TWI757238B - 白蛋白-糖鏈複合物 - Google Patents
白蛋白-糖鏈複合物 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI757238B TWI757238B TW105120821A TW105120821A TWI757238B TW I757238 B TWI757238 B TW I757238B TW 105120821 A TW105120821 A TW 105120821A TW 105120821 A TW105120821 A TW 105120821A TW I757238 B TWI757238 B TW I757238B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- sugar chain
- albumin
- complex
- formula
- sugar
- Prior art date
Links
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims abstract description 194
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims abstract description 58
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 15
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 14
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 44
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 23
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 22
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 18
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims description 14
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 13
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 claims description 13
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 12
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 claims description 11
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 9
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 claims description 8
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 claims description 8
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 claims description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 4
- 125000001140 1,4-phenylene group Chemical group [H]C1=C([H])C([*:2])=C([H])C([H])=C1[*:1] 0.000 claims description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 claims description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 3
- 210000004024 hepatic stellate cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000002030 1,2-phenylene group Chemical group [H]C1=C([H])C([*:1])=C([*:2])C([H])=C1[H] 0.000 claims 1
- SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N N-acetylneuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N 0.000 claims 1
- 238000012984 biological imaging Methods 0.000 claims 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 108
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 75
- -1 sialic acid group sugars Chemical class 0.000 description 71
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 50
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 27
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 25
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 11
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 11
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 10
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 10
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 10
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 10
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 10
- 238000001425 electrospray ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 7
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 7
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 210000004500 stellate cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 230000036325 urinary excretion Effects 0.000 description 6
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 5
- 238000012650 click reaction Methods 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 5
- DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N 1,1-Diethoxyethane Chemical compound CCOC(C)OCC DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000005427 Asialoglycoprotein Receptor Human genes 0.000 description 4
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 108010006523 asialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 4
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 4
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 3
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 description 3
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 description 3
- 229930185229 antidesmin Natural products 0.000 description 3
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 0.000 description 2
- IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 555 Chemical compound C=12C=CC(=N)C(S(O)(=O)=O)=C2OC2=C(S(O)(=O)=O)C(N)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 2
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 2
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 2
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 2
- SRVFFFJZQVENJC-IHRRRGAJSA-N aloxistatin Chemical compound CCOC(=O)[C@H]1O[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCCC(C)C SRVFFFJZQVENJC-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- IAJILQKETJEXLJ-LECHCGJUSA-N iduronic acid Chemical compound O=C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-LECHCGJUSA-N 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 125000002960 margaryl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 2
