KR102110182B1 - 신규한 옥심 유도체 화합물 및 이를 포함한 항체-약물 복합체 - Google Patents

신규한 옥심 유도체 화합물 및 이를 포함한 항체-약물 복합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 옥심 유도체 화합물 및 이를 포함하는 항체-약물 복합체에 관한 것으로, 본 발명에 따른 옥심 링커는 종래의 옥심 링커와 비교해서 안정성이 우수하고, 항체-약물 복합체 형성 시 합성 수율이 높으며, 본 발명의 링커에 의한 약물의 소수성 감소 효과로 항체-약물 복합체의 항응집성 및 약물 전달 효율을 높여주며, 구조적 안정성이 높아 치료제로서 우수한 활용성을 갖는다.

Description

신규한 옥심 유도체 화합물 및 이를 포함한 항체-약물 복합체{NOVEL OXIME DERIVATIVE COMPOUNDS AND ANTIBODY-DRUG CONJUGATE COMPRISING THEREOF}
본 발명은 신규한 옥심 유도체 화합물 및 이를 포함하는 항체-약물 복합체에 관한 것이다.
항체-약물 복합체(Andibody-Drug Conjugate, ADC)는 기존의 항체 의약품을 대체하기 위하여 개발되고 있는 의약품이다. 항체는 특정 암세포로 도달하는 역할을 하며 약물은 암세포를 사멸시키는 것으로 항체-약물 복합체는 특정 암세포만 선택적으로 사멸시킨다는 장점이 있다. 이러한 항체-약물 복합체가 효과적으로 암세포 안으로 운반되게 하기 위해서는 항체와 약물을 결합시켜주는 링커가 중요한 역할을 담당한다.
그러나 기존 항체-약물 복합체의 링커는 구조적 안정성이 낮아 혈액 내에서 순환되는 동안에 빠르게 분해되어 약물이 정상세포에 영향을 끼치거나, 대부분의 약물이 소수성이 높아 여러 개의 링커-약물이 항체에 결합되는 경우 소수성에 의해 응집되어 혈액 내에서 빠르게 제거되는 문제가 있었다.
예를 들어, SMCC 링커는 링커가 한 개의 모이어티로 구성되어 하나의 분자안에 두 가지의 다른 작용기를 보유하고 있는데, 트라스트주맙 엡타신(trastuzumab emtansine, (Kadcyla®))에 사용된 대표적 소수성 링커로, 암세포 내로 내포되었을 시 링커가 끊어지지 않고 항체가 먼저 분해되면서 링커-약물 복합체가 분리되어 암세포를 사멸시키는 기작을 갖는다. 그러나, SMCC 링커는 말단에 각각 숙신이미딜(succinimidyl)기와 말레이미드(maleimide)기를 가지고 있어 링커자체의 소수성이 매우 높기 때문에, 항체-약물 복합체를 형성하는 경우 소수성 증가에 의한 응집현상이 발생해 항체에 여러 개의 약물을 결합시킬 수 없고 불안정한 문제가 있다.
또한, 펩타이드 결합 등을 통해서 분자 내에 서로 다른 작용기를 도입한 한가지 이상의 모이어티로 구성된 링커의 예로 히드라존 링커 (Hydrazone linker)가 있다. 히드라존 링커는 두 개의 다른 작용기를 보유하고 있는 모이어티를 펩타이드 결합을 통해서 결합된 것으로, 한쪽 말단에는 히드라지드기 (hydrazide group)가 있어, 알데히드기를 가진 물질과 결합 시-C=N-NH-CO-의 히드라존 결합 (hydrazine bond)이 생성된다. 세포 내의 산성 pH 조건에서 C=N 결합이 분해되도록 설계되었으나, 히드라존 결합이 산성이 아닌 pH 조건에서도 분해되는 부작용이 있다. 또한 가수분해가 일어나기 때문에 혈액 내에서 순환되는 동안 링커가 분해되면 특정 타겟팅 역할을 하는 항체의 소실로 인해 약물이 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 치명적인 독성을 끼칠 위험이 존재한다.
마지막으로, 아미노산의 일종인 발린(valine)과 시트룰린(citrulline)을 펩타이드 결합을 통해서 붙인 펩타이드성 링커가 있다. 세포 내의 단백질 분해 효소에 의해 분해되도록 설계되었으나, 세포 내뿐만 아니라 세포 외에 존재하는 단백질 분해효소에 의해서도 링커가 끊어질 염려가 있다.
따라서, 효능이 우수한 항체-약물 복합체의 개발을 위해 이러한 문제점을 극복할 수 있는 링커의 개발이 여전히 필요하며, 특히, 항체-약물 복합체의 체내 약물 전달 효율 및 안정성을 높일 수 있는 링커의 개발이 요구된다.
상기 종래 링커의 문제점을 해결하고, 우수한 링커를 개발하기 위해, 본 발명의 발명자가 연구를 거듭한 결과, 옥심 결합의 일 측면에 소수성 모이어티와 다른 일 측면에 친수성 모이어티를 갖는 옥심 유도체 화합물을 합성하였고, 이를 소수성과 친수성을 동시에 가지면서 구조적으로 안정한 링커로 사용할 수 있음을 확인 하였다. 또한, 항체-약물 복합체의 소수성 값을 낮출 수 있어 항체에 약물 로드 효율과 약물 전달 효율을 높일 수 있고, 세포 내 산성 pH 조건에서만 분해되는 특성을 통해 체내 안정성을 높일 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 구조적 안정성을 가지면서 약물전달효율을 높일 수 있는 양친매성 링커로 활용할 수 있는 옥심 유도체 화합물에 관한 것으로, 링커의 항-응집성에 의하여 항체에 다수 개의 약물을 결합시킬 수 있어 약물 전달 효율을 높일 수 있으며, 세포의 라이소좀의 특정 산성 환경 조건에서만 분해되는 결합을 가지므로 체내 안정성이 우수한 링커 및 항체-약물 복합체를 제공한다는 점에서 특징을 갖는다.
상기 종래의 링커의 문제점을 해결하고, 체내 안정성 및 약물 전달 효율이 우수한 링커 및 항체-약물 복합체 (ADC)를 제공하기 위해, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 옥심 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.
또한, 본 발명은 화학식 2로 표시되는 항체-링커-약물 복합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.
본 발명에 따른 옥심 링커는 종래의 옥심 링커와 비교해서 안정성이 우수하고, 항체-약물 복합체 형성 시 합성 수율이 높으며, 본 발명의 링커에 의한 약물의 소수성 감소 효과로 항체-약물 복합체의 항응집성을 높여주며, 구조적 안정성이 높아 치료제로서 우수한 활용성을 갖는다.
도 1a 및 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 옥심 결찰 반응 (oxime ligation reaction)에서의 HPLC 트레이스 (trace)의 시간 경과에 따른 프로파일을 나타내는 것으로, 1a는 12 시간 반응 동안 전체 체류 시간 범위에서 RP-HPLC 크로마토그램, 1b는 8 시간 반응에서 35-50 분의 체류 시간에 대한 확대 RP-HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 조 옥심 링커 (2a) 및 정제 옥심 링커 (2b)의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 데콘볼루티드 (deconvoluted) 질량 스펙트럼을 보여주는 옥심 링커에 대한 양성모드 ESI-MS 분석 결과로, 393 Da 피크는 [M+Na+-H2O]+이고 411 Da 피크는 [M+Na]+ 을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 37 ℃에서 pH 7.0 및 pH 4.0의 PBS에서의 옥심 링커의 분해 프로파일 결과를 나타낸다.
도 5a, 5b 및 5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 옥심 링커-DM1 복합체의 RP-HPLC 크로마토그램 결과를 나타내는 것으로, 5a는 DM1, 5b는 정제된 옥심 링커-DM1 복합체, 그리고 5c는 조 옥심 링커-DM1 복합체에 대한 크로마토그램 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 데콘볼루티드 (deconvoluted) 질량 스펙트럼을 보여주는 옥심 링커-DM1 복합체 (50분 및 51분)에 대한 양성모드 ESI-MS 분석결과로, 1,130 Da 피크는 [M+Na+-H2O]+이고 1,148 Da 피크는 [M+Na]+ 을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 고정화된 허셉틴®에 EDC/NHS 활성화된 D-글루쿠론산 결합의 SPR 센서그램 분석 결과 이다; (A) EDC/NHS를 이용한 CM5 칩 표면 활성화, (B) 허셉틴 (Herceptin®) 고정화, (C) 글리신 완충제로 비결합된 허셉틴 세척, (D) 비활성화 D-글루쿠론산, (E) 활성화된 D-글루쿠론산.
도 8는 본 발명의 일 실시예에 따른 고정화된 허셉틴®에 EDC/NHS 활성화된 DM1-옥심 링커 복합체의 SPR 센서그램 분석 결과이다; (A) EDC/NHS를 이용한 CM5 칩 표면 활성화, (B) 허셉틴® 고정화, (C) 글리신으로 비결합 제거, (D) 고정화 허셉틴 ®에 대한 활성화된 DM1-옥심 링커 컨쥬게이션.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) 허셉틴®, (B) ADC-AL 그리고 (C) 표준 단백질; 티로글로불린 (thyroglobulin, 670 kDa), r-글로불린 (r-globulin, 158 kDa), 오브알부민 (Ovalbumin, 44 kDa), 미오글로빈 (Myoglobin, 17 kDa), 비타민 B (Vitamin B, 1.35 kDa)의 크기-배제 크로마토그램 결과와 (D) 단백질 표준 곡선을 나타낸다 (위에서부터 차례로 A-D).
