CN104053455A - 使用5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖标记生物活性分子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生物活性分子和5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖的缀合物，其中，所述生物活性分子选自由蛋白质、肽、核酸、寡糖和多糖组成的组。

Description

使用5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖标记生物活性分子的方法
技术领域
本发明涉及生物活性化合物的缀合物，例如蛋白质或肽，和氟-标记的糖，特别是5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖，制备这些缀合物的过程和所述缀合物，特别是包含5-18F-5-脱氧戊糖或3-18F-3-脱氧戊糖的缀合物在成像，特别是正电子发射层析成像中的应用。
背景技术
通过正电子发射层析成像(PET)，氟-18同位素广泛用于医疗成像应用。其具有110分钟的半衰期，因此制备和处理含18F的分子的方法需要快速。用于PET的最常用的碳水化合物为2-18氟-2-脱氧-葡萄糖(2-[18F]-FDG，通常称为FDG，即，以使上下文暗指18F-标记)，在国际临床所有氟-18标记研究中，其占多于90%的比例。FDG最通常被给予癌症患者用于肿瘤检测和监测，出于该原因，在全世界许多PET中心和医院中，由氟化物-18快速制备2-FDG(在回旋加速器上生产)。
对用18F标记或结合(ligating)生物活性实体，例如肽和蛋白质的需求持续增长。肽和蛋白质可特别设计用于识别疾病组织或疾病细胞类型，并且如果使用氟-18标记并注入患者中，可产生患病的组织/细胞类型的图像。含18F的蛋白质缀合物可以因此用于成像(例如，通过PET)，从而允许临床医师诊断或监测疾病。
显著的技术挑战在于实现氟-18同位素与蛋白质的有效连接。在这方面，已使用了包括含氟芳香族化合物的小的疏水性含18F的分子，例如4-[18F]氟苯甲醛。然而，期望附加水溶性标记以使所得的18F-标记的蛋白质的总体性质不会太显著偏离其母体蛋白质的性质。
小的碳水化合物提供了机会以解决使用含氟芳香族化合物发现的问题，且关于这点，由于FDG目前的临床使用使其容易得到，FDG已被广泛探究作为标记分子(参见，例如，WO2005/086612A2(Immunomedics，Inc.))。FDG与蛋白质的结合依然为化学挑战，很少的有效缀合方法已被开发。然而，肟形成是用于实现糖结合的最可修正的方法(参见R.Haubner，H.J.Wester，F.Burkhart，R.Senekowitsch-Schmidtke，W.Weber，S.L.Goodman，H.Kessler和M.Schwaiger，J.Nucl.Med.2001，42，326-336；M.Schottelius，F.Rau，J.C.Reubi，M.Schwaiger和H.-J.Wester，Bioconjugate Chem.2005，16，429-437；R.D.Egleton和T.P.Davis，NeuroRx，2005，2，44-53；和D.E.Olberg和O.K.Hjelstuen，Curr.Topics Med.Chem，2010，10，1669-1679)。
迄今为止，实际上FDG是用于与肽形成肟的唯一的氟化的糖。方便地，FDG制备于或者被递送至几乎全世界所有的PET中心。然而，蛋白质-FDG结合的主要问题是形成期望的缀合物(例如，经由肟形成)的效率差。因此，必须使用高反应温度(高达130℃)和非常低的pH值(低至1-2)以允许缀合反应的足够效率。然而，这样的条件是不可取的：高温和低pH值对于大多数蛋白质和肽是不适合的，其在这样的条件下容易降解。
两个近来的出版物(2010年)已描述了开发备选的、更详细的方法来解决FDG与蛋白质结合效率差的问题。
第一种方法涉及通过[18F]-FDG对酶葡糖脑苷脂酶(GCase)基于机制的抑制，其在活性部位固定[18F]-FDG分子(C.P.Phenix，B.P.Rempel，K.Colobong，D.J.Doudet，M.J.Adam，L.A.Clarke和S.G.Withers.PNAS，2010，107，10842-10847)。然而，该方法局限于GCase酶和相关的酶，因此不能普遍适用。
所述的第二种方法涉及开始时在FDG的1-位结合叠氮化物，以允许其与设计成为蛋白质的含乙炔的氨基酸进行所谓的“敲击”反应(参见O.Boutureira，F.D’Hooge，M.Fernandez-Gonzalez，G.J.L.Bernardes，M.Sanchez-Navarro，J.R.Koeppe和B.G.Davis，Chem.Commun.，2010，46，8142-8144；S.Maschauer和O.Prante，Carbohydr.Res.2009，344，753-761；S.Maschauer，J.Einsiedel，R.Haubner，C.Hocke，M.Ocker，H.Hubner，T.Kuwert，P.Gmeiner和O.Prante，Angew.Chem.Int.Ed.2010，49，976-979;和O.Prante，J.Einsiedel，R.Haubner，P.Gmeiner，H.-J.Wester，T.Kuwert和S.Maschauer，Bioconjugate Chem.2007，18，254-262)。改性FDG以允许引入叠氮化物官能团的需要降低了总缀合过程的效率，这是不可取的。
因此，期望提供一种制备18F-标记的生物活性分子(例如蛋白质和肽)的备选的方法，以解决一种或多种以上描述或暗示的本领域的缺陷。
发明内容
