CN107750252A - 白蛋白‑糖链复合体 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种白蛋白‑糖链复合体，该复合体上结合有足以获得糖链簇效果的数量的糖链，并且在生物体内能够比较稳定地存在。本发明提供：一种白蛋白‑糖链复合体，其特征在于：每1分子的白蛋白结合有5分子或多于5分子的天冬酰胺结合型糖链；一种功能性分子用载体，该载体用于在生物体内向靶组织有选择地运送功能性分子，其包含上述记载的白蛋白‑糖链复合体；一种生物成像探针，其特征在于：以上述记载的白蛋白‑糖链复合体作为有效成分，对动物的生物体内进行给药。

Description

白蛋白-糖链复合体
技术领域
本申请根据2015年6月30日提出的日本专利申请2015-132002的专利申请主张其优先权。本申请是通过参照所述基础申请的内容和所引用的文献内容而将其纳入本申请。
本发明涉及一种在生物体内稳定存在、且凭借1分子即可发挥糖链簇效果的白蛋白-糖链复合体。
背景技术
天冬酰胺结合型糖链(以下有时简称为“N-型糖链”。)包含在天冬酰胺(Asn)侧链的酰胺氮原子上结合有糖链的结构，根据构成糖链的单糖类(单糖或其衍生物)的种类及序列、以及是否存在支链等而存在各种结构。N-型糖链通过与蛋白或脂质等其他分子发生相互作用，而与免疫应答调节、细胞的增殖、癌化或癌细胞的转移等各种生物学功能密切相关，而且还有助于蛋白在生物体内的稳定性。由于该N-型糖链的功能可期待在用于诊断或治疗的药品中应用，所以对N-型糖链在生物体内的动力学进行分析。由于N-型糖链与蛋白等的相互作用主要依赖于糖链结构，因此作为分析N-型糖链的功能的方法，采用了下述方法：使具有特定的糖链结构的N-型糖链与白蛋白等蛋白结合，将所得的糖蛋白对动物进行给药，进行动力学分析或者分析在组织内是否存在蓄积等(例如参照非专利文献1或2)。另外，还向具有特定的糖链结构的N-型糖链的糖蛋白中进一步导入荧光物质，通过生物成像分析等非侵袭性地研究动物的体内动力学(例如参照非专利文献3)。
虽然1根糖链与蛋白的相互作用弱，但通过糖链聚集而发挥强的相互作用(糖链簇效果)。因此，作为N-型糖链的功能分析中使用的糖蛋白，优选在每1分子的蛋白上结合有尽可能多的N-型糖链以获得糖链簇效果的糖蛋白。
迄今为止，本发明人报告了：合成了向每1分子的聚赖氨酸骨架中导入4～16分子的N-型糖链、并于末端修饰有荧光物质的糖链簇，将其给予动物，进行动力学分析(参照非专利文献4)。由于糖链的体积大、羟基也多，所以以往增加每1分子蛋白上的糖链的结合分子数是非常困难的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2008/096760号
专利文献2：日本特开2015-030702号公报
非专利文献
非专利文献1：Andre等人,Bioconjugate Chemistry,1997,第8卷,第845-855页
非专利文献2：Unverzagt等人,Journal of Medicinal Chemistry,2002,第45卷,第478-491页
非专利文献3：Ogura等人,Glycoconjugate Journal,2014,第31卷,第273-279页
非专利文献4：Tanaka等人,Angewandte Chemie International Edition,2010,第49卷,第8195-8200页
发明内容
发明所要解决的课题
在每1分子的聚赖氨酸中导入有16分子的N-型糖链的糖链簇在对生物体进行给药时容易分解。另外，在实际用作对人进行诊断或治疗的药品时，更希望尽可能使用天然的蛋白。
本发明的目的在于：提供一种白蛋白-糖链复合体，该复合体上结合有足以获得糖链簇效果的数量的糖链，并且在生物体内能够比较稳定地存在。
用于解决课题的方法
为了解决上述课题，本发明人进行了深入研究，结果发现：白蛋白具有多个适合进行糖链修饰的赖氨酸残基，并且糖链修饰后的白蛋白也能够在生物体内比较稳定地存在；通过利用新开发的RIKEN-CLICK反应(共轭亚胺的6π-氮杂电子环状反应)(参照专利文献1、2)，能够向每1分子的白蛋白中导入多个N-型糖链，从而完成了本发明。
即，本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体、功能性分子用载体、以及生物成像探针为下述的[1]～[11]。
[1]一种白蛋白-糖链复合体，其特征在于：每1分子的白蛋白结合有5分子或多于5分子的天冬酰胺结合型糖链。
[2]上述[1]的白蛋白-糖链复合体，其中，上述天冬酰胺结合型糖链的非还原末端的糖包含选自N-乙酰葡糖胺、半乳糖、甘露糖和唾液酸的糖。
[3]上述[1]或[2]的白蛋白-糖链复合体，其中，上述天冬酰胺结合型糖链为选自下述式(a’)～(f’)的一种或多于一种的糖链。
【化学式1】
[上述式中，Neu5Ac是指N-乙酰神经氨酸，Gal是指半乳糖，GlcNAc是指N-乙酰葡糖胺，Man是指甘露糖。]
[4]上述[1]～[3]中任一项的白蛋白-糖链复合体，其中，天冬酰胺结合型糖链连接在白蛋白的赖氨酸残基上。
[5]一种功能性分子用载体，该载体用于在生物体内向靶组织有选择地运送功能性分子，其包含上述[1]～[4]中任一项的白蛋白-糖链复合体。
[6]一种功能性分子用载体，该载体用于在生物体内向靶组织有选择地运送功能性分子，上述靶组织为肝脏的星细胞，该载体包含上述[1]或[2]的白蛋白-糖链复合体，上述天冬酰胺结合型糖链的非还原末端为N-乙酰葡糖胺。
[7]一种功能性分子用载体，该载体用于在生物体内向靶组织有选择地运送功能性分子，上述靶组织为肝脏的库普弗(Kupffer)细胞，该载体包含上述[1]或[2]的白蛋白-糖链复合体，上述天冬酰胺结合型糖链的非还原末端为甘露糖和N-乙酰神经氨酸的双支链型。
[8]一种功能性分子用载体，该载体用于在生物体内向靶组织有选择地运送功能性分子，上述靶组织为肝脏或脾脏，该载体包含上述[1]或[2]的白蛋白-糖链复合体，上述天冬酰胺结合型糖链的非还原末端为甘露糖。
[9]一种功能性分子用载体，该载体用于在生物体内向靶组织有选择地运送功能性分子，上述靶组织为癌细胞，该载体包含上述[1]或[2]的白蛋白-糖链复合体，上述天冬酰胺结合型糖链的非还原末端为α(2-3)唾液酸。
[10]上述[5]～[9]中任一项的功能性分子用载体，其中，上述功能性分子为荧光物质或药剂。
[11]一种生物成像探针，其特征在于：以上述[1]～[4]中任一项的白蛋白-糖链复合体作为有效成分，对动物的生物体内进行给药。
发明效果
本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体在生物体内能够比较稳定地存在，并且发挥糖链簇效果，与蛋白等其他生物体分子的相互作用强。因此，该白蛋白-糖链复合体可用作N-型糖链的功能分析工具，而且还可用作：向特定的细胞或组织运送功能性分子的功能性分子用载体、标记特定的细胞或组织的生物成像探针、以特定的细胞等为靶的药品的有效成分。
附图说明
图1是式(a’)～(f’)所表示的双支链型糖链的模式图。
图2是试验例1中给予了HL750-HSA的小鼠(A)、给予了复合体2a的小鼠(B)、给予了复合体2b的小鼠(C)、以及给予了复合体2c的小鼠(D)在给药后经过0.5～3小时的时间点的小鼠个体的荧光图像。
