化的脱唾液酸糖链肽上。
作为唾液酸转移酶可以使用来自市售的Rat Recombinant的α2，3转移酶。
酶反应条件是对于丹酰化脱唾液酸糖链肽使用CMP-唾液酸衍生物4当量，反应溶剂使用50mM二甲胂酸缓冲液(pH5.0)，在反应溶液中预先加磷酸水解酶和牛血清白蛋白。
反应结束后、直接进行冷冻干燥。冷冻干燥品经HPLC纯化得到如下所示的结合了丹酰化的二-7-唾液酸衍生物的糖链肽。
(YMC-Pack A-314 S-5 ODS 300×6.0mm 展开溶剂 A：0.1％TFA水溶液 B：0.1％TFA 乙腈∶水＝90∶10 梯度A 100％0.60ml/min→B 100％ 0.60ml/min 60分)
实施例8
除了作为唾液酸转移酶使用来自市售的Rat Liver的α2，6转移酶，将二甲胂酸缓冲液的pH调整到6.0以外，其他与实施例7同样进行，得到如下所示的丹酰化的二-7-唾液酸衍生物的2，6-结合的糖链肽。
实施例9
除了使用参考例15的唾液酸衍生物代替参考例14的唾液酸衍生物以外，其他与实施例7同样进行，得到如下所示的二-8-唾液酸衍生物的2，3-结合的糖链肽。
实施例10
除了使用参考例15的唾液酸衍生物代替参考例14的唾液酸衍生物以外，其他与实施例8同样进行，得到了如下所示的二-8-唾液酸衍生物的2，6-结合的糖链肽。
实施例11
除了使用参考例16的唾液酸衍生物代替参考例14的唾液酸衍生物以外，其他与实施例7同样进行，得到了如下所示的二-9-唾液酸衍生物的2，3-结合的糖链肽。
实施例12
除了使用参考例16的唾液酸衍生物代替参考例14的唾液酸衍生物以外，其他与实施例8同样进行，得到了如下所示的二-9-唾液酸衍生物的2，6-结合的糖链肽。
Figure A0381595000571
实施例13
除了使用实施例6得到的没有丹酰化的脱唾液酸糖链肽以外，其他与实施例7同样进行，得到了如下所示的二-7-唾液酸衍生物的2，3-结合的糖链肽。
Figure A0381595000572
实施例14
除了使用实施例6得到的没有丹酰化的脱唾液酸糖链肽以外，其他与实施例8同样进行，得到了如下所示的二-7-唾液酸衍生物的2，6-结合的糖链肽。
Figure A0381595000581
实施例15
除了使用实施例6得到的没有丹酰化的脱唾液酸糖链肽以外，其他与实施例9同样进行，得到了如下所示的二-8-唾液酸衍生物的2，3-结合的糖链肽。
实施例16
除了使用实施例6得到的没有丹酰化的脱唾液酸糖链肽以外，其他与实施例10同样进行，得到了如下所示的二-8-唾液酸衍生物的2，6-结合的糖链肽。
实施例17
除了使用实施例6得到的没有丹酰化的脱唾液酸糖链肽以外，其他与实施例11同样进行，得到了如下所示的二-9-唾液酸衍生物的2，3-结合的糖链肽。
实施例18
除了使用实施例6得到的没有丹酰化的脱唾液酸糖链肽以外，其他与实施例12同样进行，得到了如下所示的二-9-唾液酸衍生物的2，6-结合的糖链肽。
Figure A0381595000602
实施例19
HOOC-Ser-Thr-Thr-Asp-Asn(disialooligo)-Asp-Ile-Pro-NH2的合成
上述目的糖肽中的Asn(disialooligo)指的是带有没有被苄基保护的唾液酸的二唾液酸寡天冬酰胺。
向固相合成用柱加入HMPA-PEGA树脂50mg，用CH2Cl2，DMF充分清洗，使其干燥。
将Fmoc-Ser(OtBu)-OH、1-磺酰基-3-硝基-1，2，4-三唑(MSNT)，N-甲基咪唑溶解于CH2Cl2，搅拌5分钟后，加到含有树脂的固相合成用柱，于室温搅拌3小时。搅拌后、用亚甲基氯、异丙醇、DMF清洗树脂，使其干燥。然后，使用20％乙酸酐DMF溶液对固相上未反应的羟基进行20分钟乙酰化，加帽。用DMF将树脂清洗后，通过使用20％哌啶/DMF溶液，搅拌20分钟，脱除Fmoc基，得到树脂-Ser-NH2。用DMF清洗后，使其干燥。
然后按照Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH的顺序，通过HOBt·H2O和PyBOP·DIPEA使其缩合。各氨基酸缩合后、通过使用20％哌啶/DMF溶液，搅拌20分钟，脱除Fmoc基。