研究了FDG和蛋白质之间的肟-形成反应的低效率，我们假设这可能是由FDG以闭环吡喃糖形式而不是开环含醛化合物存在的倾向引起的。同时这是己醛醣众所周知的现象，我们推论，使用FDG，2-位上电负性氟原子的定位将抑制开环为醛并驱使平衡仍进一步朝向吡喃糖形式，从而抑制与含氨氧基的分子的缀合速率。当期望使醛官能团与氨氧基官能团反应以提供肟时，我们推论该倾向可解释现有技术的低结合效率。
我们进一步推论，除了氟的具体定位以外，5-元环比6-元环打开更快。
这些考虑的结果是，但不束缚于它们，我们发现，比起通常的氟化的碳水化合物分子(特别是FDG)，5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖(例如5-18氟-5-脱氧戊糖或3-18氟-3-脱氧戊糖)能更有效地参与结合反应，特别是涉及在这样的脱氧戊糖的开链形式中的羰基的氨基化的结合反应。
因此，从第一方面来看，本发明提供了一种包含生物活性分子和5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖的缀合物。
从第二方面来看，本发明提供了一种制备根据本发明的第一方面的缀合物的方法，所述方法包括使生物活性分子与5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖反应。
从第三方面来看，本发明提供了一种包含本发明的第一方面的缀合物以及药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。
从第四方面来看，本发明提供了一种本发明的缀合物或组合物在人或动物身体上实践的诊断方法中的应用。
从第五方面来看，本发明提供了一种使受试者成像的方法，所述方法包括给予受试者本发明的含18F的缀合物或组合物，并通常使用PET使受试者内的18F的分布成像。
从第六方面来看，本发明提供了一种诊断疾病或状况的方法，其中给予受试者本发明的含18F的缀合物或组合物，使受试者内的18F的分布成像，且疾病或状况如果存在于受试者中，则被诊断。
根据与本发明的第五和第六方面相关的本发明的其它方面，在根据第五和第六方面成像之前，已实现了给予本发明的缀合物或组合物。
从第七方面来看，本发明提供了本发明的含18F的缀合物或组合物在诊断疾病或状况的方法中的应用，其中，给予受试者所述缀合物或组合物，使受试者内的18F的分布成像，且疾病或状况如果存在于受试者中，则被诊断。
从第八方面来看，本发明提供了本发明的含18F的缀合物或组合物在使受试者成像的方法中的应用，所述方法包括通过肠胃外给药(例如注射)给予受试者本发明的缀合物或组合物，并通常使用PET使受试者内的18F的分布成像。
从本发明的第九和第十方面来看，提供了本发明的缀合物在制造用于根据本发明的第五或第六方面的方法中的药物中的应用。
由本发明更详细的讨论和以下随后的实施例，本发明的其它方面和实施方式是显然的。
附图说明
图1描述了吡喃糖和2-[18F]-FDG(1a)及5-[18F]-FDR(1b)的开链形式之间的平衡。
图2描述了5-[19F]-FDR(1b)与肽缀合的流程。
图3描述了冷FDR(1b；5-[19F]-FDR)的已知合成。
图4描述了氨氧基化合物2的已知合成。
图5描述了谷胱甘肽-衍生的氨基氧基化合物3的典型的合成。
图6描述了谷胱甘肽衍生的氨氧基化合物3a与冷FDR(1b；5-[19F]-FDR)的缀合以提供19F-标记的肟缀合物4a的流程。
图7(a)显示了在20℃下的D2O中，19F-标记的肟缀合物4a的构象。图7(b)分别描述了4a的E-异构体和Z-异构体的1H NMR信号(N=CH)。
图8描述了氨氧基化合物2与冷FDR(1b；5-[19F]-FDR)的缀合以提供19F-标记的肟缀合物7的流程。
图9描述了18F-氟核糖(1b；18F-FDR)的已知酶促合成。
图10描述了5-[18F]-FDR(1b)与肽缀合的流程。
具体实施方式
本发明基于这样的发现：比起通常氟化的碳水化合物分子(特别是FDG)，5-氟-5-脱氧戊糖和3-氟-3-脱氧戊糖能更有效地参与结合反应，特别是涉及到开链形式的脱氧戊糖的羰基的氨基化的结合反应，例如以形成肟。因此，本发明有效地允许提供在5-位和/或3-位被18F标记的脱氧戊糖和生物活性分子的缀合物。
根据本发明的所有方面的具体实施方式，存在于5-位或3-位的氟为18F，特别是存在于5-位的氟，由此提供了5-18氟-5-脱氧戊糖。以下具体参考这些实施方式来描述本发明，但并不应被认为局限于此。
本发明使用的术语“结合”或“结合反应”(ligation)旨指两个或更多个分子的偶联(coupling)。本发明使用的这些术语分别与词语“缀合”和“缀合反应”同义。缀合物为结合反应或缀合反应的产物。
如本领域已知的，戊糖为包含5个碳原子的单糖，并且通常具有化学式C5(H2O)5(C5H10O5)。同样如已知的，戊糖可以为醛糖(醛戊糖)或酮糖(酮戊糖)。醛戊糖可以为天然衍生的(D-醛戊糖)或是非天然的(L-醛戊糖)。天然的醛戊糖为D-核糖、D-木糖、D-阿拉伯糖和D-来苏糖。存在四种相应的非天然的L-醛戊糖。在酮戊糖中，2-酮化合物(核酮糖和木酮糖)更常见。
戊糖的脱氧衍生物，即，脱氧戊糖，保留了母体化合物基本的含5个碳原子的结构。本发明中脱氧戊糖是指戊糖，该戊糖的母体化合物具有一个或多个(通常一个、两个或三个)羟基独立地被氢原子或备选的取代基代替。当未指定在x-脱氧戊糖的“x”位的取代基时，习惯上规定羟基被氢原子代替。因此，2-脱氧核糖为其中核糖的2-羟基被未指定的取代基(其可为氢)代替的核糖的衍生物；和2-脱氧核糖为其中核糖的2-羟基被氢代替的核糖的衍生物。
存在于本发明的缀合物的脱氧戊糖中，在母体戊糖中至少5-羟基不存在，并且被氟原子取代，在一些实施方式中，被氟-18取代；和/或在母体戊糖中，3-羟基不存在，并且被氟原子取代，在一些实施方式中，被氟-18取代。换言之，本发明的第一方面的缀合物包含5-氟-5-脱氧戊糖、3-氟-3-脱氧戊糖或3,5-二氟-3,5-二脱氧戊糖，可以理解为3,5-二氟-3,5-二脱氧戊糖为5-氟-5-脱氧戊糖和3-氟-3-脱氧戊糖二者的实例。