图3是显示在试验例1中各小鼠的白蛋白-糖链复合体或HL750-HSA的尿中排泄量的测定结果(A)、各小鼠在给予白蛋白-糖链复合体起经过3小时的时间点的胆嚢的荧光强度的测定结果(B)、以及各小鼠在给予白蛋白-糖链复合体起经过3小时的时间点的小肠的荧光强度的测定结果(C)的图。
图4是试验例1中给予了复合体2d的小鼠(A)、给予了复合体2e的小鼠(B)、以及给予了复合体2f的小鼠(C)在给药后经过0.5～3小时的时间点的小鼠个体的荧光图像。
图5是在试验例1中给予各复合体后经过3小时的时间点从小鼠个体中切除的肝脏和脾脏的荧光图像(A)、显示肝脏的荧光强度的测定结果的图(B)、以及显示脾脏的荧光强度的测定结果的图(C)。
图6是显示试验例2中各小鼠的白蛋白-糖链复合体的尿中排泄量的测定结果(A)、各小鼠在给予白蛋白-糖链复合体起经过3小时的时间点的胆嚢的荧光强度的测定结果(B)、以及各小鼠在给予白蛋白-糖链复合体起经过3小时的时间点的小肠的荧光强度的测定结果(C)的图。
图7是试验例3中给予了复合体2b的小鼠在给药后经过1小时的时间点的小鼠个体的荧光图像。
具体实施方式
本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体的特征在于：每1分子的白蛋白结合有5分子或多于5分子的N-型糖链。在1分子的白蛋白上结合有1分子糖链的糖链复合体中，该糖链与蛋白等其他分子的相互作用小、反应性低。相对于此，本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体，其每1分子具有5分子或多于5分子的N-型糖链，仅凭1分子即可充分发挥糖链簇效果，糖链与特定的生物体分子的相互作用强。作为本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体，优选每1分子的白蛋白具有9分子或多于9分子的N-型糖链。对N-型糖链数的上限没有特别限定，N-型糖链数例如可以是30分子以下，优选为20分子以下，更优选为15分子以下，进一步优选为11分子以下。
本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体使用白蛋白作为结合N-型糖链的蛋白。N-型糖链与白蛋白的赖氨酸残基连接。白蛋白在生物体内的稳定性优异，并且存在多个适合进行糖链修饰的赖氨酸残基。例如，在人血清白蛋白中，每1分子存在60个左右的赖氨酸残基，推测其中有10～30个可进行糖链修饰的赖氨酸残基。而且，即使在进行了糖链修饰的情况下，也具有难以获得抗原性、在生物体内不易作为异物而被代谢的优点。
构成本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体的白蛋白可以是由动物纯化的天然型蛋白，也可以是重组蛋白。另外，还可以是任一种动物本来就具有的野生型白蛋白，也可以是在野生型白蛋白中除赖氨酸残基以外的1个或多个氨基酸发生了缺失、取代或添加而获得的变异型白蛋白。
作为构成本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体的白蛋白，优选血清白蛋白，更优选来自哺乳动物的血清白蛋白。作为该哺乳动物，优选人、以及小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠、猴、绵羊、马、牛、猪、驴、狗、猫等家畜及实验动物，特别优选人。
构成本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体的N-型糖链可以只有一种，也可以是两种或多于两种。另外，构成1分子N-型糖链的糖类只要是通过糖苷键能够形成链状结构的单糖类(单糖或其衍生物)即可，没有特别限定，可以是仅由一种单糖类构成的糖链，也可以是由两种或多于两种的单糖类构成的糖链。作为该单糖类，例如可以列举葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、岩藻糖(Fuc)、木糖(Xyl)、葡萄糖醛酸(GlcA)、艾杜糖醛酸(IdoA)、N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)、脱氨基神经氨酸(KDN；2-酮-3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖酸(2－ケト－3－デオキシ－D－グリセロ－D－ガラクト－ノノン酸))、以及它们的衍生物等。
对糖苷键的形态没有特别限定，可以是α1,4键、α1,6键、α2,3键、α2,6键、β1,2键、β1,4键等。
构成本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体的N-型糖链优选具有＊-Man-GlcNAc-GlcNAc-＊＊(**表示白蛋白结合侧。)的通用序列。
在本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体中，与1分子白蛋白结合的N-型糖链的糖链部分可以是直链状，也可以是支链状。作为构成本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体的糖链，优选为在动物体内存在较多的双支链型糖链，优选为选自图1所示的式(a’)～(f’)的一种或多于一种。此外，式(a’)～(f’)的糖链是在以人为代表的动物的生物体内大量存在的糖链。
【化学式2】
例如，通过利用专利文献1、2中记载的化合物，可以在每1分子的白蛋白上连接5分子或多于5分子的N-型糖链。具体而言，通过下述反应使下述通式(I-0)所表示的含有N-型糖链的醛化合物与白蛋白的赖氨酸残基连接。对白蛋白表面的至少5个赖氨酸残基的侧链进行该反应。如此操作而合成的白蛋白-糖链复合体，其中每1分子的白蛋白具有5个或多于5个的下述通式(I)的结构。
【化学式3】
在通式(I)和通式(I-0)中，A1表示N-型糖链-Asn-(在Asn残基侧链的酰胺氮原子上结合有N-型糖链的基团)。作为A1中的糖链，优选为上述式(a’)～(f’)的糖链。另外，L1与A1中的Asn残基的不与糖链结合的氮原子结合。
在通式(I)中，＊＊表示与白蛋白的赖氨酸残基的侧链的氨基结合的碳原子所结合的部位。另外，Alb-NH2表示白蛋白。
在通式(I)和通式(I-0)中，R1表示碳原子数为1～6的烷基。该烷基可以是直链状，也可以是支链状。作为该烷基，例如可以列举甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。作为本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体，优选通式(I)中的R1是碳原子数为1～3的烷基，更优选为甲基、乙基或丙基，进一步优选为乙基。
在通式(I)和通式(I-0)中，Z1表示1,2-亚苯基、1,3-亚苯基或1,4-亚苯基。作为本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体，优选通式(I)的Z1为1,4-亚苯基。
在通式(I)和通式(I-0)中，L1表示任意的连接基。L1只要是不阻碍RIKEN-CLICK反应的二价基团即可，没有特别限定，但由于与白蛋白连接的N-型糖链的活动自由度高者容易发挥糖链簇效果，所以优选链较长的基团、以及环结构等的体积大的基团。
