KR20220012277A - 신규 인공 단백질 촉매 - Google Patents

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KR20220012277A
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카츠노리 타나카
켄워드 봉
타이지 시모다
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가부시키가이샤 도우사 고가쿠 겐큐쇼
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Abstract

[과제] 본 발명은 생체 내 물질로부터 촉매를 보호할 수 있고 생체 내 합성 화학 요법에 잠재적 유용성을 갖는 새로운 인공 단백질 촉매를 제공하는 것을 목적으로 한다.
[해결수단] 단백질과, 금속 촉매 또는 유기 촉매로부터 선택된 촉매의 복합체가 제공된다. 본 발명에 따른 복합체에서, 단백질은 그의 삼차원 구조 내에 소수성 포켓을 갖는 단백질이며, 촉매는 친수성 환경에 노출되지 않거나 실질적으로 노출되지 않도록 소수성 포켓에 수용된다.

Description

신규 인공 단백질 촉매
본 발명은 신규한 인공 단백질 촉매에 관한 것이다.
현재, 촉매를 이용한 "생체 내 합성 화학 치료(in vivo synthetic chemical treatments)"에 관한 시도가 검토되고 있다. 생체 내 합성 화학 치료의 개념은 활성 또는 독성이 없는 물질 또는 시약을 체내에 도입하여 체내의 특정 장소에서 상기 물질 또는 시약을 촉매에 의해 활성화시켜 효과를 발현시키는 것이다. 이런 상황에서, 치료 용도에 적용 가능한 새로운 촉매의 개발에 대한 관심이 높아지고 있다 (비특허문헌 1).
이러한 촉매의 개발에서 한 가지 장벽은 생체 내 물질로부터 촉매를 보호하는 것이다. 예를 들어, 금속 촉매 (금속 효소), 예컨대 금 (Au), 팔라듐 (Pd), 루테늄 (Ru) 등은 세포 내에서 0.5 내지 10 mM, 또는 혈장 중에 약 2 내지 20 μM의 범위로 존재하는 티올 함유 글루타티온 (GSH)에 노출되면 급속하게 비활성화되는 것으로 알려져 있다.
현 시점에서는, 많은 연구에 있어서, 인공 금속 효소 또는 금속 촉매 복합체 중 임의의 것을 통하여, 세포 또는 제브라피쉬 등과 같은 포유류 이외의 모델에서만 촉매 반응의 검토가 행해지고 있다 (비특허문헌 2 내지 17).
선행 기술 문헌
비특허 문헌
[비특허 문헌 1] Rebelein, J. G.; Ward, T. R. Curr. Opin. Biotechnol. 2018, 53, 106-114.
[비특허 문헌 2] Miller, M. A.; Askevold, B.; Mikula, H.; Kohler, R. H.; Pirovich, D.; Weissleder, R. Nat. Co mMun. 2017, 8, 15906.
[비특허 문헌 3] Clavadetscher, J.; Hoffmann, S.; Lilienkampf, A.; Mackay, L.; Yusop, R. M.; Rider, S. A.; Mullins, J. J.; Bradley, M. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2016, 55, 15662-15666.
[비특허 문헌 4] Clavadetscher, J.; Indrigo, E.; Chankeshwara, S. V.; Lilienkampf, A.; Bradley, M. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2017, 56, 6864-6868.
[비특허 문헌 5] Weiss, J. T.; Dawson, J. C.; Macleod, K. G.; Rybski, W.; Fraser, C.; Torres-Sanchez, C.; Patton, E. E.; Bradley, M.; Carragher, N. O.; Unciti-Broceta, A. Nat. Co mMun. 2014, 5, 3277.
[비특허 문헌 6] Perez-Lopez, A. M.; Rubio-Ruiz, B.; Sebastian, V.; Hamilton, L.; Adam, C.; Bray, T. L.; Irusta, S.; Brennan, P. M.; Lloyd-Jones, G. C.; Sieger, D.; Santamaria, J.; Unciti-Broceta, A. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2017, 56, 12548-12552.
[비특허 문헌 7] Bray, T. L.; Salji, M.; Brombin, A.; Perez-Lopez, A. M.; Rubio-Ruiz, B.; Galbraith, L. C. A.; Patton, E. E.; Leung, H. Y.; Unciti-Broceta, A. Chem. Sci. 2018, 9, 7354-7361.
[비특허 문헌 8] Liu, Y.; Pujals, S.; Stals, P. J. M.; Paulohrl, T.; Presolski, S. I.; Meijer, E. W.; Albertazzi, L.; Palmans, A. R. A. J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 3423-3433.
[비특허 문헌 9] Li, J.; Yu, J.; Zhao, J.; Wang, J.; Zheng, S.; Lin, S.; Chen, L.; Yang, M.; Jia, S.; Zhang, X.; Chen, P. R. Nat. Chem. 2014, 6, 352-361.
[비특허 문헌 10] Vidal, C.; Tomas-Gamasa, M.; Destito, P.; Lopez, F.; Mascarenas, J. L. Nat. Co mMun. 2018, 9, 1913.
[비특허 문헌 11] Destito, P.; Sousa-Castillo, A.; Couceiro, J. R.; Lopez, F.; Correa-Duarte, M. A.; Mascarenas, J. L. Chem. Sci. 2019, 10, 2598-2603.
[비특허 문헌 12] Tonga, G. Y.; Jeong, Y.; Duncan, B.; Mizuhara, T.; Mout, R.; Das, R.; Kim, S. T.; Yeh, Y.-C.; Yan, B.; Hou, S.; Rotello, V. M. Nat. Chem. 2015, 7, 597-603.
[비특허 문헌 13] Streu, C.; Meggers, E. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2006, 45, 5645-5648.
[비특허 문헌 14] Volker, T.; Dempwolff, F.; Graumann, P. L.; Meggers, E. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2014, 53, 10536-10540.
[비특허 문헌 15] Tomas-Gamasa, M.; Martinez-Calvo, M.; Couceiro, J. R.; Mascarenas, J. L. Nat. Co mMun. 2016, 7, 12538.
[비특허 문헌 16] Yusop, R. M.; Unciti-Broceta, A.; Johansson, E. M. V.; Sanchez-Martin, R. M.; Bradley, M. Nat. Chem. 2011, 3, 239-243.
[비특허 문헌 17] Unciti-Broceta, A.; Johansson, E. M. V.; Yusop, R. M.; Sanchez-Martin, R. M.; Bradley, M. Nat. Protoc. 2012, 7, 1207-1218.
본 발명의 목적은 생체 내 물질로부터 촉매의 보호를 가능하게 하고 생체 내 합성 화학 치료에 잠재적 유용성을 갖는 신규한 인공 단백질 촉매를 제공하는 것이다.
인간 혈청 알부민 (human serum albumin; HSA)은 혈장에 풍부하게 존재하는 66.5 kDa의 단백질이며, 혈청 중의 반감기는 약 19일인 것으로 알려져 있다 (Peters, T., Jr. Adv. Protein Chem. 1985, 37, 161-245.). HSA는 다양한 호르몬, 지방산 및 저분자 약제에 대한 담체 단백질인 것으로 알려져 있으며, 여러 종류의 리간드에 대한 주요 결합 부위와 부 작용 부위가 HSA에 다수 존재하는 것으로 확인되었다 (Ghuman, J.; Zunszain, P. A.; Petitpas, I.; Bhattacharya, A. A.; Otagiri, M.; Curry, S. J. Mol. Biol. 2005, 353, 38-52.).
본 발명자들은, 생체 적합성 인공 단백질 촉매를 설계하기 위해서, 단백질로서 HSA를 선택하고, HSA의 소수성 결합 포켓(hydrophobic binding pocket)에 금속 촉매를 수용하는 것을 고려하였다. 그리고, 촉매로서 금속 촉매인 루테늄을 사용하여, 쿠마린 유도체 (예컨대 와파린)와의 결합 (상호 작용)이 알려져 있는 알부민 약물 결합 부위 I에, 금속 촉매를 고정시키게 되면, 시험관 내 조건하, 20 mM GSH의 존재하에서도, 결합된 루테늄의 촉매 활성을 보호할 수 있는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기 특징을 포함한다:
[1] 단백질과, 금속 촉매 또는 유기 촉매로부터 선택되는 촉매의 복합체로서,
상기 단백질은, 그의 삼차원 구조 내에 소수성 포켓을 갖는 단백질이며,
상기 복합체는 상기 촉매가 친수성 환경에 노출되지 않거나 실질적으로 노출되지 않도록 상기 촉매를 상기 소수성 포켓 내에 수용하는, 복합체.
[2] [1]에 따른 복합체로서, 상기 단백질은 천연 또는 인공 단백질인 복합체.
[3] [1] 또는 [2]에 따른 복합체로서, 상기 단백질은 인간 혈청 알부민 (HSA), 면역글로불린 G (IgG), 면역글로불린 A (IgA), 트랜스페린, 항트립신(antitrypsin), 합토글로빈(haptoglobin), α1-산성 당단백질, 미오페린 (Myoferlin), Trk 수용체, 에스트로겐 수용체, 및 엽산 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 복합체.
[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 따른 복합체로서, 상기 금속 촉매는 붕소 촉매, 마그네슘 촉매, 알루미늄 촉매, 규소 촉매, 칼슘 촉매, 스칸듐 촉매, 티탄 촉매, 바나듐 촉매, 크롬 촉매, 망간 촉매, 철 촉매, 코발트 촉매, 니켈 촉매, 구리 촉매, 아연 촉매, 이트륨 촉매, 지르코늄 촉매, 니오븀 촉매, 몰리브덴 촉매, 루테늄 촉매, 로듐 촉매, 팔라듐 촉매, 은 촉매, 인듐 촉매, 주석 촉매, 바륨 촉매, 하프늄 촉매, 텅스텐 촉매, 레늄 촉매, 오스뮴 촉매, 이리듐 촉매, 백금 촉매, 금 촉매 및 란타노이드 루이스산(lanthanoid Lewis acid) 촉매로 이루어진 군으로부터 선택되는, 복합체.
[5] [4]에 따른 복합체로서, 상기 란타노이드 루이스산 촉매는, 이테르븀 촉매, 란탄 촉매, 세륨 촉매, 사마륨 촉매, 유로퓸 촉매, 가돌리늄 촉매, 테르븀 촉매, 툴륨 촉매, 및 루테튬 촉매로 이루어진 군으로부터 선택되는, 복합체.
[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 따른 복합체로서,
상기 단백질은 인간 혈청 알부민이고,
상기 촉매는 금속 촉매인, 복합체.
[7] [6]에 따른 복합체로서, 상기 금속 촉매는 루테늄 촉매인, 복합체.
[8] [6] 또는 [7]에 따른 복합체로서, 상기 인간 혈청 알부민의 소수성 포켓은 알부민 약물 결합 부위 I (약물 부위(drug site) I)인, 복합체.
[9] [6] 내지 [8] 중 어느 하나에 따른 복합체로서, 상기 금속 촉매는 인간 혈청 알부민에 대한 리간드(ligand)를 통해 상기 소수성 포켓에 결합하는, 복합체.
[10] [9]에 따른 복합체로서, 상기 리간드는 와파린, 아자프로파존, 아세노쿠마롤, 페닐부타존, 살리실레이트 염, 인도메타신, 페니토인, 톨부타미드, 클로르프로파미드, 이오페녹세이트, 요오디파미드, 설파디메톡신, 펜프로쿠몬, 글리벤클라미드, 설파티아졸, 테녹시캄, 캄프토테신, 발지덴데아지, 안델레라탄, 디아델레알, 디아델레알탄, 프로단, 빌리루빈, 에이코사노이드 및 카르복시-메틸-프로필-푸란프로파노에이트 (요독증 독소), 및 쿠마린으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 복합체.
[11] [9] 또는 [10]에 따른 복합체로서, 상기 금속 촉매는 상기 리간드에 결합된 링커(linker)를 통해 상기 소수성 포켓에 결합되는, 복합체.
[12] [11]에 따른 복합체로서, 상기 링커는 양 말단에 아미노기 및 카르복실기를 갖는 알킬 쇄 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 쇄인, 복합체.
[13] [12]에 따른 복합체로서, 상기 링커는 C1-C3 알킬 또는 중합도 1 내지 3의 PEG 쇄인, 복합체.
[14] [1] 내지 [13] 중 어느 하나에 따른 복합체로서, 상기 단백질의 표면은 생체 내 표적 부위와 상호 작용하도록 변형되는, 복합체.
[15] [14]에 따른 복합체로서, 상기 변형은 당쇄(sugar chain)에 의한 변형인, 복합체.
[16] [1] 내지 [13] 중 어느 하나에 따른 복합체로서, 상기 단백질은 생체 내에서 표적 부위와 상호 작용하는 부분을 추가로 포함하는, 복합체.
[17] [14] 또는 [15]에 따른 복합체로서, 상기 단백질은 인간 혈청 알부민인, 복합체.
[18] [1] 내지 [17] 중 어느 하나에 따른 복합체를 포함하는 조성물.
[19] [18]에 따른 조성물로서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물인, 조성물.
[20] [19]에 따른 조성물로서, 상기 복합체에 의해 활성화될 수 있는 전구약물(prodrug)과 조합하여 사용되는, 조성물.
[21] [19]에 따른 조성물로서, 상기 복합체에 의해 활성화될 수 있는 전구약물을 추가로 포함하는, 조성물.
[22] [19]에 따른 조성물로서, 특정 세포를 선택적으로 태깅(tagging)하는 데 사용되는 조성물.
[23] [22]에 따른 조성물로서, 상기 세포에 태깅되는 화학 물질과 조합하여 투여되는 조성물.