在一些实施方式中，在3-和/或5-位被氟标记的脱氧戊糖为2-脱氧戊糖，例如为5-氟-2,5-二脱氧戊糖、3-氟-2,3-二脱氧戊糖、5-氟-2,3,5-三脱氧戊糖；或3-氟-2,3,5-三脱氧戊糖，例如为3,5-二氟-2,3,5-三脱氧戊糖。
当不被氟原子代替时，在脱氧戊糖中不存在的羟基可以被选自由氢、氟以外的卤素、烷基、烯基、炔基、氨基(-NH2)、二烷基氨基和烷氧基组成的组的取代基代替。通常，2-脱氧戊糖中不存在的羟基不被卤素代替，特别是不被氟原子代替。
因此，存在于本发明的缀合物中的脱氧戊糖的实例包括2-脱氧戊糖、3-脱氧戊糖和5-脱氧戊糖，例如5-氟-2,5-二脱氧核糖类，如5-氟-2,5-二脱氧核糖；3-氟-2,3-二脱氧核糖类，如3-氟-2,3-二脱氧核糖；5-氟-3,5-二脱氧核糖类，如5-氟-3,5-二脱氧核糖；和3-氯-5-氟-3,5-二脱氧核糖、5-氟-2,3,5-三脱氧核糖类，如5-氟-2,3,5-三脱氧核糖；3-氟-2,3,5-三脱氧核糖类，如3-氟-2,3,5-三脱氧核糖；和3,5-二氟-2,3,5-三脱氧核糖类，如3,5-二氟-2,3,5-三脱氧核糖，包括前述任何烷基、氨基和烷氧基的衍生物，其中，失去的未指定的具有备选取代基的羟基的脱氧核糖的碳原子被烷基、氨基或烷氧基取代基取代。
本发明中“烷基”是指饱和的烃基，其可以为直链、环状或支化的(通常直链)。当烃基具有一个或多个不饱和部位时，这些部位可由碳-碳双键或碳-碳叁键构成。当烷基包含碳-碳双键时，这提供了烯基；碳-碳叁键的存在提供了炔基。通常烷基、烯基和炔基包含1-10个碳原子，更通常包含1-6个碳原子，应理解的是，烯基和炔基的下限为2个碳原子，环烷基的下限为3个碳原子。
卤素为氟、溴、氯或碘。
烷基氧基(与烷氧基同义)具有式-O-烷基，其中，烷基如上述定义。
二烷基氨基具有式-N(R)2，其中，每个R独立地为烷基或其中与氮原子N连接的两个R连接以形成亚烷基二基(形式上由烷烃衍生，其中的两个氢原子被提取，两个氢通常源自末端碳原子)，从而与氮原子N共同形成环。
通常，根据本发明的各方面的5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖(例如5-18氟-5-脱氧戊糖或3-18氟-3-脱氧戊糖)为醛脱氧戊糖，特别为醛脱氧-D-戊糖。根据本发明各方面的具体实施方式，在5-位或3-位被18F标记的脱氧戊糖为D-脱氧核糖。因此，根据本发明各方面的具体实施方式，脱氧戊糖为5-脱氧-5-18氟-醛戊糖，例如，5-脱氧-5-18氟-D-醛戊糖。根据本发明的具体实施方式，在5-位或3-位被18F标记的脱氧戊糖为5-脱氧-5-18氟核糖或3-脱氧-3-18氟核糖，特别为5-脱氧-5-18氟-D-核糖或3-脱氧-3-18氟-D-核糖。以下所涉及的5-脱氧-5-18氟-D-核糖称为FDR或热FDR(在本发明中，冷FDR是指5-脱氧-5-19氟-D-核糖)，并且本发明的讨论集中于该具体实施方式。然而，不应理解为本发明局限于此。在本发明的讨论中，按照上下文指示，化合物1b可以为(热)FDR或冷FDR。
5-氟-5-脱氧戊糖和3-氟-3-脱氧戊糖(例如5-18氟-5-脱氧戊糖或3-18氟-3-脱氧戊糖)包括但不限于FDR，可以通过化学方法和酶促法制备。例如，在文献中充分描述了FDR的合成(具体参见M Onega等，Chem.Commun.，2010，46，139-141，其中，描述了其合成的酶促路线，而且参见其中涉及的文献；还参见本发明的图9)。技术人员能够容易合成其它5-氟-5-脱氧戊糖和3-氟-3-脱氧戊糖。
本发明的具体的缀合物包含5-18F-标记-5-脱氧戊糖(例如FDR)和生物活性分子以允许缀合物靶向特定的疾病组织或疾病细胞类型。本发明中“生物活性分子”是指在关注的受试者(例如人或动物身体)中呈现药理学效果的分子。
本发明对可以与5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖(例如5-18氟-5-脱氧戊糖或3-18氟-3-脱氧戊糖)缀合的生物活性分子的性质没有特别的限定，条件是生物活性分子易与这些脱氧戊糖缀合。如以下讨论的，同时本发明使用肽和蛋白质来说明，本领域技术人员应理解的是，可以使用各种包括但不限于蛋白质、肽(是指包含2-300个，例如2-20个天然存在的或非天然存在的氨基酸的序列的分子)、核酸、寡糖、多糖和类脂类的生物活性分子。例如，生物活性分子可以为激素、生长因子、抗体(例如嵌合的、人源化的或完全人源抗体)或它们的抗原结合片段。通常，生物活性分子的分子量小于100,000Da，一般小于10,000Da。根据本发明的这些和其它实施方式，所述生物活性分子可以为潜在的药物。
在以下实施例中，使用谷胱甘肽和亲和体蛋白质来说明本发明。选择谷胱甘肽(天然的三肽)作为模型肽来优化缀合条件。为了证明本发明在潜在医疗应用中的用途，描述了亲和体的19F-标记。
该亲和体为在葡萄球菌蛋白质A的免疫球蛋白-结合区域中由B-结构域设计的短蛋白质(6.9kDa)(J.，J.Feldwisch，V.Tolmachev，J.Carlsson，S.和F.Y.Frejd，FEBS Lett.2010，584，2670-2680)。其对于许多类型的癌细胞(例如乳腺癌)中过表达的人类表皮生长因子受体2(HER2)具有皮摩尔亲和力(A.Orlova，M.Magnusson，T.L.J.Eriksson，M.Nilsson，B.Larsson，I.Hoiden-Guthenberg，C.Widstrom，J.Carlsson，V.Tolmachev，S.和F.Y.Nilsson，Cancer Res.2006，66，4339-4348)。迄今为止，亲和体主要与金属核素(例如68Ga和111In)连接用于医疗成像(V.Tolmachev，M.Altai，M.，A.Perols，A.E.，F.Boschetti和A.Orlova，BiocojugateChem.2011，doi:dx.doi.org/10.1021/bc100470x)。关于18F-标记的亲和体的合成存在两个出版物(D.O.Kiesewetter，G.Kramer-Marek，Y.Ma和J.Capala，J.Fluor.Chem.2008，129，799-805；和Z.Cheng，O.P，De Jesus，M.Namavari，A.De，J.Levi，J.M.Webster，R.Zhang，B.Lee，F.A.Syud和S.S.Gambhir，J.Nucl.Med.2008，49，804-813)，两种情况下均采用了疏水性芳香族连接基。