도 10a 및 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 허셉틴-양친매성 옥심 링커-DM1 복합체 (ADC-AL, 10a)와 캐싸일라 (Kadcyla®, 10b)의 HIC(butyl)-HPLC 크로마토그램 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 허셉틴(Herceptin®) 및 ADC-AL 단편 (Fc, LC, Fd 영역)의 MS 스펙트럼 결과를 나타낸다: (a) 허셉틴 (Herceptin®) Fc 영역, (b) ADC-AL의 Fc 영역, (c) 허셉틴(Herceptin®) LC 영역, (d) ADC-AL의 LC 영역, (e) 허셉틴 (Herceptin®) Fd 영역 및 (f) ADC-AL의 Fd 영역.
도 12a 및 12b는 본 발명의 일 실시예에 따른 MDA-MB-231 (Her2 음성 세포주, 12a), SK-BR-3 (Her2 양성 세포주, 12b)에 대한 허셉틴 (Herceptin®), 캐싸일라 (Kadcyla®) 또는 ADC-AL을 각각 처리한 후, 세포 생존능을 확인한 결과이다.
본 발명은 화학식 1로 표시되는 옥심 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.
또한, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 링커로서 포함하는 항체-약물 복합체를 제공한다.
본 발명에 있어서 "치환된" 이란 하나 이상의 수소 원자가 할로겐 원자, 히드록시기, 니트로기, 시아노기, 아미노기, 아미디노기, 히드라진, 히드라존, 카르복실기나 그의 염, 술폰산기나 그의 염, 인산이나 그의 염, 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 탄소수 1 내지 10의 알케닐기, 탄소수 1 내지 10의 알키닐기, 탄소수 6 내지 10의 아릴기, 탄소수 7 내지 20의 아릴알킬기, 탄소수 4 내지 20의 헤테로아릴기 또는 탄소수 5 내지 20의 헤테로아릴알킬기로 치환될 수 있음을 의미한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명은 화학식 1로 표시되는 옥심 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염에 관한 것이다. 구체적으로는 하기 화학식 1의 구조의 양친매성 옥심 링커에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112017091722700-pat00001
본 발명의 옥심 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 옥심 결합의 일 측면인 -R1-X에 친수성 모이어티를 가지고, 또 다른 측면인 -R2-Y에 소수성 모이어티를 포함하는 양친매성 특성을 갖는 화합물 일 수 있다. 상기 옥심 유도체 화합물은 구체적으로 항체-약물 복합체의 형성에서 링커로서 포함될 수 있다. 본 발명의 옥심 유도체 화합물이 링커로 사용되는 경우, 친수성 모이어티와 소수성 모이어티를 포함하는 양친매성 특성을 나타내므로 항체에 결합되는 약물의 숫자가 증가해도 약물-항체 복합체의 소수성 값이 낮고, 산성 조건에서만 옥심 결합이 분해되어 구조적 안정성이 우수한 특성을 갖는다. 따라서 본 발명의 옥심 유도체 화합물을 링커로 이용하는 경우, 항체-약물 복합체의 응집 현상 개선에 따른 체내 안정성 및 약물의 전달 효율 향상과 정상세포에서 약물이 분해되어 작용하는 부작용을 줄일 수 있는 우수한 효과를 갖는다.
본 발명의 화학식 1의 옥심 유도체 화합물은 옥심 결합을 갖는 것을 특징으로 하는바, 옥심 결합은 산성 pH 조건에서만 결합이 분해되고, 중성 pH에서는 높은 안정성을 갖는 특성을 갖는다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 1의 옥심 링커와 종래 히드라존 링커의 pH 안정성을 확인 한 결과, pH 7.0에서 종래 히드라존 링커는 약 30% 이상이 히드라존 결합이 분해되었으나, 본 발명의 옥심 링커는 10% 미만으로 옥심 결합이 분리되는 효과를 갖는 것을 확인 하였다. 이는 본 발명의 옥심 링커를 이용하여 항체-약물 복합체를 형성하여 체내에 주입하는 경우, 정상세포의 환경(pH 7.0 수준)에서는 링커의 분해가 거의 일어나지 않아 정상세포에 대한 약물의 부작용이 나타나지 않는 것으로, 종래 히드라존 링커의 부작용 문제를 1/3 수준으로 낮출 수 있다는 점에서 큰 `의미를 갖는다.
상기 화학식 1에서, R1은 Cn(H2O)n 이고, n은 1 내지 10의 정수일 수 있다. 구체적으로, 상기 R1은 모노오스, 디오스, 트리오스, 테트로오스, 펜토오스, 헥소오스, 헵토오스, 옥토오스, 노노오스 또는 데코오스 인 단당류 일 수 있고, 상기 단당류는 L형과 D형, 알파-형태 또는 베타-형태의 단당류를 모두 본 발명에 포함된다. 바람직하게, R1은 n이 4 내지 10의 정수인, 테트로오스, 펜토오스, 헥소오스, 헵토오스, 옥토오스, 노노오스 또는 데코오스 일 수 있다. 더욱 바람직하게 상기 R1은 n이 5 또는 6인 펜토오스, 헥소오스 일 수 있으며, 상기 펜토오스의 일 예로 크실로오스 아라비노오스, 리불로오스, 릭소오스, 리보오스, 데옥시리보오스 및 이의 유도체가 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 헥소오스의 일 예로 글루코오스, 프럭토오스, 갈락토오스, 타가토오스, 로스보오스, 푸코오스, 퀴노보오스, 람노오스, 알트로오스 또는 알로오스이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 R1은 개환되거나 개환되지 않은 형태의 단당류를 모두 포함한다.
본 발명의 옥심 유도체 화합물은 옥심 결합의 일 측면에 탄수화물 모이어티를 포함함으로써 항체-약물 복합체 형성 시 소수성 값을 감소시킬 수 있다. 상기 복합체에서 소수성 값이 감소되면, 항체에 결합시키는 약물의 수를 늘릴 수 있어 적은 양의 복합체로도 우수한 치료 효과를 가질 수 있고, 복합체의 응집현상을 줄여, 체내 안정성을 높이는 효과를 갖는다.
상기 화학식 1에서 R2는 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알킬기 일 수 있다. 바람직하게는 비치환된 C1-C20의 알킬기 일 수 있다. 상기 R2에서 알킬기의 탄소수가 상기 범위를 벗어나는 경우, 링커의 소수성 성질이 강해져 양친매성 특성에 영향을 줄 수 있다.
상기 화학식 1에서 R3는 수소 (-H) 또는 히드록시기 (-OH) 이며, 바람직하게는 수소 일 수 있다.
상기 화학식 1에서 X는 항체의 라이신과 결합할 수 있는 작용기 일 수 있고, 구체적으로 친수성을 갖는 항체의 라이신과 결합할 수 있는 작용기 일 수 있다. 상기 X는 일 예로 카르복실기(-COOH), 알데히드기(-CHO) 및 케톤기(-CO-R4)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 본 발명의 옥심 유도체가 항체-약물 복합체에서 링커로서 사용되는 경우, 상기 친수성 작용기는 항체의 라이신과 결합할 수 있다. 본 발명의 화합물이 링커로 사용되는 경우, 항체와 결합되는 부위가 친수성을 내어, 항체에 다수의 링커-소수성 약물의 복합체가 결합하는 경우에도 항체-약물 복합체의 응집이 일어나지 않는 장점이 있다. 이는 특히, 항체-약물 복합체의 응집에 의해 혈액 내에서 빠르게 제거되어, 약물 전달 효율을 낮추고 정상 세포에 약물 독성을 일으킬 수 있는 종래 링커 및 항체-약물 복합체의 문제점을 해결할 수 있다는 점에서 중요하다.
상기 R4는 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알킬기일 수 있다.
상기 화학식 1에서 Y는 약물과 결합하는 작용기 일 수 있고, 구체적으로 소수성 약물과 결합할 수 있는 소수성 작용기 일 수 있다. 상기 Y는 말레이미드기(
Figure 112017091722700-pat00002
) 및 싸이올기(-SH)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다. 본 발명의 화학식 1의 옥심 유도체를 링커로 사용하여 항체-약물 복합체를 형성하는 경우, 결합된 약물의 소수성을 낮춰, 항체-약물 복합체가 응집되는 문제를 개선할 수 있다. 이는 특히, 항체-약물 복합체의 응집에 의해 혈액 내에서 빠르게 제거되어, 약물 전달 효율을 낮추고 정상 세포에 약물 독성을 일으킬 수 있는 종래 링커 및 항체-약물 복합체의 문제점을 해결할 수 있다는 점에서 중요하다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 옥심 유도체는 화학식 1-1의 화합물 일 수 있다.
[화학식 1-1]
Figure 112017091722700-pat00003
상기 화학식 1-1에서, a는 1 내지 20의 정수이고, X 및 Y는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.
또한, 본 발명의 옥심 유도체는 하기의 화학식 1-2의 화합물 일 수 있다.
[화학식 1-2]
Figure 112017091722700-pat00004
상기 화학식 1-2에서 X 및 Y는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.