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 2
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 2
- AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N prometryn Chemical compound CSC1=NC(NC(C)C)=NC(NC(C)C)=N1 AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FVSKHRXBFJPNKK-UHFFFAOYSA-N propionitrile Chemical compound CCC#N FVSKHRXBFJPNKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKLXBIHSGMPUQS-FGZHOGPDSA-M (3r,5r)-7-[4-(4-fluorophenyl)-2,5-dimethyl-1-phenylpyrrol-3-yl]-3,5-dihydroxyheptanoate Chemical compound CC1=C(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O)C(C=2C=CC(F)=CC=2)=C(C)N1C1=CC=CC=C1 QKLXBIHSGMPUQS-FGZHOGPDSA-M 0.000 description 1
- RMMFBFFGGLOIKT-UHFFFAOYSA-N 1,2,5,8-tetrazecane Chemical compound C1CNCCNNCCN1 RMMFBFFGGLOIKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VXNZUUAINFGPBY-UHFFFAOYSA-N 1-Butene Chemical group CCC=C VXNZUUAINFGPBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000012116 Alexa Fluor 680 Substances 0.000 description 1
- 239000012119 Alexa Fluor 790 Substances 0.000 description 1
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000003930 C-Type Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090000342 C-Type Lectins Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 239000005632 Capric acid (CAS 334-48-5) Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N Isobutene Chemical group CC(C)=C VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- GSEPLROQTBZUOO-UHFFFAOYSA-N N#[C-].C1=CC=C2NC=CC2=C1 Chemical group N#[C-].C1=CC=C2NC=CC2=C1 GSEPLROQTBZUOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- FDJKUWYYUZCUJX-AJKRCSPLSA-N N-glycoloyl-beta-neuraminic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@](O)(C(O)=O)C[C@H](O)[C@H]1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-AJKRCSPLSA-N 0.000 description 1
- FDJKUWYYUZCUJX-PGIATKPXSA-N N-glycoloylneuraminic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1OC(O)(C(O)=O)C[C@H](O)[C@H]1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-PGIATKPXSA-N 0.000 description 1
- FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N N-glycolyl-beta-neuraminic acid Natural products OCC(O)C(O)C1OC(O)(C(O)=O)CC(O)C1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 108010032838 Sialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007365 Sialoglycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N Tetraxetan Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- YLEIFZAVNWDOBM-ZTNXSLBXSA-N ac1l9hc7 Chemical compound C([C@H]12)C[C@@H](C([C@@H](O)CC3)(C)C)[C@@]43C[C@@]14CC[C@@]1(C)[C@@]2(C)C[C@@H]2O[C@]3(O)[C@H](O)C(C)(C)O[C@@H]3[C@@H](C)[C@H]12 YLEIFZAVNWDOBM-ZTNXSLBXSA-N 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- CREXVNNSNOKDHW-UHFFFAOYSA-N azaniumylideneazanide Chemical group N[N] CREXVNNSNOKDHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 229960001506 brilliant green Drugs 0.000 description 1
- HXCILVUBKWANLN-UHFFFAOYSA-N brilliant green cation Chemical compound C1=CC(N(CC)CC)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](CC)CC)C=C1 HXCILVUBKWANLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000219 ethylidene group Chemical group [H]C(=[*])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005161 hepatic lobe Anatomy 0.000 description 1
- 125000004836 hexamethylene group Chemical group [H]C([H])([*:2])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[*:1] 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229960004657 indocyanine green Drugs 0.000 description 1
- MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M indocyanine green Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCCCN1C2=CC=C3C=CC=CC3=C2C(C)(C)C1=CC=CC=CC=CC1=[N+](CCCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=C(C=CC=C3)C3=C2C1(C)C MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000654 isopropylidene group Chemical group C(C)(C)=* 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- MYGMBVDLWDZOIL-UHFFFAOYSA-N methane;cyanide Chemical compound C.N#[C-] MYGMBVDLWDZOIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 125000002958 pentadecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000004817 pentamethylene group Chemical group [H]C([H])([*:2])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[*:1] 0.000 description 1
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical class [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 125000002889 tridecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 125000002948 undecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
- A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
- A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本發明之目的在於提供一種白蛋白-糖鏈複合物,其結合有適得糖鏈群聚效應之充分數量的糖鏈,且可在活體內較穩定地存在。本發明提供一種白蛋白-糖鏈複合物,其特徵在於天門冬醯胺結合型糖鏈是在每1分子白蛋白結合有5分子以上;一種機能性分子用載體,其是用以在活體內將機能性分子選擇性地送達目標組織,且含有前述記載之白蛋白-糖鏈複合物;一種生物顯影探針,其特徵在於是以前述記載之白蛋白-糖鏈複合物為有效成分,且投予至動物活體內。
Description