应理解的是，可以成像的靶疾病、组织或细胞的性质仅限于用于靶向关注的细胞或组织的适当的生物活性分子的可用性。任何与疾病组织结合的蛋白质或肽（如与癌症通过例如肿瘤相关抗原结合）可以因此由根据本发明的5-18氟-5-脱氧戊糖或3-18氟-3-脱氧戊糖标记以允许成像(例如，以用于检测或监测)关注的细胞或组织。因此，根据本发明的某些实施方式，本发明提供了使癌组织成像，从而允许诊断和监测癌症。
生物活性化合物与18F-标记的分子(包括18F-标记的芳香族化合物和FDG)缀合的方法为本领域众所周知。如已知的，所述生物活性分子可以通过连接部分(例如水溶性连接部分)与关注的化合物(这里为5-18氟-5-脱氧戊糖或3-18氟-3-脱氧戊糖)缀合。术语"连接部分"或"连接基"为本领域容易理解的术语，是指短的(例如约2-50个原子长，如，约3-10)双官能部分，用于例如衍生生物活性分子，以引入期望的能与关注的化合物缀合的官能团。通常，通过使用连接基也赋予了其它优点。本领域充分提供了适当的连接部分。例如，连接部分可以包含选自由氨氧基、酯、胺、二硫化物和酰亚胺组成的组的官能团中的一种或多种。对于描述抗体-药物缀合物中连接基的使用的回顾参见L.Ducry和B.Stump(Bioconjugate Chem.，2010，21(1)，第5-13页)。
根据本发明的具体实施方式，所述生物活性分子的衍生用于引入显示亲核氨基官能团的连接部分。这可以参与存在于脱氧戊糖的开链形式中的羰基的氨基化。这样的氨基化包括使酰肼-或肼-官能化的生物活性分子与本发明所描述的18F-标记的脱氧戊糖反应，从而提供包含腙键的缀合物；或者，氨基硫脲官能化的生物活性分子与18F-标记的脱氧戊糖反应，从而提供包含缩氨基硫脲键的缀合物。
根据本发明的具体实施方式，可以实现生物活性分子的衍生以引入显示氨氧基(-ONH2)官能团的连接部分。该衍生允许与5-氟或3-氟-(例如，18F-)标记的脱氧戊糖或戊糖通过肟键缀合。这方面的缀合方法为本领域技术人员众所公知(例如，参见T Poethko等，J.Nucl.Med.，2004，45，892-902；T Poethko等，Radiochim.Acta，2004，92，317-327；和M.Schottelius等，Clin.CancerRes，2004，10，3593-3606)。
如上所述，本发明的特别益处在于5-氟或3-氟-(例如，18F-)标记的脱氧戊糖(特别是FDR)在还原性氨基化条件下结合特别快，例如通过氨氧基-官能化的生物活性材料与18F-标记的脱氧戊糖的反应以形成肟键。在此我们证明了这样的反应在温和条件下能直接和有效地进行。事实上，其反应速度比2-FDG快若干数量级。方便地，所述缀合反应可以在pH为4-6的水溶液(可选择无有机溶剂)、环境温度(例如约15℃至约40℃)、相对短的时间尺度(如持续时间为约1-30分钟，例如，约5或约7-30分钟)中进行。特别的益处在于，18F-标记的脱氧戊糖(例如FDR)可以与任选地预活化的生物活性分子缀合以引入适用于与18F-标记的脱氧戊糖反应的官能团，这可以反应而无需任何事先的衍生。
以下的实验部分中，使用“冷”(含19F的)化合物的制备来说明本发明。技术人员应理解的是，当使用相应的含18F的化合物时，相同的化学性将起作用，其反应流程由图10示意性描述。
本发明描述的一些含18F的化合物和含19F的化合物本身为新的，且这些化合物构成了本发明的其它方面。因此，本发明还提供了具有以下结构的化合物：
结构1-4和11-16中，R可以为任何生物活性分子的残基，例如本发明所定义的那些基团，特别是肽或蛋白质的残基。
在结构1-16的每一个中，衍生自5-氟-5-脱氧核糖的每一个结构中右侧描述的部分上的氟原子可以为氟-18或氟-19。因此，当氟原子为氟-18时，结构1-4和11-16的这些实施方式构成了根据本发明的第一方面的缀合物的实施方式。
结构1、3、5、7、11、12和14的化合物描述了含肟缀合物或含腙缀合物的开环形式，其中结构7中的马来酰亚胺易与生物活性分子缀合，从而提供了相应的如结构1中描述的琥珀酰亚胺。
结构2、4、6、8、13和16的化合物描述了含肟缀合物或含腙缀合物的闭环形式，其中结构8中的马来酰亚胺易与生物活性分子缀合，从而提供了相应的如结构2中描述的琥珀酰亚胺。
结构9和10的化合物描述了与生物活性分子连接的琥珀酰亚胺，具有适用于与18F-标记的脱氧戊糖缀合的受限的氨氧基和酰肼官能团，从而提供了本发明的缀合物。
结构15的化合物描述了由如结构14所示的腙还原得到的产物，其改进了水解稳定性。
之前，我们已开发了用于合成[18F]-FDR的生物合成方法(参见Onega等.(下文)和其中引用的参考文献、WO03/020945和WO2004/078914A2)。这种[18F]-FDR及其它5-氟-5-脱氧戊糖和3-氟-3-脱氧戊糖可以容易通过合成的化学合成法制成。
本发明为蛋白质标记提供了显著的优点，并且发现可以通常用于世界各地的PET中心，用于研究和临床目的。以下实验部分说明，与其它糖相比，FDR在说明性缀合反应中的显著更大的反应性，而且在使用技术人员非常熟悉的现有缀合方法时，典型的缀合在技术上是非常简单的。