作为通式(I)和通式(I-0)中的L1，优选下述通式(II)所表示的基团。在通式(II)中，R2表示碳原子数为1～20的亚烷基，L2表示任意的连接基。在通式(II)中，＊显示与上述通式(I)中的A1结合的部位，＊＊显示与上述通式(I)中的Z1结合的部位。
【化学式4】
R2的亚烷基可以是直链状，也可以是支链状。将白蛋白和N-型糖链通过柔软的亚烷基进行连接，从而使得N-型糖链的活动自由度增加，结果是与相同的白蛋白分子结合的多个N-型糖链彼此容易聚集。作为该亚烷基，例如可以列举亚甲基、亚乙基、亚丙基、异亚丙基、正亚丁基、异亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基、亚癸基、亚十一烷基、亚十二烷基、亚十三烷基、亚十四烷基、亚十五烷基、亚十六烷基、亚十七烷基、亚十九烷基等。作为本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体，其中通式(II)的R2优选碳原子数为3～10的亚烷基，更优选碳原子数为3～10的直链状亚烷基，进一步优选碳原子数为4～8的直链状亚烷基。
通式(II)中的L2只要是不阻碍RIKEN-CLICK反应的二价基团即可，没有特别限定。具体而言，作为L2，可以列举-O-CO-NH-(CH2)n-CO-NH-、-O-CO-NH-(CH2)n-NH-CO-、-(CH2)n-、-(CH2)n-O-(CH2)m-、-(CH2)n-CO-NH-或-(CH2)n-NH-CO-(上述式中，n和m分别独立表示1～20的整数)。
通式(I-0)中的L1为通式(II)所表示的基团的醛化合物(I’-0)例如可以通过下述通式(III)所表示的叠氮化物与下述通式(IV)所表示的醛的环化反应(炔-叠氮环化反应)来合成。在通式(III)和(IV)中，A1、Z1和R1与通式(I)相同，而L2和R2与通式(II)相同。
【化学式5】
该环化反应例如可以通过在氮环境下、在极性溶剂中混合上述两种物质来进行。作为极性溶剂，例如可以列举水、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甲基氰(乙腈)、丙腈、二乙氧基乙烷(DME)、以及它们的混合溶剂等。反应温度优选在50℃或高于50℃进行，更优选在60～100℃下进行，进一步优选在60～80℃下进行。
作为本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体，优选具有下述通式(V-1)～(V-8)的结构的复合体。在通式(V-1)～(V-8)中，R1与上述通式(I)的R1相同，R2与上述通式(II)的R2相同，n1为1～6的整数，“＊”是与糖链结合的部位，“＊＊”是与白蛋白的赖氨酸残基侧链的氨基结合的碳原子所结合的部位。作为通过“＊”结合的糖链，优选为上述式(a’)～(f’)中的任一种。
作为下述通式(V-1)～(V-8)所表示的化合物，优选R1是碳原子数为1～3的烷基、R2是碳原子数为3～16的亚烷基、n1为1～3的整数、在＊处结合的糖链为上述式(a’)～(f’)中的任一种的化合物，更优选R1是碳原子数为1～3的烷基、R2是碳原子数为3～10的亚烷基、n1为1～3的整数、在＊处结合的糖链为上述式(a’)～(f’)中的任一种的化合物。
【化学式6】
【化学式7】
上述通式(I-0)所表示的醛化合物与白蛋白的RIKEN-CLICK反应例如可以通过在极性溶剂中混合这两种物质来进行。
作为极性溶剂，例如可以列举水、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甲基氰、丙腈、二乙氧基乙烷(DME)、以及它们的混合溶剂等。反应温度优选在白蛋白不会发生变性的60℃以下进行，更优选在50℃以下进行，进一步优选在15～40℃下进行。
通过调节供给上述RIKEN-CLICK反应的上述通式(I-0)所表示的醛化合物与白蛋白的摩尔比，可以调节向1分子的白蛋白中导入的N-型糖链的分子数。上述醛化合物相对于白蛋白的量越多，就越能增加向1分子白蛋白中导入的N-型糖链的分子数。
向1分子的白蛋白中导入两种或多于两种的N-型糖链时，使含有各N-型糖链的通式(I-0)所表示的醛化合物依次与白蛋白反应。在白蛋白表面的多个赖氨酸残基中，从容易与醛化合物反应的赖氨酸残基开始依次被导入N-型糖链。因此，根据与白蛋白反应的顺序，即使每1分子的白蛋白上结合的各N-型糖链的分子数相同，有时也会得到与其他蛋白的反应性不同的白蛋白-糖链复合体。
作为本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体，还优选含有标记物质或用于与标记物质结合的部位。根据标记物质可以检测出白蛋白-糖链复合体。作为标记物质，优选能够检测出投入到生物体内的白蛋白-糖链复合体的标记物质，可以列举荧光物质、具有与放射性金属配位的结构的物质、包含放射性同位体的物质、具有与MRI用的顺磁性金属配位的结构的物质等。这些标记物质优选与白蛋白-糖链复合体中的N-型糖链以外的部分结合。
对本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体所具有的荧光物质没有特别限定，可以从对蛋白及糖等进行荧光标记时使用的荧光物质中适当选择使用。可以是蛋白，也可以是色素，还可以是量子点。作为本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体所含有的荧光物质，优选为能够对生物体内比较安全地进行给药的荧光物质，由于生物体内的白蛋白-糖链复合体从生物体外也更容易进行检测，所以更优选近红外荧光物质。作为近红外荧光物质，可以列举HiLyte Fluor(注册商标)750、吲哚菁绿、Alexa Flor(注册商标)647、AlexaFluor 680、AlexaFluor 790、Cy(注册商标)3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7等具有吲哚菁骨架的有机荧光色素、亮蓝、亮绿等菁蓝衍生物、Y2O3荧光纳米颗粒等无机纳米颗粒等。
在本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体所具有的标记物质中，作为具有与放射性金属配位的结构的物质，可以列举卟啉、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环癸烷-1,4,7,10-四乙酸)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)等。作为含有上述放射性同位体的物质，可以列举包含选自18F、11C、13N、15O和99mTc的一种或多于一种的衍生物(例如三氟(18F)硼酸盐)等。作为上述具有与MRI用的顺磁性金属配位的结构的物质，例如可以列举钆等。
本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体可以含有标签肽及生物素等低分子化合物。作为该标签肽，可以列举His标签、Flag标签、HA标签等。通过含有与特定物质特异性结合的这些物质，可以容易地从混合物中进行分离及纯化。