[24] [18]에 따른 조성물로서, 바이오센서로 사용되는 조성물.
[25] [18]에 따른 조성물로서, 에틸렌을 검출하기 위한 바이오센서(biosensor)로 사용되는 조성물.
[26] 전구약물을 포함하는 약학 조성물로서,
상기 전구약물은, [1] 내지 [17] 중 어느 하나에 따른 복합체에 의해 활성화될 수 있으며,
상기 약학 조성물은, [1] 내지 [17] 중 어느 하나에 따른 복합체와 조합하여 사용되는, 약학 조성물.
[27] [1] 내지 [17] 중 어느 하나에 따른 복합체를 포함하는 제1 약제(agent), 및
상기 복합체에 의해 활성화될 수 있는 전구약물을 포함하는 제2 약제를 포함하는 조합 의약(combination medicine).
전술한 본 발명의 하나 이상의 특징을 임의로 조합한 발명도 본 발명의 범위에 포함된다는 것을 당업자는 인정할 것이다.
본 발명에 따르면, 생체 내 물질로부터 촉매를 보호할 수 있는 새로운 인공 단백질 촉매가 제공된다.
도 1은 루테늄 촉매 Ru1 - 3, 6과 HSA의 반응에 의해 얻어진 생성물의 형광 검정 결과를 나타낸다.
도 2는 HSA와 와파린 또는 이부프로펜의 반응 후 루테늄 촉매 Ru1 - 3, 6과의 반응을 수행했을 때의 포화 결합 곡선을 나타낸다.
도 3은 본원 실시예에서 사용된 alb-Ru 복합체의 촉매 능력을 시험하기 위한 실험 시스템을 나타낸다.
도 4는 상이한 조건에서의 alb-Ru 복합체의 촉매 능력의 평가 결과를 나타낸다.
도 5는 상이한 조건에서의 alb-Ru 복합체의 촉매 능력의 평가 결과를 나타낸다.
도 6은 ArM 활성 (인공 금속 효소 활성)과 관련하여 GSH의 존재 또는 부재하에 기질 1a 내지 e의 미카엘리스-멘텐의 속도론적 파라미터 (Michaelis-Menten kinetic parameter)를 나타낸다.
도 7은 루테늄 촉매 Ru1 - 3, 6이 인간 혈청 알부민 (PDB:1H9Z)에 도킹될 때의 분자 모델링을 나타낸다.
도 8은 GArM-Ru1 (2,3-Sia)이 SW620 인간 결장 선암 세포에 잘 축적됨을 나타내는 세포 이미징(imaging) 결과이다.
도 9는 GArM-Ru1 (2,3-Sia)의 축적에 대한 SW620 인간 결장 선암 세포, HeLa 인간 자궁경부암 유래 세포 및 A549 인간 폐포 기저 상피 선암 세포 사이의 비교를 나타낸다.
도 10은 GArM-Ru 복합체에 의한 전구약물 1g 및 1h의 활성화에 대한 동역학 실험을 나타낸다.
도 11은 암 세포주에 대한 전구약물, 전구약물과 alb-Ru1 또는 전구약물과 GArM-Ru1에 의한 세포 증식 억제 효과의 비교를 나타낸다.
도 12는 ArM 에틸렌 프로브 (AEP)의 합성 방식을 나타낸다.
도 13은 AEP 프로브와 비교하여 alb-Ru 화합물의 관찰된 형광 강도를 나타낸다.
도 14는 본 연구에서 다양한 단백질 화합물의 폴딩 구조의 변화를 조사하기 위한 CD 스펙트럼의 비교를 나타낸다.
도 15는 AEP를 이용한 키위 과일의 상이한 발달 단계 (미숙성 및 숙성)에 있어서의 다양한 소기관 (외측 과피, 씨방 및 자주)에서 발현된 에틸렌 생산량의 변화를 관찰한 결과를 나타낸다. 샘플 수는 외측 과피 (n=24), 씨방 (n=2) 및 자주 (n=4)이며, 통계 분석은 한 쌍의 샘플의 t-검정을 사용하여 행하였다. *P<0.03, **P<0.002, ***P<0.0002, ****P<0.0001, ns = 중요하지 않은 부분.
도 16은 AEP (100 μM)를 작용시킨 야생형 Col-0 (b)의 표피의 형광 강도와 명시야(bright field) 현미경 이미징 이미지 (40배 확대) 및 에틸렌 생합성 촉진제 ACC (1 mM)를 더 첨가하여 검출한 결과를 나타낸다.
도 17은 ACC 첨가에 의해 애기장대 (Arabidopsis thaliana)로부터 생산되는 에틸렌의 양을 형광 강도로 관찰한 결과를 나타낸다. 모든 값은 3 세트의 실험에서 얻어졌다. 통계 분석은 터키 (Tukey)의 다중 비교 검정의 일원 배치 분산 분석을 사용하여 수행되었다. *P<0.03, **P<0.002, ***P<0.0002, ****P<0.0001, ns = 중요하지 않은 부분.
도 18은 GArM으로 처리된 HeLa 세포와 비처리 HeLa 세포의 유세포 계측 결과의 비교를 나타낸다.
도 19는 GArM으로 처리한 마우스 복강 유래 대식세포와 비처리 마우스 복강 유래 대식세포의 유세포 계측 결과의 비교를 나타낸다.
도 20은 GArM으로 처리된 HeLa 세포 및 마우스 복강 유래 대식세포와, GArM으로 처리되지 않은 HeLa 세포 및 마우스 복강 유래 대식세포의 유세포 계측 결과의 비교를 나타낸다. 또한, 좌상도 및 좌하도의 Q3의 값은 각각 99.09% 및 43.06%이다.
도 21은 실시예 8에서 수행된 세포 접착 분석의 결과를 나타낸다.
본 발명은 신규한 인공 단백질 촉매에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 인공 단백질 촉매는 단백질과, 금속 촉매 또는 유기 촉매로부터 선택되는 촉매의 복합체 (이하, "본 발명의 복합체"라고도 함)이다.
본 발명의 복합체는 그의 삼차원 구조 내에 소수성 포켓을 갖는 단백질의 상기 소수성 포켓 내에 촉매를 수용함으로써 촉매가 친수성 환경에 노출되지 않거나 실질적으로 노출되지 않도록 하는 구성을 특징으로 할 수 있다. 즉, 본 발명의 복합체는 촉매의 친수성 환경에의 노출 또는 실질적인 노출을 회피함으로써 생체 내 물질로부터 촉매를 보호할 수 있다. 본 발명의 복합체는 단백질에 존재하는 소수성 포켓 중 단지 한 곳에서만 촉매를 수용할 수 있거나, 복수의 (또는 모든) 포켓에 촉매를 수용할 수 있다.
본 발명의 복합체는 또한 촉매의 친수성 환경에의 노출 또는 실질적인 노출을 회피하는 구성을 가지는 한편, 상기 구성을 갖고 있어도, 촉매가 목표로 하는 반응을 촉진할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 본 발명의 복합체는 바람직한 실시양태에서 생체 내 물질로부터 촉매를 보호하면서 생체 내에서 목적하는 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명에서, "촉매가 친수성 환경에 실질적으로 노출되지 않는다"란, 친수성 환경으로부터 촉매의 보호가 인정되는 정도로 친수성 환경에의 노출이 허용되는 것을 지칭한다. "친수성 환경으로부터 촉매의 보호가 인정된다"는 자유 촉매를 생체 내 환경에 노출시킨 경우와 비교하여, 본 발명의 복합체에 수용된 촉매의 활성이 동일 환경하에서 보다 장기로 유지되고, 예를 들어, 대사 회전 (TON)에 의해 평가될 수 있음을 지칭한다. 노출이 허용되는 정도는 사용되는 촉매의 종류, 또는 조합하여 사용되는 단백질의 종류 등에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, "촉매가 친수성 환경에 실질적으로 노출되지 않는다"는 단백질의 소수성 포켓에 수용된 경우 촉매의 상대 용매 접근 가능 표면적 (SASA)이 5.0 이하, 바람직하게는 4.0 이하, 보다 바람직하게는 3.5 이하, 보다 바람직하게는 3.0 이하, 보다 바람직하게는 2.5 이하, 보다 바람직하게는 2.0 이하, 보다 바람직하게는 1.5 이하, 보다 바람직하게는 1.0 이하, 보다 바람직하게는 0.9 이하, 보다 바람직하게는 0.8 이하, 보다 바람직하게는 0.7 이하, 보다 바람직하게는 0.6 이하, 보다 바람직하게는 0.5 이하, 보다 바람직하게는 0.4 이하, 보다 바람직하게는 0.3 이하, 보다 바람직하게는 0.2 이하, 또는 보다 바람직하게는 0.1 이하인 것을 의미한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, "촉매가 친수성 환경에 실질적으로 노출되지 않는다"는 촉매의 총 표면적의 50% 이상, 바람직하게는 55% 이상, 보다 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 65% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 96 % 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 또는 보다 바람직하게는 99% 이상이 단백질의 소수성 포켓 내에 수용되는 것을 의미한다. 또는, "촉매가 친수성 환경에 실질적으로 노출되지 않는다"는 친수성 환경에 노출된 촉매의 면적이, 촉매의 총 표면적의 50% 이하, 바람직하게는 45% 이하, 보다 바람직하게는 40% 이하, 보다 바람직하게는 35% 이하, 보다 바람직하게는 30% 이하, 보다 바람직하게는 25% 이하, 보다 바람직하게는 20% 이하, 보다 바람직하게는 15% 이하, 보다 바람직하게는 10% 이하, 보다 바람직하게는 5% 이하, 보다 바람직하게는 4% 이하, 보다 바람직하게는 3% 이하, 보다 바람직하게는 2% 이하, 또는 보다 바람직하게는 1% 이하인 것을 의미한다.
본 발명의 복합체에 사용될 수 있는 단백질은 촉매의 수용을 가능하게 하는 하나 이상의 소수성 포켓을 갖는 한 제한되지 않고, 천연 또는 인공 단백질이 사용될 수 있다. 인공 단백질은 천연 단백질의 일부에 인공적으로 돌연변이가 도입된 돌연변이 단백질을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 복합체에 사용되는 단백질은 그의 소수성 포켓 중 어느 하나에 결합 또는 상호 작용하는 리간드의 입수가 용이한 단백질이다. 이러한 단백질은 리간드를 통한 촉매의 복합체화를 용이하게 한다는 점에서 바람직할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 복합체에 사용되는 단백질은 인간 혈청 알부민 (HSA), 면역글로불린 G (IgG), 면역글로불린 A (IgA), 트랜스페린, 항트립신, 합토글로빈, α1- 산성 당단백질 등으로부터 선택되는 단백질이다. 이들 단백질은 혈액 내에서 자유롭게 이동할 수 있는 단백질이기 때문에 약물 전달 시스템에 적합하다고 생각된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 복합체에 사용되는 단백질은 미오페린(Myoferlin), Trk 수용체, 에스트로겐 수용체, 엽산 수용체 등으로부터 선택되는 단백질이다. 이들 단백질은 암세포에서 많이 발현되는 것으로 알려져 있기 때문에, 이에 대한 리간드 및 금속을 배위시킴으로써 암을 직접적으로 사멸시킬 수 있는 복합체의 제조가 가능하다고 생각된다.
본 발명의 복합체에 사용될 수 있는 유기 촉매 또는 금속 촉매는 특별히 제한되지 않고, 당업자가 임의로 선택할 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 복합체에 사용될 수 있는 유기 촉매 또는 금속 촉매는 주어진 전구약물을 활성 형태로 변경시키는 활성을 갖는 것이다.
예를 들어, 본 발명의 복합체에 사용되는 유기 촉매로서, 이에 한정되는 것은 아니지만, 프롤린 유도체, 4급 암모늄염 유도체를 기반으로 하는 상 이동 촉매, 티오우레아 유도체, 티아졸륨염이나 이미다졸륨염으로부터 얻어지는 N-헤테로사이클릭 카르벤 유도체, 사이클릭 케톤 유도체, 4-디메틸아미노피리딘 유도체, 아미노산과 같은 2급 아민 등을 들 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 복합체에 사용되는 금속 촉매로서, 이에 한정되는 것은 아니지만, 붕소 촉매, 마그네슘 촉매, 알루미늄 촉매, 규소 촉매, 칼슘 촉매, 스칸듐 촉매, 티탄 촉매, 바나듐 촉매, 크롬 촉매, 망간 촉매, 철 촉매, 코발트 촉매, 니켈 촉매, 구리 촉매, 아연 촉매, 이트륨 촉매, 지르코늄 촉매, 니오븀 촉매, 몰리브덴 촉매, 루테늄 촉매, 로듐 촉매, 팔라듐 촉매, 은 촉매, 인듐 촉매, 주석 촉매, 바륨 촉매, 하프늄 촉매, 텅스텐 촉매, 레늄 촉매, 오스뮴 촉매, 이리듐 촉매, 백금 촉매, 금 촉매, 란타노이드 루이스산 촉매 등을 들 수 있다. 또한, 상기 란타노이드 루이스산 촉매로서, 이에 한정되는 것은 아니지만, 이테르븀 촉매, 란탄 촉매, 세륨 촉매, 사마륨 촉매, 유로퓸 촉매, 가돌리늄 촉매, 테르븀 촉매, 툴륨 촉매, 루테튬 촉매 등을 들 수 있다.