应理解的是，本发明的缀合物和本发明所描述的其它化合物可以以各种立体异构形式存在。这些化合物应理解为包括所有的立体异构形式和它们的混合物，这包括对映异构体、非对映异构体和外消旋混合物。本发明在其范围内包括任何这样的立体异构形式或立体异构体的混合物的应用，包括本发明的缀合物的单个对映异构体和非对映异构体以及这样的立体异构体的混合物。
技术人员还应理解的是，本发明的一些缀合物含有一种或多种碱性官能团，例如(烷基)氨基。此类缀合物因此能与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”容易被普通技术人员理解，并且在本发明中应理解为，是指本发明的缀合物的相对无毒的、无机和有机酸加成盐。这些盐可以在给药媒介物中原位制备，或者通过使本发明纯化的化合物以游离碱形式与适当的有机或无机酸单独反应，并且在后续纯化期间分离因此形成的盐。代表性盐包括无机盐，例如氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐和硝酸盐；和有机酸盐，例如甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐和乙酸盐。
技术人员还应理解本的是，本发明的一些缀合物含有一种或多种酸性官能团。此类缀合物因此能与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。因此，在本上下文中，术语“药学上可接受的盐”是指本发明的缀合物的相对无毒的、无机和有机碱加成盐。这些盐可以在给药媒介物中原位制备，或者通过使本发明的纯化的化合物以游离酸形式与适当的碱，例如药学上可接受的金属阳离子(例如锂、钠、钾、钙和镁)的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐、与氨，或者与药学上可接受的胺，例如乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶和哌嗪单独反应而制备。
如上所述，本发明的缀合物用于使受试者成像和诊断的方法。在本发明的这些方面的一些实施方式中，事先给予受试者本发明的缀合物。在某些实施方式中，所述成像为PET成像，并且按照设想，本发明易于在PET中心的自动操作。
在典型的PET研究中，给予受试者(通常为人或其它动物)少量的化合物。在受试者内循环从而允许化合物（通常在标靶的组织/细胞类型中）的吸收。根据本发明，鉴于与18F-标记的脱氧戊糖缀合的生物活性分子，所述缀合物优先保留在特定的组织类型中。随后使用PET可以使所述缀合物的分布成像。所得数据为临床医师构成了有用的定量空间信息，临床医师可利用该数据以达到诊断。例如，所述缀合物的不同累积可以说明缀合物已标靶的疾病或细胞类型。
在其它益处中，PET允许研究潜在的候选药物在体内的生物化学变化或代谢效果。采用这种方式，PET可以用于测量药物分布，因此允许评估研究的特定候选药物的药代动力学和药效学。如本领域已知的，PET可以用于定量组织中结合部位的存在。
本发明的缀合物通常用于包含本发明的缀合物以及一种或多种适用于PET成像的药学上可接受的载体的组合物，其量足以使用PET成像设备得到有意义的图像。
适当的药学上可接受的载体为本领域技术人员所公知，且包括但不限于0.1M(且优选0.05M)磷酸盐缓冲液或0.8%盐水。此外，药学上可接受的载体可以为水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的例子为丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化的林格氏或固定油。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。
通常，所述缀合物通过肠胃外给予(一般通过注射给予)。受试者中所述缀合物的引入可以经一次或多次给药(例如注射)。根据本领域普通技术人员通常的能力，这样的给药中通常将缀合物配制为无菌、无热原的、肠胃外可接受的水性溶液。基于受试者的年龄、重量和性别以及仪器方面的考虑，专业临床医师将确定用于研究的受试者的任何合适的量。
本发明所涉及的每一个文件(包括专利和非专利文献)通过参考并入到本发明中，犹如每个文献的全部内容被完整地叙述。
本发明将通过以下描述的非限制性实施例得到进一步说明。
含19F的缀合物(冷缀合物)的制备
通过使用内源性三肽(谷胱甘肽)作为缀合的模型肽进行实验。图2显示了进行的合成流程，该流程包含已知的连接基2与谷胱甘肽或亲和体蛋白质之间的缀合以提供化合物3a和3b，其随后与含19F的FDR(含19F的化合物1b；冷FDR)缀合以提供缀合物4a和4b。
冷FDR(1b；如图3中描述)的合成根据已公布的过程(参见T.Carell等，Angew.Chem.Int.Ed.，2007，46，2325-2327；F.J.Lopez-Herrera等，Tetrahedron，1996，52，4757-4768；A.E.Stutz等，Carbohydr.Res.，1998，305，331-336；和M.J.Weiss等，J.Am.Chem.Soc.，1958.80，5559-5564)进行。
连接基2根据公布的过程(M.Berndt等，Nuclear Medicine Biology，2007，34，5-15)合成。
2与谷胱甘肽之间的缀合在水中于室温下超过3分钟完成，经完全转化得到化合物3a。化合物3a的制备如图5所示。进行制备的典型例子如下：在25℃下，将连接基2(12.4mg，50.0μmol)和谷胱甘肽(15.4mg，50.0μmol)在无菌水(1mL)中的溶液在Eppendorf管中孵育3分钟。HPLC分析表明实现完全转化。将所得到的3a(50mM)的水溶液分成等分试样，并且储存于-80℃下以进一步使用。因此而得的3a用于随后的缀合而无需任何纯化。为了方便分析，通过经过C18RP柱方便地纯化3a。
由于谷胱甘肽的硫醇基从两侧攻击2的碳-碳双键，得到的3a作为非对映异构体的混合物(如所示的)，这解释了纯化的化合物的HPLC跟踪中的肩状外观。