本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体，由于在其1分子中具有多个N-型糖链，所以糖链与其他物质的特异性相互作用较1分子中只有1个N-型糖链的糖链复合体表现得更为显著。因此，利用该糖链与其他物质的亲和性，本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体可用作用于检测表面存在有与所含糖链的亲和性高的物质的细胞或组织的探针。特别是，由于本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体在动物的生物体内比较稳定，所以在细胞及组织、或者个体水平捕捉蛋白等生物体分子的分布或存在，以图像形式分析其动力学，因此可作为投入到动物的生物体内的生物成像探针的有效成分。
例如，对动物给予本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体时，含有如式(d’)所示非还原末端为N-乙酰葡糖胺的N-型糖链的复合体聚集在肝脏内，特别是通过与结蛋白(Desmin)及波形蛋白(Vimentin)的相互作用，而被摄入星细胞内。因此，这些白蛋白-糖链复合体可用作用于检测肝脏、特别是活化的星细胞的生物成像探针、以及用于向肝脏、特别是星细胞内有选择地运送功能性分子的功能性分子用载体。另外，含有如式(f’)所示非还原末端为甘露糖和N-乙酰神经氨酸的双支链型的N-型糖链的复合体聚集在肝脏内，特别是被摄入库普弗细胞中。因此，这些白蛋白-糖链复合体可用作用于检测肝脏、特别是检测库普弗细胞的生物成像探针、以及用于向肝脏、特别是向库普弗细胞内有选择地运送功能性分子的功能性分子用载体。另外，含有如式(e’)所示非还原末端为甘露糖的N-型糖链的复合体通过与库普弗细胞上的C-型凝集素的相互作用，而主要聚集在肝脏及脾脏内。因此，这些白蛋白-糖链复合体可用作用于检测肝脏及脾脏的生物成像探针、以及向肝脏及脾脏中有选择地运送功能性分子的功能性分子用载体。而且，含有如式(b’)所示非还原末端为α(2-3)唾液酸(具有唾液酸-半乳糖键)的N-型糖链的复合体通过与在癌细胞表面高度表达的选择素的相互作用，而聚集在癌细胞中。因此，在每1分子的白蛋白中至少1分子以上的N-型糖链为α(2-3)唾液酸糖链的白蛋白-糖链复合体可用作用于检测癌症的生物成像探针、以及用于向癌细胞内有选择地运送功能性分子的功能性分子用载体。此外，作为功能性分子，可以列举放射线治疗药剂、诊断药等。使用本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体作为功能性分子用载体时，功能性分子优选与白蛋白-糖链复合体中的N-型糖链以外的部分结合，更优选与白蛋白的赖氨酸残基以外的部分结合。
另外，本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体还可用作药品的有效成分。例如，使抗癌药与含有非还原末端为α(2-3)唾液酸的N-型糖链的白蛋白-糖链复合体中的白蛋白结合的产物可以作为用于治疗癌症的药品的有效成分。
在本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体中，通过糖链簇效果，更强调因糖链结构的不同而产生的生理活性的差异。因此，本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体还可用于分析糖链在生命现象中作为识别信号的功能。对动物给予含有标记物质的白蛋白-糖链复合体，再检测该标记物质，从而可以分析该白蛋白-糖链复合体在体内的动力学、例如排出路径等。例如，血液中的糖蛋白中，非还原末端不是唾液酸的脱唾液酸糖蛋白与存在于肝细胞表面的脱唾液酸糖蛋白受体(AGCR)结合而被摄入肝细胞内，而非还原末端为唾液酸的唾液酸蛋白虽然与AGCR结合，但其并没有被摄入肝细胞内。实际上已经明确：如后述的实施例所示，含有如式(a’)及(b’)所示非还原末端为酸性唾液酸的N-型糖链的白蛋白-糖链复合体经过代谢而经由肾脏从膀胱快速排出，但含有如式(c’)所示非还原末端为半乳糖的N-型糖链的白蛋白-糖链复合体经过肝脏、胆嚢进行肠道排泄。其他糖链对物质的排泄路径的影响也可以使用本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体同样地进行分析。
实施例
下面，给出实施例等以详细说明本发明。但本发明并不受下述记载的限定。
此外，以后的实验所使用的成分中，下述式(a)～(f)所表示的N-型糖链的叠氮化物衍生物均由株式会社糖链工学研究所按照Angew.Chem.Int.Ed.第49卷,第8195-8200页(2010)中记载的方法合成的，而下述式(1)所表示的醛化合物是按照Org.Biomol.Chem.第12卷,第1412-1418页(2014)所记载的方法合成的。
另外，在以后的实验中，反相HPLC使用具备C18柱(产品名称：5C18-AR-300、4.6×250mm、Nacalai Tesque公司制造)的高效液相色谱仪(装置名称：Prominence(注册商标)系统、岛津制作所制造)来进行。高分解能质谱(HRMS)是通过使用了质量分析仪(产品名称：micrOTOF-QIII(注册商标)分光计、Bruker公司制造)的ESI-TOF MS得到的。蛋白的质谱是通过使用了质量分析仪(产品名称：autoflex(注册商标)分光计、Bruker公司制造)的MALDI-TOF MS得到的。
[制造例1]HL750-HSA的合成
将3.4mg(48nmol)的人血清白蛋白(HSA、从SIGMA公司购入)溶解于300μL的PBS(磷酸缓冲生理盐水、pH7.4)中，在所得的HSA溶液中添加将0.25mg(0.19μmol)的近红外荧光色素HiLyte Fluor(注册商标)750acid SE(2×四乙铵盐)溶解于10μL的DMSO中而得到的溶液，调制反应液。将所得反应液在37℃下培养10分钟，使近红外荧光色素与HSA结合，之后通过Amicon(注册商标)10K(Merck Millipore公司制造)进行离心分离处理(15,000rpm、10分钟)。残余物再用磷酸缓冲液清洗3次。将得到的HL750-HSA(与近红外荧光色素结合了的HSA)溶解于800μL的超纯水中，以所得溶解液作为HL750-HSA储备溶液。通过MALDI-TOF MS进行分析时，所合成的HL750-HSA的平均质量为70.5kDa，每1分子结合有3.1分子的近红外荧光色素。
[实施例1]
合成了结合有式(a’)所表示的N-型糖链的HL750-HSA(2,6-HLF-HSA、以下有时称作“复合体2a”。)。
＜式(1a)所表示的醛化合物的合成＞
将1.24mg(0.50μmol)的具有式(a’)所表示的糖链的N-型糖链的叠氮化物衍生物(下述式(a)所表示的叠氮化物衍生物)(株式会社糖链工学研究所制作)溶解于139μL的DMSO中，在氮环境下向所得溶液中添加45μL(0.45μmol)的溶解于甲基氰中的10mM的式(1)所表示的醛化合物的溶液。将所得反应液在70℃下加热，通过HPLC检验反应物。在最初添加的醛化合物被消耗后，将反应液冷却至室温，得到了下述式(1a)所表示的醛化合物溶解于DMSO中的储备溶液(3.8mM)。所合成的式(1a)所表示的醛化合物可以通过ESI-TOF MS检测(C128H183N13O71[M-2H]-2/2的检测值：1518.0509、计算值：1518.0482)。