然后将二苄基Fmoc-天冬酰胺二唾液酸糖链溶解于DMSO、DM F1比1的混合溶剂中，使用HATU和DIPEA，于室温搅拌24小时，使其缩合。用DMF清洗后，于10％乙酸酐/2-丙醇∶甲醇中搅拌20分钟，加帽。用DMF清洗后，向树脂中加入DMF∶2，6-Lutidine＝1∶1的混合溶剂，通过加相当于各个糖羟基3当量的TESOTf后，使其反应1小时，用TES(TriethylSilyl)基对糖羟基进行保护。
用DMF，THF将树脂清洗后，于20％哌啶/THF中搅拌20分钟，脱除Fmoc基，用THF将树脂清洗。
在该树脂中于THF溶剂中用HOBt·H2O和PyBOP·DIPEA、对天冬氨酸(Asp)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(PrO)进行缩合，用20％哌啶/THF脱除Fmoc基，得到树脂-Ser-Thr-Thr-Asp-Asn(TES化二苄基disialooligo)-Asp-Ile-Pro-NH2。其中Asn(TES化二苄基disialooligo)指的是含有唾液酸羧基被苄基保护、糖羟基被TES基保护的唾液酸的二唾液酸寡天冬酰胺。
将缩合结束后的树脂充分干燥后、加95％TFA水溶液，于室温下搅拌3小时，切断氨基酸的保护基、TES基和树脂。将树脂过滤除去，将反应溶液于室温下减压浓缩后，溶解于水，进行冷冻干燥。将冷冻干燥品溶解于pH11的氢氧化钠水溶液，对苄基酯进行水解，脱去苄基后用醋酸中和，直接进行冷冻干燥。通过用HPLC对冷冻干燥品进行纯化，得到目的HOOC-Ser-Thr-Thr-Asp-Asn(disialooligo)-Asp-Ile-Pro-NH2。
(Mightsyl ODS-C18 250×20mm 展开溶剂 A：0.1％TFA水溶液 B：0.1％TFA 乙腈∶水＝90∶10梯度A 100％0→B 100％60分钟流速2.50ml/min)
通过本发明提供可以通过人工方式容易而且大量地合成在肽链任意位置含有至少1以上天冬酰胺糖链或粘蛋白结合型糖链的糖肽的糖肽制造方法。
另外通过本发明可以得到即使是含有唾液酸的天冬酰胺糖链，酸处理也不会将唾液酸从糖肽切下，容易地得到唾液酸糖肽。
另外通过本发明通过人工方式容易而且大量地合成在肽链任意位置含有至少1以上任意除去(缺失)糖残基的各种新的天冬酰胺糖链的糖肽
另外通过本发明，通过使用唾液酸转移酶将唾液酸或其衍生物导入到糖肽，可以得到导入了唾液酸或其衍生物的糖肽。

Claims (21)

1.一种在肽链的任意位置至少含有1个以上天冬酰胺糖链的糖肽的制造方法，其特征是：
(1)使带有羟基的树脂(resin)的羟基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酯化反应，
(2)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(3)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酰胺化反应，
(4)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(5)将上述(3)和(4)工序重复1次以上，
(6)与氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，
(7)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(8)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酰胺化反应，
(9)将上述(7)和(8)工序重复1次以上，
(10)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(11)用酸将树脂(resin)切去。
2.在肽链的任意位置至少含有2个以上天冬酰胺糖链的糖肽的制造方法，其中，适当追加(6)的与氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，(7)的脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基的工序。
3.在肽链上至少含有1个以上天冬酰胺糖链的糖肽的制造方法，其中，在最后工序进行(6)的与氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，(7)的脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基的工序。