상기 화학식 1-1 또는 1-2의 구조를 갖는 옥심 유도체 화합물은 일 측면인 X와 다른 일 측면인 Y 각각에 친수성 작용기와 소수성 작용기와 옥심결합을 포함한다. 따라서, 화학식 1-2의 화합물을 링커로 사용하는 경우 형성된 복합체의 소수성 성질을 낮춰 주어, 복합체 안정성 및 약물 전달 효율을 놓일 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 옥심 유도체는 보다 구체적으로, 화학식 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 및 1-8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다.
[화학식 1-3]
Figure 112017091722700-pat00005
[화학식 1-4]
Figure 112017091722700-pat00006
[화학식 1-5]
Figure 112017091722700-pat00007
[화학식 1-6]
Figure 112017091722700-pat00008
[화학식 1-7]
Figure 112017091722700-pat00009
[화학식 1-8]
Figure 112017091722700-pat00010
상기 화학식 1-7 또는 화학식 1-8에서 R4는 화학식 1에서 정의한 바와 같다.
본 발명의 일 실시예에 따라, X에 카르복실기를 포함하고, Y에 말레이미드기를 포함하는 화학식 1-3의 옥심 유도체를 합성하여, 그 특성을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 1-3의 옥심 유도체 화합물은 일 측면에 탄수화물 및 카르복실기를 포함하는 친수성 모이어티와 또 다른 측면에 C6 알킬기와 말레이미드기를 포함하는 소수성 모이어티를 갖는 양친매성 특성을 갖는다. 상기 양친매성 특성을 갖는 화학식 1-1의 옥심 유도체 화합물을 항체-약물 복합체에서 링커로 포함하는 경우, 결합된 약물의 소수성을 낮춰, 항체-약물 복합체가 응집되는 문제를 개선할 수 있다. 이는 특히, 항체-약물 복합체의 응집에 의해 혈액 내에서 빠르게 제거되어, 약물 전달 효율을 낮추고 정상 세포에 약물 독성을 일으킬 수 있는 종래 링커 및 항체-약물 복합체의 문제점을 해결할 수 있다는 점에서 중요하다. 또한, 약물의 소수성 특성을 낮춤으로써 항체 하나당 결합되는 약물의 수(DAR)를 늘릴 수 있어, 항체-약물 복합체에 의한 치료 효율을 높일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 화학식 1-3의 화합물을 링커로 포함하여 옥심 링커-DM1 접합체를 형성하여, 이를 다시 허셉틴에 결합하는 경우, 허셉틴 1개 당 4개의 옥심 링커-DM1 접합체가 결합된 항체-약물 복합체가 형성된 것을 확인 하였다. 이는 종래 항체-약물 복합체인 캐싸일라 보다 많은 개수의 약물이 결합된 형태로, 이는 항체-약물 복합체의 약물 로드 비율을 높일 수 있다는 점에서 본 발명의 링커는 우수한 효과를 갖는다. 또한, 상기 복합체에 포함된 옥심 링커-DM1 접합체는 캐싸일라의 SMCC-DM1 접합체 보다 소수성 값 (Clog P)이 현저히 낮아, 본 발명의 옥심 링커를 포함하는 항체-약물 복합체의 응집률이 종래 캐싸일라 보다 낮아 체내 안정성 및 전달 효율이 뛰어나 치료제로서 우수한 효과를 갖는 것을 의미한다.
이러한 측면에서, 본 발명은 항체-약물 복합체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염 일 수 있다.
본 발명에서 항체-약물 복합체 (Andibody-Drug Conjugate, ADC)는 항체와 약물이 링커 화합물에 의하여 결합되어 있는 복합체를 모두 포함하는 의미로 사용되며, 본 발명의 일 실시예에 따른 링커를 포함하는 항체-약물 복합체는 ADC-AL로 지칭될 수 있다.
본 발명의 항체-약물 복합체 (ADC)는 상기 화학식 1의 옥심 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 링커로서 포함하는 것 일 수 있고, 구체적으로는 하기 화학식 2로 나타낸 것 일 수 있다.
[화학식 2]
Figure 112017091722700-pat00011
상기 화학식 2에서, Ab는 항체이며, R1은 Cn(H2O)n 이고, n은 1 내지 10의 정수이며, R2는 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알킬기이고, R3는 수소 또는 히드록시기 이며, X는 카르복실기(-COOH), 알데히드기(-CHO) 및 케톤기(-CO-R4)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, Y는 말레이미드기(
Figure 112017091722700-pat00012
), 싸이올기(-SH)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, Drug은 약물이고, 그리고 m은 1 내지 10의 정수이다.
상기 화학식 2에서 R1, R2, R3, R4, X 및 Y는 상기 화학식 1과 동일한 바, 중복되는 기재는 생략한다.
일 예로, 본 발명의 항체-약물 복합체는 화학식 2-1의 구조를 가질 수 있다.
[화학식 2-1]
Figure 112017091722700-pat00013
상기 화학식 2-1에서 a는 1 내지 20의 정수이고, m, X 및 Y는 상기 화학식 2에서 정의된 바와 같다.
상기 화학식 2에서 Ab는 항체일 수 있다.
본 발명에서 항체는 항체는 최대한 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날항체, 2종 이상의 항체로부터 형성된 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포함한다. 항체는 특이적인 항원을 인식하고 결합할 수 있는 면역계에 의하여 생성되는 단백질이다. 그 구조적인 면에서, 항체는 통상적으로 4개의 아미노산 쇄(2개의 중쇄 및 2개의 경쇄)로 이루어진 Y-형상의 단백질을 가진다. 각각의 항체는 주로 가변 영역 및 불변 영역의 2개의 영역을 가진다. Y의 팔의 말단 부분에 위치한 가변 영역은 표적 항원에 결합하고 상호작용한다. 상기 가변 영역은 특정 항원 상의 특이적 결합 부위를 인식하고 결합하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. Y의 꼬리 부분에 위치한 불변 영역은 면역계에 의하여 인식되고 상호작용한다. 표적 항원은 일반적으로 다수의 항체 상의 CDR에 의하여 인식되는, 에피토프라고도 하는 다수의 결합 부위를 가지고 있다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각각의 항체는 상이한 구조를 가진다. 그러므로, 한 항원은 하나 이상의 상응하는 항체를 가질 수 있다.
본 발명의 한 실시형태로서, 항체는 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 항원에 면역특이적인 항체는 상업적으로 입수하거나, 재조합 발현 기술과 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 항원에 면역특이적인 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 진뱅크 데이터베이스 또는 문헌으로부터 얻거나, 통상의 클로닝 및 시퀀싱에 의해 얻을 수 있다. 본 발명의 항체는 암 또는 면역질환 등의 질환 치료를 위한 항체일 수 있고, 상업적으로 판매되는 항체 치료제 등을 모두 포함하는 의미이다.
치료에 이용가능한 항체의 예는 전이성 유방암의 치료를 위한 인간화된 항-HER2 항체인 트라스트주맙 (허셉틴®, 제넨테크사), 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 키메라 항-CD20 항체인 리툭시맙 (리툭산®, 제넨테크사), 두부 및 목의 암과 같은 상피성장인자 양성 암의 치료를 위한 키메라 항-EGFR 항체인 세툭시맙 (어비툭스®, 임클론 시스템즈사), 육종의 치료를 위한 인간화된 항-인테그린 αvβ3 항체인 비탁신® (메드이뮨사), 벨리무맙 (Benlysta®, Belimumab), 에쿨리주맙 (Soliris®, Eculizumab)®, 에파리주맙 (Raptiva®, Efalizumab), 알레파셉트 (Alefacept®, Amevive), 이브리투모맙(Ibritumomab), 토시투모맙 (Bexxar®, Tositumomab), 오파투무맙 (Arzerra®, Ofatumumab), 뮤로모납-CD3 (Orthoclone-OKT3®, Muromonab-CD3), 브렌툭시맙 베도틴 (Adcetris®, Brentuximab vedotin), 젬투주맙 (Gemtuzumab), 알레투주맙 (Campath-1H®, Alemtuzumab), 아바타셉트 (Orencia®, Abatacept), 벨라타셉트 (Nulojix®, Belatacept), 이필리무맙 (Yervoy®, Ipilimumab), 파니투무맙 (Vectibix®, Panitumumab), 카투막소맙 (Removab®, Catumaxomab), 압식시맙 (ReoPro®, Abciximab), 퍼투주맙 (Perjeta®, Pertuzumab), 오마리주맙 (Xolair®, Omalizumab), 카나키누맙 (Ilaris®, Canakinumab), 릴로나셉트 (Arcalyst®, Rilonacept), 우스테키누맙 (Stelara®, Ustekinumab), 다클리주맙 (Zenapax®, Daclizumab), 바실릭시맙 (Simulect®, Basiliximab), 토실리주맙 (Actemra®, Tocilizumab), 나탈리주맙 (Tysabri®, Natalizumab), 데노수맙 (Prolia®, Denosumab), 파빌리주맙 (Synagis®, Pavilizumab), 인플릭시맙 (Remicade®, Infliximab), 엔타네셉트 (Enbrel®, Etanercept), 아달리무맙 (Humira®, Adalimumab), 세르톨리주맙 (Cimzia®, Certolizumab), 골리무맙 (Simponi®, Golimumab), 로미플로스팀 (Nplate®, Romiplostim), 베바시주맙 (Avastin®, Bevacizumab), 라니비주맙 (Lucentis®, Ranibizumab) 또는 아플리버셉트 (Eylea®, Aflibercept)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체-약물 복합체는 링커 또는 링커-약물 복합체가 항체에 직접 결합될 수 있다. 구체적으로 항체의 라이신 잔기에 직접 결합될 수 있다.