【化学式8】
＜复合体2a的合成＞
在通过制造例1合成的132μL(7.5nmol)的HL750-HSA储备溶液中混合132μL的水、66μL的DMSO、以及32μL(0.12μmol、16eq)的式(1a)所表示的醛化合物的储备溶液(3.8mM)，调制反应液。将所得反应液在大气环境下、在37℃下平稳地振荡一夜，同时进行培养以使之反应，合成了复合体2a。所得反应物通过Amicon 10K进行过滤处理，之后用水清洗3次。之后，将反应液用Durapore(注册商标)PVDF膜(0.45μm)进行过滤处理，之后用水稀释至150μL，调制了复合体2a溶液。通过MALDI-TOF MS进行分析时，所合成的复合体2a的平均质量为98.0kDa，每1分子结合有9.2分子的N-型糖链(式(1a)所表示的醛化合物)。
[实施例2]
合成了结合有式(b’)所表示的N-型糖链的HL750-HSA(2,3-HLF-HSA、以下有时称作“复合体2b”)。
＜式(1b)所表示的醛化合物的合成＞
将1.48mg(0.59μmol)的具有式(b’)所表示的糖链的N-型糖链的叠氮化物衍生物(下述式(b)所表示的叠氮化物衍生物)(株式会社糖链工学研究所制作)溶解于144μL的DMSO中，在氮环境下向所得溶液中添加54μL(0.54μmol)的溶解于甲基氰中的10mM的式(1)所表示的醛化合物的溶液。将所得反应液在70℃下加热，通过HPLC检验反应物。在最初添加的醛化合物被消耗后，将反应液冷却至室温，得到了下述式(1b)所表示的醛化合物溶解于DMSO中的储备溶液(3.8mM)。所合成的式(1b)所表示的醛化合物可以通过ESI-TOF MS来检测(C128H183N13O71[M-2H]-2/2的检测值：1518.0460、计算值：1518.0482)。
【化学式9】
＜复合体2b的合成＞
在通过制造例1合成的52.5μL(3.0nmol)的HL750-HSA储备溶液中混合52.5μL的水、26.2μL的DMSO、以及24μL(90nmol、30eq)的式(1b)所表示的醛化合物的储备溶液(3.8mM)，调制反应液。将所得反应液在大气环境下、在37℃下平稳地振荡一夜，同时进行培养以使之反应，合成了复合体2b。所得反应物通过Amicon 10K进行过滤处理，之后用水清洗3次。之后，将反应液通过Durapore PVDF膜(0.45μm)进行过滤处理，之后用水稀释至60μL，调制了复合体2b溶液。通过MALDI-TOF MS进行分析时，所合成的复合体2b的平均质量为102.1kDa，每1分子结合有10.5分子的N-型糖链(式(1b)所表示的醛化合物)。
[实施例3]
合成了结合有式(c’)所表示的N-型糖链的HL750-HSA(脱唾液酸-HLF-HSA、以下有时称作“复合体2c”)。
＜式(1c)所表示的醛化合物的储备溶液的调制＞
将1.09mg(0.57μmol)的具有式(c’)所表示的糖链的N-型糖链的叠氮化物衍生物(下述式(c)所表示的叠氮化物衍生物)(株式会社糖链工学研究所制作)溶解于139μL的DMSO中，在氮环境下向所得溶液中添加52μL(0.52μmol)的溶解于甲基氰的10mM的式(1)所表示的醛化合物的溶液。将所得反应液在70℃下加热，通过HPLC检验反应物。在最初添加的醛化合物被消耗后，将反应液冷却至室温，得到了下述式(1c)所表示的醛化合物溶解于DMSO中的储备溶液(3.8mM)。所合成的式(1c)所表示的醛化合物可以通过ESI-TOF MS进行检测(C106H147N11O55[M-2H]-2/2的检测值：1226.9545、计算值：1226.9527)。
【化学式10】
＜复合体2c的合成＞
将0.29mg(0.15μmol)的上述式(c)所表示的叠氮化物衍生物(株式会社糖链工学研究所制作)溶解于20μL的DMSO中，在氮环境下向所得溶液中添加30μL(0.15μmol)的溶解于甲基氰中的5mM的式(1)所表示的醛化合物的溶液。将所得反应液在70℃下加热，通过HPLC检验反应物。在最初添加的醛化合物被消耗后，将反应液冷却至室温，添加44μL的DMSO和88μL的水进行稀释。然后，添加88μL(5.0nmol)的通过制造例1合成的HL750-HSA储备溶液，充分混合，调制反应液。将所得反应液在大气环境下、在37℃下平稳地振荡一夜，同时进行培养以使之反应，合成了复合体2c。所得反应物通过Amicon 10K进行过滤处理，之后用水清洗3次。之后，将反应液用Durapore PVDF膜(0.45μm)进行过滤处理，之后用水稀释至100μL，调制了复合体2c溶液。通过MALDI-TOF MS进行分析时，所合成的复合体2c的平均质量为92.6kDa，每1分子结合有9.1分子的N-型糖链(式(1c)所表示的醛化合物。
[实施例4]
合成了结合有式(d’)所表示的N-型糖链的HL750-HSA(GlcNAc-HLF-HSA、以下有时称作“复合体2d”)。
＜式(1d)所表示的醛化合物的合成＞
将0.24mg(0.15μmol)的具有式(d’)所表示的糖链的N-型糖链的叠氮化物衍生物(下述式(d)所表示的叠氮化物衍生物)(株式会社糖链工学研究所制作)溶解于20μL的DMSO中，在氮环境下向所得溶液中添加30μL(0.15μmol)的溶解于甲基氰中的5mM的式(1)所表示的醛化合物的溶液。将所得反应液在70℃下加热，通过HPLC检验反应物。在最初添加的醛化合物被消耗后，将反应液冷却至室温，合成了下述式(1d)所表示的醛化合物。所合成的式(1d)所表示的醛化合物可以通过ESI-TOF MS进行检测(C94H129N11O45[M-2H]-2/2的检测值：1064.9041、计算值：1064.8999)。
【化学式11】
＜复合体2d的合成＞
然后，在冷却至室温的反应液中添加44μL的DMSO和88μL的水进行稀释。然后，添加88μL(5.0nmol)的通过制造例1合成的HL750-HSA储备溶液，充分混合，调制了反应液。将所得反应液在大气环境下、在37℃下平稳地振荡一夜，同时进行培养以使之反应，合成了复合体2d。将所得反应物通过Amicon 10K进行过滤处理，之后用水清洗3次。之后，将反应液通过Durapore PVDF膜(0.45μm)进行过滤处理，之后用水稀释至100μL，调制了复合体2d溶液。通过MALDI-TOF MS进行分析时，所合成的复合体2d的平均质量为91.9kDa，每1分子结合有10.1分子的N-型糖链(式(1d)所表示的醛化合物)。
[实施例5]
合成了结合有式(e’)所表示的N-型糖链的HL750-HSA(Man-HLF-HSA、以下有时称作“复合体2e”)。
＜式(1e)所表示的醛化合物的合成＞
将0.18mg(0.15μmol)的具有式(e’)所表示的糖链的N-型糖链的叠氮化物衍生物(下述式(e)所表示的叠氮化物衍生物)(株式会社糖链工学研究所制作)溶解于20μL的DMSO中，在氮环境下，向所得溶液中添加30μL(0.15μmol)的溶解于甲基氰中的5mM的式(1)所表示的醛化合物的溶液。将所得反应液在70℃下加热，通过HPLC检验反应物。在最初添加的醛化合物被消耗后，将反应液冷却至室温，合成了下述式(1e)所表示的醛化合物。所合成的式(1e)所表示的醛化合物可以通过ESI-TOF MS进行检测(C78H101N9O35[M-2H]-2/2的检测值：861.8176、计算值：861.8206)。