단백질의 소수성 포켓에 촉매를 수용하기 위한 수단으로서는, 예를 들어 소수성 포켓과 상호 작용하거나 결합하는 리간드를 통해 상기 소수성 포켓 내에 촉매를 결합시키는 수단을 포함할 수 있다. 이 경우, 리간드와 촉매 (예를 들면, 금속 촉매)의 연결에는 적절하게 펩티드, 탄화수소 쇄, PEG 등의 링커를 사용할 수 있다. 사용되는 링커의 길이는 촉매가 소수성 포켓 내에 수용되고 친수성 환경으로부터 노출되지 않거나 실질적으로 노출되지 않는 길이여야 한다. 즉, 소수성 포켓, 이와 상호 작용하는 리간드 및 사용되는 촉매의 크기에 대하여, 사용되는 링커가 너무 긴 경우에는, 촉매가 링커 및 리간드를 통해 소수성 포켓에 결합할 때 촉매가 소수성 포켓 내에 수용되지 않고 그 일부 또는 전부가 소수성 포켓으로부터 친수성 환경에 노출되어 친수성 환경에 대한 충분한 보호를 얻지 못할 수 있다.
단백질의 소수성 포켓에 촉매를 수용하기 위한 또 다른 수단으로서, 예를 들어 단백질의 소수성 포켓 내 또는 그 근처에 존재하는 시스테인 또는 리신의 측쇄 작용기 (각각 티올기 및 아미노기)에 말레이미드 또는 숙신이미드를 적용시켜 촉매를 활성화시키고 그와 공유 결합시키는 것을 포함할 수 있다.
단백질의 소수성 포켓에 촉매를 수용하기 위한 또 다른 수단으로서는, 소수성 포켓을 구성하는 아미노산 서열의 특정 위치에 돌연변이를 도입하여 이중 결합 또는 아지드를 도입하고, 복분해 또는 클릭 반응을 수행하여 촉매와 공유 결합시키는 방법을 포함할 수 있다 (Young TS, Ahmad I, Brock A, Schultz PG., Expanding the genetic repertoire of the methylotrophic yeast Pichia pastoris., Biochemistry. 2009. 48 (12): 2643-53.; Wang L, Schultz PG., Expanding the genetic code., Angew Chem Int Ed Engl. 2004. 44 (1): 34-66.). 이 경우, 촉매(예를 들어, 금속 촉매)로서, 펩티드 또는 PEG와 같은 링커를 갖는 촉매를 사용할 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 복합체는 생체 내 표적 부위와 상호 작용하도록 변형된다. 이에 따라, 본 발명의 복합체가 생체 내의 목적하는 부위로 유도되고/거나, 목적하는 부위를 표적화(targeting)할 수 있다. 이와 관련하여, "생체 내 표적 부위와 상호 작용한다"는 것은 생체 내의 다른 부위와 비교하여 상당히 강한 지향성으로 표적 부위에 축적되거나 전형적으로 결합하는 것을 의미한다. 본 발명에서, 표적 부위는 특정 장기, 또는 특정 세포종 등일 수 있다.
이러한 변형으로서는, 예를 들면, 당화를 들 수 있다. 예를 들어, 아스파라긴 결합형 당쇄 (N-결합형 당쇄)를 단백질 변형에 사용함으로써 그 당쇄의 클러스터 및/또는 결합수에 따라 특정 장기에 대한 지향성이 변화하는 것이 알려져 있다 (Tanaka, K., et al., Angew. Chem. Int. Ed., 49, 8195-8200 (2010); Latypova, L., et al., Adv. Sci., 1600394 (2017); Ogura, A., et al., Chem. Commun., 54, 8693-8696 (2018); Taichi, M., et al., Adv. Sci., 1700147 (2017)). 예를 들어, 말단에 시알산을 갖는 당쇄는 간에, 또는 갈락토스를 갖는 당쇄는 장관 말단에 신속하게 도달하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 선택된 생체 내 표적 부위에 따라, 적절한 당쇄 구조 및 당쇄 수로 본 발명의 복합체를 변형시킴으로써, 상기 표적 부위에 대한 지향성(directionality)이 향상된 복합체를 얻을 수 있다.
일 실시양태에서, 당화로서, 예를 들면, 다양한 종류의 암과 상호 작용하는 시알산, 갈락토사민, 갈락토스, 또는 만노스를 비환원 말단에 갖는 당쇄를 복수 개 (예를 들면 5 내지 30개) 사용할 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 당화로서 푸코스를 갖는 당쇄가 사용될 수 있다. 해당 실시양태에 있어서, 변형되는 복수 개의 당쇄는 동 종류일 수도 복수 종류일 수도 있고, 각 당쇄의 크기는 1 내지 25 당의 범위일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 당화로서, 예를 들어 간, 췌장, 장관, 담낭, 방광 또는 뇌에서와 같은 특정 기관으로 선택적으로 전이하는 시알산, 갈락토사민, 갈락토스 또는 만노스를 비환원 말단에 갖는 당쇄를 복수 개 (예를 들면 5 내지 30개) 사용할 수 있다. 해당 실시양태에 있어서, 변형되는 복수 개의 당쇄는 동 종류일 수도 복수 종류일 수도 있고, 각 당쇄의 크기는 1 내지 25 당의 범위일 수 있다.
변형 부위는 전형적으로 상기 복합체의 단백질 표면이다. 단백질 표면의 특정 부위를 당화하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 임의의 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 예를 들어 국제 공개 제2008/096760호, 일본 특허 제6327547호, 국제 공개 제2017/002918호 등에 기재된 클릭 반응에 의해 단백질 표면에 당화를 도입할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 복합체는 생체 내 표적 부위와 상호 작용하는 부분을 추가로 포함한다. 이와 관련하여, "표적 부위와 상호 작용하는"은 다른 부위와 비교하여 상당히 강한 지향성으로 표적 부위에 축적되거나 전형적으로 결합하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서, 표적 부위는 특정 장기, 또는 특정 세포종(cytoma) 등일 수 있다.
본 발명에 있어서, "생체 내 표적 부위와 상호 작용하는 부분"은 항체 또는 그의 단편, 펩티드 리간드 또는 그의 단편, DNA나 RNA, 또는 pNA (펩티드 핵산) 또는 그의 단편 등일 수 있다. 이와 관련하여, "생체 내 표적 부위와 상호 작용하는 부분"은 예를 들어 복합체에 사용되는 단백질과의 융합 단백질로서 제조될 수 있고, 복합체에 사용되는 단백질과 "생체 내의 표적 "부위와 상호 작용하는 부분"은 별도로 제조될 수 있며, 이어 당업자에게 공지된 수단에 의해 결합 (예를 들어, 공유 결합)될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 단백질과 금속 촉매의 복합체인 인공 금속 효소 (artificial metalloenzyme; ArM)에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 ArM은 HSA와 금속 촉매의 복합체이고, 상기 복합체는 금속 촉매를 HSA의 소수성 포켓에 수용하여 금속 촉매가 친수성 환경에 노출되지 않거나 실질적으로 노출되지 않도록 하는 것을 특징으로 한다.
이 실시양태에서, HSA와 함께 사용되는 금속 촉매는, 예를 들면 활성화의 대상이 되는 전구약물의 종류 등에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, HSA와 함께 사용되는 금속 촉매는 루테늄이다.
이 실시양태에서, 금속 촉매를 수용하는 HSA의 소수성 포켓은, 특별히 제한되지 않고, 하나의 소수성 포켓이 금속 촉매를 수용할 수도 있고, 복수의 소수성 포켓이 금속 촉매를 수용할 수도 있다. HSA의 소수성 포켓으로는 알부민 약물 결합 부위 I 및 알부민 약물 결합 부위 II를 들 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 복합체는 HSA의 알부민 약물 결합 부위 I에 금속 촉매를 수용한다.
이 실시양태에서는, 금속 촉매와 HSA에 대한 리간드를 연결한 다음, 상기 리간드를 통해 소수성 포켓 내에 금속 촉매를 결합시킴으로써, HSA의 소수성 포켓에 금속 촉매를 수용시킬 수 있다. 이러한 목적으로 사용될 수 있는 리간드는 금속 촉매를 수용하는 소수성 포켓에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, HSA의 알부민 약물 결합 부위 I에 금속 촉매를 수용시키는 경우, 상기 리간드는 와파린, 아자프로파존, 아세노쿠마롤, 페닐부타존, 살리실레이트 염, 인도메타신, 페니토인, 톨부타미드, 클로르프로파미드, 이오페녹세이트, 요오디파미드, 설파디메톡신, 펜프로쿠몬, 글리벤클라미드, 설파티아졸, 테녹시캄, 캄프토테신, 발지덴데아지, 안델레라탄, 디아델레알, 디아델레알탄, 프로단, 빌리루빈, 에이코사노이드, 및 카르복시-메틸-프로필-푸란프로파노에이트 (요독증 독소) 및 쿠마린으로부터 선택될 수 있다. 또는, HSA의 알부민 약물 결합 부위 II에 금속 촉매를 수용시키는 경우에는, 상기 리간드는 디아제팜, 케토프로펜, 클로피브레이트, 이부프로펜, 이오파노에이트, 아지드 데옥시티미딘, 플루페나메이트, 에타크리네이트, 나프록센, 플루르비프로펜, 시클로프로펜, 베녹사프로펜, 플루크록사실린, 클로로티아지드, 피르프로펜, 프로포폴, 이소플루란, 단실사르코신, 단실글리신, 알킬아미노쿠마린 아세트산, 하이드록시플라본, L-트립토판, 중쇄 지방산 음이온 (예컨대, 옥타노에이트), L-티록신, 클로라이드 이온, 요오도아세트산, 인독실 설페이트 및 히푸르산 (요독소)으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, HSA의 소수성 포켓은 약물 결합 부위 I이고, 상기 언급된 부위에 루테늄을 수용하기 위해 리간드로서 쿠마린 유도체, 예를 들어 7-디메틸아미노 쿠마린이 사용된다.
금속 촉매와 리간드의 연결은 링커를 통해 이루어질 수 있다. 이러한 목적으로 사용될 수 있는 링커는 전형적으로 양 말단에 아미노기 및 카르복시기를 갖는 알킬 쇄, 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 쇄 등을 사용할 수 있다. 구체적으로, 알킬 쇄 링커로서는, 예를 들면, -NH-(CH2)x-CO- (식 중, x는 정수이며, 목적으로 하는 링커 기능을 저해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들면 1 내지 15의 정수일 수 있음), -NH-(CH2CH2O)y-CH2-CO- (식 중, y는 정수이며, 목적으로 하는 링커 기능을 저해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들면 1 내지 15의 정수일 수 있음) 또는 -NH-(CH2CH2O)z-CH2CH2-CO- (식 중, z는 정수이며, 목적으로 하는 링커 기능을 저해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들면 1 내지 15의 정수일 수 있음) 등을 들 수 있다.
금속 촉매와 상기 리간드의 연결에 링커를 사용하는 경우, 사용되는 링커의 길이는 금속 촉매가 HSA의 소수성 포켓 내에 수용되고 친수성 환경에 노출되지 않거나 실질적으로 노출되지 않도록 하는 길이여아 한다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, 리간드로서 쿠마린 또는 이의 유도체 (예컨대, 7-디메틸아미노쿠마린, 7-디에틸아미노쿠마린 (DEAC))를 사용하여 HSA의 알부민 약물 결합 부위 I에 루테늄을 수용하는 경우, "친수성 환경에 실질적으로 노출되지 않는다"는 친수성 환경에 노출되는 루테늄의 면적이 루테늄의 총 표면적의 40% 이하, 바람직하게는 35% 이하인 것일 수 있다. 대안적으로, "친수성 환경에 실질적으로 노출되지 않는다"는 HSA의 알부민 약물 결합 부위 I에 수용되는 경우 루테늄의 SASA가 3.0 이하, 바람직하게는 1.0 이하인 것일 수 있다. 또한, 이 경우에 사용되는 예시적인 링커는 -NH-(CH2CH2O)y-CH2-CO-이며, 여기서 y는 1 내지 6의 정수, 바람직하게는 1 내지 3의 정수일 수 있다.