文献(例如，J.W.Haas，Jr.和R.E.Kadunce，J.Am.Chem.Soc.，1962，84，4910-4913)指出，在25℃下，D-核糖形成肟的最佳pH约为4.6。因此，在25℃下，化合物3a(20mM)与FDR(1b)(20mM)在乙酸钠缓冲液(0.25M，pH4.6)中孵育，在7分钟内完全转化导致了肽-糖缀合物4a的形成。缀合物4a的制备的典型过程如图6所述。进行以下制备：
测试规模的实验：在25℃下，将3a(1.0mg，2.0μmol)和FDR(0.3mg，2.0μmol)在乙酸钠缓冲液(100μL，0.25M，pH4.6)中的溶液在Eppendorf管中孵育。以一定的时间间隔取出样品(每次2μL)并用水稀释50倍以用于HPLC分析。反应在7分钟内达到完全转化。
制备规模的实验：在25℃下，将3a(10.4mg，20.0μmol)和FDR(3.0mg，20.0μmol)在乙酸钠缓冲液(1mL，0.25M，pH4.6)中的溶液在Eppendorf管中孵育7分钟。将反应混合物负载于C18RP筒柱上。柱子用水(5×2mL，0.1%甲酸)洗涤，随后用洗脱缓冲液(30%CH3CN，0.1%甲酸水溶液，通常10mL)洗涤。使含有产物4a的洗脱部分合并，并将合并的溶液冷冻干燥，得到白色固体产物4a(12.9mg，19.8μmol，分离收率99%)。1H NMR(500MHz，CD3OD)δ7.40(d，J=6.8Hz，0.8H，N=CH，E-异构体)，6.78(d，J=6.0Hz，0.2H，N=CH，Z-异构体)，4.93(dd，J=6.0Hz，3.0Hz，0.2H，N=CHCH，Z-异构体)，4.58(m，1H)，4.43(d，J=3.7Hz，1H)，4.37(dd，J=6.8Hz，4.1Hz，0.8H，N=CHCH，E-异构体)，3.98(m，3H)，3.83(s，2H)，3.76，(m，2H)，3.63(t，J=7.0Hz，2H)，3.39(t，J=7.0Hz，2H，NCH2)，3.21(m，2H)，2.99(1H)，2.60(dddd，1H)，2.21(m，2H)，2.02(q，2H)，1.43(m，4H)，1.20(m，4H)。19F NMR(470MHz，D2O)δ-234.70(ddt，J=47.4Hz，24.4Hz)，-235.38(ddt，J=47.5Hz，25.5Hz)。
为了证实产物的同一性，4a通过经过Alltech C18圆筒/柱分离并经质谱(MS)、1D和2D NMR分析。如图7所示，1H NMR表明了缀合物只以开环形式(在20℃下，E/Z比率4:1)在溶液(D2O)中存在。对于E-异构体，亚胺质子出现在7.40ppm(N=CH，d，J=6.8Hz)，且在Z-异构体中，相应的部分在6.78(d，J=6.0Hz)。这种简单的缀合可以促进将来的GMP评价，用于PET示踪剂的常规生产。与此相反，2-FDG与肽/蛋白质的缀合产生若干额外的异构产物(例如，闭环、开环的)。因此本发明允许提供更均匀的产物。
稳定性研究证实，在37℃下，缀合的4a在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稳定至少8小时，对于PET应用这足够稳定。
底物浓度影响4a和1b的缀合效率。在pH4.6下，在25℃下，当相对高浓度的3a(20-50mM)与一当量的1b反应(参见表1，条目1和2)时，在3-7分钟内观察到定量形成的4a。当施用相对低浓度的3a(1mM)和1b(1mM)时，在其它相同的条件下，需要110分钟使反应完全(条目3)。然而，数据显示，在反应介质相对宽的pH范围(2.6-6.0)和合理的反应时间(<30分钟)内，可以实现3a与1b之间的缀合，最佳的pH为4.6(表1，条目2)。与FDG缀合需要低至pH1-2的pH值和高达130℃的温度相比，在pH4-7和25℃的条件下，与FDR缀合的可行性表现出明显的优点。
表1在25℃下，底物(3a和1b)浓度和介质pH对缀合效率的影响。
为了证实在FDR1b5-位的氟化具有特定的能力以提高缀合速率的假设，使用其它糖与3a进行缀合。在相同的反应条件下，与相应的非氟化的D-核糖(条目1和2)相比，5-FDR1b反应明显更快，并且比D-葡萄糖(条目3)快得多。3a与2-FDG(1b)的缀合相当迟缓，反应经过18小时的转化率为48%，该条件由于其低效率不能用于热标记实验。
表2在25℃下，在pH4.6下，3a(20mM)与糖(20mM)之间的缀合(6-FDG=6-氟-6-脱氧-D-葡萄糖)
为了确立肽序列的存在是否影响缀合产物，无蛋白质的缀合物7的制备如图8所示。进行以下制备：
在25℃下，将连接基2(12.4mg，50.0μmol)和FDR1b(7.6mg，50.0μmol)在乙酸钠缓冲液(1mL，pH=4.6，0.25M)中的溶液在Eppendorf管中孵育7分钟。HPLC分析表明达到完全转化。将得到的反应混合物经过C18RP柱(Alltech，High Capacity C18)。将该柱用水(5mL，含有0.1%甲酸)洗涤。用缓冲液(10%CH3CN，0.1%甲酸)从柱子中洗脱化合物7。合并含有7的部分并冷冻干燥一整夜，得到半固体状的产物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.44(d，J=6.8Hz，0.8H，N=CH，E-异构体)，6.78(d，J=6.0Hz，0.2H，N=CH，Z-异构体)，6.72(s，2H，马来酰亚胺)，4.93(dd，J=6.0Hz，3.0Hz，0.2H，N=CHCH，Z-异构体)，4.58(d，J=3.1Hz，1H)，4.46(d，J=3.7Hz，1H)，4.36(dd，J=6.8Hz，4.1Hz，0.8H，N=CHCH，E-异构体)，3.98(t，J=6.6Hz，2H，CH2ON)，3.76，(m，1H)，3.73(m，1H)，3.39(t，J=7.0Hz，2H，NCH2)，1.55(m，4H)，1.20(m，4H)。19F NMR(376MHz，D2O)δ-234.70(dt，J=47.4Hz，24.4Hz)，-235.38(dt，J=47.5Hz，25.5Hz)。