【化学式12】
＜复合体2e的合成＞
然后，在冷却至室温的反应液中添加44μL的DMSO和88μL的水进行稀释。然后，添加88μL(5.0nmol)的通过制造例1合成的HL750-HSA储备溶液，充分混合，调制了反应液。将所得反应液在大气环境下、在37℃下平稳地振荡一夜，同时进行培养以使之反应，合成了复合体2e。所得反应物通过Amicon10K进行过滤处理后，用水清洗3次。之后，将反应液用Durapore PVDF膜(0.45μm)进行过滤处理，之后用水稀释至100μL，调制了复合体2e溶液。通过MALDI-TOF MS进行分析时，所合成的复合体2e的平均质量为88.5kDa，每1分子结合有10.4分子的N-型糖链(式(1e)所表示的醛化合物)。
[实施例6]
合成了结合有式(f’)所表示的N-型糖链的HL750-HSA(Half-HLF-HSA、以下有时称作“复合体2f”)。
＜式(1f)所表示的醛化合物的合成＞
将0.28mg(0.15μmol)具有式(f’)所表示的糖链的N-型糖链的叠氮化物衍生物(下述式(f)所表示的叠氮化物衍生物)(株式会社糖链工学研究所制作)溶解于20μL的DMSO中，在氮环境下，向所得溶液中添加30μL(0.15μmol)的溶解于甲基氰中的5mM的式(1)所表示的醛化合物的溶液。将所得反应液在70℃下加热，通过HPLC检验反应物。在最初添加的醛化合物被消耗后，将反应液冷却至室温，合成了下述式(1f)所表示的醛化合物。所合成的式(1f)所表示的醛化合物可以通过ESI-TOF MS进行检测(C103H143N11O53[M-2H]-2/2的检测值：1189.9316、计算值：1189.9344)。
【化学式13】
＜复合体2f的合成＞
然后，在冷却至室温的反应液中添加44μL的DMSO和88μL的水进行稀释。然后，添加88μL(5.0nmol)的通过制造例1合成的HL750-HSA储备溶液，充分混合，调制了反应液。将所得反应液在大气环境下、在37℃下平稳地振荡一夜，同时进行培养以使之反应，合成了复合体2f。所得反应物通过Amicon 10K进行过滤处理，之后用水清洗3次。之后，将反应液用Durapore PVDF膜(0.45μm)进行过滤处理，之后用水稀释至100μL，调制了复合体2f溶液。通过MALDI-TOF MS进行分析时，所合成的复合体2f的平均质量为94.0kDa，每1分子结合有9.9分子的N-型糖链(式(1f)所表示的醛化合物)。
[实施例7]
合成了结合有式(a’)所表示的N-型糖链和式(c’)所表示的N-型糖链的HL750-HSA(Hetero3-HSA、以下有时称作“复合体2g”)。
在通过制造例1合成的175μL(10nmol)的HL750-HSA储备溶液中添加175μL的水和88μL的DMSO，向所得溶液中混合46.7μL(175nmol、17.5eq)的通过实施例1制造的式(1a)所表示的醛化合物的储备溶液(3.8mM)，调制了反应液。将所得反应液在大气环境下、在37℃下平稳地振荡一夜，同时进行培养以使之反应，合成了在HL750-HSA上结合有式(a’)所表示的N-型糖链的中间体。分取0.5μL该反应液，通过Amicon 10K进行纯化，用水清洗2次，之后通过MALDI-TOF MS进行分析时，所合成的中间体的平均质量为96.9kDa，每1分子结合有8.3分子的式(a’)所表示的N-型糖链(式(1a)所表示的醛化合物)。
然后，在剩余的44μL(1.0nmol)反应液中混合2.0μL(7.5nmol、7.5eq)通过实施例3制造的式(1c)所表示的醛化合物的储备溶液(3.8mM)，调制了反应液。将所得反应液在大气环境下、在37℃下平稳地振荡一夜，同时进行培养以使之反应，合成了在上述中间体上结合有式(c’)所表示的N-型糖链的复合体2g。所得反应物通过Amicon 10K进行过滤处理，之后用水清洗3次。之后，将反应液用Durapore PVDF膜(0.45μm)进行过滤处理，之后用水稀释，调制了复合体2g溶液(50μM)。通过MALDI-TOF MS进行分析时，所合成的复合体2g的平均质量为103.9kDa，每1分子结合有2.6分子的式(c’)所表示的N-型糖链(式(1c)所表示的醛化合物)。即，复合体2g是在白蛋白上以约8：2结合有式(a’)所表示的N-型糖链和式(c’)所表示的N-型糖链的异型白蛋白-糖链复合体。
[实施例8]
合成了结合有式(a’)所表示的N-型糖链和式(c’)所表示的N-型糖链的HL750-HSA(Hetero2-HSA、以下有时称作“复合体2h”)。
在通过制造例1合成的210μL(12nmol)的HL750-HSA储备溶液中添加210μL的水和105μL的DMSO，向所得溶液中混合43.4μL(163nmol、13.6eq)的通过实施例1制造的式(1a)所表示的醛化合物的储备溶液(3.8mM)，调制了反应液。将所得反应液在大气环境下、在37℃下平稳地振荡一夜，同时进行培养以使之反应，合成了在HL750-HSA上结合有式(a’)所表示的N-型糖链的中间体。分取0.5μL该反应液，通过Amicon 10K进行纯化，用水清洗2次，之后通过MALDI-TOF MS进行分析时，所合成的中间体的平均质量为87.1kDa，每1分子结合有5.3分子的式(a’)所表示的N-型糖链(式(1a)所表示的醛化合物)。
然后，向剩余反应液中的215μL(5.0nmol)中混合14.2μL(52nmol、10.4eq)的通过实施例3制造的式(1c)所表示的醛化合物的储备溶液(3.8mM)，调制了反应液。将所得反应液在大气环境下、在37℃下平稳地振荡一夜，同时进行培养以使之反应，合成了在上述中间体上结合有式(c’)所表示的N-型糖链的复合体2h。所得反应物通过Amicon 10K进行过滤处理后，用水清洗3次。之后，将反应液用Durapore PVDF膜(0.45μm)进行过滤处理，之后用水进行稀释，调制了复合体2h溶液(50μM)。通过MALDI-TOF MS进行分析时，所合成的复合体2h的平均质量为98.7kDa，每1分子结合有4.7分子的式(c’)所表示的N-型糖链(式(1c)所表示的醛化合物)。即，复合体2h是相对于白蛋白以约5：5结合有式(a’)所表示的N-型糖链和式(c’)所表示的N-型糖链的异型白蛋白-糖链复合体。
[实施例9]
合成了结合有式(a’)所表示的N-型糖链和式(c’)所表示的N-型糖链的HL750-HSA(Hetero1-HSA、以下有时称作“复合体2i”)。
在通过制造例1合成的175μL(10nmol)的HL750-HSA储备溶液中添加175μL的水和88μL的DMSO，向所得溶液中混合13.3μL(50nmol、5.0eq)的通过实施例1制造的式(1a)所表示的醛化合物的储备溶液(3.8mM)，调制了反应液。将所得反应液在大气环境下、在37℃下平稳地振荡一夜，同时进行培养以使之反应，合成了在HL750-HSA上结合有式(a’)所表示的N-型糖链的中间体。分取0.5μL该反应液，通过Amicon 10K进行纯化，用水清洗2次后，通过MALDI-TOF MS进行分析时，所合成的中间体的平均质量为78.9kDa，每1分子结合有2.8分子的式(a’)所表示的N-型糖链(式(1a)所表示的醛化合物)。