일 실시양태에 있어서, HSA와 금속 촉매의 복합체인 본 발명의 ArM에서, HSA의 표면은 당쇄로 변형되어 있다. 당화 변형의 함량은 생체 내 표적에 따라 달라질 수 있다. HSA 표면 상의 변형 위치는 당쇄의 도입이 가능하다면 특별히 제한되지 않으며, 예로서 HSA 표면에 있는 30번 위치의 리신 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 복합체는 상기 복합체에 수용된 촉매의 종류에 따라 생체 내에서 전구약물을 활성화할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 복합체는 상기 복합체에 수용된 촉매의 종류에 따라 생체 내의 특정 위치에 축적되어, 상기 위치로 선택적으로 전구약물을 활성화할 수 있다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 복합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 복합체에 의해 활성화될 수 있는 전구약물과 조합하여 사용되는 약학 조성물이다. 상기 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 및 경우에 따라 본 발명의 복합체에 의해 활성화될 수 있는 전구약물을 추가로 포함하는 단일 복용형일 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 본 발명의 복합체에 의해 활성화될 수 있는 전구약물로서는, 예를 들면 각종 항암제를 들 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니지만, 구체적으로 마이토마이신 C, 독소루비신, 탁솔, 엔도시펜 등이 예시될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은, 본 발명의 복합체와 상기 복합체에 의해 활성화될 수 있는 전구약물이 별개의 약제로서 제공되는 조합 의약의 형태이다. 본 발명의 조합 의약에서는, 본 발명의 복합체를 포함하는 제1 약제와, 상기 복합체에 의해 활성화될 수 있는 전구약물을 포함하는 제2 약제가, 동시에 또는 상이한 시기에 대상에게 투여될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 복합체에 의해 활성화될 수 있는 전구약물 및 임의의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 상기 약학 조성물은 본 발명의 복합체와 조합하여 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 생체 내에 특정 세포를 선택적으로 태깅하는데 사용될 수 있다. 본 발명에서, "태깅"은 내인성 또는 외적으로 투여될 수 있고 세포 기능을 파괴할 수 있거나 (예를 들어, 접착 억제제), 또는 면역학적 반응을 유도할 수 있는 비독성 화학 물질을 사용하여 표적 세포에 태깅하는 것을 지칭한다. 이러한 화학 물질은, 임의의 금속 촉매에 의해 비활성형에서 활성형으로 변환되는 생체 내 또는 생체 외 화학 물질이나, 임의의 금속 촉매에 의해 그 기능이 강화되는 생체 내 또는 생체 외 화학 물질일 수 있다. 치료 용도에서 이러한 방법은 선택적 세포 태깅 (SeCT)으로 지칭되고, 고 수준의 세포 독성제를 사용하여 암세포를 직접 제거하는 종래의 화학 요법과는 대조적으로 주변 조직을 현저하게 손상시키지 않고 간접적으로 표적 세포 (예를 들어, 암세포)의 사멸을 유도할 수 있을 것으로 기대된다. 예를 들어, 본원 실시예에서는, 암세포 표면 상에 발현된 인테그린에 대한 cRGD-프로파길 에스테르 (cRGD-PE)의 결합이 본 발명의 복합체에 의해 증강되어 전이를 저해할 수 있는 가능성이 나타났다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 바이오센서로서 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 복합체에서는, 금속 촉매, 자체로 형광성을 갖고/거나 알부민과 같은 단백질과의 결합에 의해 형광성이 증강되는 링커 (예를 들면 쿠마린 유도체) 및 금속 촉매와 검출 대상 물질과의 반응에 의해 이탈될 수 있는 퀀처를 사용함으로써, 검출 대상 물질의 종류에 따른 적절한 바이오센서로서 본 발명의 복합체 또는 조성물을 설계할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 식물에서 에틸렌을 검출하기 위한 바이오센서로서 사용된다.
본원에서 사용되는 용어는 특정 실시양태를 설명하기 위해 사용되는 것이며, 본 발명을 한정하려는 의도는 아닌 것에 유의바란다.
또한, 본원에서 사용되는 "포함하는"이라는 용어는 문맥상 명백하게 달리 이해해야 하는 경우를 제외하고 기술된 사항 (예컨대 성분, 단계, 요소 및 숫자)이 존재하고 그 밖의 사항 (예컨대 성분, 단계, 요소 및 숫자)이 존재하는 것을 배제하지 않는 것으로 의도된다.
다른 정의가 없는 한, 본원에 사용된 모든 용어 (기술 용어 및 과학 용어를 포함함)는 본 발명이 속하는 기술의 당업자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 사용된 용어는, 다른 정의가 명시되지 않는 한, 본원 및 관련 기술 분야에서 의미와 일관된 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 이상화되거나, 지나치게 형식적인 의미로 해석되어서는 안된다.
제1, 제2 등의 용어가 다양한 요소를 표현하는데 사용될 수 있지만, 이들 요소는 그 용어에 의해 한정되어서는 안되는 것으로 인정되어야 한다. 이들 용어는 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해서만 사용되며, 예를 들어 제1 요소를 제2 요소라고 칭하고, 마찬가지로 제1 요소를 제2 요소라 칭하는 것이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 가능하다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 여기에 기재된 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
[실시예 1]
alb-Ru의 제조
금속 촉매가 용매에 노출되는 것을 방지할 수 있는 (결합 포켓을 갖는) 생체 적합성 인공 금속 효소 (ArM)의 설계를 위해, 알부민의 약물 결합 부위 I (약물 부위 I) (유사-활성 부위로서의 소수성 결합 포켓)을 이용하였다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 쿠마린 유도체 (예컨대 와파린)의 결합 (상호 작용)이 알려진 약물 결합 부위 I에 금속 촉매를 고정시켰다 (Ghuman, J.; Zunszain, P. A.; Petitpas, I.; Bhattacharya, A. A.; Otagiri, M.; Curry, S. J. Mol. Biol. 2005, 353, 38-52). 금속 촉매의 고정에 상이한 PEG 링커 길이를 갖는 쿠마린-Ru 복합체 Ru1 - 3, 6을 사용하였다.
1. 쿠마린-Ru 복합체의 제조
1-1. 일반 절차 B
하기 반응식에 따라, 쿠마린 결합 루테늄 복합체 Ru1 - 3, 6을 합성할 수 있다.
[화학식 1]
Figure pct00001
루테늄 복합체 III를 공지 기술 (Lo, C.; Ringenberg, M. R.; Gnandt, D.; Wilson, Y.; Ward, T. R. ChemComm 2011, 47, 12065-12067; Kajetanowicz, A.; Chatterjee, A.; Reuter, R.; Ward, T. R. Catal. Lett. 2014, 144, 373-379; Zhao, J.; Kajetanowicz, A.; Ward, T. R. Org. Biomol. Chem. 2015, 13, 5652-5655)에 따라 제조하였다. 디클로로메탄 (3 mL) 중 루테늄 복합체 III (80.0 mg, 0.106 mmol)의 용액에 25℃에서 염산 가스를 버블링하였다. 염산 가스는 염화암모늄에 진한 황산을 적가함으로써 제조된다. 45분 동안 교반한 후, 디클로로메탄 (1 mL)을 주사기로 반응물에 첨가하고 동일한 온도에서 교반하였다. 추가 15분 후, 반응물을 감압 농축하여 아민 IV를 수득하고, 이를 정제하지 않고 다음 반응에 사용하였다.
다른 플라스크에서, 디클로로메탄 (1 mL)에 용해된 카르복실산 IIa (1.1 당량) 및 커플링제 HCTU (1.3 당량)의 용액을 25℃에서 30분 동안 교반하였다. 이 반응물에 디클로로메탄 (1 mL)에 용해된 아민 IV (1 당량), 이어서 동일한 온도에서 N,N-디이소프로필에틸아민 (10 당량)을 첨가하였다. 6시간 동안 교반한 후, 1M HCl 수용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 생성물을 디클로로메탄으로 3회 추출하고, 합한 유기 추출층을 포화 중조수 및 염수로 세척하고, 건조시키고 (황산나트륨으로), 감압 농축하였다. 농축 잔류물을 실리카겔 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 쿠마린-Ru 복합체 Ru1 - 3, 6을 수득할 수 있다.
1-2. 쿠마린-Ru 복합체 Ru1의 제조
일반 절차 B에 따라, 루테늄 복합체 III (80.1 mg, 0.106 mmol), 카르복실산 IIa (42.4 mg, 0.117 mmol), HCTU (57.6 mg, 0.139 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (137 mg, 1.06 mmol)으로부터 수득된 반응물을 실리카겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (사이클로헥산/EtOAc/CHCl3/MeOH=40/40/15/5)로 정제한 후 목적하는 쿠마린-Ru 복합체 Ru1 (37.7 mg, 35.6%)를 녹색 고체로서 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, δ) 1.24-1.27 (m, 12H), 2.37-2.51 (br m, 18H), 3.47 (q, 4H, J = 7.1 Hz), 3.53-3.71 (m, 6H), 3.79 (m, 1H), 3.93 (d, 1H, J = 15.3 Hz), 3.99 (d, 1H, J = 15.3 Hz), 4.05 (dd, 1H, J1 = J2 = 10.0 Hz), 4.33 (dd, 1H, J1 = J2 = 10.0 Hz), 4.75-4.84 (br m, 1H), 4.89 (sept, 1H, J = 6.1 Hz), 6.50 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6.66 (dd, 1H, J1 = 2.3 Hz, J2 = 9.1 Hz), 6.78 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 6.85 (dd, 1H, J1 = J2 = 7.7 Hz), 6.91 (dd, 1H, J1 = 1.7 Hz, J2 = 7.7 Hz), 7.02 (s, 중첩, 2H), 7.04 (s, 1H), 7.07 (s, 1H), 7.42 (d, 1H, J = 9.1 Hz), 7.48 (ddd, 1H, J1 = 1.7 Hz, J2 = J3 = 7.7 Hz), 8.67 (s, 1H), 9.09 (s, 1H), 16.50 (s.1H);
HRMS (ESI) m/z 964.3355 (C50H61ClN5O6Ru, [M-Cl]+에 대한 계산치 964.3359).
[화학식 2]
Figure pct00002
1-3. 쿠마린-Ru 복합체 Ru2의 제조
일반 절차 B에 따라, 루테늄 복합체 III (80.1 mg, 0.106 mmol), 카르복실산 IIb (47.4 mg, 0.117 mmol), HCTU (57.1 mg, 0.138 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (137 mg, 1.06 mmol)로부터 수득된 반응물을 실리카겔 플래시 컬럼 크로마토그래피 (사이클로헥산/EtOAc/CHCl3/MeOH=40/40/15/5)로 정제한 후 목적하는 쿠마린-Ru 복합체 Ru2 (27.9 mg, 25.2%)를 녹색 고체로서 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, δ) 1.22-1.26 (m, 12H), 2.26-2.46 (br m, 18H), 3.38-3.54 (m, 4H), 3.61-3.70 (m, 10H), 3.74-3.82 (m, 1H), 3.97 (s, 2H), 4.11 (dd, 1H, J1 = J2 = 10.3 Hz), 4.28 (dd, 1H, J1 = J2 = 10.3 Hz), 4.66-4.75 (br m, 1H), 4.88 (sept, 1H, J = 6.1 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6.65 (dd, 1H, J1 = 2.3 Hz, J2 = 9.0 Hz), 6.77 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 6.83 (dd, 1H, J1 = J2 = 7.6 Hz), 6.89 (dd, 1H, J1 = 1.9 Hz, J2 = 7.6 Hz), 6.98-7.01 (br m, 4H), 7.43 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 7.47 (ddd, 1H, J1 = 1.9 Hz, J2 = J3 = 7.6 Hz), 8.67 (s, 1H), 9.05 (s, 1H), 16.47 (s.1H);
HRMS (ESI) m/z 1008.3613 (C52H65ClN5O7Ru, [M-Cl]+에 대한 계산치 1008.3622).
[화학식 3]
Figure pct00003
1-4. 쿠마린-Ru 복합체 Ru3의 제조
일반 절차 B에 따라, 루테늄 복합체 III (28.8 mg, 38.1 μmol), 카르복실산 IIc (18.9 mg, 42.0 μmol), HCTU (21.3 mg, 51.5 μmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (49.7 μg, 385 μmol)으로부터 수득된 반응물을 실리카겔 플래시 컬럼 크로마토그래피 (사이클로헥산/EtOAc/CHCl3/MeOH=40/40/15/5)로 정제한 후 목적하는 쿠마린-Ru 복합체 Ru3 (12.0 mg, 28.9%)를 녹색 고체로서 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, δ) 1.22-1.28 (m, 12H), 2.34-2.44 (br m, 18H), 3.46 (q, 4H, J = 7.2 Hz), 3.55-3.70 (m, 14H), 3.71-3.80 (m, 1H), 3.95 (s, 2H), 4.04 (dd, 1H, J1 = J2 = 10.7 Hz), 4.27 (dd, 1H, J1 = J2 = 10.7 Hz), 4.57-4.65 (m, 1H), 4.89 (sept, 1H, J = 6.2 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6.65 (dd, 1H, J1 = 2.3 Hz, J2 = 8.8 Hz), 6.79 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 6.84 (dd, 1H, J1 = J2 = 7.6 Hz), 6.89 (dd, 1H, J1 = 1.9 Hz, J2 = 7.6 Hz), 7.01-7.05 (br m, 4H), 7.42 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.47 (ddd, 1H, J1 = 1.9 Hz, J2 = J3 = 7.6 Hz), 8.67 (s, 1H), 8.98 (s, 1H), 16.47 (s.1H);
HRMS (ESI) m/z 1088.3661 (C54H70Cl2N5O8Ru, [M+H]+에 대한 계산치 1088.3648).
[화학식 4]
Figure pct00004
1-5. 쿠마린-Ru 복합체 Ru6의 제조
일반 절차 B에 따라, 루테늄 복합체 III (80.4 mg, 0.106 mmol), 카르복실산 IId (69.9 mg, 0.117 mmol), HCTU (57.5 mg, 0.139 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (137 mg, 1.06 mmol)으로부터 수득된 반응물을 실리카겔 플래시 컬럼 크로마토그래피 (사이클로헥산/EtOAc/CHCl3/MeOH=20/20/55/5)로 정제한 후 목적하는 쿠마린-Ru 복합체 Ru6 (34.4 mg, 26.3%)을 녹색 고체로서 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, δ) 1.21-1.30 (m, 12H), 2.37-2.45 (br m, 18H), 3.45 (q, 4H, J = 7.3 Hz), 3.56-3.68 (m, 31H), 3.99 (dd, 1H, J1 = J2 = 10.5 Hz), 4.25 (dd, 1H, J1 = J2 = 10.5 Hz), 4.53-4.62 (br m, 1H), 4.91 (sept, 1H, J = 6.1 Hz), 6.49 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6.64 (dd, 1H, J1 = 2.3 Hz, J2 = 8.8 Hz), 6.80 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 6.86 (dd, 1H, J = 7.6 Hz), 6.90 (dd, 1H, J1 = 1.9 Hz, J2 = 7.6 Hz), 7.03-7.07 (br m, 4H), 7.42 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.48 (ddd, 1H, J1 = 1.9 Hz, J2 = J3 = 7.6 Hz), 8.68 (s, 1H), 9.00 (s, 1H), 16.47 (s.1H);
HRMS (ESI) m/z 1234.4603 (C61H84Cl2N5O11Ru, [M+H]+에 대한 계산치 1234.4593.