상기 화학식 2에서 Drug은 약물을 의미하는 것으로, 상기 약물은 자연 유래 물질로부터 분리 또는 정제된 화합물 또는 인위적으로 합성된 화합물 일 수 있다. 구체적으로는 체내 에서 생물활성을 갖는 것이라면, 제한되지 않고 본 발명에 포함될 수 있고, 더욱 구체적으로 본 발명의 항체-약물 복합체는 화학식 1의 옥심 유도체 화합물을 링커로 포함하는데 그 특징이 있으므로, 화학식 1에서 소수성 모이어티인 Y 와 결합할 수 있는 작용기 또는 결합을 가지는 것이라면, 본 발명에 모두 포함된다. 화학식 1의 소수성 모이어티 Y와 결합할 수 있는 작용기 또는 결합은 싸이올기, 말레이미드기 또는 이황화 결합일 수 있으나, 이에 제안되는 것은 아니며, 본 발명의 옥심 유도체 화합물과 결합이 가능하면, 그 종류의 제한을 받지 않는다. 따라서, 본 발명의 항체-약물 복합체는 싸이올기 또는 말레이미드기를 가지면서 치료능을 갖는 화합물이라면 모두 본 발명에 포함된다. 일 예로, 상기 약물은 세포에 대하여 사멸활성을 갖거나 손상 세포 또는 조직에 대하여 치료 또는 개선 활성을 갖는 화합물은 모두 포함하는 것이다. 상기 약물은 예를 들어 상업적으로 생산 및 판매되는 면역치료제 또는 항암제 일 수 있으나, 그 종류에 제한되는 것은 아니다.
구체적인 예로, 종양세포에 특이적인 항체와 복합체를 형성하는 약물은 종양세포에 대하여 사멸 활성을 갖는 것으로 알려진 화합물이라면 그 종류에 제한되지 않고 모두 본 발명에 포함될 수 있다. 비제한적인 예로, 칼리키아마이신(Calicheamicin), 메이탄신(maytansine) 또는 그 유도체 계열의 항암제 일 수 있고, 상기 항암제는 일 예로 DM1 (N2'-deacetyl-N2'-(3-mercapto-1-oxopropyl)-maytansine), DM2, DM3 (N2'-deacetyl-N2'-(4-methyl-4-mercapto-1-oxopentyl)-maytansine), 또는 DM4 (N2'-deacetyl-N-2'(4-mercapto-1-oxopentyl)-maytansine)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 기술적 특징은 항체와 약물을 연결시켜 항체-약물 복합체를 형성시킬 수 있는 "링커"에 있다는 점에서, 상기 항체 또는 약물은 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용 또는 연구되어지는 것이라면 그 종류에 상관없이 본 발명의 링커를 이용해서 항체-약물 복합체를 형성할 수 있으므로, 항체 및 약물의 구체적인 종류에 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
상기 화학식 2에서 m은 항체 하나 당 결합될 수 있는 링커-약물 접합체의 개수를 의미하는 것으로, 그 수는 항체와 약물의 종류에 따라 다르게 형성될 수 있다.
구체적으로 항체가 트라스트주맙 이고, 화학식 1-1의 옥심 링커를 포함하는 경우 상기 m은 1 내지 10의 정수 일 수 있고, 본 발명의 일 구체예에 따라 트라스트주맙 하나당 화학식 1-1의 옥심링커-DM1 약물이 4개 결합된 것을 실험적으로 확인 하였다. 이는 종래 항체-약물 복합체인 캐싸일라 보다 더 많은 수의 약물이 결합된 것으로, 본 발명의 링커를 포함하는 항체-약물 복합체의 경우 약물 로드 효율 및 전달 효율이 높아, 더 우수한 치료효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 화학식 2에 따른 항체-약물 복합체가 화학식 1-1의 옥심 유도체 화합물을 포함하고, 약물(drug)로 DM1을 포함하는 경우, [화학식 2-2]의 구조를 가질 수 있다.
[화학식 2-2]
Figure 112017091722700-pat00014
또한, 본 발명은 상기 화학식 1에 따른 옥심 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 약물 전달용 조성물 일 수 있다.
본 발명의 약물 전달용 조성물은 인비보에서 생물 활성을 갖는 약물과 화학식 1에 따른 옥심 유도체 화합물의 복합체, 또는 상기 약물-옥심 유도체 화합물 및 항체의 복합체를 포함하는 것 일 수 있다. 상기의 경우 항체의 표적 특이성에 의하여 목적하는 부위까지 약물을 효율적으로 전달 할 수 있는 효과를 갖는다.
이러한 측면에서, 본 발명은 상기 항체-약물 복합체를 포함하는 질병 개선 또는 치료용 약제학적 조성물 일 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 복합체를 구성하는 항체 및 약물의 종류에 따라 그 질병을 달리 할 수 있다는 점에서, 질병의 종류에 제한을 받지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 조성물은 항암용 조성물 일 수 있고, 더욱 구체적으로 유방암 치료용 조성물 일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구적으로(예를 들면, 복용 또는 흡입) 또는 비경구적으로(예를 들면, 주사, 침착, 이식, 좌약) 투여될 수 있으며, 주사는 예를 들면, 정맥주사, 피하주사, 근육내주사 또는 복강내주사 일 수 있다. 본 발명에 따른 항암제는 투여 경로에 따라, 정제, 캡슐제, 과립제, 파인 서브틸래(fine subtilae), 분제, 설하 정제, 좌약, 연고, 주사제, 유탁액제, 현탁액제, 시럽제, 분무제 등으로 제형화될 수 있다. 상기 여러 가지 형태의 본 발명에 따른 약학적 조성물은 각 제형에 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체 (carrier)를 사용하여 공지기술에 의해 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 부형제, 결합제, 붕해제 (disintegrating agent), 윤활제, 방부제, 항산화제, 등장화제 (isotonic agent), 완충제, 피막제, 감미제, 용해제, 기제 (base), 분산제, 습윤제, 현탁화제, 안정제, 착색제 등을 포함한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약제의 형태에 따라 다르지만, 본 발명의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 약 0.01 내지 95 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 항암제 조성물의 구체적인 투여량은 치료되는 사람을 포함한 포유동물의 종류, 체중, 성별, 질환의 정도, 의사의 판단 등에 따라 다를 수 있다. 바람직하게는, 경구투여의 경우에는 하루에 체중 1 kg당 활성성분 0.01 내지 50 mg이 투여되고, 비경구투여의 경우에는 하루에 체중 1 kg당 활성성분 0.01 내지 10 mg이 투여된다. 상기 총 일일 투여량은 질환의 정도, 의사의 판단 등에 따라 한번에 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 항체-약물 복합체(ADC)에서 링커로 사용될 수 있으며, 구체적으로는 양친매성 특성을 갖는 링커로서 항체-약물 복합체 형성 시 종래 링커들의 높은 소수성 문제점, 낮은 pH 안정성을 해결하여, 우수한 약물 전달 효율과 구조적 안정성을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 양친매성 특성을 갖는 본 발명의 옥심 유도체 화합물을 항체-약물 복합체에서 링커로 포함하는 경우, 결합된 약물의 소수성을 낮춰, 항체-약물 복합체가 응집되는 문제를 개선할 수 있다. 이는 특히, 항체-약물 복합체의 응집에 의해 혈액 내에서 빠르게 제거되어, 약물 전달 효율을 낮추고 정상 세포에 약물 독성을 일으킬 수 있는 종래 링커 및 항체-약물 복합체의 문제점을 해결할 수 있다는 점에서 중요하다. 또한, 약물의 소수성 특성을 낮춤으로써 항체 하나당 결합되는 약물의 수(DAR)를 늘릴 수 있어, 항체-약물 복합체에 의한 치료 효율을 높일 수 있다.