4.权利要求1所述的糖肽制造方法，其中取代(6)的工序或除了(6)的工序之外，再使(1)带有羟基的树脂(resin)的羟基与氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酯化反应。
5.权利要求1～4任一项所述糖肽制造方法，其中权利要求1(6)的天冬酰胺糖链含有6个以上糖残基。
6.权利要求1～4任一项所述糖肽制造方法，其中权利要求1(6)的天冬酰胺糖链含有9～11个糖残基。
7.权利要求1～4任一项所述糖肽制造方法，其中权利要求1(6)的天冬酰胺糖链含有6个以上的糖残基，并且结合2分叉型糖链。
8.权利要求1～4任一项所述糖肽制造方法，其中权利要求1(6)的天冬酰胺糖链是天冬酰胺二唾液酸糖链或天冬酰胺单唾液酸糖链，该唾液酸的羧基被保护基保护。
9.权利要求1～4任一项所述糖肽制造方法，其中权利要求1(6)的天冬酰胺糖链是天冬酰胺连脱唾液酸糖链。
10.权利要求8任一项所述糖肽制造方法，其中唾液酸羧基的保护基是苄基。
11.权利要求1～4任一项所述糖肽制造方法，其中脂溶性保护基是9-芴甲氧羰基(Fmoc)基。
12.权利要求1～11任一项所述糖肽制造方法，其中用粘蛋白结合型糖链代替天冬酰胺糖链的一部分或全部。
13.一种在肽链的任意位置至少含有1个以上通过权利要求1～12任一项所述制造方法可获得的天冬酰胺糖链或粘蛋白结合型糖链的糖肽。
14.权利要求13所述糖肽，其中天冬酰胺糖链或粘蛋白结合型糖链含有6个以上糖残基，并且结合2分叉型糖链。
15.权利要求13所述糖肽，其中作为天冬酰胺糖链是结合了从天冬酰胺二唾液酸糖链和天冬酰胺单唾液酸糖链中选择的至少1种以上的糖链。
16.权利要求13所述糖肽，其中天冬酰胺糖链如式(1)所示，
Figure A038159500004C1
式中、R3和4是氢原子、式(2)～(5)表示的基团、可以相同，也可以不同。
17.一种在肽链的任意位置至少含有1个以上天冬酰胺糖链，而且在末端带有唾液酸或其衍生物残基的糖肽的制造方法，其特征是：
(1)使带有羟基的树脂的羟基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酯化反应，
(2)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(3)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酰胺化反应，
(4)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(5)将上述(3)和(4)工序重复1次以上，
(6)与氨基氮被脂溶性保护基保护的天冬酰胺糖链的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应，
(7)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(8)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酰胺化反应，
(9)将上述(7)和(8)工序重复1次以上，
(10)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(11)用酸将树脂切去，
(12)利用唾液酸转移酶使唾液酸或其衍生物转移到得到的糖肽上。
18.权利要求17所述糖肽的制造方法，其中在上述工序(11)的用酸切去树脂前使标记试剂反应。
19.权利要求18所述糖肽的制造方法，其中标记试剂是丹酰卤化物。
20.一种5-乙酰胺-3，5，7-三脱氧-7-氟-D-甘油基-β-D-半乳糖-2-吡喃壬酮糖酸的制造方法，其特征是使N-乙酰基-4-脱氧-4-氟-D-甘露糖胺、丙酮酸钠、牛血清白蛋白、唾液酸醛缩酶反应。
21.一种5-乙酰胺-3，5，7-三脱氧-7-氟-D-甘油基-β-D-半乳糖-2-吡喃壬酮糖酸的制造方法，其特征是在乙酸酐存在下，对苄基2-叠氮-2，4-二脱氧-4-氟-β-D-吡喃甘露糖苷加氢，得到N-乙酰基-4-脱氧-4-氟-D-甘露糖胺，然后使他与丙酮酸钠、牛血清白蛋白、唾液酸醛缩酶反应。
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