[화학식 5]
Figure pct00005
2. alb-Ru의 제조
alb-Ru의 제조는 루테늄 촉매 Ru1 - 3, 6과 인간 혈청 알부민 (HAS)을 반응시켜 alb-Ru 복합체를 형성함으로써 수행하였다.
반응 용액의 조성물은, 30 μM의 인간 혈청 알부민 (이하, HSA라 함; 167 μL의 50 nmol, 300 μM 스톡 용액 (수용액)을 사용)과, 다양한 농도의 촉매 (Ru1 - 3, 6)를 포함하였다. 촉매는 예를 들어 37 μM의 Ru1 (167 μL의 62 nmol, 370 μM 스톡 용액 (디옥산 용액)을 사용)을 사용하였다. 총 반응 부피는 10% 디옥산을 함유하는 PBS 완충액 (pH 7.4)으로 1670 μL로 하였다. HSA 첨가에 의한 반응 개시 후, 반응 혼합물을 부드럽게 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어, 반응 용액을 AmiconTM 초원심 필터 (30 kDa)를 사용하여 PBS 완충액으로 세척하고 농축시켰다. 이어서, 농축된 alb-Ru 용액을 PBS 완충액으로 희석하여 50 μM 스톡 용액으로서 1000μL를 얻었다.
Alb-Ru 복합체 형성의 확인에는, 쿠마린계 분자가 용매의 극성에 민감하다는 사실에 의존하는 형광 분석을 사용하였다. Ru1 - 3, 6을 이용하여 리간드-알부민의 1:1 반응에서 얻어진 형광 강도 (측정값)를 도 1에 나타내었다.
대조군 (리간드 단독 또는 HSA 단독)과 비교하여, alb-Ru 복합체 형성의 지표로 간주되는 형광 수준이 유의하게 높은 수준으로 검출되었다.
또한 Ru1 - 3, 6의 결합 부위를 간접적으로 확인하기 위해, HSA 용액을 2 당량의 두 결합 리간드 (와파린, 이부프로펜)와 함께 37℃에서 1시간 동안 사전 인큐베이션하였다. 그 후, 알부민과 결합 리간드의 혼합물을 사용하여 Ru1 - 3, 6의 포화 결합 곡선을 생성하였다 (도 2).
도 2의 결과로부터, Ru1 - 3, 6의 결합은 이부프로펜의 존재하에서는 영향을 받지 않지만, 와파린의 존재하에서는 유의하게 감소하는 것이 밝혀졌다. 이 결과는 HSA의 약물 결합 부위 I가 이들 화합물의 주요 결합 부위임을 강력하게 시사한다.
[실시예 2]
alb-Ru의 반응성 검증
다음으로, alb-Ru 복합체의 올레핀 1a 내지 1d 및 엔인 1e의 폐환 복분해 (RCM)를 촉매하는 능력을 조사하였다 (도 3). 또한, alb-Ru1- 3, 6은 상이한 PEG 링커 길이를 가지므로 소수성 결합 포켓의 유효 크기 및 적합성도 함께 검증하였다.
반응 용액은 기본적으로는 1:9 디옥산:PBS 완충액 (pH 7.4) 중에, 기질로서 1a 내지 e 및 alb-Ru 복합체 (즉, Ru1 - 3, 6)를 포함하였다. 반응을 37 ℃에서 2시간 인큐베이션한 후, 도데칸 티올로 퀀칭하고, 메탄올로 더 희석하고, 샘플을 여과한 후, HPLC 분석을 수행하고, 각각의 생성물 2a 내지 e로의 대사 회전 (TON)을 계산하였다. 대조군으로서, 액체 중 자유 루테늄 촉매 (free-in-solution), Ru1 - 3, 6을 사용하는 반응도 동일한 조건하에서 수행하였다.
Figure pct00006
이 실험에서의 첫 번째 관찰 중 하나는 (쿠마린 앵커와 루테늄 촉매 사이의) PEG 링커 길이의 증가와 활성 감소 사이의 상관 관계였다. 예를 들어, 기질 4,4-비스((벤조일옥시)메틸)-1,6-헵타디엔 1d (Entry 7)의 대사 회전은 alb-Ru1 (19.7)의 존재하에서 가장 높고, alb-Ru2 (2.8)의 존재하에서 급격히 감소하였으며, alb-Ru6 (0.5)의 존재하에서 매우 작은 수준을 나타내었다. 사용한 모든 링커 길이에서, 액체 중 자유 루테늄 촉매 Ru1을 사용하여 얻어진 대사 회전 (TON)이 일반적으로 28 내지 35의 범위 내 (Entry 8)에 머무르는 것을 생각하면, 이러한 관찰 결과는 소수성 결합 포켓이 긴 링커를 갖는 쿠마린 앵커-촉매 복합체를 수용할 수 없음을 시사한다.
[실시예 3]
alb-Ru의 생체 적합성 검증
alb-Ru 복합체가 폐환 복분해 및 엔인 교차 복분해를 촉매하는 활성을 나타내는 것을 확인한 후, 글루타티온의 작용을 평가함으로써 생체 적합성을 증명하는 것을 목표로 하였다. 이 연구를 위해, 화합물 1d를 모델 기질로서 선택하였다.
이 연구에서 중요한 실험 중 하나는 글루타티온에 대한 alb-Ru1의 촉매 보호 능력을 조사하는 것이었다. 하기에 나타낸 바와 같이, 1 mol%의 alb-Ru1을 사용하여 다양한 농도의 GSH 첨가하면서 기질 1d를 반응시켰다. 또한, alb-Ru1의 농도에 따라, 글루타티온이 동등 당량으로 첨가되었다.
[화학식 6]
Figure pct00007
그 결과, 20 mM GSH (alb-Ru에 대해 1000 당량의 GSH)까지 (산출된) TON의 변화는 관찰되지 않았다. 최종적으로, 100 mM 및 200 mM GSH 첨가에서, 대조군에 비해 각각 60% 및 82%의 TON 감소가 관찰되었다.
다음 연구에서는, GSH 보호 능력의 역치 상한을 알아내기 위해서, 금속 촉매 보호의 지속 시간을 평가하였다. 구체적으로, alb-Ru1을 GSH, 도데칸 티올 또는 PBS 완충액 (블랭크로서)의 어느 하나와 함께 다양한 시간 동안 사전-인큐베이션한 후, 기질 1d를 반응 용액에 첨가하고, 반응 1시간 후에 TON 값을 계산하였다. 도 4는 생리학적으로 적절한 GSH 농도 (200 μM, alb-Ru1에 대해 10 당량)로 수행된 실험을 나타낸다.
GSH와 6시간의 사전인큐베이션 후에 측정된 TON 값은 일반적으로 블랭크 (PBS 완충액)에 비해 약간의 감소만을 나타내었다. 대조적으로, 임계 상한 GSH (20 mM, alb-Ru1에 대해 1000 당량)를 사용한 실험에서는 반응성에 대해 유의한 (아주 큰) 효과를 나타내었다 (도 5).
이 경우, GSH와 1시간 사전인큐베이션 후, 활성의 약 50%의 감소가 관찰된 반면, 4시간의 사전인큐베이션에서는 활성이 거의 사라졌다.
Alb-Ru 복합체의 생체 적합성을 추가로 평가하기 위해, 기질 1d를 10 mol%의 alb-Ru1 복합체와 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2d의 생성 수율은 1:8:1 소 태아 혈청/DMEM 배지/디옥산에서 약 2%이고, 1:8:1 정상 래트 혈청/PBS 완충액/디옥산에서 약 1%였다. 그러나, 수집된 출발 물질 1d가 각각 약 8% 및 3%이었기 때문에, 낮은 생성 수율은 혈청 중에 통상적으로 존재하는 단백질에 의한 기질의 포획 또는 분해에 기인할 가능성이 높다.
ArM 활성 (인공 금속 효소 활성)에 관해서, GSH의 첨가 및 첨가없이, 기질 1a 내지 e의 미카엘리스-멘텐의 속도론적 파라미터를 산출하였다 (도 6).
그 결과, GSH 첨가의 유무에 관계없이, ArM 활성에 있어서, 1a-1e에 대해 측정된 속도론적 수치는 약간의 변화 (오차 내)만이 있었다. 하지만, 특히 중요한 것은 이들 기질 사이에서 관찰된 촉매 효율의 차이 (kcat/KM)이다. 특히, 기질 1e는 약 3×103 M-1s-1 의 kcat/KM 값을 나타내었는데, 이 값은 천연 효소의 반응성 (kcat/KM - 108 M-1s-1) 과 비교하면 뒤떨어지지만, 이 결과로부터 비천연 금속의 ArM이 천연 효소와 동등한 반응성에 도달할 가능성이 있는 것이 강조된다.
[실시예 4]
글루타티온 내성의 메카니즘
알부민의 약물 결합 부위 I의 소수성 결합 포켓에서의 침입 및 입체 형태의 정도를 예측하기 위해, AutoDockTools의 GUI 인터페이스에 Autodock 4.2 (Morris, G. M.; Huey, R.; Lindstrom, W.; Sanner, M. F.; Belew, R. K.; Goodsell, D. S.; Olson, A. J. J. Comput. Chem. 2009, 30, 2785-2791.)를 사용하여 화합물 Ru1- 3, 6을 인간 혈청 알부민 (PDB:1H9Z)에 도킹하는 분자 모델링에 대해 연구를 수행하였다. 그 결과는 알부민의 약물 결합 부위 I의 결합 포켓이 비교적 짧은 PEG 링커 길이를 갖는 쿠마린-루테늄 촉매 (예를 들어, Ru1)의 결합을 수용하기에 충분한 깊이라는 근본적인 가설을 뒷받침한다. 그러나, 도 7에 도시된 바와 같이, PEG 링커 길이가 점차적으로 길어지면 (예를 들어, Ru6), 결합 포켓 외측으로 루테늄 부분이 압출되어 용액 중의 생체분자에 대한 노출을 증가시킨다.
이 이론은 도킹하는 리간드의 루테늄 원자의 상대 용매 접근가능 표면적 (SASA)의 계산에 의해서도 긴 PEG 링커와의 상관이 증가한다는 사실에서 더욱 지지되었다. 도 7에서, 0 값은 용매에 노출되지 않은 원자를 나타낸다.
[실시예 5]
인공 금속 효소의 표적화
치료 ArM의 개발을 추진하기 위해 고려해야 할 또 다른 측면은 신체 내의 특정 장기/세포로의 국소화를 촉진하기 위한 표적화 방법론의 필요성이다.
성공하면 전구약물 요법에 적응이 가능할 것이며, 이는 세포독성 분자에 기초한 항암 요법과 같이 부작용 위험이 있는 의약품 후보의 개발에 특히 유용하다.
상이한 진핵 세포의 표면을 감싸는 글리코칼릭스의 복잡성이 변화하고 있기 때문에, 특정 복합형 N-글리칸 집합체에 결합된 글리코알부민이 상이한 암 세포간에 상이한 인식능이나 결합성을 발휘할 수 있는 것이 발견되었다. 이들 글리코알부민이 생체 내 지지체로서 작용하는 능력이 있는지를 시험하는 것을 목적으로 한 중요한 연구에서는, 프로파길에스테르를 기초로 한 단백질 라벨링에 관하여, 금 촉매를 포함하는 글리코알부민이 그의 N-글리칸 구조에 의해 살아있는 마우스의 특정 장기에 국한되어 생체 내 촉매 활성을 보였다 (Tsubokura, K.; Vong, K. K. H.; Pradipta, A. R.; Ogura, A.; Urano, S.; Tahara, T.; Nozaki, S.; Onoe, H.; Nakao, Y.; Sibgatullina, R.; Kurbangalieva, A.; Watanabe, Y.; Tanaka, K. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2017, 56, 3579-3584.).
암에 대한 적응성을 개발 검토하기 위해, 표적기로서 시알산 α(2,3)-결합 말단에서 N-글리칸의 균일한 집합체를 선택하였다. 이 선택은 시알산 알파(2,3)-결합을 갖는 글리코알부민 (2,3-Sia)이 SW620 인간 결장 선암 세포에 우선적으로 축적될 수 있고, 또한 A549 인간 폐포 기저 상피 선암 세포 및 HeLa 인간 자궁경부암 유래 세포에 대해 중등도의 결합을 보인 이전의 연구에 기초하여 이루어졌다 (Ogura, A.; Urano, S.; Tahara, T.; Nozaki, S.; Sibgatullina, R.; Vong, K.; Suzuki, T.; Dohmae, N.; Kurbangalieva, A.; Watanabe, Y.; Tanaka, K. ChemComm 2018, 54, 8693-8696.). 이 효과는 기지 알파(2,3)-결합 시알산으로 알려진 갈렉틴-8의 과발현에 의해 발생할 가능성이 높다 (Lahm, H.; Andre, S.; Hoeflich, A.; Fischer, J. R.; Sordat, B.; Kaltner, H.; Wolf, E.; Gabius, H.-J. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2001, 127, 375-386; Carlsson, S.; Oberg, C. T.; Carlsson, M. C.; Sundin, A.; Nilsson, U. J.; Smith, D.; Cummings, R. D.; Almkvist, J.; Karlsson, A.; Leffler, H. Glycobiology 2007, 17, 663-676.).