[실시예]
실시예 1. 실험의 준비 및 재료
D- 글루쿠론산, 아세트산 암모늄 및 아세트산은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 아미노-옥시 헥실 말레이미드 히드로클로라이드는 Pe Bioscience (Hong Kong, China)로부터 구입하였다. ADC-AL 합성을 위해, Y biologics, Inc. (Daejeon, Korea)로부터 허셉틴(Herceptin)을 구입하였고, 세포 독성 약물인 DM1 (N2'-deacetyl-N2'-(3-mercapto-1-oxopropyl)-maytansine)은 AbCam (Cambridge, UK)로부터 수득하였다. RP-HPLC 분석을 위해 C18 컬럼 (Shim-pack GIS-ODS)이 장착된 Agilent 1260 시스템을 214 nm에서 감지하는 UV-Vis 검출기에 연결했다. 아세토 니트릴 (ACN)과 트리플루오로아세트산 (TFA) (둘 다 HPLC 등급)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. ESI-MS는 한국과학기술원 (오창, 한국)에서 수행되었다. Clog P 계산에는 Chem-droTM 프로그램을 사용하였다. SPR 실험을 위해 CM5 칩이 장착된 4 채널 BIAcore 3000 광 센서 장비가 사용되었다 (GE Healthcare, USA). N-하이드록시숙신이미드 (NHS), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이 미드 하이드록클로라이드 (EDC), 제2 및 제1인산칼륨 (potassium phosphate dibasic and monobasic), 구연산 나트륨 (sodium citrate), 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (ethylene diamine tetra acetic acid, EDTA) 및 디메틸 술폭 시드 (dimethyl sulfoxide, DMSO)는 Sigma (USA)로부터 구입하였다. ACN 및 TFA를 제외한 모든 화학 물질은 분석 등급을 사용하였다. Amicon Ultra-15 원심 분리 필터 유닛 (100 kD 분자량 컷-오프)은 Millipore (Germany)로부터 입수하였다. SEC, HIC-HPLC 및 LC-QTOF MS는 오송 메디칼 이노베이션 파운데이션 (Osong Medical Innovation Foundation, 한국 오송)에서 수행하였다. 종양 세포주 (MDA-MB-231 및 SK-BR-3)는 한국 세포주 은행에서 입수하였다. RPMI 1640, 태아 소 혈청 (FBS), 페니실린 및 둘베코 인산염- 완충 생리 식염수 (DPBS)를 포함한 세포 배양 배지 및 성분은 Welgene, Inc. (경산, 한국)에서 구입하였다. 세포 독성 측정을 위한 EZ-Cytox® kit (EZ-3000)는 (주)대일 랩 서비스에서 구입하고, Biotek (USA)에서 구입한 플레이트 판독기 (Synergy mX)를 사용하였다. 복합체의 열적 거동은 시차주사 열량측정계 DSC (DSC-60, Shimadzu, Japan) 및 UV-1800 분광기 (Shimadzu Inc., 교토, 일본)를 사용하여 조사하였다.
실시예 2. 실험 방법
2-1. 옥심 링커의 합성
D-글루쿠론산과 아미노-옥시 헥실 말레이미드를 함께 결합시켜 옥심 링커를 형성시켰다. 아미노 말레이미드는 아미노-옥시 작용기를 갖고, 개방 사슬 형태의 D-글루쿠론산은 알데히드기를 함유한다. 이 두 작용기는 축합 반응을 통해 결찰되어 옥심 작용기를 형성한다 (하기 반응식 1 참조).
[반응식 1]
Figure 112017091722700-pat00015
D-글루쿠론산 용액 (40 mM)을 100 mM 암모늄 아세테이트 완충액 (pH 4.5)에서 제조하였다. 아미노-옥시 헥실 말레이미드 하이드로클로라이드 (4 mM)를 메탄올에 용해시켰다. 옥심 결찰 (ligation)은 1 mM 아미노-옥시 헥실 말레이미드 및 10 mM D- 글루쿠론산을 1:10의 몰비로 혼합하여 반응시켰다. 반응은 주위 온도 (ambient temperature)에서 24 시간 동안 수행하고 C18 칼럼이 장착된 RP-HPLC로 관찰하였다.
2-2. HPLC 분석 및 옥심 링커 정제
옥심 링커의 형성 및 정량은 구배 용출 모드 (gradient elution mode)를 갖는 RP-HPLC 시스템에 의해 관찰하였다. 100 % 완충액 A (아세토니트릴-물 (5:95, v/v)와 0.1 % TFA)에서 100 % 완충액 B (아세토니트릴-물 (90:10, v/v)와 0.1 % TFA)로 50 분간 처리하였다. 각 분석 완료 후, 컬럼을 완충액 A로 30 분 동안 평형화시켜 초기 조건으로 회복시켰다. HPLC 트레이스(trace)의 43 분 (ACN 용리 78 %)에서 단일 피크로 나타난 것으로 보이는 옥심 링커를 분별하고 동결건조를 위해 조합하였다. 생성된 분말을 다음 단계을 위해 메탄올에 용해시켰다. 옥심 합성 수율은 HPLC 크로마토그램의 피크 면적으로부터 계산하였다.
2-3. 옥심 링커의 전기분무 이온화 질량 분석 ( Electrospray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS) 분석
옥심 링커의 분자량은 전기분무 이온 소스 (Waters, Milford, MA, USA)가 장착된 Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry (HDMS)-Quadrupole time-of-flight (QTOF) 질량 분광계로 분석하였다. 상기 기기는 NaF 용액을 사용하여 보정하였다. 시료를 100 % MeOH에 용해시키고, 양성모드에서 작동하는 이온 소스로 20㎕/min의 유속으로 직접 주입하여 도입시켰다. 모든 스펙트럼은 50 내지 1500 m/z 범위에서 획득하였다. 류신 엔케팔린(Leucine encephalin)은 정확한 질량 측정 보정을 위해 고정 질량 (lock mass)으로 사용되었다.
2-4. 옥심 링커의 pH 안정성
옥심 링커의 pH 의존작 안정성을 확인하기 위해, 산성 조건에서 분해되는 히드라존 링커 (hydrazone linker)와 비교하는 실험을 수행하였다. 실시예 2-2와 같이 조 옥심링커 용액을 50% 메탄올에 50%의 100 mM 암모늄 아세테이트 완충액 (pH 4.5)을 사용하여 약 11 mM의 조(crude) 옥심 링커 용액을 제조하였다. 상기 옥심 링커 용액을 1N NaOH 및 6N HCl로 pH를 조정하여 pH 7.0 및 pH 4.0에서 1 X PBS (1:9, v/v)로 희석시켰다. 희석된 옥심 링커 용액을 37 ℃의 인큐베이터에서 2 일까지 연속적으로 교반하였다. 상이한 시간 간격 (t=0 에서 시작)에서, 용액 (50㎕)의 분취액 (aliquot)을 회수하고 RP-HPLC로 분석하였다. 절단된 옥심 링커의 농도를 추정하기 위한 옥심 링커 피크 면적은 초기 HPLC 면적 (t=0 에서)을 100 %로 사용하는 하기 [일반식 1]을 사용하여 계산하였다.
[일반식 1]
% Cleaved Oxime = [1- (Area of Oxime (t) / Area of Oxime (t 0 ))] x 100%
2-5. 옥심 링커-DM1 복합체 형성 (conjugation)
DM1-옥심 복합체의 경우, 옥심 링커의 말레이미드기와 DM1 약물의 티올기가 컨쥬게이션되었다 (하기 반응식2 참조).
[반응식 2]
Figure 112017091722700-pat00016
DMSO에서 DM1 스톡용액 (약 6.7 mM; 유리 티올 형태)을 제조하였다. DM1 원액을 1.3 mM의 DM1 농도에 도달하도록 시트르산 나트륨 완충액 (150 mM NaCl 및 2 mM EDTA로 pH 6.0에서 35 mM)에 희석시켰다. 정제된 옥심 링커를 복합체 형성을 위해 DM1 용액과 혼합하였다. 복합체 형성 효율은 정제 옥심 링커와 조 (crude) 옥심 링커 를 비교하였다 (RP-HPLC 분획 없이). 두 경우 모두, 옥심 링커에 대한 DM1의 몰비 (molar ratio)는 1:1이었고, 4 내지 20 시간 동안 교반하면서 실온에서 복합체 형성 반응을 수행하였다. 복합체 형성 생성물은 옥심 링커 분석에 사용된 것과 동일한 방법으로 RP-HPLC 및 ESI-MS로 분석하였다.
2-6. 소수성 값 (Clog P) 계산
소수성 DM1이 양친매성 옥심 링커에 복합체화 될 때, 그 소수성은 합성된 옥심 링커의 탄수화물 모이어티 때문에 실질적으로 감소되어야 한다. 이러한 현상은 화합물의 소수성 추정을 할 수 있게 하는 소수성 값 (Clog P) 계산으로 추정 할 수 있다. 이는 유기상 (organic phase)에서 수상 (aqueous phase)으로 분포된 화합물의 농도의 비율로 정의된다. Clog P 추정은 통상적으로 DaylightTM 또는 Chem droTM 소프트웨어와 같은 프로그램을 사용하여 수행된다. Clog P 계산 프로그램은 분자를 단편으로 나누고 상기 단편값과 Hansch 및 Leo의 데이터베이스에서 구조-의존적 보정값을 합산하여, 여러 유기 분자의 log P를 예측한다. 전형적으로, Clog P > 0 인 경우, 유기상에서 더 많이 구획된 소수성 물질을 특징으로하는 반면, Clog P < 0은 친수성 분자를 나타낸다.
2-7. 항체 약물 컨쥬게이트의 바이오컨쥬게이션
정제된 허셉틴(Herceptin®) 21 μM을 50 mM 인산 칼륨 및 2 mM EDTA (pH 7.0)로 완충액 교환하였다. 아민 커플링을 통해 옥심 링커의 카르복실산기와 항체의 아민기를 컨쥬게이션시키기 위해 옥심 링커의 카르복실산을 EDC와 NHS 용액으로 활성화시켰다. 옥심, EDC, NHS의 몰비는 1:7:10 이었다.
100mM 암모늄 아세테이트 완충액 (pH 4.5) 중의 활성화된 조 옥심 링커 용액을 최종 옥심 링커 대 Ab 몰비가 10:1 되도록, 항체 용액에 첨가하였다. 반응은 실온에서 4 시간 동안 인산염 완충액에서 혼합하면서 진행되었다. 그 후, 옥심 링커-변형된 항체를 150 mM NaCl 및 2 mM EDTA를 함유하는 시트르산 나트륨 완충액 (pH 6.0에서 35 mM)에 대한 100 kD MWCO Amicon Ultra-15 원심 필터 유닛을 통한 투석여과를 통해 정제하였다.