NMR分析表明E-:Z-异构体比率与4a的类似。因此，该实验表明氨氧基化合物3a与化合物1b的有效缀合不是因为对具体的含氨氧基的化合物的使用。
含18F的缀合物的制备
以上描述的类似的关于合成冷的含5-19F的缀合物的方法可以用于制备本发明的含3-19F的缀合物和含18F的缀合物。例如，热FDR可以根据常规的酶促方法生产((参见Onega等人(下文)和其中引用的参考文献、WO03/020945和WO2004/078914A2)，如图9中的示意描述。此外，技术人员容易能够通过化学合成制备其它的含18F的脱氧戊糖。
使用亲和体的18F-标记谷胱甘肽的例子如图10所述。如技术人员所理解的，所涉及的化学方法与以上描述的关于冷缀合物的制备完全类似。
关于以下非限制性条款，可以进一步理解本发明：
1、一种缀合物，所述缀合物包含生物活性分子和5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖。
2、条款1的缀合物，其中，所述5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖为醛脱氧戊糖。
3、条款1或条款2的缀合物，其中，所述5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖为2-脱氧戊糖。
4、条款3的缀合物，其中，所述2-脱氧戊糖在2-位具有选自由氢、烷基、烯基、炔基、氨基、二烷基氨基和烷氧基组成的组的取代基。
5、前述条款中任意一项的缀合物，其中，所述5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖为5-氟-3,5-二脱氧戊糖或3-氟-3,5-二脱氧戊糖，其中，所述5-氟-3,5-二脱氧戊糖在3-位具有取代基，且所述3-氟-3,5-二脱氧戊糖在5-位具有取代基，在3-位和5-位的所述取代基选自由氢、卤素、烷基、烯基、炔基、氨基、二烷基氨基和烷氧基组成的组。
6、前述条款中任意一项的缀合物，其中，所述5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖为脱氧-D-核糖。
7、前述条款中任意一项的缀合物，其中，所述生物活性分子经由连接部分与脱氧戊糖缀合。
8、前述条款中任意一项的缀合物，其中，所述生物活性分子通过肟键、腙键或缩氨基硫脲键与脱氧戊糖缀合。
9、条款8的缀合物，其中，所述缀合物具有以下结构之一：
其中，R表示生物活性分子。
10、条款8或条款9的缀合物，其中，所述生物活性分子通过肟键与脱氧戊糖缀合。
11、前述条款中任意一项的缀合物，其中，所述生物活性分子为蛋白质或肽。
12、前述条款中任意一项的缀合物，其中，所述5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖为5-18氟-5-脱氧戊糖或3-18氟-3-脱氧戊糖。
13、条款12的缀合物，其中，所述5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖为5-脱氧-5-18氟-D-核糖或3-脱氧-3-18氟-D-核糖。
14、条款13的缀合物，其中，所述5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖为5-脱氧-5-18氟-D-核糖或3-脱氧-3-18氟-D-核糖。
15、前述条款中任意一项的缀合物，其中，所述5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖为5-氟-5-脱氧戊糖。
16、一种制备在条款1-14中任意一项中所限定的缀合物的方法，所述方法包括使生物活性分子与5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖反应。
17、条款16的方法，其中，所述生物活性分子与5-氟-5-脱氧戊糖反应。
18、条款16或条款17的方法，其中，所述生物活性分子包含氨氧基官能团。
19、一种组合物，所述组合物包含在条款1-15中任意一项所限定的缀合物以及药学上可接受的载体或稀释剂。
20、条款19的组合物，其中，在所述缀合物中的5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖为18F-脱氧戊糖。
21、包含在条款1-15中任意一项所限定的18F-脱氧戊糖的缀合物在人或动物身体上实践的诊断方法中的应用。
22、一种使受试者成像的方法，所述方法包括给予受试者包含在条款1-15中任意一项所限定的18F-脱氧戊糖的缀合物或在条款20中所限定的组合物，并通常使用PET使受试者内的18F的分布成像。
23、一种诊断疾病或状况的方法，其中，给予受试者包含在条款1-15中任意一项所限定的18F-脱氧戊糖的缀合物或在条款20中所限定的组合物，使受试者内的18F的分布成像，且疾病或状况如果存在于受试者内，则被诊断。
24、一种包含在条款1-15中任意一项所限定的18F-脱氧戊糖的缀合物或在条款20中所限定的组合物在诊断疾病或状况的方法中的应用，其中，给予受试者所述缀合物或组合物，在受试者内使18F的分布成像，且疾病或状况如果存在于受试者内，则被诊断。
25、一种包含在条款1-15中任意一项所限定的18F-脱氧戊糖的缀合物或在条款20中所限定的组合物在使受试者成像的方法中的应用，所述方法包括通过肠胃外给药(例如注射)给予受试者本发明的缀合物或组合物，并通常使用PET使受试者内的18F的分布成像。
26、一种包含在条款1-15中任一意项所限定的18F-脱氧戊糖的缀合物在制造用于条款22或条款23中所限定的方法中的药物中的应用。

Claims (29)