然后，在剩余反应液中的119μL(2.8nmol)中混合15.3μL(50nmol、20.9eq)的通过实施例3制造的式(1c)所表示的醛化合物的储备溶液(3.8mM)，调制了反应液。将所得反应液在大气环境下、在37℃下平稳地振荡一夜，同时进行培养以使之反应，合成了在上述中间体上结合有式(c’)所表示的N-型糖链的复合体2i。所得反应物通过Amicon 10K进行过滤处理，之后用水清洗3次。之后，将反应液用Durapore PVDF膜(0.45μm)进行过滤处理，之后用水稀释，调制了复合体2i溶液(50μM)。通过MALDI-TOF MS进行分析时，所合成的复合体2i的平均质量为97.2kDa，每1分子结合有6.3分子的式(c’)所表示的N-型糖链(式(1c)所表示的醛化合物)。即，复合体2i是相对于白蛋白以约3：7结合有式(a’)所表示的N-型糖链和式(c’)所表示的N-型糖链的异型白蛋白-糖链复合体。
[实施例10]
合成了结合有式(a’)所表示的N-型糖链和式(c’)所表示的N-型糖链的HL750-HSA(Hetero4-HSA、以下有时称作“复合体2j”)。
在通过制造例1合成的175μL(10nmol)的HL750-HSA储备溶液中添加175μL的水和88μL的DMSO，在所得溶液中混合43μL(16nmol、16eq)的通过实施例3制造的式(1c)所表示的醛化合物的储备溶液(3.8mM)，调制反应液。将所得反应液在大气环境下、在37℃下平稳地振荡一夜，同时进行培养以使之反应，合成了在HL750-HSA上结合有式(c’)所表示的N-型糖链的中间体。分取0.5μL的该反应液，通过Amicon 10K进行纯化，用水清洗2次，之后通过MALDI-TOF MS进行分析时，所合成的中间体的平均质量为83.5kDa，每1分子结合有5.2分子的式(c’)所表示的N-型糖链(式(1c)所表示的醛化合物)。
然后，在剩余反应液中的88μL(2.0nmol)中混合4.3μL(16nmol、8.0eq)的通过实施例1制造的式(1a)所表示的醛化合物的储备溶液(3.8mM)，调制了反应液。将所得反应液在大气环境下、在37℃下平稳地振荡一夜，同时进行培养以使之反应，合成了在上述中间体上结合有式(a’)所表示的N-型糖链的复合体2j。所得反应物通过Amicon 10K进行过滤处理，之后用水清洗3次。之后，将反应液用Durapore PVDF膜(0.45μm)进行过滤处理，之后用水稀释，调制了复合体2j溶液(50μM)。通过MALDI-TOF MS进行分析时，所合成的复合体2j的平均质量为97.6kDa，每1分子结合有4.7分子的式(a’)所表示的N-型糖链(式(1a)所表示的醛化合物)。即，复合体2j是相对于白蛋白以约5：5结合有式(a’)所表示的N-型糖链和式(c’)所表示的N-型糖链的异型白蛋白-糖链复合体。
[试验例1]
通过检测由HL750发出的近红外荧光，非侵袭性地研究了对小鼠给予实施例1～6中制造的白蛋白-糖链复合体时的动力学。
＜生物成像图像的获取＞
首先，在30μL(1.5nmol)的各白蛋白-糖链复合体溶液或通过制造例1合成的HL750-HSA中添加70μL生理盐水进行稀释，调制注射用溶液。将该注射用溶液注入到8～12周龄的雌性BALB/c裸小鼠(BALB/cAJcl-nu/nu小鼠)的尾静脉(n＝4)。注射后的小鼠用戊巴比妥进行麻醉，之后在生物体荧光成像装置IVIS(注册商标)动力学荧光成像仪(CaliperLife Sciences公司制造)中静置，在给予白蛋白-糖链复合体后的3小时期间每隔30分钟获取个体整体的荧光图像。所获取的荧光图像是从710nm的激发光图像中去除了背景荧光(640nm激发光)后的图像。
＜尿中排泄量＞
在所获得的荧光图像中，测定膀胱及其周围的任意所关心区域的荧光强度，根据膀胱及其周围的荧光强度的增加，通过半定量分析测定各白蛋白-糖链复合体和HL750-HSA的尿中排泄量(荧光强度值[count])。图中的尿中排泄量显示从刚刚给药后到3小时后每单位时间排泄到膀胱中的平均值。
＜各组织中蓄积的白蛋白-糖链复合体的荧光强度＞
自给予白蛋白-糖链复合体起经过3小时后从小鼠中切除小肠，测定胆嚢和小肠的荧光强度，测定白蛋白-糖链复合体的蓄积量(荧光强度值[count])。
另外，自给予白蛋白-糖链复合体起经过3小时后从小鼠中切除肝脏和脾脏，测定荧光强度，测定白蛋白-糖链复合体的蓄积量(荧光强度值[count])。
＜测定结果＞
图2(A)～(D)分别显示注射了HL750-HSA、复合体2a、复合体2b和复合体2c的各小鼠在给药后经过0.5～3小时的时间点的小鼠个体的荧光图像。由该结果可知：未导入糖链的HL750-HSA即使在给药后经过3小时的时间点也会通过血管内而扩散至小鼠的整个体内。相对于此，每1分子的白蛋白导入有10分子左右的非还原末端为酸性唾液酸的糖链的复合体2a和复合体2b确认在肾脏和膀胱中蓄积，被快速排泄到尿中。另外，在给予了复合体2a的小鼠和给予了复合体2b的小鼠中，小鼠个体整体的荧光强度逐渐减低，从给药起经过12小时的时间点几乎检测不到荧光强度(结果没有图示)。另外，同样对小鼠给予在每1分子的白蛋白上结合有1.8分子的式(a’)所表示的N-型糖链的HL750-HSA(2,6-few-HLF-HSA、以下有时称作“复合体2SIa”)时，未导入糖链的HL750-HAS即使在给药后经过3小时的时间点也会通过血管内而扩散至小鼠的几乎整个体内(结果没有图示)。另一方面，每1分子的白蛋白导入有10分子左右的非还原末端不是唾液酸的脱唾液酸糖链的复合体2c不在肾脏及膀胱中蓄积，而是观察到其在肠中蓄积，经过肝脏及胆嚢排出到肠道。
图3(A)显示各小鼠的白蛋白-糖链复合体或HL750-HSA的尿中排泄量的测定结果。其结果，HL750-HSA从肾脏和膀胱排出的量最多。另外，与复合体2b相比，复合体2a的尿中排泄量多、且在尿中的排出速度快。
图3(B)显示自给药起经过3小时的时间点各小鼠胆嚢的荧光强度的测定结果，图3(C)分别显示自给药起经过3小时的时间点各小鼠小肠的荧光强度的测定结果。其结果，在给予了复合体2c的小鼠中，确认到胆嚢和小肠的荧光强度非常高，复合体2c与肝细胞表面的AGCR结合，经由肝脏及胆嚢进行肠道排泄。另外，复合体2a和复合体2b几乎没有进行肠道排泄，而是有选择地从膀胱排出。
图4(A)～(C)分别显示注射了复合体2d、复合体2e和复合体2f的各小鼠在给药后经过0.5～3小时的时间点小鼠个体的荧光图像。如图所示，确认到这些复合体主要在肝脏及脾脏中蓄积。
图5(A)显示在给予各复合体后经过3小时的时间点从小鼠个体中切除的肝脏和脾脏的荧光图像。另外，图5(B)显示自给药起经过3小时的时间点各小鼠肝脏的荧光强度的测定结果，图5(C)显示自给药起经过3小时的时间点各小鼠脾脏的荧光强度的测定结果。其结果，与给予了复合体2a的小鼠相比，给予了复合体2d、复合体2e和复合体2f的小鼠的肝脏和脾脏的荧光强度都非常高，这些白蛋白-糖链复合体有选择地聚集在肝脏和脾脏中。