이어서, 항체-옥심 링커 중간체를 DM1 약물과 반응시켰다. DMSO에 용해된 DM1을 항체에 대한 DM1의 몰비가 10:1이 되도록, 옥심 링커-항체에 첨가하였다. 반응은 실온에서 교반하면서 시트르산 완충액에서 6 내지 12 시간 동안 수행하였다. 컨쥬게이션 혼합물을 1xPBS (pH 7.4)를 갖는 동일한 100kD Amicon 필터 유닛을 통해 정제하여 과량의 DM1을 제거하였다. 최종 ADC-AL 산물은-20 ℃에서 보관하였고, 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 크기배제-HPLC(Size exclusion-HPLC, SEC-HPLC), HIC (부틸) HPLC 및 LC-QTOF MS로 분석하였다.
2-8. 표면 플라즈몬 공명을 이용한 결합 분석
CM5 센서 칩이 장착된 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 바이오 센서 (Biacore 3000, GE Healthcare, USA)를 사용하여 (1) D-글루쿠론산에 대한 허셉틴® 및 (2) 허셉틴®의 DM1-옥심 복합체에 대한 분자-대-분자 결합을 분석하였다.
2 mM EDTA를 함유한 인산칼륨 완충액 (pH 7.0에서 34 μM) 내의 허셉틴 (Herceptin®)을 동일한 인산염 완충액 (pH 7.0)에서 70 mM EDC 및 50 mM NHS로 활성화시킨 CM5 칩 표면에 고정시켰다. 결합되지 않은 허셉틴은 글리신 (pH 1.5)으로 세척하였다. 5 mM의 비활성화 D-글루쿠론산을 공급하여 D-글루쿠론산이 허셉틴에 결합하지 않음을 확인했다. 그 후 활성화 D-글루쿠론산 (5 mM)을 허셉틴 (Herceptin®)과의 결합 분석을 위해 제공하였다. 활성화된 D-글루쿠론산 대 허셉틴 (Herceptin®)의 몰-대-몰 결합비는 공명 단위 (resonance unit, RU)의 증가를 몰 농도로 환산하여 계산되었다. 하기 [반응식 3]은 허셉틴에 대한 활성화 D-글루쿠론산의 결합에 대한 SPR 반응식을 나타낸다.
[반응식 3]
Figure 112017091722700-pat00017
각 공명 단위 (RU)를 몰 농도로 환산하기 위해, 1 RU는 약 시료 1 pg/mm2 와 상응하였다. DM1-옥심 링커 복합체에 대한 허셉틴®의 SPR 결합 분석과정은 이전의 D-글루쿠론산 방법과 유사했다 (반응식 4). 그러나 비활성화 D-글루쿠론산이 허셉틴에 결합하지 않음을 확인했기 때문에, 활성화된 옥심 링커-DM1 (1 mM)은 CM5칩 표면에 고정화된 후 Herceptin®에 직접 로드시켰다.
[반응식 4]
Figure 112017091722700-pat00018
2-9. ADC-AL의 크기 배제 및 HIC(부틸) HPLC 분석
SEC 및 HIC-HPLC로 ADC-AL의 특성을 확인하였다. SEC는 Sepax SEC300 컬럼을 사용하였으며, 25 ℃에서 1ml/min의 유속으로 1xPBS (pH 7.0)로 용리시켰다. 크로마토그램은 220 nm에서 기록되었다. 허셉틴(Herceptin®)과 ADC-AL의 대략적인 분자량은 단백질 표준의 체류 시간 (retention time)과 분자량에 기초한 검정 곡선을 사용하여 측정되었다.
HIC(부틸)-HPLC에는 Propac 부틸 칼럼 (Propac butyl column)이 장착되었다. 상기 방법은 100 % 이동상 A (95 % v/v 50mM 인산 나트륨, 5 % v/v 이소프로판올, 1.5M (NH4) 2SO4, pH 7.0)에서 100 % 이동상 B (75 % v/v 50 mM 인산 나트륨, 25 % v/v 이소프로판올, pH 7.0)로 15 분 동안 선형 구배하는 것으로 수행하였다. 유속은 1 ml/min, 온도는 25 ℃, UV 검출은 214 nm에서 수행하였다. ADC-AL의 HIC 크로마토그램은 허셉틴(Herceptin®)과 캐싸일라(Kadcyla®, 참고 ADC)의 HIC 크로마토그램과 비교되었다.
2-10. ADC -AL의 액체 크로마토 그래피 / QTOF ( Quadrapole time of flight ) 분석
항체 및 ADC-AL 샘플을 1xPBS (pH 7.4)에 용해시켰다. 트리스(2-카르복시 에틸) 포스핀 (TCEP)을 상기 샘플에 10 mM 첨가하고 상기 혼합물을 60 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하여 이황화 결합을 감소시켰다. 상기 샘플을 37 ℃로 냉각한 후, 스트렙토코커스 파이오젠스 (Streptococcus pyogenes)유래의 이뮤노글로불린-분해 효소(immunoglobulin-degrading enzyme, IdeS)를 첨가 한 후 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이트하여 항체 및 ADC-AL을 중쇄의 힌지 영역에서 절단하여 경쇄, Fd 영역 및 Fc 영역을 생성하였다.
LC/MS/MS는 전기분무 이온 양성모드를 갖는 Synapt G2-Si HDMS (High Definition Mass Spectrometry) 시스템과 결합된 Waters Acquity UPLC (에틸렌 브릿지 하이브리드 (BEH) C4) 시스템을 사용하여 수행되었다. 항체 단편은 물을 이동상 A로 사용하고 아세토니트릴을 이동상 B로 사용 (둘 다 0.1 % 포름산을 함유)하여 구배 용출로 분리 하였다.
상기 구배 용출은 다음과 같이 사용되었다; 0 내지 2 분 동안 0에서 10% B, 2 내지 15 분 동안 10에서 90% B, 15 내지 17 분 동안 90% B, 17.0 내지 17.1 분 동안 90에서 10% B, 17.1 내지 20분 동안 10% B.
MS 스캔은 Synapt G2-Si HDMS에서 수행되었다. 전자분무 이온화 전압 (Electrospray ionization voltage)은 3.0kV이고 샘플링 콘 전압 (sampling cone voltage)은 60V 였다. 소스 온도는 120 ℃, MS 스캔 속도는 질량 범위가 700-4000 m/z에서 1 초 였다.
2-11. 세포 사멸 (세포 독성) 분석
종양 세포 생존력에 대한 허셉틴 및 ADC-AL 분석은 WST-1 분석을 사용하여 수행되었다. MDA-MB-231과 SK-BR-3 세포주를 96-웰 플레이트에 1 웰 당 약 10,000 세포를 각각 처리하고, 5 % CO2, 습윤 공지 (humidified atmosphere) 중, 37 ℃에서 하룻밤 동안 접착시켰다. 다음날 세포를 PBS 완충액 만으로 또는 허셉틴 (Herceptin®), 캐싸일라 (Kadcyla®) 및 ADC-AL을 0.001 내지 5㎍/ml 농도의 포함하는 약물로 처리하였다.
정확한 실험을 위해 각 세포 처리에 대하여 3 개의 웰에 반복 수행하였다. 처리 4 일 후, WST-1 증식 분석은 [Jung, S.외 Oleic acid-embedded nanoliposome as a selective tumoricidal agent. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2016, 146, 585-589., 40]에 기재된 프로토콜에 따라 수행하였다. 결과는 대조군 (PBS만 처리된 세포)에 대한 상대값 (%)으로 나타내었다.
[실시예 3] 결과 및 고찰
3-1. 옥심 링커에 대한 역상 (Reverse phase RP)-HPLC 분석
본 발명의 옥심 링커의 체류 시간 및 합성 수율을 관찰하기 위해 RP-HPLC를 수행하였다. HPLC 트레이스에서 D-글루쿠론산과 아미노-옥시 헥실 말레이미드의 체류 시간은 각각 16 및 40 분 이었지만, 옥심 생성물은 43 분에 용리되었다 (도 1에서 3번)
도 1a 및 1b에 나타낸 바와 같이, 친수성 탄수화물 모이어티의 존재에도 불구하고 옥심의 체류 시간(43 분)이 아미노-옥시 말레이미드(40 분, 도 1에서 2번)보다 길다는 것은 흥미로운 결과이다. 12 시간 반응 동안, D-글루쿠론산과 아미노-옥시 말레이미드의 피크는 급격히 감소하는 반면, 옥심 생성물에 해당하는 피크는 증가했다. 약 4 시간 후, 거의 모든 아미노-옥시 말레이미드가 소비되었고 옥심 합성이 완료된 것처럼 보였다. HPLC 크로마토그램의 면적으로부터 계산 된 옥심 합성 수율은 90 % 이상이었다.
그 다음 RP-HPLC의 43 분 피크의 분획 수집에 의해 탄수화물 옥심 링커를 정제하고 동결 건조시켰다. 상기 정제된 옥심 링커를 RP-HPLC에 다시 넣어 순도를 확인한 결과, 43 분 후에 일부 응집 피크가 나타났다; 46, 47 분 (도 2b 참조). 동결 건조 과정에서 옥심 산물이 손상 될 수 있는 것으로 보였다. 이 문제를 해결하기 위해 본 발명에서는 RP-HPLC 정제없이 조(crude) 생성물로서 탄수화물 옥심 결찰 혼합물을 사용했다.