먼저, 루테늄 촉매 Ru1을 고정시킨 글루코실화 ArM (GArM)-Ru1(2,3-Sia)를 제조한 후, SW620 인간 결장 선암 세포에의 표적화능을 결합 실험으로 평가하였다. 암세포에 대한 GArM-Ru1 (2,3-Sia)의 특이적 결합을 평가하기 위해, 암세포를 96- 웰 투명 바닥 플레이트에 104 세포/웰의 밀도로 시딩하고 밤새 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고, [1] GArM-Ru1 (2,3-Sia), [2] alb-Ru, [3] GA (2,3-Sia) 또는 [4] Ru1을 모두 최종 농도 10 μM이 되도록 첨가하였다. 세포를 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션한 후, 배지를 제거하고, PBS 완충액으로 세척하고 (3회), 포름알데히드 시약을 사용하여 플레이트에 고정하였다. 세포 관찰을 키엔스사 (Keyence) 제 BZ-X710 All-in-one Fluorescence MicroscopeTM을 사용하여 행하고, 형광 이미지와 명시야 이미지를 기록하였다. 쿠마린 유래 형광의 검출에는 ET-EBFP2/쿠마린/Attenuated DAPI Filter Set Cat# 49021 (Chroma, Technology, Corp., 미국 버몬트 소재)을 사용하였다. 이미징 이미지를 20배 배율로 촬영하고 BZ-X 분석기 (키엔스사 제) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
결과를 도 8에 나타내었다. HSA에 결합된 쿠마린의 형광 발광을 이용한 세포 이미징에 의해, GArM-Ru1 (2,3-Sia)와 인큐베이션된 SW620 인간 결장 선암 세포에서는 그 대조군에 비해 보다 강한 형광 축적이 확인되었다.
추가 시험으로서, HeLa 인간 자궁경부암 유래 세포 및 A549 인간 폐포 기저 상피 선암 세포를 사용하여 유사한 실험을 또한 수행하였다. 이전 보고서와 일치하게, SW620 인간 결장 선암 세포에서의 GArM-Ru1 (2,3-Sia)의 축적이 HeLa 인간 자궁경부암 유래 세포 및 A549 인간 폐포 기저 상피 선암 세포에서보다 높은 것으로 관찰되었다 (도 9).
[실시예 6]
전구약물 요법
이어서, GArM-Ru 복합체의 표적화 항암 치료에 대한 적응성을 조사하였다. 폐환 복분해에 의해 활성화되는 약물 후보의 초기 연구로서 움벨리프레닌 (2h)을 선택하였다.
[화학식 7]
Figure pct00008
페룰라 (Ferula) 식물에서 추출된 천연 산물로 알려진 움벨리프레닌은 다양한 암 세포주에 대해 세포 독성 활성을 나타냈다 (Shakeri, A.; Iranshahy, M.; Iranshahi, M. J. Asian. Nat. Prod. Res. 2014, 16, 884-889; Rashidi, M.; Khalilnezhad, A.; Amani, D.; Jamshidi, H.; Muhammadnejad, A.; Bazi, A.; Ziai, S. A. J. Cell. Physiol. 2018, 233, 8908-8918; Jun, M.; Bacay, A. F.; Moyer, J.; Webb, A.; Carrico-Moniz, D. Bioorganic Med. Chem. Lett. 2014, 24, 4654-4658). 세포 독성의 메커니즘은 G1 단계에서 세포를 정지시키고 카스파제-8 및 9의 추가 활성화, Bcl-2 및 Mcl-1의 하향 조절에 의해 세포 사멸을 유도하는 것으로 나타났다 (Barthomeuf, C.; Lim, S.; Iranshahi, M.; Chollet, P. Phytomedicine 2008, 15, 103-111; Gholami, O.; Jeddi-Tehrani, M.; Iranshahi, M.; Zarnani, A. H.; Ziai, S. A. Iran J. Pharm. Res. 2013, 12, 371-376; Gholami, O.; Jeddi-Tehrani, M.; Iranshahi, M.; Zarnani, A. H.; Ziai, S. A. Iran J. Pharm. Res. 2014, 13, 1387-1392). 매우 높은 소수성 (주로 파르네실 부분에 의해 부여됨) 때문에, 움벨리프레닌의 전구약물 (1h)은 알부민계 ArM에 이상적인 기질이라고 이론화되었다.
[화학식 8]
Figure pct00009
이를 검증하기 위해, 단순화된 쿠마린 유도체 1g와 움벨리프레닌의 전구약물 1h 모두를 사용하여 속도론적 실험을 수행하였다 (도 10).
쿠마린 전구체는 통상, 수성 조건하에서 RCM 반응성이 떨어지는 것이 알려져 있지만, 쿠마린 유도체 1g의 극히 작은 반응성 (kcat/KM < 1)은 예상외였다. 이에 대한 설명은 전구체 1g가 알부민에 대해 매우 낮은 결합 친화도 (KD 약 129 μM)를 가진다는 결합 실험의 결과로 입증된다. 한편, 소수성 전구약물 1h의 상당히 높은 활성 (1g에 비해 적어도 1500배 높은 kcat/KM)은 소수성 결합 포켓으로의 진입을 용이하게 하는 1h의 긴 알킬 쇄 부분에 기인하는 것으로 보인다.
다음으로, GArM에 기초한 항암 접근법의 인 셀룰로 (in cellulo) 활성을 평가하기 위한 일련의 실험을 수행하였다.
설정된 특정 농도 (SW620 인간 결장 선암 세포에서 32 μM; HeLa 인간 자궁경부암 유래 세포 및 A549 인간 폐포 기저 상피 선암 세포에서 64 μM)의 전구약물 1h를 사용하여, 첨가하는 GArM-Ru1의 양을 변화시키면서 세포독성 시험을 수행하였다.
세포 생존율 측정은, 프로메가사 (Promega) 제인 CellTiter 96TM Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)을 이용하여 행하였다. 배양된 세포를 FalconTM의 96-웰 마이크로플레이트에 웰당 약 103 세포의 밀도로 시딩하고 밤새 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 다양한 농도의 화합물을 첨가하였다. 화합물을 용해시키기 위해 DMSO를 사용하였고, 세포에 첨가시, DMSO 농도는 1%로 하였다. 96시간 인큐베이션 후, 세포 배양 배지를 신선한 배지 85 μL로 대체하였다. 그 후, 15 μL의 MTS 시약을 첨가하고, 37℃에서 2.5시간 인큐베이션한 후, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로서 1% DMSO를 첨가한 세포의 흡광도를 100%로 하고, 세포 생존율을 산출하였다.
당쇄에 의한 표적화 효과를 설명하기 위해, 대조군으로서 당쇄가 없는 alb-Ru1을 사용하여 유사한 조건하에서 실험을 수행하였다. 이들 결과로부터, 3개의 암 세포주 모두에서, 전구약물 1h 및 GArM-Ru1의 혼합물은 세포 증식을 유의하게 감소시켰고 (< 5%), 그 효과는 전구약물 1h 및 GArM-Ru1의 상응하는 농도에서의 효과를 능가하였다 (도 11). 또 다른 중요한 관찰은 전구약물 1h와 alb-Ru1의 혼합물의 세포 독성 활성이 훨씬 덜 효과적이라는 것이었다. 이는 당쇄에 의한 표적화가 세포 표면 또는 세포 내로의 금속 촉매의 국소화에 필수적임을 시사한다.
[실시예 7]
에틸렌을 검출하는 인공 금속 효소 (ArM) (ArM 에틸렌 프로브; AEP)의 합성
도 12는 ArM 에틸렌 프로브 (AEP)의 합성 방식을 설명한다.
7-디에틸아미노쿠마린 (DEAC) 자체가 발광하는 형광은 주위 용매의 극성에 높은 감수성을 가지고 있으며, DEAC-Ru의 양자 수율은 극성 환경하 (10% 디옥산/물)로부터 비극성 환경하 (60% 디옥산/물)로의 변화가 약 20배까지 증가한다. 따라서, 본 합성에서는, 올레핀을 포함하는 DABCYL 비활성화제 (퀀처)와 alb-Ru의 반응에 기초하여 AEP를 합성하였다.
7-1. AEP의 제조
30 μM HSA 용액 (50 nmol, 300 μM 수용액으로부터 167 μL)과 37 μM DEAC-Ru 용액 (62 nmol, 370 μM 디옥산 용액으로부터 167 μL)을 혼합하여 alb-Ru를 제조하였다. 반응 용액은 10% 디옥산을 함유하는 pH 7.4의 PBS 완충 용액으로 총량을 1670 μL로 하였다. HSA 첨가에 의한 반응 개시 후, 반응 용액을 부드럽게 교반하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 반응 용액을 Amicon 초원심 필터 (30 kDa)를 사용하여 농축하고, PBS 완충 용액으로 3회 세척하였다. 농축된 alb-Ru 용액에 물을 첨가하여 50 μL로 희석하고 1 mM 스톡 용액을 얻었다. AEP 용액을 제조하기 위해, 100 μM alb-Ru 용액 (50 nmol, 1 μM 수용액으로부터 50 μL)과 500 μM DABCYL 퀀처 용액 (250 nmol, 555 μM의 DMSO:물 = 1:8 용액으로부터 450 μL)의 혼합 용액을 만들었다. 반응 용액을 부드럽게 교반하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 반응 혼합물을 Amicon 초원심 필터 (30 kDa)를 사용하여 농축하고, PBS 완충 용액으로 3회 세척하였다. 농축된 AEP 용액에 물을 첨가하여 500 μL로 희석하고 100 μM의 스톡 용액을 얻었다.
단백질 복합체 (alb-Ru, AEP)의 형광 강도를 JASCO FMP-963 마이크로플레이트 리더가 장착된 JASCO FP-6500 분광형광계로 측정하였다. 샘플을 제조하기 위해, alb-Ru와 AEP를 모두 10 μM 농도로 수용액에서 준비하였다. 샘플을 96-웰 마이크로플레이트에 분취하고 (100 μL), λEX = 420 nm/λEM = 463 nm에서 측정하였다. 모든 측정은 3회 수행하였다.
또한, 이 연구에서 사용된 단백질 복합체 (alb-Ru, AEP)의 주요 구조 변화를 확인하기 위해, 원편광 이색성 (CD) 분석을 수행하였다. CD 스펙트럼에 0.1 cm의 셀을 사용하고, 측정에는 J-1500 원편광 이색성 분광계 (JASCO)를 사용하였다. 10% 디옥산 수용액을 블랭크로서 사용하였고, 이것은 스캔 중에 자동으로 샘플로부터 제해졌다. 데이터를 200 내지 250 nm에 대해 100 nm/분의 스캔 속도로 기록하였다. 각 단백질 복합체의 농도는 2.3 μM으로 유지하였다.
[결과]
알부민의 결합 포켓에 존재하는 RuQ 복합체 (DEAC-Ru-DABCYL 복합체)는 퀀처로 인해 형광 강도가 현저히 낮으며, 이는 또한 도 13에서 alb-Ru와 AEP 프로브의 형광 강도 비교로서 분명하다. 또한, 이들 원편광 이색성 (CD)이 완전히 겹쳐지면서 단백질의 큰 구조 변성은 보이지 않는 것으로 확인되었다 (도 14).
7-2. AEP에 의한 에틸렌의 검출
AEP에 의한 에틸렌의 검출 메카니즘은, 에틸렌을 AEP 중의 루테늄 촉매와 반응시킴으로써 DABCYL 퀀처로 치환시켜 형광 신호를 활성화하는 것에 의한다. 따라서, 본 실시예에서는 과일 및 식물에서 에틸렌을 검출하기 위해 AEP를 사용하였다.
[키위 과일의 이미징]
미숙성 또는 숙성 키위 과일을 식료품점에서 구입하였다. 외측 과피, 씨방 및 자주를 포함하는 단편을 얻기 위해, 키위 과일을 주방칼로 약 2.0 cm × 4.5 cm의 크기로 잘라 키위 과일의 단편을 준비하였다. 에틸렌 생산을 추적하기 위해, 10 cm 접시의 중앙에 170 μL AEP (400 μM 용액)를 부었다. 이어서, 샘플을 AEP 용액 위에 작용시켰다. 샘플을 실온에서 인큐베이션하고, 특정 시간 (1, 24시간 후)에 이미징을 수행하였다. 이미징에 ET-EBFP2/쿠마린/Attenuated DAPI Filter Set Cat# 49021 (Chroma Technology Corp.)를 장착한 Keyence BZ-X710 All-in-one Fluorescence MicroscopeTM을 사용하였다. 명시야 이미지 (컬러)는 25분의 1초, 형광 이미지는 3.5분의 1초의 노출 설정으로 각각 얻었다. 복수의 이미징 이미지를 4배율로 얻고, BZ-X Analyzer 소프트웨어 (Keyence)를 사용하여 화상 결합과 분석을 수행하였다.