本案主張於2015年6月30日提出申請之日本特願2015-132002專利申請案為基礎的優先權。本案透過參照該基礎申請案之內容及所引用之文獻內容,而將該等納入本案之中。
本發明有關於一種白蛋白-糖鏈複合物,其在活體內可穩定存在,且1分子便可發揮糖鏈群聚效應(cluster effect)。
天門冬醯胺結合型糖鏈(以下有時略稱為「N-型糖鏈」。)是由在天門冬醯胺(Asn)側鏈之醯胺基氮原子上結合有糖鏈之結構所構成,根據構成糖鏈之單糖類(單糖或其衍生物)之種類、序列或分支的有無等,而有多種多樣的結構。N-型糖鏈透過與蛋白質或脂質等其他分子相互作用,而深入參與免疫反應調節、細胞增殖、癌化或癌細胞轉移等各式各樣生物學上的機能,甚至亦有助於蛋白質在活體內之穩定性。此N-型糖鏈機能由於可期待應用於用以診斷或治療之醫藥品,因此N-型糖鏈在活體內之動態分析是正
在進行當中。N-型糖鏈與蛋白質等的相互作用主要是依賴糖鏈構造,因此,就分析N-型糖鏈機能之方法而言,可進行如下方法:使具有特定糖鏈構造之N-型糖鏈結合到白蛋白等蛋白質上的糖蛋白質,將該糖蛋白質投予至動物,並進行動態分析或分析有無積蓄至組織(例如,參照非專利文獻1或2。)。又,對具特定糖鏈構造之N-型糖鏈的糖蛋白質進一步導入螢光物質,並將動物之體內動態進行生物顯影(bioimaging)分析等,藉此亦可進行非侵害性的調查(例如,參照非專利文獻3。)。
1股糖鏈與蛋白質之相互作用雖弱,然透過累積糖鏈,能發揮出強相互作用(糖鏈群聚效應)。因此,用於分析N-型糖鏈之機能的糖蛋白質宜在每1分子蛋白質盡可能結合多數N-型糖鏈以獲得糖鏈群聚效應。
本案發明人等報告,至今已合成在聚離胺酸骨架上每1分子導入4~16分子之N-型糖鏈,且進一步在末端有螢光物質修飾之糖鏈簇(sugar chain cluster),並進行了將其投予於動物之動態分析(非專利文獻4參照。)。由於糖鏈龐大,羥基亦多,因此以往要增加每1分子蛋白質之糖鏈的結合分子數是非常困難的。
專利文獻1:國際公開第2008/096760號
專利文獻2:日本特開2015-030702號公報
非專利文獻1:Andre, et al., Bioconjugate Chemistry, 1997, Vol. 8, p.845-855
非專利文獻2:Unverzagt, et al., Journal of Medicinal Chemistry, 2002, Vol.45, p.478-491
非專利文獻3:Ogura, et al., Glycoconjugate Journal, 2014, Vol. 31, p.273-279
非專利文獻4:Tanaka, et al., Angewandte Chemie International Edition, 2010, Vol. 49,p.8195-8200
在聚離胺酸上每1分子導入有16分子N-型糖鏈之糖鏈簇若投予至活體,會容易被分解。又,實際上使用做為用以對人類診斷或治療之醫藥品時,則更是希望盡可能使用天然蛋白質。
本發明之目的在於提供一種白蛋白-糖鏈複合物,其結合有盡可能可獲得糖鏈群聚效應之充分數量的糖鏈,且可在活體內較穩定的存在。
本案發明人等為解決前述課題而全心研究,結果發現下述者,進而完成本發明:白蛋白具有許多適合糖鏈修飾之離胺酸殘基,且經糖鏈修飾者亦可在活體內較穩定的存在;透過利用新開發之RIKEN-CLICK反應(共軛亞胺之6π-氮雜電子環狀反應(aza electrocyclic reaction))(參照專利
文獻1、2。),每1分子白蛋可導入多數的N-型糖鏈。
亦即,有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物、機能性分子用載體及生物顯影探針如下述[1]~[12]。
[1]一種白蛋白-糖鏈複合物,特徵在於天門冬醯胺結合型糖鏈是在每1分子白蛋白結合有5分子以上。
[2]如前述[1]之白蛋白-糖鏈複合物,其中前述天門冬醯胺結合型糖鏈之非還原末端的糖包含選自於由N-乙醯葡萄糖胺、半乳糖、甘露糖及唾液酸所構成群組之糖。
[3]如前述[1]或[2]之白蛋白-糖鏈複合物,其中前述天門冬醯胺結合型糖鏈是選自於由下述式(a’)~(f’)所構成群組之1種以上。
[前述式中Neu5Ac意指N-乙醯神經氨酸、Gal意指半乳糖、GlcNAc意指N-乙醯葡萄糖胺、Man意指甘露糖。]
[4]如前述[1]~[3]之任一項之白蛋白-糖鏈複合物,其中天門冬醯胺結合型糖鏈是連結在白蛋白之離胺酸殘基上。
[5]一種機能性分子用載體,是用以在活體內將機能性分子選擇性地送達目標組織,且含有如前述[1]~[4]之任一項的白蛋白-糖鏈複合物。
[6]一種機能性分子用載體,是用以在活體內將機能性分子選擇性地送達目標組織,其中,前述目標組織為肝臓之星狀細胞,且含有如前述[1]或[2]之白蛋白-糖鏈複合物,前述天門冬醯胺結合型糖鏈之非還原末端為N-乙醯葡萄糖胺。
[7]一種機能性分子用載體,是用以在活體內將機能性分子選擇性地送達目標組織,其中,前述目標組織為肝臓之庫佛氏細胞,且含有如前述[1]或[2]之白蛋白-糖鏈複合物,前述天門冬醯胺結合型糖鏈之非還原末端為甘露糖與N-乙醯神經氨酸之2分支型。
[8]一種機能性分子用載體,是用以在活體內將機能性分子選擇性地送達目標組織,其中,前述目標組織為肝臓或脾臓,且含有如前述[1]或[2]之白蛋白-糖鏈複合物,前述天門冬醯胺結合型糖鏈之非還原末端為甘露糖。
[9]一種機能性分子用載體,是用以在活體內將機能性分子選擇性地送達目標組織,其中,前述目標組織為癌細胞,且含有如前述[1]或[2]之白蛋白-糖鏈複合物,前述天門
冬醯胺結合型糖鏈之非還原末端為α(2-3)唾液酸。
[10]如前述[5]~[9]之任一項的機能性分子用載體,其中前述機能性分子為螢光物質或藥劑。
[11]一種生物顯影探針,特徵在於是以如前述[1]~[4]之任一項的白蛋白-糖鏈複合物為有效成分,且可投予至動物活體內。
有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物在活體內可較穩定的存在,且可發揮糖鏈群聚效應,與蛋白質等其他活體分子之相互作用強。因此,該白蛋白-糖鏈複合物作為N-型糖鏈之機能分析工具是有用的,進一步,作為將機能性分子送達特定細胞或組織之機能性分子用載體、標識特定細胞或組織之生物顯影探針,或者作為以特定細胞等為目標之醫藥品的有效成分,亦有用。
圖1是以式(a’)~(f’)所示2分支型糖鏈的示意圖。
圖2是在試驗例1中,投予了HL750-HSA之小鼠(A)、投予了複合物2a之小鼠(B)、投予了複合物2b之小鼠(C)及投予了複合物2c之小鼠(D),在投予後0.5~3小時之經過時間點之小鼠個體的螢光圖像。
圖3是顯示以下測定結果之圖:在試驗例1中,各小鼠之白蛋白-糖鏈複合物或HL750-HSA之尿中排泄量的測定結果(A)、各小鼠自投予白蛋白-糖鏈複合物起3小時之經過時間點時膽囊之螢光強度的測定結果(B),及各小鼠自投予
白蛋白-糖鏈複合物起3小時之經過時間點時小腸之螢光強度的測定結果(C)。
圖4是在試驗例1中,投予了複合物2d之小鼠(A)、投予了複合物2e之小鼠(B),及投予了複合物2f之小鼠(C),在投予後0.5~3小時之經過時間點之小鼠個體的螢光圖像。
圖5是在試驗例1中,在投予各複合物後3小時之經過時間點,從小鼠個體切除出之肝臓與脾臓的螢光圖像(A)、顯示肝臓螢光強度之測定結果的圖(B),及顯示脾臓螢光強度之測定結果的圖(C)。
圖6是顯示以下測定結果之圖:在試驗例2中,各小鼠之白蛋白-糖鏈複合物之尿中排泄量的測定結果(A)、各小鼠自投予白蛋白-糖鏈複合物起3小時之經過時間點時膽囊之螢光強度的測定結果(B),及各小鼠自投予白蛋白-糖鏈複合物起3小時之經過時間點時小腸之螢光強度的測定結果(C)。
圖7是在試驗例3中,投予了複合物2b之小鼠在投予後1小時之經過時間點之小鼠個體的螢光圖像。
有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物,其特徵在於,N-型糖鏈是每1分子白蛋白結合5分子以上。使在1分子白蛋白結合有1分子糖鏈之糖鏈複合物,該糖鏈與蛋白質等其他分子之相互作用小、反應性低。相對於此,有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物每1分子具有5分子以上之N-型
糖鏈,僅1分子即可充分發揮糖鏈群聚效應,且糖鏈與特定活體分子之相互作用強。有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物宜每1分子白蛋白具有9分子以上之N-型糖鏈。N-型糖鏈之數量上限並無特別限定,然N-型糖鏈之數量可設為例如30分子以下,且宜為20分子以下,以15分子以下為佳、以11分子以下更佳。
有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物是使用白蛋白做為結合N-型糖鏈之蛋白質。N-型糖鏈是連結於白蛋白之離胺酸殘基。白蛋白在活體內之穩定性優異,且存在多數適於糖鏈修飾之離胺酸殘基。例如,在人類血清白蛋白上,每1分子存在60個左右的離胺酸殘基,且推測其中可糖鏈修飾之離胺酸殘基有10~30個。除此之外,亦有即便在經糖鏈修飾之情況下,仍難以獲得抗原性,且在活體內難以作為異物被代謝之優點。
構成有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物的白蛋白,可為自動物純化之天然型蛋白質,亦可為重組物。又,可皆為動物本來所具有之野生型白蛋白,且在野生型白蛋白之中,亦可為離胺酸殘基以外之1或數個胺基酸有欠失、取代或附加之突變型白蛋白。
構成有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物的白蛋白宜為血清白蛋白,且以源自哺乳動物之血清白蛋白為佳。該哺乳動物宜為人類、小鼠、大鼠、兔子、天竺鼠、倉鼠、猴子、羊、馬、牛、豬、驢、狗或貓等家畜,或者實驗動物,且以人類特別為佳。
構成有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物的N-型糖鏈可僅為1種,亦可為2種以上。又,構成1分子N-型糖鏈之糖類,若為可藉糖苷鍵來形成鏈狀態結構之單糖類(單糖或其衍生物),則無特別限定,可為僅由1種單糖類構成之糖鏈,亦可為由2種以上單糖類構成之糖鏈。該單糖類可舉例如葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、海藻糖(Fuc)、木糖(Xyl)、葡糖醛酸(GlcA)、艾杜糖醛酸(IdoA)、N-乙醯神經氨酸(Neu5Ac)、N-羥基乙醯神經氨酸(Neu5Gc)、去胺基神經氨酸(KDN;2-酮-3-去氧-D-甘油-D-半乳糖-癸酸),及該等之衍生物等。
糖苷鍵之形態並無特別限定,可為α 1,4鍵、α 1,6鍵、α 2,3鍵、α 2,6鍵、β 1,2鍵、β 1,4鍵等。
構成有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物的N-型糖鏈宜具有*-Man-GlcNAc-GlcNAc-**(**表示白蛋白結合側。)之共通序列。
在有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物中,結合在1分子白蛋白之N-型糖鏈在糖鏈部分可為直鏈狀,亦可為分支鏈狀。構成有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物的糖鏈宜為在動物體內存在較多之2分支型糖鏈,且宜為選自由於圖1所示式(a’)~(f’)所構成群組之1種以上。此外,式(a’)~(f’)之糖鏈是以人類為首在動物活體內存在許多之糖鏈。