도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 조(crude) 옥심 링커는 정제된 것보다 상대적으로 더 선명한 피크를 나타내었다 (도 2a): 옥심 생성물에 상응하는 43 분 (ACN 용출 78 %)의 주 피크, 각각 D-글루쿠론산 및 아미노-옥시 말레이미드에 상응하는 16 분 및 40 분에서의 매우 작은 피크.
3-2. 옥심 링커에 대한 ESI-MS 분석
양성모드 ESI-MS 분석 스펙트럼은 옥심 링커의 분자량이 388 Da임을 보여주었다. ESI-MS 결과는 두 가지 주요 피크를 보여주었다; [M+Na+-H2O]+에 대한 393Da 및 [M+Na]+에 대한 411Da이며, 이것은 형성된 옥심 생성물이 분자량 및 아마도 구조식의 이론값과 동일함을 나타낸다 (도 3).
3-3. pH에 대한 옥심 링커의 안정성
본 발명에 따른 옥심 링커의 pH 안정성을 확인하기 위해, 산성 조건 하에서 분해되는 옥심과 히드라존 결합을 각각 갖는 옥심 링커와 히드라존 링커의 pH 안정성을 비교하였다.
두 링커 모두를 pH 7.0과 pH 4.0에서 1xPBS (37 ℃) 중에서 50 시간 동안 인큐베이션하고, RP (C18)-HPLC로 분석하였다. pH 7.0에서 히드라존 링커는 약 30 %가 분해되었으나, 본 발명에 따라 합성된 옥심 링커는 동일한 완충액에서 10 % 미만으로 분해되는 우수한 안정성을 보였다. 또한, pH 4.0의 PBS에서 인큐베이션 되었을 때, 두 링커 모두 빠르게 분해되었다 (도 4).
따라서, 본 발명의 탄수화물 옥심 링커는 중성 pH에서는 매우 안정하고, 리소좀 pH와 같은 산성 pH에서 절단되는 산 분해성 링커임을 확인할 수 있었다. 그러나, 비교예로 사용된 종래의 히드라존 링커는 중성 pH에서 부분적으로 분해되며, 이는 혈액순환 중에 정상 세포에 악영향을 미친다. 결과적으로, 본 발명에 따른 탄수화물 옥심 링커는 기존의 히드라존 링커보다 더 효율적이고 안정정임을 알 수 있다.
또한, pH 7.0의 PBS에서 지수적 감소 (exponential decay)를 가정한 공식을 사용하여 히드라존 및 옥심 링커의 반감기를 계산했다.
N(t) = N0 exp(-λt)
여기서 N(t)는 시간 t에서 링커의 농도, N0는 t=0에서 초기 농도이며, 1/λ는 지수 감소 상수이다.
반감기는 t1/2 = ln2/λ로 계산하였다. 옥심 링커는 반감기가 약 99 h로 더 느린 분해를 보이는 반면, 히드라존 링커는 비교적 빠른 분해, 평균 반감기가 약 43 h을 나타내었다. 따라서, 본 발명에 따른 옥심 링커가 중성 pH 조건에서 종래의 히드라존 링커보다 안정하며, 리소좀 환경에 가까운 산성 pH 조건에서 잘 절단되는 효과를 가져 전신성 투여에 더욱 적합함을 알 수 있다.
3-4. 옥심 링커-DM1 복합체에 대한 RP-HPLC 및 ESI-MS 분석 결과 확인
DM1은 이성질체 때문에, 62.0 및 66.0 분의 체류 시간에 2 개의 RP-HPLC 피크를 일으켰다 (도 5a). 정제된 옥심 링커가 DM1과 복합체를 형성하고 반응 혼합물을 RP-HPLC에 의해 분석한 결과, 6 개의 피크가 나타났다; 모든 피크는 50.0분과 55.0 분 사이에 나타났다; 50.6, 51.2, 52.6, 53.2, 53.7, 54.3 분 (도 5b). ESI-MS를 사용하여 식별을 위해 각 피크를 수집했다. 50.6 및 51.2 분에 용리된 피크가 옥심 링커-DM1 복합체 인 것으로 밝혀졌다. 그러나 옥심 링커-DM1 복합체 외에도 ESI-MS에서 다른 물질이 용출되었으며 생성물 상태가 명확하지 않았다. 이 결과는 동결건조된 옥심 링커가 약간의 응집 피크를 나타내는 이전의 RP-HPLC 결과와 관련이 있는 것으로 보인다.
따라서, 더욱 명확한 옥심 링커-DM1 복합체를 얻기 위해 조(crude) 옥심 링커 용액을 사용 하였다. 조 옥심 링커 용액을 사용하여 컨쥬게이션 하는 경우, 50.4 및 51.0 분에만 두 개의 피크가 나타났다 (도 5c). 링커-약물 복합체가 DM1 (51.0 및 62.0 분)에 비해 더 짧은 체류 시간을 나타내므로, 그 DM1의 소수성은 복합체 형성에 의하여 실질적으로 감소되었음을 확인할 수 있다.
또한, 조 옥심 링커-DM1 복합체 (50.0 및 51.0 분)를 RP-HPLC에 의해 정제한 후, 증발시키고 양성모드 ESI-MS로 분석하였다. 50.4 및 51.0 분에서 용리된 피크는 동일한 비권취된 (deconvoluted) ESI-MS 스펙트럼을 나타내었는데, 이는 두 피크가 동일한 물질 (아마 이성질체)임을 나타낸다 [42]. 옥심 링커-DM1 복합체의 이론적인 분자량은 1,126 Da이다. 두 가지 복합체에 대한 ESI-MS 결과는 두 개의 주요 피크를 보여주었다 (도 6). [M+Na+-H2O]+는 1,130Da이고, [M+Na]+는 1,148Da이며, 이는 예상된 복합체 형성을 의미한다. 이러한 결과는 DM1 피크의 ESI-MS 결과와도 일치한다.
3-5. 옥심-DM1 복합체와 SMCC-DM1의 소수성 값 (Clog P) 비교
표 1은 DM1, SMCC 링커, 양친매성 옥심 링커 및 DM1-링커 복합체에 대한 ClogP 값을 나타낸다.
Oxime linker -DM1 SMCC linker -DM1
( reference - kadcyla ) 		Clog P
Oxime linker - -2.41
- SMCC linker 0.41
DM1 drug DM1 drug 4.18
Oximelinker-DM1 - 2.17
- SMCC-DM1 4.99
옥심 링커의 ClogP 값은 -2.41, SMCC 링커 (참조 ADC 인 Kadcyla®에서 사용)의 ClogP 값은 0.41로, 본 발명에 따른 옥심 링커가 더 낮은 소수성을 나타낸다. DM1 (Clog P = 4.18)이 옥심 링커와 복합체를 형성하였을 때, 복합체의 소수성 값은 2.17로 오히려 현저히 감소되었지만, SMCC 링커와 결합된 경우 복합체의 소수성 값인 4.99로 증가했다. 따라서, ClogP 비교를 통해, 본 발명의 양친매성 옥심 링커를 사용하는 항체-약물 접합체(ADC-AL)가 소수성 상호 작용으로 인한 복합체의 응집문제를 개선할 수 있음을 기대할 수 있다.
3-6. 옥심 링커-DM1 복합체와 허셉틴 ® 사이의 컨쥬게이션에 대한 SPR 결합 연구
SPR 센서그램을 도 7에 나타내었다. 허셉틴(Herceptin®)을 CM5 칩 (도 7의 단계 B)에 고정시킨 후, 활성화 D-글루쿠론산 (즉, 카르복실기가 EDC/NHS로 에스테르화된 것)이 항체의 표면에 컨쥬게이트된 것으로 나타났고 (도 7의 단계 E), 이에 반해 비활성화 D-글루쿠론산은 반응성이 없었다 (도 7의 단계 D).
또한, 각 단계에서의 공명 유닛 (RU) 변화를 몰 농도를 변환하여 표 2에 나타내었다.
RUb RUa △RU △pmol
E/N activation 18564 19385 821 7.1
Ab conjugation 19385 23279 3894 0.026
D-glu conjugation 23279 23280 1 0.005
Activated D-glu conjugation 23280 23409 129 0.66
표 2에 나타낸 바와 같이, 활성화 D-글루쿠론산 약 0.66pmol이 허셉틴 0.026 pmol과 컨쥬게이션 하는 것으로 나타났고, 이러한 결과는 고정된 허셉틴과 활성화 D-글루쿠론산 사이에 약 1:25로 결합 몰비가 높음을 나타낸다.
개질되지 않은 D-글루쿠론산이 허셉틴에 결합하지 않는다는 것을 확인한 후에, 활성화된 옥심 링커-DM1 복합체를 고정된 허셉틴(Herceptin®)에 직접 로드시켰다. 도 8은 센서 그램, 표 3에 활성화된 옥심-DM1 복합체에 대한 허셉틴의 SPR 분석 결과를 나타내었다.
RUb RUa △RU △pmol
E/N activation 18942 19227 285 2.4
Ab conjugation 19227 23485 4258 0.028
Activated Oxime-DM1 conjugation 23485 23614 129 0.11
옥심 링커-DM1 복합체의 경우, 몰-대-몰 결합 비는 D-글루쿠론산보다 낮은 약 1:4 였다. DM1은 소수성이고 친수성 항체에 대한 입체 장애 (steric hindrance)를 가질 수 있기 때문에, 구조적으로 접근 가능한 구조에 대하여 사용 가능한 공간이 줄어들어 결합된 옥심 링커-DM1 복합체가 D-글루쿠론산보다 작은 것으로 추론하였다 [44]. 그러나, 본 발명에 따른 약물-항체 복합체(ADC-AL)는 캐싸일라보다 우수한 약물 대 항체비를 나타냈다.