[애기장대 (Arabidopsis thaliana)의 이미징]
애기장대를 23℃의 토양에서 85 μmol m-2s-1의 광 강도로 성장시켰다. 10시간 명/14시간 암의 주성을 적용하였다. 에틸렌 생산을 추적하기 위해, 먼저 4-6 주 식물에서 잎을 취하였다. 이어서, 클램프를 사용하여 잎으로부터 투명한 표피 껍질을 벗기고 96-웰 투명 바닥 플레이트에 놓았다. 물 (100 μL)을 첨가한 후, 상처 스트레스의 효과를 배제하기 위해 샘플을 실온에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. 실험 조건에 따라, 1 mM ACC 용액 (55 mM 수용액 2 μL), 4.8 μM flg22 또는 elf18 용액 (5 μM, 100 μM 수용액), 및 OD600 = 0.02 슈도모나스 (Pseudomonas) 세균 용액 (2 μL의 OD600 = 1.0 표준 용액)과 같은 다양한 용액을 필요에 따라 첨가하였다. ACC 및 슈도모나스 세균을 포함하는 실험에서는, 실온에서 12시간 인큐베이션을 적용하였다. 한편, PAMP를 포함한 실험에서는 실온에서 6시간의 인큐베이션을 적용하였다. 이어서, 이들 용액을 표피 스킨 샘플로부터 완전히 제거하고, 100 μM AEP 용액 (스톡 용액으로부터 50 μL)을 첨가하였다. 30분 후, 용액을 완전히 제거하고 물로 세척한 후, ET-EBFP2/쿠마린/Attenuated DAPI Filter Set Cat# 49021 (Chroma Technology Corp.)이 장착된 Keyence BZ-X710 All-in-one Fluorescence MicroscopeTM을 사용하여 이미징을 수행하였다. 이미징 이미지를 20배율, 40배율로 얻고, 명시야 이미지 (흑백)는 400분의 1초, 형광 이미지는 30분의 1초의 노출 설정으로 각각 얻었다. 복수의 이미징 이미지를 4배율로 얻고, BZ-X Analyzer 소프트웨어 (Keyence)를 사용하여 분석을 수행하였다.
[결과]
과일에서 에틸렌의 공간적 검출
일반적으로 클라이맥테릭형 (climacteric) 과일은 숙성 과정에서 자가촉매형 에틸렌 (시스템 2)의 생산이 진행된다. 상처에 의한 스트레스나 병원체 감염과 같은 외부 자극도 마찬가지이다. 이 연구에서는, 먼저 내인성 에틸렌을 AEP 프로브로 조사하였다. 숙성 동안 키위 과일은 외부 과피에서 ACS 아이소진의 상향조절을 통해 에틸렌 생산량이 증가하는 것으로 보고되었다. AEP를 이용한 키위 과일의 이미징 실험에서는, 상이한 발달 단계 (미숙성 및 숙성)에 있어서의 다양한 소기관 (외측 과피, 씨방 및 자주)에서 발현된 에틸렌 생산량의 변화를 관찰하는 것에 초점을 맞추었다. 도 15에 정리한 바와 같이, 과실이 미숙성 상태로부터 숙성된 상태로 됨에 따라, 외측 과피에서 현저한 형광 강도의 증대가 관찰되었다. 한편, 키위 과일의 씨방과 자주에서의 형광 강도의 변화는 그다지 관찰되지 않았다. 이러한 결과로부터, 과일의 숙성 및 숙성 기간 동안 에틸렌 발현을 검출하기 위해 AEP를 사용하는 것은 유망한 수단임이 밝혀졌다.
식물에서 에틸렌 검출
식물 중의 AEP 검출의 효과를 조사하기 위해, 작은 현화 식물인 애기장대 (십자화과 (Brassicaceae family))를 모델 식물로서 선택하였다. AEP에 의한 에틸렌 생산을 검출할 수 있음을 확실히 나타내기 위해, 에틸렌 생산을 제어하는 것으로 알려져 있는 저분자와 에틸렌 생산에 관여하는 다양한 식물 변이체를 이용하여 비교 실험을 행하였다.
이 연구에서는, 야생형 모델 식물로 애기장대 Col-0 생태형을 사용하였다. 또한, acs1/2/6/4/5/9/7/11 또는 eto1-1과 같은 광범위한 다양한 식물 변이체도 사용되었다. 변이체 acs1/2/6/4/5/9/7/11은 8개의 ACS 유전자를 녹아웃한 변이체이며, 병원체가 침입했을 때에도 에틸렌량은 증가하지 않는다. 이것은 ACS가 에틸렌의 생합성 경로와 관련된 중요한 역할을 담당하기 때문이다. 또, 다른 변이체로서 에틸렌을 과잉 생산하는 eto1-1을 사용하였다. 에틸렌 과발현 단백질 1 (ETO1)의 발현을 통해 프로테아좀 의존적 분해가 억제되고 ACS 활성이 양성으로 조절된다. 이것은 타입 II ACS의 C-말단과 ETO1 사이의 상호 작용에 기초한다.
AEP를 첨가하거나 첨가하지 않고 실온에서 인큐베이션한 Col-0의 이미징 이미지를 도 16에 나타내었다. 도 17에서 정량된 바와 같이, 현저한 형광 강도의 증가가 관찰되었고, 이에 의해 애기장대 표피 스킨에서의 에틸렌 검출에 AEP가 이용될 수 있음이 확인되었다. 양성 대조군으로서, ACC에 의해 외인적으로 자극된 Col-0 (의 에틸렌 생성물)과 비교를 수행하였다. 예상대로, 야생형 Col-0에 비해 형광 강도의 더 높은 증가가 나타났다.
[실시예 8]
글루코실화 ArM에 의한 암세포에 대한 cRGD의 선택적 태깅
많은 연구에서 사이클릭 Arg-Gly-Asp (cRGD) 펜타펩타이드는 암세포 표면에서 과발현되는 αvβ3 및 αvβ5 인테그린을 억제하고 세포 외 매트릭스에 대한 접착을 방지하는데 효과적인 것으로 보고되고 있다 (J. S. Desgrosellier, D. A. Cheresh, Integrins in cancer: Biological implications and therapeutic opportunities. Nat. Rev. Cancer 10, 9-22 (2010).; M. Pfaff, K. Tangemann, B. Muller, M. Gurrath, G. Muller, H. Kessler, R. Timpl, J. Engel, Selective recognition of cyclic RGD peptides of NMR defined conformation by αIIbβ3, αvβ3, and α5β1 integrins. J. Biol. Chem. 269, 20233-20238 (1994).; 및 M. Aumailley, M. Gurrath, G. Muller, J. Calvete, R. Timpl, H. Kessler, Arg-Gly-655 Asp constrained within cyclic pentapeptides. Strong and selective inhibitors of 656 cell adhesion to vitronectin and laminin fragment P1. FEBS Lett. 291, 50-54 657 (1991).). 또한, 혈관 내피 세포에서 발현된 인테그린에 대한 RGD 기반 길항제가 혈관 신생의 억제에 의해 종양을 촉진하는 것으로 나타났다 (P. C. Brooks, A. M. P. Montgomery, M. Rosenfeld, R. A. Reisfeld, T. Hu, G. Klier, D. A. Cheresh, Integrin αvβ3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels. Cell 79, 1157-1164 (1994).; 및 D. G. Stupack, D. A. Cheresh, Integrins and angiogenesis. Curr. Top. Dev. Biol. 64, 207-238 (2004).).
본 실시예에서는, 미세전이의 시딩 과정을 모방하는, 단일 세포 수준에서 암세포의 접착을 파괴하기 위한 선택적 세포 태깅 (SeCT) 요법에 글루코실화 ArM (GArM)이 사용될 수 있는지를 조사하였다. 구체적으로, HeLa를 표적으로 하는 GArM 복합체를 암세포에 선택적으로 축적한 후, 표면 단백질에 cRGD를 선택적으로 태깅함으로써 이것이 가능한지에 대하여 검증하였다.
8-1. cRGD-PE의 제조
cRGD-PE의 제조에 사용된 반응식은 다음과 같다 :
[화학식 9]
Figure pct00010
(화합물 I의 제조)
표준 고상 펩타이드 합성 기술에 의해 합성을 수행하였다. 고체상 담체로부터 분리한 후, 혼합물을 40분에 걸쳐 20-80% 아세토니트릴 수용액 (0.1% TFA)의 선형 구배 조건으로 역상 HPLC에 의해 직접 정제하였다. 수율: 2.92 g, 89%, ESI-HRMS m/z C53H83N9O14S ([M+H]+)에 대한 계산치 1102.5853, 실측치 1102.5859.
(화합물 II의 제조)
화합물 I (90.1 mg, 0.0833 mmol) 및 EDC (17.6 mg, 0.0916 mmol)를 메틸렌 클로라이드 (0.5 mL)에 용해시켰다. 이어서, 용액을 실온에서 3.5시간 동안 교반하였다. 후처리를 위해, 메틸렌 클로라이드를 첨가하고 유기층을 물/포화 염수로 세척한 다음, 황화마그네슘으로 건조시키고 감압하에 농축시켰다. 얻어진 잔사의 질량 분석에 의해, 목적물이 생성되었음을 확인하였다. ESI-HRMS m/z C53H81N9O13S ([M+H]+)에 대한 계산치 1084.5747, 실측치 1084.5744.
이어서, 얻어진 보호된 펩타이드를 TFA/메틸렌 클로라이드 (1:1)의 용액에 2시간 동안 용해시켜 탈보호하였다. 혼합물을 감압하에 농축시키고, 40분에 걸쳐 20-80% 아세토니트릴 수용액 (0.1% TFA)의 선형 구배 조건으로 역상 HPLC에 의해 직접 정제하였다. 수율: 54.5 mg, 77% (2 단계 수율). ESI-HRMS m/z C27H41N9O8 ([M+H]+)에 대한 계산치 620.3151, 실측치 620.3169.
(화합물 III의 제조)
아디프산 (1.0 g, 6.84 mmol)의 DMF (20 mL) 용액을 교반하고, N-하이드록시숙신이미드 (3.0 g, 27.4 mmol) 및 EDC (5.14 g, 27.4 mmol)를 첨가하였다. 용액을 실온에서 24시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 감압하에 농축시키고, 조 생성물을 200 mL의 아세톤에 용해시키고, 250 mL의 1M 염산 수용액을 적가하였다. 2시간 후, 백색 침전물을 여과하고, 물과 아세톤으로 세척하여 목적 물질을 수득하였다 (1.75 g, 77%). 1H NMR (500 MHz, CDCl3, 25℃) δ2.84 (s, 4H), 2.83 (s, 4H), 2.67 (t, J = 3.5 Hz, 4H), 1.89 (t, J = 3.5 Hz, 4H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3, 25℃) 169.4, 168.4, 30.7, 25.9, 23.9. ESI-HRMS m/z C14H17N2O8 ([M+H]+)에 대한 계산치 341.0979, 실측치 341.0973.
(화합물 IV의 제조)
화합물 II (28.8 mg, 0.034 mmol) 및 화합물 III (23.2 mg, 0.068 mmol)의 DMF (680 mL) 용액을 교반하고, DIEA (16.8 μL, 0.10 mmol)를 첨가하였다. 용액을 실온에서 24시간 동안 교반한 후, 혼합물을 화합물 I의 제조에 사용된 것과 동일한 조건으로 역상 HPLC에 의해 직접 정제하여 목적 화합물을 수득하였다 (14.0 mg, 43%). 1H NMR (500 MHz, CD3OD, 25℃) δ7.00 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 6.68 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 4.74 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.41 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 4.26-4.30 (m, 2H), 3.91-3.86 (m, 1H), 3.22-3.18 (m, 1H), 3.14-3.10 (m, 1H), 3.09 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.91-2.85 (m, 2H), 2.84-2.78 (m, 5H), 2.59 (t, J = 9.5 Hz, 2H), 2.64-2.60 (m, 1H), 2.58 (dd, J = 16.5, 9.0 Hz, 1H), 2.19 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.22 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.92-1.82 (m, 1H), 1.74-1.60 (m, 6H), 1.57-1.44 (m, 3H), 1.44-1.32 (m, 2H), 1.09-0.90 (m, 2H); ESI-HRMS m/z C37H53N10O13 ([M+H]+)에 대한 계산치 845.3788, 실측치 845.3769.
(cRGD-PE의 제조)
화합물 IV (4.2 mg, 3.9 μmol) 및 화합물 V (1.1 mg, 7.8 μmol)의 DMF (200 μL) 용액을 교반하고, DIEA (3.3 μL, 19.6 μmol)를 첨가하였다. 용액을 실온에서 24시간 동안 교반한 후, 혼합물을 화합물 I의 제조에 사용된 것과 동일한 조건으로 역상 HPLC에 의해 직접 정제하여 cRGD-PE를 수득하였다 (3.2 mg, 85%). δ1H NMR (500 MHz, CD3OD, 25℃) 7.02 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 6.71 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.76 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 4.75 (s, 2H), 4.44 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 4.29-4.20 (m, 2H), 3.98 (s, 2H), 3.91 (dd, J = 9.5, 3.0 Hz, 1H), 3.25-3.20 (m, 1H), 3.18-3.11 (m, 1H), 3.11 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.96 (s, 1H), 2.88 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 2.85 (dd, J = 16.5, 8.0 Hz, 1H), 2.58 (dd, J = 16.5, 8.0 Hz, 1H), 2.29 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.22 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.92-1.84 (m, 1H), 1.74-1.60 (m, 6H), 1.59-1.42 (m, 3H), 1.41 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 1.09-0.80 (m, 2H); ESI-HRMS m/z C38H55N10O12 ([M+H]+)에 대한 계산치 843.3995, 실측치 843.4006.
8-2. GArM 복합체의 제조
이전에 보고된 방법을 사용하여 말단 α(2,3)-시알산을 갖는 당쇄-알데히드 프로브 (R. Sibgatullina, K. Fujiki, T. Murase, T. Yamamoto, T. Shimoda, A. Kurbangalieva, K. Tanaka, Highly reactive "RIKEN click" probe for glycoconjugation on lysines. Tetrahedron Lett. 58, 1929-1933 (2017).), 및 쿠마린에 결합된 금 촉매 (K. Tsubokura, K. K. Vong, A. R. Pradipta, A. Ogura, S. Urano, T. Tahara, S. Nozaki, H. Onoe, Y. Nakao, R. Sibgatullina, A. Kurbangalieva, Y. Watanabe, K. Tanaka, In vivo gold complex catalysis within live mice. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 3579-3584 (2017).)를 합성하였다.