例如,透過利用專利文獻1、2記載之化合物,可使每1分子白蛋白連結5分子以上之N-型糖鏈。具體而言,下述通式(I-0)所表含有N-型糖鏈之醛化合物,可藉由下述反應,連結到白蛋白之離胺酸殘基上。將該反應對白蛋白表面之至少5個離胺酸殘基側鏈進行。如此合成之白蛋白-糖鏈複合物在每1分子白蛋白具有5個以上下述通式(I)之結構。
通式(I)及通式(I-0)中,A1表示N-型糖鏈-Asn-(在Asn殘基側鏈之醯胺基氮原子上結合有N-型糖鏈的基)。A1中之糖鏈宜為前述式(a’)~(f’)之糖鏈。又,L1是與A1中之Asn殘基的氮原子結合,且前述氮原子未與糖鏈結合。
通式(I)中,**表示結合到碳原子之部位,且前述碳原子是結合在白蛋白之離胺酸殘基之側鏈的胺基上。又,Alb-NH2表示白蛋白。
通式(I)及通式(I-0)中,R1表示碳數1~6之烷基。該烷基可為直鏈狀,亦可為分支鏈狀。該烷基可舉例如甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、戊基、異戊基、己基等。有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物,在通式(I)中之R1宜為碳數1~3之烷基,且以甲基、乙基、或丙基為佳,以乙基更佳。
通式(I)及通式(I-0)中,Z1表示1,2-伸苯基、1,3-伸苯基或1,4-伸苯基。有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物,在通式(I)之Z1宜為1,4-伸苯基。
通式(I)及通式(I-0)中,L1表示任意之連結基。L1若為不阻礙RIKEN-CLICK反應之2價的基,則無特別限定,然由於連結到白蛋白之N-型糖鏈在動作自由度高者容易發
揮糖鏈群聚效應,因此宜為較長鏈之基或環構造等大基團。
通式(I)及通式(I-0)中之L1宜為下述通式(II)所表之基。通式(II)中,R2表示碳數1~20之伸烷基、L2表示任意之連結基。通式(II)中,*表示與前述通式(I)中之A1結合之部位、**表示與前述通式(I)中之Z1結合之部位。
R2之伸烷基可為直鏈狀,亦可為分支鏈狀。透過將白蛋白與N-型糖鏈以柔軟之伸烷基來連結,N-型糖鏈之動作自由度會變高,結果便是結合在相同白蛋白分子之複數個N-型糖鏈會變的容易互相累積。該伸烷基可舉例如亞甲基、伸乙基、伸丙基,伸異丙基、伸正丁基、伸異丁基、伸戊基、伸己基、伸庚基、伸辛基、伸壬基、伸癸基、伸十一烷基、伸十二烷基、伸十三烷基、伸十四烷基、伸十五烷基、伸十六烷基、伸十七烷基、伸十九烷基等。有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物,在通式(II)之R2宜為碳數3~10之伸烷基,且以碳數3~10之直鏈狀伸烷基為佳,以碳
數4~8之直鏈狀伸烷基更佳。
通式(II)中之L2若為不阻礙RIKEN-CLICK反應之2價的基,則無特別限定。具體而言,L2可舉-O-CO-NH-(CH2)n-CO-NH-、-O-CO-NH-(CH2)n-NH-CO-、-(CH2)n-、-(CH2)n-O-(CH2)m-、-(CH2)n-CO-NH-、或-(CH2)n-NH-CO-(前述式中,n及m分別獨立為1~20之整數。)。
通式(I-0)中之L1為通式(II)所表之基,即醛化合物(I’-0),可透過例如,下述通式(III)所表之疊氮化物與下述通式(IV)所表醛的環化反應(Alkyne-Azide Cyclization)來合成。通式(III)及(IV)中,A1、Z1及R1與通式(I)相同,L2及R2與通式(II)相同。
該環化反應可藉由,例如,將兩物質於氮環境下在極性溶劑中混合來進行。極性溶劑可舉例如水、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基亞碸(DMSO)、氰化甲烷(乙腈)、丙腈、二乙氧乙烷(DME)及該等之混合溶劑等。反應溫度宜在50℃以上進行,且以在60~100℃進行為佳,以在60~80℃進行更佳。
有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物宜具有下述通式(V-1)~(V-8)之結構。通式(V-1)~(V-8)中,R1與前述通式(I)之R1相同、R2與前述通式(II)之R2相同、n1為1~6之整數、「*」為與糖鏈之結合部位、「**」為結合到碳原子之部位,且前述碳原子是結合在白蛋白之離胺酸殘基之側鏈的胺基上。在「*」結合之糖鏈宜為前述式(a’)~(f’)之任一者。
下述通式(V-1)~(V-8)所表化合物宜為下述化合物:R1為碳數1~3之烷基、R2為碳數3~16之伸烷基、n1為1~3之整數、在*上結合之糖鏈為前述式(a’)~(f’)之任一者;且以下述化合物為佳:R1為碳數1~3之烷基、R2為碳數3~10之伸烷基、n1為1~3之整數、在*上結合之糖鏈為前述式(a’)~(f’)之任一者。
前述通式(I-0)所表醛化合物與白蛋白之RIKEN-CLICK反應可藉由,例如,將兩物質於極性溶劑中混合來進行。
極性溶劑可舉例如水、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基亞碸(DMSO)、氰化甲烷、丙腈、二乙氧乙烷(DME)及該等之混合溶劑等。反應溫度宜在60℃以下進行,且以在50℃以下為佳,以在15~40℃特別為佳,以不使白蛋白變性。
透過調節供給於前述RIKEN-CLICK反應之前述
通式(I-0)所表醛化合物與白蛋白之莫耳比,可調節對1分子白蛋白導入之N-型糖鏈的分子數。相對於白蛋白,前述醛化合物之量越多,越可增加對1分子白蛋白導入之N-型糖鏈的分子數。
對1分子白蛋白導入2種以上N-型糖鏈時,可使含有各N-型糖鏈之通式(I-0)所表醛化合物依序與白蛋白反應。在白蛋白表面之複數個離胺酸殘基之中,可從容易與醛化合物反應者依序導入N-型糖鏈。因此,根據與白蛋白反應之順序,即便結合在每1分子白蛋白之各N-型糖鏈的分子數相同,仍有可獲得與其他蛋白質之反應性相異的白蛋白-糖鏈複合物的情形。
有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物亦宜含有標識物質或用以與標識物質結合之結合部位。利用標識物質,可檢測白蛋白-糖鏈複合物。標識物質宜為可檢測投予到活體內之白蛋白-糖鏈複合物者,且可舉螢光物質、具有與放射性金屬配位之結構的物質、含有放射性同位素之物質、具有與MRI用之順磁性金屬配位之結構的物質等。該等標識物質宜結合在白蛋白-糖鏈複合物中之N-型糖鏈以外的部分。
有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物所具有的螢光物質並無特別限定,可從螢光標識蛋白質或糖等時所使用之螢光物質之中來適宜選擇並使用。可為蛋白質、色素,亦可為量子點。有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物所含有之螢光物質宜為可較安全的投予至活體內者,且以近紅外
螢光物質為佳,因其更容自活體外檢測活體內之白蛋白-糖鏈複合物。近紅外螢光物質可舉HiLyte Fluor(註冊商標)750、靛氰綠(Indocyanine green)、Alexa Flor(註冊商標)647、AlexaFluor 680、AlexaFluor 790、Cy(註冊商標)3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7等具有吲哚氰骨架之有機螢光色素、亮藍(brilliant blue)、亮綠(brilliant green)等青色素(Cyanine)衍生物、Y2O3螢光奈米粒子等無機奈米粒子等。
有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物所具有之標識物質之中,具有與放射性金屬配位之結構的物質可舉紫質、DOTA(1,4,7,10-四氮雜環癸烷-1,4,7,10-四乙酸)、DTPA(二乙烯三胺五乙酸)等。前述含有放射性同位素之物質可舉含有選自於由18F、11C、13N、15O、及99mTc構成群組之1種以上的衍生物(例如三氟(18F)硼酸鹽)等。前述具有與MRI用之順磁性金屬配位之結構的物質可舉例如釓等。
有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物亦可含有標籤牲肽(tag peptide)或生物素等低分子化合物。該標籤胜肽可舉例如His標籤、Flag標籤、HA標籤等。透過含有與特定物質專一結合之該等物質,可容易從混合物進行分離或純化。
有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物由於在1分子中有多數個N-型糖鏈,因此糖鏈與其他物質之專一的相互作用會較在1分子中只有1個N-型糖鏈之糖鏈複合物還要顯著的表現。就此,利用該糖鏈與其他物質之親和性,本發明之白蛋白-糖鏈複合物可使用作為一探針,其可用以檢
測細胞或組織,該細胞或組織於表面存在與該白蛋白-糖鏈複合物所含有之糖鏈親和性高之物質。特別是有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物由於在動物活體內較穩定,而可掌握在細胞或組織、或者個體程度之蛋白質等的活體分子分布或位置(localozation),並將該動態以圖像來分析,因此做為投予至動物活體內之生物顯影探針的有效成分是有用的。
例如,將有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物投予至動物時,含有如式(d’)之在非還原末端為N-乙醯葡萄糖胺之N-型糖鏈的複合物會累積在肝臓,特別是透過與Desmin或Vimentin之相互作用,而會被星狀細胞攝取。因此,該等白蛋白-糖鏈複合物做為用以檢測肝臓、特別是經活性化之星狀細胞的生物顯影探針,或者做為用以將機能性分子選擇性的送達肝臓、特別是星狀細胞的機能性分子用載體是有用的。又,含有如式(f’)之在非還原末端為甘露糖與N-乙醯神經氨酸之2分支型之N-型糖鏈的複合物會累積在肝臓,且特別是會被庫佛氏細胞攝取。因此,該等白蛋白-糖鏈複合物做為用以檢測肝臓、特別是庫佛氏細胞的生物顯影探針,或者做為用以將機能性分子選擇性的送達肝臓、特別是庫佛氏細胞的機能性分子用載體是有用的。又,含有如式(e’)之在非還原末端為甘露糖之N-型糖鏈的複合物,透過與庫佛氏細胞上的C-型凝集素之相互作用,而主要會累積在肝臓或脾臓。因此,該等白蛋白-糖鏈複合物做為用以檢測肝臓或脾臟的生物顯影探針,或者做為用
以將機能性分子選擇性的送達肝臓或脾臟的機能性分子用載體是有用的。進一步,含有如式(b’)之在非還原末端為α(2-3)唾液酸(具有唾液酸-半乳糖鍵)之N-型糖鏈的複合物,透過與在癌細胞表面高度表現之選擇素(selectin)之相互作用,而會累積在癌細胞。因此,每1分子白蛋白至少1分子以上之N-型糖鏈為α(2-3)唾液酸糖鏈的白蛋白-糖鏈複合物,做為用以檢測癌的生物顯影探針,或者做為用以將機能性分子選擇性的送達癌細胞的機能性分子用載體是有用的。此外,機能性分子可舉放射線治療藥劑、診斷藥等。將有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物使用做為機能性分子用載體時,機能性分子宜結合在白蛋白-糖鏈複合物中N-型糖鏈以外之部分,且以結合在白蛋白之離胺酸殘基以外為佳。