为了研究复合体2d、复合体2e和复合体2f聚集在肝脏的哪个部分，将从小鼠中切除的肝脏进行组织染色。具体而言，将从小鼠中切除的肝脏在4％PFA溶液中、在4℃下浸泡24小时将其固定，之后在含有15％蔗糖的PBS中、在4℃下浸泡24小时，然后在含有30％蔗糖的PBS中、在4℃下浸泡24小时。将已固定的肝脏在OCT compound(注册商标)中、在-78℃下冷冻，之后制作6～8μm的切片。将这些切片在封闭缓冲液(含有3％BSA、10％山羊血清和0.1M的甘氨酸的PBST缓冲液)中培养30分钟，之后在作为一次抗体液的大鼠抗结蛋白抗体(产品编号：RB-9014、Thermo Fisher Scientific公司制造)的300倍稀释液、大鼠抗LYVE-1抗体(产品编号：ab14917、abcam公司制造)的200倍稀释液、或大鼠抗F4/80抗体(产品编号：MCA497GA、AbD serotec公司制造)的200倍稀释液中浸泡，在4℃下培养一夜，然后在作为二次抗体液的含有Alexa Fluor 488标记抗大鼠IgG抗体和Alexa Fluor 555标记抗大鼠IgG抗体两者的200倍稀释液中浸泡，在室温下培养2小时。之后将这些切片进一步在Hoechst33258的2500倍稀释液(同仁化学研究所公司制造)中浸泡，在室温下培养10分钟，之后用承载液(产品名称：Fluoromount(注册商标)、Diagnostic BioSystems公司制造)将其承载于载玻片上。将载有切片的载玻片在荧光显微镜(产品名称：BZ-X710All-in-oneFluorescence Microscope(注册商标)、Keyence公司制造)下进行观察。
其结果，复合体2d和复合体2f被摄入到了肝脏中的非实质细胞中、而没有摄入到实质细胞中。组织染色的结果，将星细胞特异性染色的抗结蛋白抗体和将肝窦内皮细胞特异性染色的抗LYVE-1抗体经常与复合体2d共存，而将库普弗细胞特异性染色的抗F4/80抗体几乎不与复合体2d共存。上述结果暗示：复合体2d通过与结蛋白及波形蛋白的相互作用，有可能被特异性地摄入到已活化的星细胞中。
另外，复合体2f也和复合体2d一样，经常与抗结蛋白抗体和抗LYVE-1抗体共存，由此暗示复合体2f也有可能被特异性地摄入星细胞中。另一方面，复合体2e经常与抗F4/80抗体共存，暗示其有可能被特异性地摄入库普弗细胞中。
如上所述，根据物质表面的糖链的种类，该物质在生物体内的排出机制、以及在生物体内的蓄积部位会发生变化，这无法使用现有的生物成像探针来进行分析，通过以使用白蛋白作为结合糖链的蛋白、并且每1分子结合有多个糖链的本发明所涉及的白蛋白-糖链复合体作为生物成像探针，首次阐明了上述现象。
[试验例2]
在试验例2中，由于复合体2a主要从肾脏排泄、而复合体2c主要从肠道排出，因此使用以各种比例具有构成复合体2a的N-型糖链(式(1a))和构成复合体2c的N-型糖链(式(1c))的异型复合体，研究了糖链的存在比和对排出路径的影响。
具体而言，对于实施例1、3、7～9中制造的复合体2a、2c、2g～2j，与试验例1相同地对小鼠进行给药，之后在给药后3小时期间每隔30分钟获取小鼠个体整体的荧光图像。并且，与试验例1相同地研究了各复合体的尿中排泄量、以及在胆嚢和小肠中的蓄积量。此外，各复合体中的糖链的存在比(摩尔比)见表1。
【表1】
式(1a)的糖链 式(1c)的糖链
复合体2a 10 0
复合体2g 8 2
复合体2h 5 5
复合体2i 3 7
复合体2c 0 10
复合体2j 5 5
图6(A)显示各小鼠的白蛋白-糖链复合体的尿中排泄量的测定结果，图6(B)显示自给药起经过3小时的时间点各小鼠胆嚢的荧光强度的测定结果，图6(C)显示在给药后经过3小时的时间点各小鼠小肠的荧光强度的测定结果。其结果，观察到了下述趋势：非还原末端不是唾液酸的式(1c)的糖链的存在比越高，则复合体的排出路径越从肾脏向胆嚢和小肠肠道偏移。由上述结果可知：根据物质表面的糖链的种类、特别是非还原末端是否为唾液酸，会影响到物质在生物体内的排出路径，因此在对生物体给予物质时，通过调节物质表面的糖链，能够控制该物质的动力学。
此外，虽然复合体2h和复合体2j均以1：1(摩尔比)含有式(1a)的糖链和式(1c)的糖链，但却存在着如下的差异：复合体2h容易从肾脏排出，而复合体2j容易从小肠排出。这暗示了：由于对白蛋白进行糖链修饰的顺序不同，所以使哪个糖链与白蛋白分子表面的任一个赖氨酸残基连接较为重要。
[试验例3]
α(2-3)唾液酸蛋白通过与促胰液素的相互作用，被特异性地摄入到癌细胞中。
因此，对移植了来自癌细胞的培养株A431细胞的癌症模型小鼠给予实施例2中制造的复合体2b，观察其在个体内的动力学。
对于8周龄的雌性BALB/c裸小鼠，在其右肩附近移植3×106个A431细胞，之后以经过了2周的小鼠作为癌症模型。进行与试验例1相同的操作，对该癌症模型小鼠进行给药，之后在给药后5小时期间每隔30分钟获取小鼠个体整个的荧光图像。
图7显示注射了复合体2b的各小鼠在给药后经过1小时的时间点小鼠个体的荧光图像。图中箭头所示的部分是移植了A431细胞的位置。复合体2b在给药后用1小时被快速摄入到A431细胞中。另外，复合体2b在给药后用5小时几乎都已排泄(没有图示)。

Claims (11)

1.一种白蛋白-糖链复合体，其特征在于：每1分子的白蛋白结合有5分子或多于5分子的天冬酰胺结合型糖链。
2.根据权利要求1所述的白蛋白-糖链复合体，其中，所述天冬酰胺结合型糖链的非还原末端的糖包含选自N-乙酰葡糖胺、半乳糖、甘露糖和唾液酸的糖。
3.根据权利要求1或2所述的白蛋白-糖链复合体，其中，所述天冬酰胺结合型糖链为选自下述式(a’)～(f’)的一种或多于一种的糖链：
【化学式1】
(a')
(b')
(c')
(d')
(e')
(f')
在上述式中，Neu5Ac是指N-乙酰神经氨酸，Gal是指半乳糖，GlcNAc是指N-乙酰葡糖胺，Man是指甘露糖。
4.根据权利要求1或2所述的白蛋白-糖链复合体，其中，天冬酰胺结合型糖链连接在白蛋白的赖氨酸残基上。
5.一种功能性分子用载体，是用于在生物体内向靶组织有选择地运送功能性分子的载体，其包含权利要求1或2所述的白蛋白-糖链复合体。
6.一种功能性分子用载体，是用于在生物体内向靶组织有选择地运送功能性分子的载体，所述靶组织为肝脏的星细胞，该功能性分子用载体包含权利要求1或2所述的白蛋白-糖链复合体，所述天冬酰胺结合型糖链的非还原末端为N-乙酰葡糖胺。
7.一种功能性分子用载体，是用于在生物体内向靶组织有选择地运送功能性分子的载体，所述靶组织为肝脏的库普弗细胞，该功能性分子用载体包含权利要求1或2所述的白蛋白-糖链复合体，所述天冬酰胺结合型糖链的非还原末端为甘露糖和N-乙酰神经氨酸的双支链型。
8.一种功能性分子用载体，是用于在生物体内向靶组织有选择地运送功能性分子的载体，所述靶组织为肝脏或脾脏，该功能性分子用载体包含权利要求1或2所述的白蛋白-糖链复合体，所述天冬酰胺结合型糖链的非还原末端为甘露糖。
9.一种功能性分子用载体，是用于在生物体内向靶组织有选择地运送功能性分子的载体，所述靶组织为癌细胞，该功能性分子用载体包含权利要求1或2所述的白蛋白-糖链复合体，所述天冬酰胺结合型糖链的非还原末端为α(2-3)唾液酸。
10.根据权利要求5所述的功能性分子用载体，其中，所述功能性分子为荧光物质或药剂。
11.一种生物成像探针，其特征在于：以权利要求1或2所述的白蛋白-糖链复合体作为有效成分，对动物的生物体内进行给药。
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