인간 혈청 알부민 용액 (5.3 mL 수용액, 66.7 nmol)에 DMSO 중의 말단 α(2,3)-시알산을 갖는 당쇄-알데히드 프로브의 용액 (3.8 mM 스톡 용액으로부터 1 μmol, 15 당량, 260 μL)을 대기하에 첨가하였다. 용액을 부드럽게 교반하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 용액을 Amicon 초원심 필터 (30 kDa)를 사용하여 농축시키고, 물로 세척하였다. 불용성 부산물을 Durapore 멤브레인 (Durapore PVDF 0.45 μmTM)을 사용하여 제거한 후, 물을 첨가하여 희석하고 당쇄 알부민의 1.0 mM 스톡 용액을 얻었다. 결합된 당쇄 수의 확인을 MALDI-TOF-MS (positive mode)를 이용하여 수행하고, 이에 의해 알부민 1 분자당 6.2 분자의 당쇄가 결합된 당쇄 알부민의 분자량 (85.8 kDa)을 검출하였다. 프로토콜의 다음 단계에서, PBS 완충 용액 (60.6 μL, pH 7.4) 중 당쇄 알부민 용액 (66.7 nmol)의 용액에 DMSO (6.1 μL) 중의 쿠마린-금 복합체 (66.7 nmol) 용액을 첨가하였다. 용액을 부드럽게 교반하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 용액을 Amicon 초원심 필터 (30 kDa)로 농축하고, PBS 완충 용액으로 세척하여 목적하는 GArM 복합체를 수득하였다.
(세포)
HeLa 암세포는 RGD 특이적 인테그린 (α5β1, αvβ3, αvβ5)을 과발현하는 것으로 알려져 있기 때문에, 본 연구에서는 HeLa 세포를 모델로서 선택하였다. HeLa 세포는 이화학 연구소 (RIKEN)의 세포 배양 개발실에서 제공한 세포를 사용했다.
HeLa 세포를 10% 열 불활성 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가한 듈베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 배양하였다. HeLa-Luc 세포주는 10% FBS 및 0.01% 퓨로마이신을 함유한 DMEM에서 배양된 반딧불이 루시퍼라제 및 퓨로마이신 아세틸 트랜스퍼라제에 의한 HeLa 세포의 안정적인 형질감염에 의해 생성하였다. HeLa-V 세포주는 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.8% 제네티신을 포함하는 DMEM에서 배양된 반딧불이 루시퍼라제 및 Venus (V)에 의한 HeLa 세포의 안정적인 형질감염에 의해 생성하였다. 모든 세포주를 5% 이산화탄소를 포함하는 37℃ 인큐베이터에서 증식시켰다. 마우스 대식세포를 이미 기재된 바와 같이 (A. Ray, B. N. Dittel, Isolation of mouse peritoneal cavity cells. JoVE, e1488 723 (2010).), 0.9% 염수 (6 mL)가 투여된 BALB/c-nu/nu 마우스의 복강으로부터 채취하였다.
8-3. GArM의 HeLa 세포에 대한 선택성 검증
GArM이 HeLa 세포를 보다 선택적으로 표적화될 수 있는지를 확인하기 위해, 일련의 유세포 계측 연구를 수행하였다. 쿠마린 유도체의 형광 강도는 알부민에 결합하면 증가하는 것으로 알려져 있으므로, 유세포 계측법에서 λEx = 405 nm/λEm = 470 nm에서 측정한 형광 강도가 쿠마린이 결합된 GArM 복합체가 세포에 결합했는지의 지표가 될 것이다.
유세포 계측법 및 셀 분류는 Sony SH800 Cell Sorter (Sony Corporation)를 사용하여 일반적인 방법으로 수행하였다. 유세포 계측기에는 405, 488, 561 및 638 nm 레이저가 장착되어 있고, GArM 검출의 경우에는 λEx = 405 nm/λEm = 470 nm, Venus (V) 검출의 경우에는 λEx = 515 nm/λEm = 528 nm의 여기/방출 파장 게이트를 각각 사용하고, 결과를 Sony SH800 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
우선, 세포 배양 시스템에서, GArM 처리된 HeLa 세포와 비처리 HeLa 세포 사이에서는 유세포 계측기에서 명백한 피크 차이가 나타났다 (도 18). GArM 처리된 HeLa 세포와 비처리 HeLa 세포를 혼합함으로써, 이러한 특징은 보다 강조되었고, 명확하게 2개로 정의되는 피크가 관찰되었다.
이어서, 대조 실험으로서, 마우스의 복강으로부터 추출한 대식세포를 이용하여 GArM의 결합 능력을 조사하였다. 유세포 계측법의 히스토그램 (도 19)을 비교하면, GArM을 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우 대식세포 사이에는 약간의 차이밖에 관찰되지 않았고, 이것은 예상대로, 결합이 전혀 없거나 거의 없음을 제안한다.
선택성을 검증하는 최종 시험에서는, GArM의 첨가 또는 첨가없이 인큐베이션된 대식세포와 HeLa 세포의 조합을 관찰하였다 (도 20). 이 실험에서는, HeLa 세포와 대식세포를 구별하여 관찰하기 위해, Venus (V) 황색 형광 단백질을 발현하는 HeLa-V 세포주를 사용하였다. 유세포 계측법의 프로파일로부터, Venus 발현 HeLa 세포와 대식세포는 명확하게 구별할 수 있었다. GArM을 첨가하면 HeLa-V 세포의 대부분이 GArM 결합을 나타내는 오른쪽 상단 부분으로 이동한다는 것이 밝혀졌다. 한편, 대식세포에서는 이러한 변화가 보이지 않았다. 결과적으로, 이 데이터는 GArM이 세포 수준에서 HeLa 암 세포에 우선적으로 결합할 수 있음을 강력하게 나타낸다.
8-4. 세포 접착 분석
인테그린 기반 세포 접착을 방해하는 SeCT 표지 시약 (GArM/cRGD-PE)의 능력을 시험관 내 세포 접착 분석에 의해 확인하였다. 세포 접착 분석을 R&D System (미국 미네아폴리스)에서 구입한 인간 피브로넥틴 코팅 96-웰 마이크로플레이트로 수행하였다.
접착된 세포를 시판중인 MTS 분석인 CellTiter 96 Aqueous One Solution 세포 증식 분석 (Promega)을 사용하여 정량하였다. 본 실험에 사용한 HeLa 세포는, 증식 배지를 DMEM (무혈청)으로 교환함으로써, 실험 16시간 전에 혈청을 제거하였다. 이어서, 세포를 6×105 세포/mL의 스톡 용액의 농도로 계대 배양하고, 추가 원심 분리에 의해 남아있는 트립신을 제거하였다. 그런 다음, HeLa 세포 (세포 스톡 용액으로부터 360 μL), cRGD-PE (0, 160, 320, 640, 1280, 2560, 5120, 10240 μM 스톡 수용액으로부터 45 μL), 및 GarM (400 μM PBS 완충 용액으로부터 45 μL)을 사용하여 에펜도르프 튜브에서 혼합 용액을 제조하였다. 병행하여, GArM을 45 μL의 PBS 완충 용액으로만 대체하여 대조 용액도 제조하였다. 록킹 진탕기 (rocking shaker)를 사용하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션을 수행하였다. 이어서, 세포를 스핀 다운 (0.8 ppm에서 4분간)하고 상등액을 제거한 후, 450 μL의 DMEM에만 (무혈청) 재현탁시키는 세척 단계를 2회 수행하였다. 피브로넥틴 코팅된 96-웰 마이크로플레이트에 130 μL의 표지된 HeLa 세포 혼합물을 각 웰에 첨가한 후, 플레이트를 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 배지를 제거한 후, 접착된 세포를 PBS 완충액으로 3 내지 4회 세척하였다. 비특이적으로 결합된 세포를 제거하기 위해, PBS 완충 용액을 간헐적으로 상하로 피펫팅하였다. 마지막 단계에서, 100 μL의 DMEM (10% FBS + 1% 페니실린-스트렙토마이신)과 20 μL의 MTS 시약을 첨가하였다. 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 후, SpectraMax iD3 멀티-모드 마이크로플레이트 리더 (Molecular Devises, 미국)를 사용하여 490 nm에서 종점 흡광도를 얻었다.
결과를 도 21에 나타내었다. 예상대로, 피브로넥틴으로 코팅된 플레이트에서 세포 접착의 현저한 차이가 SeCT 표지 시약 (GArM/cRGD-PE)으로 처리된 HeLa 세포에서 관찰되었다. 이러한 차이는 특히 cRGD-PE의 처리 농도가 높은 경우 더 분명하며, 이는 세포 표면에 촉매적으로 결합된 cRGD가 더 높은 농도임을 나타낸다.

Claims (27)

  1. 단백질과, 금속 촉매 또는 유기 촉매로부터 선택되는 촉매의 복합체(complex)로서,
    상기 단백질은, 그의 삼차원 구조 내에 소수성 포켓(hydrophobic pocket)을 갖는 단백질이며,
    상기 복합체는 상기 촉매가 친수성 환경에 노출되지 않거나 실질적으로 노출되지 않도록 상기 촉매를 상기 소수성 포켓 내에 수용하는,
    복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 천연 또는 인공 단백질인, 복합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단백질은 인간 혈청 알부민 (HSA), 면역글로불린 G (IgG), 면역글로불린 A (IgA), 트랜스페린, 항트립신(antitrypsin), 합토글로빈(haptoglobin), α1-산성 당단백질, 미오페린 (Myoferlin), Trk 수용체, 에스트로겐 수용체, 및 엽산 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 복합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속 촉매는 붕소 촉매, 마그네슘 촉매, 알루미늄 촉매, 규소 촉매, 칼슘 촉매, 스칸듐 촉매, 티탄 촉매, 바나듐 촉매, 크롬 촉매, 망간 촉매, 철 촉매, 코발트 촉매, 니켈 촉매, 구리 촉매, 아연 촉매, 이트륨 촉매, 지르코늄 촉매, 니오븀 촉매, 몰리브덴 촉매, 루테늄 촉매, 로듐 촉매, 팔라듐 촉매, 은 촉매, 인듐 촉매, 주석 촉매, 바륨 촉매, 하프늄 촉매, 텅스텐 촉매, 레늄 촉매, 오스뮴 촉매, 이리듐 촉매, 백금 촉매, 금 촉매 및 란타노이드 루이스산(lanthanoid Lewis acid) 촉매로 이루어진 군으로부터 선택되는, 복합체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 란타노이드 루이스산 촉매는, 이테르븀 촉매, 란탄 촉매, 세륨 촉매, 사마륨 촉매, 유로퓸 촉매, 가돌리늄 촉매, 테르븀 촉매, 툴륨 촉매, 및 루테튬 촉매로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 복합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질은 인간 혈청 알부민이고,
    상기 촉매는 금속 촉매인,
    복합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 금속 촉매는 루테늄 촉매인, 복합체.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 인간 혈청 알부민의 소수성 포켓은 알부민 약물 결합 부위 I (약물 부위 I)인, 복합체.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속 촉매는 인간 혈청 알부민에 대한 리간드를 통해 상기 소수성 포켓에 결합되는, 복합체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 리간드는 와파린, 아자프로파존, 아세노쿠마롤, 페닐부타존, 살리실레이트 염, 인도메타신, 페니토인, 톨부타미드, 클로르프로파미드, 이오페녹세이트, 요오디파미드, 설파디메톡신, 펜프로쿠몬, 글리벤클라미드, 설파티아졸, 테녹시캄, 캄프토테신, 발지덴데아지, 안델레라탄, 디아델레알, 디아델레알탄, 프로단, 빌리루빈, 에이코사노이드 및 카르복시-메틸-프로필-푸란프로파노에이트 (요독증 독소) 및 쿠마린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 복합체.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 금속 촉매는 상기 리간드에 결합된 링커(linker)를 통해 상기 소수성 포켓에 결합되는, 복합체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 링커는 양 말단에 아미노기 및 카르복실기를 갖는 알킬 쇄 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 쇄인, 복합체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 링커는 C1-C3 알킬인, 복합체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질의 표면은 생체 내 표적 부위와 상호 작용하도록 변형되는, 복합체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 변형은 당쇄(sugar chain)에 의한 변형인, 복합체.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 생체 내 표적 부위와 상호 작용하는 부분을 추가로 포함하는, 복합체.
  17. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 단백질은 인간 혈청 알부민인, 복합체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 복합체를 포함하는 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물인 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 복합체에 의해 활성화될 수 있는 전구약물(prodrug)과 조합하여 사용되는 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 복합체에 의해 활성화될 수 있는 전구약물을 추가로 포함하는 조성물.
  22. 제19항에 있어서, 특정 세포를 선택적으로 태깅(tagging)하는 데 사용되는 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 세포에 태깅되는 화학 물질과 조합하여 투여되는 조성물.
  24. 제18항에 있어서, 바이오센서(biosensor)로 사용되는 조성물.
  25. 제18항에 있어서, 에틸렌을 검출하기 위한 바이오센서로 사용되는 조성물.
  26. 전구약물을 포함하는 약학 조성물로서,
    상기 전구약물은, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 복합체에 의해 활성화될 수 있으며,
    상기 약학 조성물은 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 복합체와 조합하여 사용되는,
    약학 조성물.
  27. 조합 의약(combination medicine)으로서,
    제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 복합체를 포함하는 제1 약제(agent); 및
    상기 복합체에 의해 활성화될 수 있는 전구약물을 포함하는 제2 약제;를 포함하는,
    조합 의약.
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