又,有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物做為醫藥品之有效成分亦有用。例如,使抗癌劑結合在白蛋白-糖鏈複合物中的白蛋白上,且前述白蛋白-糖鏈複合物含有非還原末端為α(2-3)唾液酸之N-型糖鏈者,可做成用於治療癌之醫藥品的有效成分。
有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物透過糖鏈群聚效應,而可更強調因糖鏈結構之差異所致生理活性之差異。因此,有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物,亦可用於分析糖鏈在生命現象中做為辨識訊息的機能。透過將含有標識物質之白蛋白-糖鏈複合物投予至動物,並檢測該標識物質,將可分析在體內之該白蛋白-糖鏈複合物的動態,例
如,分析排出路徑等。例如,在血液中之糖蛋白質之中,非還原末端不是唾液酸之非唾液酸糖蛋白質會與存在於肝細胞表面上之非唾液酸糖蛋白受容體(AGCR)結合,而被攝取至肝細胞內,然而,非還原末端為唾液酸之唾液酸蛋白質儘管會與AGCR結合,卻不會被肝細胞攝取。實際上,如後述實施例所示可明白,含有如式(a’)或(b’)之在非還原末端為酸性唾液酸之N-型糖鏈的白蛋白-糖鏈複合物會受到代謝而經由腎臓從膀胱迅速排出,然含有如式(c’)之在非還原末端為半乳糖之N-型糖鏈的白蛋白-糖鏈複合物是經由肝臓、膽囊而被腸管排泄。其他糖鏈對物質之排泄路徑的影響亦可使用有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物來同樣的進行分析。
以下將顯示實施例等以詳細說明本發明。但本發明並非為以下之記載所限定。
此外,在以下實驗所使用之物品當中,下述式(a)~(f)所表N-型糖鏈之疊氮化物衍生物皆是透過股份有限公司糖鏈工學研究所以Angew.Chem.Int.Ed.vol.49,p.8195-8200(2010)所記載之方法來合成,而下述式(1)所表醛化合物是以Org.Biomol.Chem.vol.12,p.1412-1418(2014)所記載之方法來合成。
又,在以下之實驗中,逆相HPLC是使用具備C18管柱(製品名:5C18-AR-300、4.6×250mm、Nacalai Tesque公司製)之高速液體色層分析(裝置名:Prominence(註冊商
標)系統、島津製作所製)來進行。高解析質譜(HRMS)是透過使用有質量分析器(製品名:micrOTOF-QIII(註冊商標)spectrometer、Bruker公司製)之ESI-TOF MS來獲得。蛋白質之質譜是透過使用有質量分析器(製品名:autoflex(註冊商標)spectrometer、Bruker公司製)之MALDI-TOF MS來獲得。
[製造例1]合成HL750-HSA
使人類血清白蛋白(自HSA、SIGMA公司購入)3.4mg(48nmol)溶解於300μL之PBS(磷酸緩衝生理食鹽水、pH7.4)而形成HSA溶液,使近紅外螢光色素HiLyte Fluor(註冊商標)750 acid SE(2×四乙基銨鹽)0.25mg(0.19μmol)溶解於10μL之DMSO而形成溶液,並於前述HSA溶液中添加前述溶液來調製反應液。將獲得之反應液在37℃下培養10分鐘,使近紅外螢光色素結合到HSA,之後,進行利用Amicon(註冊商標)10K(Merck Millipore公司製)之離心處理(15,000rpm、10分鐘)。將殘渣進一步以磷酸緩衝液洗淨3次。將獲得之HL750-HSA(與近紅外螢光色素結合之HSA)溶解於800μL之超純水,並令其為HL750-HSA儲備溶液(stock solution)。以MALDI-TOF MS分析後,合成好之HL750-HAS的平均質量為70.5kDa,且每1分子結合3.1分子的近紅外螢光色素。
[實施例1]
合成結合有式(a’)所表N-型糖鏈之HL750-HSA(2,6-HLF-HSA,以下有時稱為「複合物2a」。)。
<合成式(1a)所表醛化合物>
使具有式(a’)所表糖鏈之N-型糖鏈的疊氮化物衍生物(下述式(a)所表疊氮化物衍生物)(股份有限公司糖鏈工學研究所製作)1.24mg(0.50μmol)溶解於139μL之DMSO形成溶液;在氮環境下,於前述溶液中添加溶解於氰化甲烷之10mM的式(1)所表醛化合物之溶液45μL(0.45μmol)。將獲得之反應液在70℃下加熱,並以HPLC檢查反應物。在最初添加之醛化合物被消費後,將反應液冷卻至室溫,獲得下述式(1a)所表醛化合物是溶解在DMSO的儲備溶液(3.8mM)。合成好之式(1a)所表醛化合物是以ESI-TOF MS檢測(C128H183N13O71[M-2H]-2/2之檢測值:1518.0509、算出值:1518.0482)。
<合成複合物2a>
於以製造例1合成之HL750-HSA儲備溶液132μL(7.5nmol)中,混合132μL的水、66μL的DMSO及32μ
L(0.12μmol、16eq)的式(1a)所表醛化合物之儲備溶液(3.8mM)來調製反應液。將獲得之反應液在大氣環境下、於37℃邊使之穩定震盪邊培養一晚使之反應以合成複合物2a。將獲得之反應物透過Amicon 10K進行過濾器處理後,以水洗淨3次。之後,將反應液利用Durapore(註冊商標)PVDF膜(0.45μm)進行過濾器處理,之後,以水稀釋到150μL,調製複合物2a溶液。在以MALDI-TOF MS分析後,合成之複合物2a之平均質量為98.0kDa,且每1分子結合9.2分子之N-型糖鏈(式(1a)所表醛化合物)。
[實施例2]
合成結合有式(b’)所表N-型糖鏈之HL750-HSA(2,3-HLF-HSA,以下有時稱為「複合物2b」。)。
<合成式(1b)所表醛化合物>
使具有式(b’)所表糖鏈之N-型糖鏈的疊氮化物衍生物(下述式(b)所表疊氮化物衍生物)(股份有限公司糖鏈工學研究所製作)1.48mg(0.59μmol)溶解於144μL之DMSO形成溶液;在氮環境下,於前述溶液中添加溶解於氰化甲烷的10mM之式(1)所表醛化合物之溶液54μL(0.54μmol)。將獲得之反應液在70℃下加熱,並以HPLC檢查反應物。在最初添加之醛化合物被消費後,將反應液冷卻至室溫,獲得下述式(1b)所表醛化合物是溶解在DMSO之儲備溶液(3.8mM)。合成好之式(1b)所表醛化合物是以ESI-TOF MS檢測(C128H183N13O71[M-2H]-2/2之檢測值:1518.0460、算出值:1518.0482)。
<合成複合物2b>
於以製造例1合成之HL750-HSA儲備溶液52.5μ
L(3.0nmol)中,混合52.5μL的水、26.2μL的DMSO及24μL(90nmol、30eq)的式(1b)所表醛化合物之儲備溶液(3.8mM)來調製反應液。將獲得之反應液在大氣環境下、於37℃邊使之穩定震盪邊培養一晚使之反應以合成複合物2b。將獲得之反應物透過Amicon 10K進行過濾器處理,之後,以水洗淨3次。之後,將反應液利用Durapore(註冊商標)PVDF膜(0.45μm)進行過濾器處理,之後,以水稀釋到60μL,調製複合物2b溶液。在以MALDI-TOF MS分析後,合成之複合物2b之平均質量為102.1kDa,且每1分子結合10.5分子之N-型糖鏈(式(1b)所表醛化合物)。
[實施例3]
合成結合有式(c’)所表N-型糖鏈之HL750-HSA(asialo-HLF-HSA,以下有時稱為「複合物2c」。)。
<調製式(1c)所表醛化合物之儲備溶液>
使具有式(c’)所糖鏈之N-型糖鏈的疊氮化物衍生物(下述式(c)所表疊氮化物衍生物)(股份有限公司糖鏈工學研究所製作)1.09mg(0.57μmol)溶解於139μL之DMSO形成溶液;在氮環境下,於前述溶液中添加溶解於氰化甲烷的10mM之式(1)所醛化合物之溶液52μL(0.52μmol)。將獲得之反應液在70℃下加熱,並以HPLC檢查反應物。在最初添加之醛化合物被消費後,將反應液冷卻至室溫,獲得下述式(1c)所表醛化合物是溶解在DMSO之儲備溶液(3.8mM)。合成好之式(1c)所表醛化合物是以ESI-TOF MS檢測
(C106H147N11O55[M-2H]-2/2之檢測值:1226.9545、算出值:1226.9527)。
<合成複合物2c>
使前述式(c)所表疊氮化物衍生物(股份有限公司糖鏈工學研究所製作)0.29mg(0.15μmol)溶解於20μL之DMSO形成溶液;在氮環境下,於前述溶液中添加溶解於氰化甲烷的5mM之式(1)所表醛化合物之溶液30μL(0.15μmol)。將獲得之反應液在70℃下加熱,並以HPLC檢查反應物。在最初添加之醛化合物被消費後,將反應液冷卻至室溫,並添加44μL的DMSO與88μL的水來稀釋。接著,添加以製造例1合成之HL750-HSA儲備溶液88μL(5.0nmol)並充分混合以調製反應液。將獲得之反應液在大氣環境下、於37℃邊使之穩定震盪邊培養一晚使之反應以合成複合物2b。將獲得之反應物透過Amicon 10K進行過濾器處理後,以水洗淨3次。之後,將反應液利用Durapore(註冊商標)PVDF膜(0.45μm)進行過濾器處理,之後,以水稀釋到100μL,調製複合物2c溶液。在以MALDI-TOF MS分析後,合成之複合物2b之平均質量92.6kDa,且每1分子結合9.1分子之N-型糖鏈(式(1c)所表醛化合物)。
[實施例4]
合成結合有式(d’)所表N-型糖鏈之HL750-HSA(GlcNAc-HLF-HSA,以下有時稱為「複合物2d」。)。
<合成式(1d)所表醛化合物>
使具有式(d’)所表糖鏈之N-型糖鏈的疊氮化物衍生物(下述式(d)所表疊氮化物衍生物)(股份有限公司糖鏈工學研
究所製作)0.24mg(0.15μmol)溶解於20μL之DMSO形成溶液;在氮環境下,於前述溶液中添加溶解於氰化甲烷的5mM之式(1)所表醛化合物之溶液30μL(0.15μmol)。將獲得之反應液在70℃下加熱,並以HPLC檢查反應物。在最初添加之醛化合物被消費後,將反應液冷卻至室溫,合成下述式(1d)所表醛化合物。合成好之式(1d)所表醛化合物是以ESI-TOF MS檢測(C94H129N11O45[M-2H]-2/2之檢測值:1064.9041、算出值:1064.8999)。
<合成複合物2d>
接著,於冷卻至室溫之反應液中添加44μL的DMSO與88μL的水來稀釋。接著,添加以製造例1合成之HL750-HSA儲備溶液88μL(5.0nmol)並充分混合來調製反應液。將獲得之反應液在大氣環境下、於37℃邊使之穩定震盪邊培養一
晚使之反應以合成複合物2d。將獲得之反應物透過Amicon 10K進行過濾器處理,之後,以水洗淨3次。之後,將反應液利用Durapore(註冊商標)PVDF膜(0.45μm)進行過濾器處理,之後,以水稀釋到100μL,調製複合物2d溶液。在以MALDI-TOF MS分析後,合成之複合物2d之平均質量為91.9kDa,且每1分子結合10.1分子之N-型糖鏈(式(1d)所表醛化合物)。
[實施例5]
合成結合有式(e’)所表N-型糖鏈之HL750-HSA(Man-HLF-HSA,以下有時稱為「複合物2e」。)。
<合成式(1e)所表醛化合物>
使具有式(e’)所表糖鏈之N-型糖鏈的疊氮化物衍生物(下述式(e)所表疊氮化物衍生物)(股份有限公司糖鏈工學研究所製作)0.18mg(0.15μmol)溶解於20μL之DMSO形成溶液;在氮環境下,於前述溶液中添加溶解於氰化甲烷的5mM之式(1)所表醛化合物之溶液30μL(0.15μmol)。將獲得之反應液在70℃下加熱,並以HPLC檢查反應物。在最初添加之醛化合物被消費後,將反應液冷卻至室溫,合成下述式(1e)所表醛化合物。成好之(1e)所表醛化合物是以ESI-TOF MS檢測(C78H101N9O35[M-2H]-2/2之檢測值:861.8176、算出值:861.8206)。