3-7. ADC-AL에 대한 크기 배제 크로마토그래피 분석
도 9에 본 발명의 ADC-AL에 대한 SEC 크로마토그램의 결과를 나타내었다.
허셉틴 (약 145 kD)은 7.8 분에 용출되었고, 표준곡선 (standard curve)과 일치 함을 보였다. 본 발명의 양친매성 옥심 링커를 함유하는 ADC-AL는 거의 동일한 시간 (7.8 분)에 용출되었고 그의 분자량은 허셉틴 (Herceptin)과 유사하게 나타났다. 두 크로마토그램 모두 응집 또는 단편화 피크가 없었으며, 이는 두 샘플 모두 높은 순도를 가짐을 의미한다.
3-8. ADC-AL에 대한 HIC (부틸) HPLC 분석
본 발명의 ADC-AL은 허셉틴의 아민기 (라이신 잔기)와 탄수화물 옥심 링커-DM1 복합체의 NHS 관능화 에스테르기 사이의 무작위 컨쥬게이션에 의해 제조되었다. 링커-약물 복합체가 ADC의 소수성에 미치는 영향을 측정하기 위해 HIC-HPLC를 수행하였다.
도 10a는 허셉틴이 10.8 분에 용리되었고, ADC-AL이 11.8 분에 용출되었음을 보여준다. 허셉틴의 뾰족한 피크에 비해 ADC-AL의 피크는 더 넓어지고 오른쪽으로 이동하였다. 이를 통해, ADC-AL은 DM1과 컨쥬게이션되어 허셉틴보다 소수성이 더 높을 것으로 기대할 수 있다. 또한, 합성된 ADC-AL은 이의 분자 개체 (entity) 및 약물 대 항체비에서 균일한 것으로 나타났다.
도 10b에 나타낸 바와 같이, 캐싸일라(　Kadcyla®)의 경우, 컨쥬게이트되지 않은 허셉틴은 8.4 분에 용리되었고, 컨쥬게이트된 캐싸일라(Kadcyla®)는 오른쪽으로 이동되었다. 몇몇 링커-DM1 복합체가 컨쥬게이트되어, 몇 개의 피크가 나타났다. 따라서 캐싸일라는 비균일 (heterogeneous)하며 다양한 약물 대 항체 비를 가지고 있는 것으로 나타났다.
3-9. ADC-AL에 대한 LC-QTOF 분석 결과 확인
허셉틴과 본 발명에 따른 ADC-AL은 IdeS 효소로 절단되어 경쇄, Fd 영역 및 Fc 영역으로 감소되었다. 도 11에 QTOF-LC/MS 데이터를 나타내었다.
허셉틴의 Fc 영역은 글리칸을 가지고 있으며, 이들 글리칸을 포함한 정확한 분자량은 25,237 Da (G0F 글리칸과 Fc) 및 25,399 Da (G1F 글리칸과 Fc) 이다. 항체 경쇄 및 Fd 영역의 분자량은 각각 23,442 Da 및 25,382 Da 이었다. 허셉틴 (Herceptin®)과 비교하여, 본 발명의 ADC-AL은 경쇄에서 1,937 Da의 분자량 증가를 보였다. 이는 탄수화물 옥심 링커-DM1 복합체 두 분자가 허셉틴의 각 경쇄에 결합되어 있음을 의미한다 [46]. 이러한 결과는 또한 합성된 ADC-AL이 균일하다는 HIC(부틸)-HPLC 결과와 일치한다. 항체 분자는 2 개의 경쇄를 가지고 있기 때문에, 두 개의 링커-약물 복합체 분자가 허셉틴의 각 경쇄에 결합되어 있다는 사실은 4 개의 링커-약물 복합체가 전체 항체 분자에 접합됨을 의미한다. 이러한 결과는 이전의 SPR 데이터의 1:4 DAR로 결합하는 결과와 일치한다.
3-10. 세포 독성 분석 (WST-1 분석).
In vitro 세포 효능에 대한 허셉틴 (Herceptin®), 캐싸일라 (Kadcyla®) 및 본 발명의 ADC-AL의 영향은 두 세포주에 대한 WST-1 분석에 의해 확인하였다; MDA-MB-231 (HER2 음성 세포주) 및 SK-BR-3 (HER2 양성 세포주). 상기 세포주들은 유방암의 중요한 바이오 마커인 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2) 발현 수준에 의해 확립되었다.
MDA-MB-231 세포에 허셉틴 (Herceptin®), 캐싸일라 (Kadcyla®) 및 본 발명에 따른 ADC-AL를 각각 처리하고 4 일간 배양했을 때, HER2 발현의 결여 때문에 감수성이 없었다 (도 12a).
그러나 HER2가 과발현된 SK-BR-3 세포를 허셉틴으로 처리하면 용량-의존적으로 세포 증식이 40 %까지 감소하였다. 본 발명의 ADC-AL의 경우, 세포 성장이 52 %까지 억제되었고, 캐싸일라(Kadcyla®)는 약 90 %의 최대 세포 사멸을 보였다 (도 12b).
결론적으로 허셉틴 (Herceptin®), 캐싸일라 (Kadcyla®) 및 본 발명에 따른 ADC-AL은 HER2 양성 유방암 세포주에 대해 높은 선택성을 나타내지만, 유리 DM1은 HER2 과발현에 관계없이 모든 세포주에서 동등한 효능을 나타낸다. ADC-AL은 Herceptin®에 비해 SK-BR-3 세포주에서 약 12 % 향상된 역가를 나타내었다.

Claims (8)

  1. 하기 화학식 1의 옥심 유도체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:
    [화학식 1]
    Figure 112017091722700-pat00019

    (상기 화학식 1에서,
    R1은 Cn(H2O)n 이고, n은 1 내지 10의 정수이며,
    R2는 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알킬기 이고,
    R3는 수소 또는 히드록시기 이며,
    X는 카르복실기, 알데히드기 또는 케톤기 이고, 및
    Y는 말레이미드기 또는 싸이올기 이다)
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R1은 n이 4 내지 10의 정수인, 테트로오스, 펜토오스, 헥소오스, 헵토오스, 옥토오스, 노노오스 또는 데코오스 인, 옥심 유도체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 옥심 유도체는 하기 화학식 1-1의 화합물인, 옥심 유도체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.
    [화학식 1-1]
    Figure 112017091722700-pat00020

    (상기 화학식 1-1에서,
    a는 1 내지 20의 정수이고,
    X는 카르복실기, 알데히드기 또는 케톤기 이며 및
    Y는 말레이미드기 또는 싸이올기 이다)
  4. 하기 화학식 2의 항체-약물 복합체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:
    [화학식 2]
    Figure 112017091722700-pat00021

    (상기 화학식 2에서,
    Ab는 항체이며,
    R1은 Cn(H2O)n 이고, n은 1 내지 10의 정수이며,
    R2는 치환 또는 비치환된 C1-C20의 알킬기 이고,
    R3는 수소 또는 히드록시기 이며,
    X는 카르복실기, 알데히드기 또는 케톤기로 이고,
    Y는 말레이미드기 또는 싸이올기 이며,
    Drug은 약물이고, 그리고 m은 1 내지 10의 정수이다)
  5. 제4항에 있어서,
    상기 R1은 n이 4 내지 10의 정수인, 테트로오스, 펜토오스, 헥소오스, 헵토오스, 옥토오스, 노노오스 또는 데코오스 인, 항체-약물 복합체
  6. 제4항에 있어서,
    항체-약물 복합체는 화학식 2-1의 복합체인, 항체-약물 복합체.
    [화학식 2-1]
    Figure 112017091722700-pat00022

    (상기 화학식 2-1에서,
    Ab는 항체이며,
    X는 카르복실기, 알데히드기 또는 케톤기로 이고,
    Y는 말레이미드기 또는 싸이올기 이며,
    Drug은 약물이고, a는 1 내지 20의 정수이며, 그리고 m은 1 내지 10의 정수이다)
  7. 제4항에 있어서,
    상기 항체는 트라스트주맙, 리툭시맙, 세툭시맙, 비탁신, 벨리무맙, 에쿨리주맙, 에파리주맙, 알레파셉트, 이브리투모맙, 토시투모맙, 오파투무맙, 뮤로모납-CD3, 브렌툭시맙, 젬투주맙, 알레투주맙, 아바타셉트, 벨라타셉트, 이필리무맙, 파니투무맙, 카투막소맙, 압식시맙, 퍼투주맙, 오마리주맙, 카나키누맙, 릴로나셉트, 우스테키누맙, 다클리주맙, 바실릭시맙, 토실리주맙, 나탈리주맙, 데노수맙, 파빌리주맙, 인플릭시맙, 엔타네셉트, 아달리무맙, 세르톨리주맙, 골리무맙, 로미플로스팀, 베바시주맙, 라니비주맙 및 아플리버셉트로 이루어진 군에서 선택된 것인, 항체-약물 복합체.
  8. 제1항에 따른 옥심 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 약물 전달용 조성물.
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