1.一种生物活性分子和5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖的缀合物，其中，所述生物活性分子选自由蛋白质、肽、核酸、寡糖和多糖组成的组。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中，所述5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖为醛脱氧戊糖。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的缀合物，其中，所述5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖为2-脱氧戊糖。
4.根据权利要求3所述的缀合物，其中，所述2-脱氧戊糖在2-位具有选自由氢、烷基、烯基、炔基、氨基、二烷基氨基和烷氧基组成的组的取代基。
5.根据前述权利要求中任意一项所述的缀合物，其中，所述5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖为5-氟-3,5-二脱氧戊糖或3-氟-3,5-二脱氧戊糖，其中，所述5-氟-3,5-二脱氧戊糖在3-位具有取代基，和所述3-氟-3,5-二脱氧戊糖在5-位具有取代基，在3-位和5-位的所述取代基选自由氢、卤素、烷基、烯基、炔基、氨基、二烷基氨基和烷氧基组成的组。
6.根据前述权利要求中任意一项所述的缀合物，其中，所述5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖为脱氧-D-核糖。
7.根据前述权利要求中任意一项所述的缀合物，其中，所述生物活性分子经由连接部分与脱氧戊糖缀合。
8.根据前述权利要求中任意一项所述的缀合物，其中，所述生物活性分子通过肟键、腙键或缩氨基硫脲键与脱氧戊糖缀合。
9.根据权利要求8所述的缀合物，其中，所述缀合物具有以下结构之一：
其中，R表示生物活性分子。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的缀合物，其中，所述生物活性分子通过肟键与脱氧戊糖缀合。
11.根据前述权利要求中任意一项所述的缀合物，其中，所述生物活性分子为蛋白质或肽。
12.根据前述权利要求中任意一项所述的缀合物，其中，所述5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖为5-18氟-5-脱氧戊糖或3-18氟-3-脱氧戊糖。
13.根据权利要求12所述的缀合物，其中，所述5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖为5-脱氧-5-18氟-D-核糖或3-脱氧-3-18氟-D-核糖。
14.根据权利要求13所述的缀合物，其中，所述5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖为5-脱氧-5-18氟-D-核糖或3-脱氧-3-18氟-D-核糖。
15.根据前述权利要求中任意一项所述的缀合物，其中，所述5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖为5-氟-5-脱氧戊糖。
16.一种制备权利要求1-14中任意一项所限定的缀合物的方法，所述方法包括使生物活性分子与5-氟-5-脱氧戊糖或3-氟-3-脱氧戊糖反应。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述生物活性分子与5-氟-5-脱氧戊糖反应。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中，反应的所述生物活性分子使用连接部分衍生。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述连接部分显示亲核氨基部分。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述亲核氨基部分为氨基、氨氧基、肼基或氨基硫脲基官能团。
21.根据权利要求16-20中任意一项所述的方法，其中，所述生物活性分子包含氨氧基官能团。
22.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-15中任意一项所限定的缀合物以及药学上可接受的载体或稀释剂。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中，所述缀合物为18F-脱氧戊糖的缀合物。
24.权利要求1-15中任意一项所限定的18F-脱氧戊糖的缀合物在人或动物身体上实践的诊断方法中的应用。
25.一种使受试者成像的方法，所述方法包括给予受试者权利要求1-15中任意一项所限定的18F-脱氧戊糖的缀合物或在权利要求23中所限定的组合物，并通常使用PET使受试者内的18F的分布成像。
26.一种诊断疾病或状况的方法，其中，给予受试者权利要求1-15中任意一项所限定的18F-脱氧戊糖的缀合物或权利要求23中所限定的组合物，使受试者内的18F的分布成像，且疾病或状况如果存在于受试者内，则被诊断。
27.权利要求1-15中任意一项所限定的18F-脱氧戊糖的缀合物或在权利要求23中所限定的组合物在诊断疾病或状况的方法中的应用，其中，给予受试者所述缀合物或组合物，在受试者内使18F的分布成像，且疾病或状况如果存在于受试者内，则被诊断。
28.权利要求1-15中任意一项所限定的18F-脱氧戊糖的缀合物或在权利要求23中所限定的组合物在使受试者成像的方法中的应用，所述方法包括通过肠胃外给药，例如注射，给予受试者本发明的缀合物或组合物，并通常使用PET使受试者内的18F的分布成像。
29.权利要求1-15中任意一项所限定的18F-脱氧戊糖的缀合物在制造用于权利要求25或权利要求26所限定的方法中的药物中的应用。
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