<合成複合物2e>
接著,於冷卻至室溫之反應液中添加44μL的DMSO與88μL的水來稀釋。接著,添加以製造例1合成之HL750-HSA儲備溶液88μL(5.0nmol)並充分混合來調製反應液。將獲得之反應液在大氣環境下、於37℃邊使之穩定震盪邊培養一晚使之反應以合成複合物2e。將獲得之反應物透過Amicon 10K進行過濾器處理,之後,以水洗淨3次。之後,將反應液利用Durapore(註冊商標)PVDF膜(0.45μm)進行過濾器處理,之後,以水稀釋到100μL,調製複合物2e溶液。在以MALDI-TOF MS分析後,合成之複合物2e之平均質量為88.5kDa,且每1分子結合10.4分子之N-型糖鏈(式(1e)所表醛化合物)。
[實施例6]
合成結合有式(f’)所表N-型糖鏈之HL750-HSA(Half-HLF-HSA,以下有時稱為「複合物2f」。)。
<合成式(1f)所表之醛化合物>
使具有式(f’)所表糖鏈之N-型糖鏈的疊氮化物衍生物(下述式(e)所表疊氮化物衍生物)(股份有限公司糖鏈工學研究所製作)0.28mg(0.15μmol)溶解於20μL之DMSO形成溶液;在氮環境下,於前述溶液中添加溶解於氰化甲烷的5mM之式(1)所表醛化合物之溶液30μL(0.15μmol)。將獲得之反應液在70℃下加熱,並以HPLC檢查反應物。在最初添加之醛化合物被消費後,將反應液冷卻至室溫,合成下述式(1f)所表醛化合物。合成好之式(1f)表醛化合物是以
ESI-TOF MS檢測(C103H143N11O53[M-2H]-2/2之檢測值:1189.9316、算出值:1189.9344)。
<合成複合物2f>
接著,於冷卻至室溫之反應液中添加44μL的DMSO與88μL的水來稀釋。接著,添加以製造例1合成之HL750-HSA儲備溶液88μL(5.0nmol)並充分混合來調製反應液。將獲得之反應液在大氣環境下、於37℃邊使之穩定震盪邊培養一晚使之反應以合成複合物2f。將獲得之反應物透過Amicon 10K進行過濾器處理,之後,以水洗淨3次。之後,將反應液利用Durapore(註冊商標)PVDF膜(0.45μm)進行過濾器處理,之後,以水稀釋到100μL,調製複合物2f容液。在以MALDI-TOF MS分析後,合成之複合物2f之平均質量為94.0kDa,且每1分子結合9.9分子之N-型糖鏈(式(1f)所表醛化合物)。
[實施例7]
合成結合有式(a’)所表N-型糖鏈與式(c’)所表N-型糖鏈之HL750-HSA(Hetero3-HSA,以下有時稱為「複合物2g」。)。
在以製造例1合成之HL750-HSA儲備溶液175μL(10nmol)中添加175μL的水及88μL的DMSO形成溶液;於前述溶液中混合以實施例1製造之式(1a)所表醛化合物之儲備溶液(3.8mM)46.7μL(175nmol、17.5eq)來調製反應液。將獲得之反應液在大氣環境下、於37℃邊使之穩定震盪邊培養一晚使之反應,以合成在HL750-HSA上結合有式(a’)所表N-型糖鏈之中間體。分取該反應液0.5μL,透過Amicon 10K來純化並以水洗淨2次,之後,以MALDI-TOF MS來分
析,合成好之中間體之平均質量為96.9kDa,且每1分子結合有8.3分子之式(a’)所表N-型糖鏈(式(1a)所表醛化合物)。
接著,於殘餘之反應液(44μL、1.0nmol)中混合以實施例3製造之式(1c)所表醛化合物之儲備溶液(3.8mM)2.0μL(7.5nmol、7.5eq),來調製反應液。將獲得之反應液在大氣環境下、於37℃邊使之穩定震盪邊培養一晚使之反應,以合成在前述中間體上結合有式(c’)所表N-型糖鏈之複合物2g。將獲得之反應物透過Amicon 10K進行過濾器處理,之後,以水洗淨3次。之後,將反應液利用Durapore(註冊商標)PVDF膜(0.45μm)進行過濾器處理,之後,以水稀釋,調製複合物2g溶液(50μM)。在以MALDI-TOF MS分析後,合成好之複合物2g之平均質量為103.9kDa,且每1分子結合有2.6分子之式(c’)所表N-型糖鏈(式(1c)所表醛化合物)。亦即,複合物2g是如下之異型(hetero type)白蛋白-糖鏈複合物:對白蛋白,式(a’)所表N-型糖鏈與式(c’)所表N-型糖鏈是以約8:2來結合。
[實施例8]
合成結合有式(a’)所表N-型糖鏈與式(c’)所表N-型糖鏈之HL750-HSA(Hetero2-HSA,以下有時稱為「複合物2h」。)。
於製造例1合成之HL750-HSA儲備溶液210μL(12nmol)中添加210μL的水及105μL的DMSO形成溶液;於前述溶液中混合以實施例1製造之式(1a)所表醛化合物之
儲備溶液(3.8mM)43.4μL(163nmol、13.6eq)來調製反應液。將獲得之反應液在大氣環境下、於37℃邊使之穩定震盪邊培養一晚使之反應,以合成在HL750-HSA上結合有式(a’)所表N-型糖鏈之中間體。分取該反應液0.5μL,透過Amicon 10K來純化並以水洗淨2次,之後,以MALDI-TOF MS來分析,合成好之中間體之平均質量為87.1kDa,且每1分子結合有5.3分子之式(a’)所N-型糖鏈(式(1a)所表醛化合物)。
接著,在殘餘之反應液中的215μL(5.0nmol)中,混合以實施例3製造之式(1c)所表醛化合物之儲備溶液(3.8mM)14.2μL(52nmol、10.4eq),來調製反應液。將獲得之反應液在大氣環境下、於37℃邊使之穩定震盪邊培養一晚使之反應,以合成在前述中間體上結合有式(c’)所表N-型糖鏈之複合物2g。將獲得之反應物透過Amicon 10K進行過濾器處理,之後,以水洗淨3次。之後,將反應液利用Durapore(註冊商標)PVDF膜(0.45μm)進行過濾器處理,之後,以水稀釋,調製複合物2h溶液(50μM)。在以MALDI-TOF MS分析後,合成好之複合物2h之平均質量為98.7kDa,且每1分子結合有4.7分子之式(c’)所表N-型糖鏈(式(1c)所表醛化合物)。亦即,複合物2h是如下之異型白蛋白-糖鏈複合物:對白蛋白,式(a’)所表N-型糖鏈與式(c’)所表N-型糖鏈是以約5:5來結合。
[實施例9]
合成結合有式(a’)所表N-型糖鏈與式(c’)所表N-型糖鏈之HL750-HSA(Heterol-HSA,以下有時稱為「複合物2i」。)。
於以製造例1合成之HL750-HSA儲備溶液175μL(10nmol)中添加175μL的水及88μL的DMSO形成溶液;於前述溶液中混合以實施例1製造之式(1a)所表醛化合物之儲備溶液(3.8mM)13.3μL(50nmol、5.0eq),來調製反應液。將獲得之反應液在大氣環境下、於37℃邊使之穩定震盪邊培養一晚使之反應,以合成在HL750-HSA上結合有式(a’)所表N-型糖鏈之中間體。分取該反應液0.5μL,透過Amicon 10K來純化並以水洗淨2次,之後,以MALDI-TOF MS來分析,合成好之中間體之平均質量為78.9kDa,且每1分子結合有2.8分子之式(a’)所表N-型糖鏈(式(1a)所表醛化合物)。
接著,在殘餘之反應液中的119μL(2.8nmol)中,混合以實施例3製造之式(1c)所表醛化合物之儲備溶液(3.8mM)15.3μL(50nmol、20.9eq),來調製反應液。將獲得之反應液在大氣環境下、於37℃邊使之穩定震盪邊培養一晚使之反應,以合成在前述中間體上結合有式(c’)所表N-型糖鏈之複合物2i。將獲得之反應物透過Amicon 10K進行過濾器處理,之後,以水洗淨3次。之後,將反應液利用Durapore(註冊商標)PVDF膜(0.45μm)進行過濾器處理,之後,以水稀釋,調製複合物2i溶液(50μM)。在以MALDI-TOF MS分析後,合成好之複合物2i之平均質量為97.2kDa,且每1分子結合有6.3分子之式(c’)所表N-型糖鏈(式(1c)所表醛化合物)。亦即,複合物2i是如下之異型白蛋白-糖鏈複合物:對白蛋白,式(a’)所表N-型糖鏈與式(c’)所表N-型糖鏈是
以約3:7來結合。
[實施例10]
合成結合有式(a’)所表N-型糖鏈與式(c’)所表N-型糖鏈之HL750-HSA(Hetero4-HSA,以下有時稱為「複合物2j」。)。
在以製造例1合成之HL750-HSA儲備溶液175μL(10nmol)中添加175μL的水及88μL的DMSO形成溶液;於前述溶液中混合以實施例3製造之式(1c)所表醛化合物之儲備溶液(3.8mM)43μL(16nmol、16eq),來調製反應液。將獲得之反應液在大氣環境下、於37℃邊使之穩定震盪邊培養一晚使之反應,以合成在HL750-HSA上結合有式(c’)所表N-型糖鏈之中間體。分取該反應液0.5μL,透過Amicon 10K來純化並以水洗淨2次,之後,以MALDI-TOF MS來分析,合成好之中間體之平均質量為83.5kDa,且每1分子結合有5.2分子之式(c’)所表N-型糖鏈(式(1c)所表醛化合物)。
接著,在殘餘之反應液中的88μL(2.0nmol)中,混合以實施例1製造之式(1a)所表醛化合物之儲備溶液(3.8mM)4.3μL(16nmol、8.0eq),來調製反應液。將獲得之反應液在大氣環境下、於37℃邊使之穩定震盪邊培養一晚使之反應,以合成在前述中間體上結合有式(a’)所表N-型糖鏈之複合物2j。將獲得之反應物透過Amicon 10K進行過濾器處理,之後,以水洗淨3次。之後,將反應液利用Durapore(註冊商標)PVDF膜(0.45μm)進行過濾器處理,之
後,以水稀釋,調製複合物2j溶液(50μM)。在以MALDI-TOF MS分析後,合成好之複合物2j之平均質量為97.6kDa,且每1分子結合有4.7分子之式(a’)所表N-型糖鏈(式(1a)所表醛化合物)。亦即,複合物2j是如下之異型白蛋白-糖鏈複合物:對白蛋白,式(a’)所表N-型糖鏈與式(c’)所表N-型糖鏈是以約5:5來結合。
[試驗例1]
將以實施例1~6製造之白蛋白-糖鏈複合物投予至小鼠時之動態,透過檢測從HL750產生之近紅外螢光,來非侵害性的調查。
<取得生物顯影圖像>
首先,調製注射用溶液,其是在30μL(1.5nmol)之各白蛋白-糖鏈複合物溶液或以製造例1合成之HL750-HSA中添加70μL之生理食鹽水而稀釋。將該注射用溶液對8~12週齡之雌BALB/c裸小鼠(BALB/cAJcl-nu/nu小鼠)的尾靜脈進行注射(n=4)。注射後之小鼠在以戊巴比妥施加麻醉後,靜置於活體螢光顯影裝置IVIS(註冊商標)Kinetics fluorescence imager(Caliper Life Sciences公司製),並在直到投予白蛋白-糖鏈複合物後之3小時之間的每30分取得個體整體之螢光圖像。取得之螢光圖像是從710nm之激發光圖像扣除背景螢光(640nm激發光)的圖像。
<尿中排泄量>
在取得之螢光圖像中,針對膀胱及其周圍之任意的關注區域測定螢光強度,並從膀胱及其周圍之螢光強度的增
加,藉由半定量分析,來測定各白蛋白-糖鏈複合物及HL750-HSA之尿中排泄量(螢光強度值[count])。圖中之尿中排泄量是顯示從投予瞬後直到3小時後之間每單位時間排至膀胱的平均值。
<累積在各組織之白蛋白-糖鏈複合物的螢光強度>
從投予白蛋白-糖鏈複合物過3小時後,從小鼠切除小腸,測定膽囊與小腸之螢光強度,並測定白蛋白-糖鏈複合物之累積量(螢光強度值[count])。
又,從投予白蛋白-糖鏈複合物過3小時後,從小鼠切除肝臓與脾臓,測定螢光強度,並測定白蛋白-糖鏈複合物之累積量(螢光強度值[count])。
<測定結果>
圖2(A)~(D)分別顯示注射HL750-HSA、複合物2a、複合物2b及複合物2c之各小鼠在投予後0.5~3小時之經過時間點之小鼠個體的螢光圖像。該結果可知,未導入糖鏈之HL750-HSA即便在投予後3小時之經過時間點上,仍通過血管內而擴散至小鼠體內整體。相對於此,可知即使非還原末端為酸性之唾液酸的糖鏈是每1分子白蛋白導入10分子左右之複合物2a及複合物2b,可確認到會累積到腎臓及膀胱,而迅速排泄於尿中。又,在投予複合物2a之小鼠與投予複合物2b之小鼠中,小鼠個體整體之螢光強度會緩慢減少,在從投予過12小時之經過時間點上螢光強度是幾乎檢測不到(結果並未圖示。)。又,同樣地將以式(a’)所示N-
型糖鏈是在每1分子白蛋白結合1.8分子之HL750-HSA(2,6-few-HLF-HSA,以下有時稱為「複合物2SIa」。)投予至小鼠時,未導入糖鏈之HL750-HSA在投予後3小時之經過時間點亦是通過血管內而幾乎擴散於小鼠體內整體(結果未圖示。)。另一方面,非還原末端不是唾液酸之非唾液酸糖鏈是在每1分子白蛋白亦導入10分子左右的複合物2c,可觀察到會累積到腸,而非腎臓或膀胱,而可確認會經由肝臓或膽囊排至腸管。
圖3(A)顯示各小鼠之白蛋白-糖鏈複合物或HL750-HSA之尿中排泄量的測定結果。該結果顯示,從腎臓及膀胱之排出量是以HL750-HSA為最多。又,複合物2a比複合物2b在尿中排泄量還要多,且排至尿中的速度快。
圖3(B)顯示,自投予起3小時之經過時間點上,各小鼠之膽囊之螢光強度的測定結果;圖3(C)顯示,自投予起3小時之經過時間點上,各小鼠之小腸之螢光強度的測定結果。該結果可知,在投予複合物2c之小鼠中,膽囊與小腸之螢光強度極高,而可確認到複合物2c會與肝細胞表面之AGCR結合,並經由肝臓或膽囊來腸管排泄。又,複合物2a與複合物2b幾乎不為腸管排泄,而是選擇性的從膀胱排出。
圖4(A)~(C)分別顯示注射複合物2d、複合物2e及複合物2f之各小鼠在投予後0.5~3小時之經過時間點之小鼠個體的螢光圖像。如圖所示,可確認到該等複合物主要是積集在肝臓或脾臓。
圖5(A)顯示從各複合物投予後3小時之經過時間點上,從小鼠個體切除之肝臓與脾臓的螢光圖像。又,圖5(B)顯示自投予起3小時之經過時間點上,各小鼠之肝臓之螢光強度的測定結果;圖5(C)顯示自投予起3小時之經過時間點上,各小鼠之脾臓之螢光強度的測定結果。該結果顯示,相較於投予複合物2a之小鼠,投予複合物2d、複合物2e及複合物2f之小鼠其肝臓與脾臓之螢光強度皆極高,而可知該等白蛋白-糖鏈複合物會選擇性的累積在肝臓與脾臓。
為了調查複合物2d、複合物2e及複合物2f是累積在肝臓的哪個部分,將自小鼠切除之肝臓進行組織染色。具體而研,將自小鼠切除之肝臓於4℃使之浸漬於4%PFA溶液中24小時以固定,之後,在4℃下使之浸漬於含有15%蔗糖之PBS中24小時,接著,在4℃下使之浸漬於含有30%蔗糖之PBS中24小時。使經固定化之肝臓在-78℃下於OCT compound(註冊商標)中冷凍後,製作6~8μm之切片。在將該等切片於封阻斷緩衝液(blocking buffer)(含有3% BSA、10%山羊血清及0.1M甘胺酸之PBST緩衝液)中培養30分鐘後,使之在4℃下浸漬於一次抗體液中並培養一晚,接著,使之在室溫下浸漬於二次抗體液中並培養2小時;前述一次抗體液為大鼠抗Desmin抗體(製品編號:RB-9014、Thermo Fisher Scientific公司製)的300倍稀釋液、大鼠抗LYVE-1抗體(製品編號:ab14917、abcam公司製)的200倍稀釋液或大鼠抗F4/80抗體(製品編號:MCA497GA、AbD serotec公司
製)的200倍稀釋液;前述二次抗體液為含有Alexa Fluor 488標識抗大鼠IgG抗體與Alexa Fluor 555標識抗大鼠IgG抗體兩者的200倍稀釋液。該等切片在之後進一步是使之在室溫下浸漬於Hoechst 33258的2500倍稀釋液(同仁化學研究公司製)中並培養10分鐘,之後,以封固液(製品名:Fluoromount(註冊商標)、Diagnostic BioSystems公司製)封固(mount)在載玻片上。將放置切片之載玻片設置在螢光顯微鏡(製品名:BZ-X710 All-in-one Fluorescence Microscope(註冊商標)、Keyence社製)上並觀察。
該結果顯示,複合物2d與複合物2f在肝臓中,不是被實質細胞,而是被非實質細胞所攝取。組織染色之結果顯示,專一染色星狀細胞之抗Desmin抗體與專一染色竇狀隙內皮細胞(sinusoidal endothelial cells)之抗LYVE-1抗體是常與複合物2d共位(co-localization);專一染色庫佛氏細胞之抗F4/80抗體並不太與複合物2d共存。從該等結果暗示到,複合物2d有可能是透過與Desmin或Vimentin之的相互作用,而專一的被已活性化之星狀細胞所攝取。
又,與複合物2d相同,由於抗Desmin抗體及抗LYVE-1抗體常共位,因此暗示到複合物2f亦有可能專一的被星狀細胞所攝取。另一方面,複合物2e是與抗F4/80抗體常共位,而暗示到可能專一的被庫佛氏細胞所攝取。
如此,根據物質表面之糖鏈種類,該物質在活體內之排出機制或在活體內之積集部位的變化,在以往之生物顯影探針無法分析,然利用有關於本發明之白蛋白-糖鏈
複合物做為生物顯影探針而首次釋明,前述有關於本發明之白蛋白-糖鏈複合物是使用白蛋白做為使糖鏈結合之蛋白質,且每一分子結合有複數個糖鏈。
[試驗例2]
因複合物2a主要是從腎臓排泄,複合物2c主要是從腸管排出,因此在試驗例2中是使用以各種比例具有構成複合物2a之N-型糖鏈(式(1a))與構成複合物2c之N-型糖鏈(式(1c))之異複合物,調查對糖鏈之存在比與排出路徑的影響。
具體而研,針對以實施例1、3、7~9製造之複合物2a、2c、2g~2j,與試驗例1相同進行並在投予至小鼠後,在投予後直到3小時之間的每30分鐘,取得小鼠個體整體之螢光圖像。進一步,與試驗例1相同進行並調查各複合物之尿中排泄量與對膽囊與小腸之積集量。此外,將各複合物中之糖鏈的存在比(莫耳比)顯示於表1。
圖6(A)顯示各小鼠之白蛋白-糖鏈複合物之尿中排泄量的測定結果、圖6(B)顯示自投予起3小時之經過時間點上各小鼠之膽囊之螢光強度的測定結果、圖6(C)顯示自投予起3小時之經過時間點上各小鼠之小腸之螢光強度的
測定結果。該結果可觀察到,非還原末端不是唾液酸之式(1c)糖鏈的存在比變得越高,複合物之排出路徑,相較於腎臓,有轉移(shift)到膽囊與小腸腸管之傾向。從該等結果可知,根據物質表面之糖鏈種類,且特別是非還原末端是否為唾液酸,會影響在活體內之物質的排出路徑,因此,在將物質投予至活體時,藉由調節物質表面之糖鏈,可控制該物質之動態。
此外,複合物2h與複合物2j皆是以1:1(莫耳比)含有式(1a)之糖鏈與式(1c)之糖鏈,然有複合物2h容易從腎臓排出、複合物2j容易排至小腸如此差異。這暗示到,因對白蛋白進行糖鏈修飾之順序不同,因此在白蛋白分子表面之哪個離胺酸殘基上連結合何種糖鏈是重要的。
[試驗例3]
α(2-3)唾液酸蛋白質是透過與選擇素之相互作用而專一的被癌細胞攝取。
在此,將以實施例2製造之複合物2b投予至移植了源自癌細胞之培養株A431細胞的模式小鼠中,並觀察在個體內之動態。
於8週齡之雌BALB/c裸小鼠上,將3×106個A431細胞移植到右肩附近,之後,令經過2週之小鼠為癌模式。對該癌模式小鼠與試驗例1相同進行並投予後,在直到投予後5小時之間的每30分鐘,取得小鼠個體整體的螢光圖像。
圖7顯示投予複合物2b之各小鼠在投予後1小時之經過時間點之小鼠個體的螢光圖像。圖中箭號所示部分
是移植A431細胞的位置。複合物2b在投予後1小時迅速被A431細胞所攝取。又,在投予後5小時,是幾乎被排泄(未圖示。)。
Claims (10)
- 一種白蛋白-糖鏈複合物,特徵在於天門冬醯胺結合型糖鏈是每1分子白蛋白結合有5分子以上,且該天門冬醯胺結合型糖鏈具有下述通式(I)表示之結構:
- 如請求項1之白蛋白-糖鏈複合物,其中前述天門冬醯胺結合型糖鏈之非還原末端的糖包含選自於由N-乙醯葡萄糖胺、半乳糖、甘露糖及唾液酸所構成群組之糖。
- 一種機能性分子用載體,是用以在活體內將機能性分子選擇性地送達目標組織,且含有如請求項1至3中任一項 之白蛋白-糖鏈複合物。
- 一種機能性分子用載體,是用以在活體內將機能性分子選擇性地送達目標組織,其中,前述目標組織為肝臟之星狀細胞,且前述機能性分子用載體含有如請求項1或2之白蛋白-糖鏈複合物,前述天門冬醯胺結合型糖鏈之非還原末端為N-乙醯葡萄糖胺。
- 一種機能性分子用載體,是用以在活體內將機能性分子選擇性地送達目標組織,其中,前述目標組織為肝臟之庫佛氏細胞,且前述機能性分子用載體含有如請求項1或2之白蛋白-糖鏈複合物,前述天門冬醯胺結合型糖鏈之非還原末端為甘露糖與N-乙醯神經氨酸之2分支型。
- 一種機能性分子用載體,是用以在活體內將機能性分子選擇性地送達目標組織,其中,前述目標組織為肝臟或脾臟,且前述機能性分子用載體含有如請求項1或2之白蛋白-糖鏈複合物,前述天門冬醯胺結合型糖鏈之非還原末端為甘露糖。
- 一種機能性分子用載體,是用以在活體內將機能性分子選擇性地送達目標組織,其中,前述目標組織為癌細胞,且前述機能性分子用載體含有如請求項1或2之白蛋白-糖鏈複合物,前述天門冬醯胺結合型糖鏈之非還原末端為α(2-3)唾液酸。
- 如請求項4至8中任一項之機能性分子用載體,其中前述機能性分子為螢光物質或藥劑。
- 一種生物顯影探針,特徵在於是以如請求項1至3中任一 項之白蛋白-糖鏈複合物為有效成分,且可投予至動物活體內。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015132002 | 2015-06-30 | ||
JP2015-132002 | 2015-06-30 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW201705976A TW201705976A (zh) | 2017-02-16 |
TWI757238B true TWI757238B (zh) | 2022-03-11 |
Family
ID=57608323
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW105120821A TWI757238B (zh) | 2015-06-30 | 2016-06-30 | 白蛋白-糖鏈複合物 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10683341B2 (zh) |
EP (1) | EP3318575B1 (zh) |
JP (1) | JP6956959B2 (zh) |
KR (1) | KR102611306B1 (zh) |
CN (1) | CN107750252B (zh) |
AU (1) | AU2016286027B2 (zh) |
CA (1) | CA2991013C (zh) |
DK (1) | DK3318575T3 (zh) |
SG (2) | SG11201710829WA (zh) |
TW (1) | TWI757238B (zh) |
WO (1) | WO2017002918A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20220012277A (ko) * | 2019-05-24 | 2022-02-03 | 가부시키가이샤 도우사 고가쿠 겐큐쇼 | 신규 인공 단백질 촉매 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015030702A (ja) * | 2013-08-02 | 2015-02-16 | 独立行政法人理化学研究所 | 新規化合物及びその利用 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7943763B2 (en) * | 2002-07-05 | 2011-05-17 | Otsuka Chemical Holdings Co., Ltd. | Process for preparing glycopeptides having asparagine-linked oligosaccharides, and the glycopeptides |
TWI466897B (zh) * | 2005-07-19 | 2015-01-01 | Glytech Inc | 癌細胞之檢測方法、糖鏈之構造解析方法,以及糖鏈衍生物 |
JP4449915B2 (ja) | 2006-02-08 | 2010-04-14 | ソニー株式会社 | 符号化装置、符号化方法およびプログラム、並びに、記録媒体 |
JP4983148B2 (ja) * | 2006-08-18 | 2012-07-25 | ニプロ株式会社 | 糖鎖含有アルブミン、その製造方法およびその用途 |
JP5013378B2 (ja) | 2007-02-05 | 2012-08-29 | 国立大学法人大阪大学 | 新規ヘキサトリエン−β−カルボニル化合物 |
US7943570B2 (en) | 2007-10-16 | 2011-05-17 | Nipro Corporation | Sugar chain-containing albumin, production method thereof and use thereof |
AU2012225900B2 (en) * | 2011-03-04 | 2015-09-17 | Glytech, Inc. | Method for producing sialic-acid-containing sugar chain |
-
2016
- 2016-06-30 SG SG11201710829WA patent/SG11201710829WA/en unknown
- 2016-06-30 KR KR1020177037467A patent/KR102611306B1/ko active IP Right Grant
- 2016-06-30 TW TW105120821A patent/TWI757238B/zh active
- 2016-06-30 JP JP2017526430A patent/JP6956959B2/ja active Active
- 2016-06-30 EP EP16818026.3A patent/EP3318575B1/en active Active
- 2016-06-30 US US15/740,511 patent/US10683341B2/en active Active
- 2016-06-30 CA CA2991013A patent/CA2991013C/en active Active
- 2016-06-30 WO PCT/JP2016/069438 patent/WO2017002918A1/ja active Application Filing
- 2016-06-30 SG SG10201912682XA patent/SG10201912682XA/en unknown
- 2016-06-30 AU AU2016286027A patent/AU2016286027B2/en active Active
- 2016-06-30 DK DK16818026.3T patent/DK3318575T3/da active
- 2016-06-30 CN CN201680038209.4A patent/CN107750252B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015030702A (ja) * | 2013-08-02 | 2015-02-16 | 独立行政法人理化学研究所 | 新規化合物及びその利用 |
Non-Patent Citations (4)
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN107750252A (zh) | 2018-03-02 |
KR102611306B1 (ko) | 2023-12-06 |
EP3318575A4 (en) | 2019-03-13 |
US10683341B2 (en) | 2020-06-16 |
SG11201710829WA (en) | 2018-02-27 |
SG10201912682XA (en) | 2020-03-30 |
CA2991013C (en) | 2023-09-26 |
EP3318575A1 (en) | 2018-05-09 |
KR20180021727A (ko) | 2018-03-05 |
EP3318575B1 (en) | 2021-01-06 |
JP6956959B2 (ja) | 2021-11-02 |
JPWO2017002918A1 (ja) | 2018-04-26 |
US20180186859A1 (en) | 2018-07-05 |
TW201705976A (zh) | 2017-02-16 |
WO2017002918A1 (ja) | 2017-01-05 |
AU2016286027A1 (en) | 2018-01-25 |
AU2016286027B2 (en) | 2020-02-27 |
CN107750252B (zh) | 2021-11-30 |
DK3318575T3 (da) | 2021-04-12 |
CA2991013A1 (en) | 2017-01-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20150238637A1 (en) | Blood-brain Barrier Epitopes and Uses Thereof | |
US20200002401A1 (en) | Cd44 binding peptides | |
Ogura et al. | Glycan multivalency effects toward albumin enable N-glycan-dependent tumor targeting | |
Konopka et al. | Multimodal imaging of the receptor for advanced glycation end-products with molecularly targeted nanoparticles | |
EP3361251A1 (en) | Method for detecting cancer cells, reagent for introducing substance into cancer cells, and composition for treating cancer | |
McCann et al. | Biodistribution and excretion of monosaccharide− albumin conjugates measured with in vivo near-infrared fluorescence imaging | |
CN104053455A (zh) | 使用5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖标记生物活性分子的方法 | |
Chen et al. | Bio-orthogonal metabolic fluorine labeling enables deep-tissue visualization of tumor cells in vivo by 19F magnetic resonance imaging | |
Kang et al. | Hybrid PET/optical imaging of integrin α V β 3 receptor expression using a 64 Cu-labeled streptavidin/biotin-based dimeric RGD peptide | |
TWI757238B (zh) | 白蛋白-糖鏈複合物 | |
Mather | Molecular imaging with bioconjugates in mouse models of cancer | |
EP3940000B1 (en) | Carrageenan derivative, probe for labelling macrophages, and method for preparing same | |
Taichi et al. | Cell surface and in vivo interaction of dendrimeric N-glycoclusters | |
US20220162347A1 (en) | Carrageenan derivative, probe for labelling macrophages, and method for preparing same | |
US20170065730A1 (en) | Composition for imaging atherosclerosis and method for diagnosing atherosclerosis by using same | |
Tanaka et al. | Chemical Approach to a Whole Body Imaging of Sialo-N-Linked Glycans | |
Maedomari | Kiss1R identification and biodistribution analysis employing a western ligand blot and ligand-derivative stain with a FITC-kisspeptin derivative | |
Tanaka et al. | Development of Azaelectrocyclization-Based Labeling and Application to Noninvasive Imaging and Targeting Using N-Glycan Derivatives—In Pursuit of N-Glycan Functions on Proteins, Dendrimers, and Living Cells— | |
WO2019175019A1 (en) | Compounds and methods for detecting early atherosclerotic lesions in blood vessels | |
Xiao | Development and Evaluation of Molecular Imaging Agents for Inflammation and Cancer |