CN116174044B - 一种蛋白质构架的人工金属酶的新制备方法和用途 - Google Patents
一种蛋白质构架的人工金属酶的新制备方法和用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116174044B CN116174044B CN202310145419.5A CN202310145419A CN116174044B CN 116174044 B CN116174044 B CN 116174044B CN 202310145419 A CN202310145419 A CN 202310145419A CN 116174044 B CN116174044 B CN 116174044B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- solution
- artificial
- metalloenzyme
- denaturant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 47
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 21
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims abstract description 19
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 19
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 39
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 claims description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 11
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 11
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 9
- JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N L-lactic acid Chemical compound C[C@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 6
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 5
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 5
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 5
- VYWQTJWGWLKBQA-UHFFFAOYSA-N [amino(hydroxy)methylidene]azanium;chloride Chemical compound Cl.NC(N)=O VYWQTJWGWLKBQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 4
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 4
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 3
- 150000004696 coordination complex Chemical group 0.000 claims description 3
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 claims description 2
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 claims description 2
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 claims description 2
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 claims description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 claims 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims 1
- VIHDTGHDWPVSMM-UHFFFAOYSA-N ruthenium;triphenylphosphane Chemical compound [Ru].C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 VIHDTGHDWPVSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 4
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 10
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 10
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 8
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- LHGVFZTZFXWLCP-UHFFFAOYSA-N guaiacol Chemical compound COC1=CC=CC=C1O LHGVFZTZFXWLCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 108010062636 apomyoglobin Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- WIWBLJMBLGWSIN-UHFFFAOYSA-L dichlorotris(triphenylphosphine)ruthenium(ii) Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ru+2].C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 WIWBLJMBLGWSIN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229960001867 guaiacol Drugs 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J31/00—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds
- B01J31/16—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing coordination complexes
- B01J31/18—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing coordination complexes containing nitrogen, phosphorus, arsenic or antimony as complexing atoms, e.g. in pyridine ligands, or in resonance therewith, e.g. in isocyanide ligands C=N-R or as complexed central atoms
- B01J31/1805—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing coordination complexes containing nitrogen, phosphorus, arsenic or antimony as complexing atoms, e.g. in pyridine ligands, or in resonance therewith, e.g. in isocyanide ligands C=N-R or as complexed central atoms the ligands containing nitrogen
- B01J31/181—Cyclic ligands, including e.g. non-condensed polycyclic ligands, comprising at least one complexing nitrogen atom as ring member, e.g. pyridine
- B01J31/1825—Ligands comprising condensed ring systems, e.g. acridine, carbazole
- B01J31/183—Ligands comprising condensed ring systems, e.g. acridine, carbazole with more than one complexing nitrogen atom, e.g. phenanthroline
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J31/00—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds
- B01J31/16—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing coordination complexes
- B01J31/24—Phosphines, i.e. phosphorus bonded to only carbon atoms, or to both carbon and hydrogen atoms, including e.g. sp2-hybridised phosphorus compounds such as phosphabenzene, phosphole or anionic phospholide ligands
- B01J31/2404—Cyclic ligands, including e.g. non-condensed polycyclic ligands, the phosphine-P atom being a ring member or a substituent on the ring
- B01J31/2409—Cyclic ligands, including e.g. non-condensed polycyclic ligands, the phosphine-P atom being a ring member or a substituent on the ring with more than one complexing phosphine-P atom
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2531/00—Additional information regarding catalytic systems classified in B01J31/00
- B01J2531/80—Complexes comprising metals of Group VIII as the central metal
- B01J2531/82—Metals of the platinum group
- B01J2531/821—Ruthenium
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2531/00—Additional information regarding catalytic systems classified in B01J31/00
- B01J2531/80—Complexes comprising metals of Group VIII as the central metal
- B01J2531/84—Metals of the iron group
- B01J2531/842—Iron
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供一种蛋白质构架的人工金属酶的新制备方法和用途，涉及化工领域和西药制备领域。本发明公开的制备方法由变性‑加合‑复性三步构成。第一步变性，把蛋白质的折叠构象变成张开构象；第二步加合，加入金属活性中心使之与张开构象的蛋白质分子形成加合物；第三步复性，蛋白质在自主折叠过程中把金属活性中心封装进蛋白质内部。本发明公开的制备方法，金属活性中心封装率高，原料价廉易得，工艺简便，鉴于人工金属酶制备三步法具有诸多的优秀品质，便于开发更多人工金属酶新产品，并应用到工业生产中，使其得到充分的利用，对增加化工和西药制备行业的生产能力，提高化工和西药制备行业的竞争力具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及化工领域和西药制备领域，具体为一种蛋白质构架的人工金属酶的新制备方法和用途。
背景技术
天然酶具有催化效率高、作用专一性强和反应条件温和等显著特点，但是，天然酶存在纯化困难和价格昂贵等方面的不足，而且因为天然酶的专一性强，不能催化大多数化学反应，这就限制其大规模生产和应用。人工酶可以克服天然酶所存在的问题。人工酶有小分子和大分子两种构架方式。基于小分子构架的人工酶，结构较为简单，缺少底物识别信息，因此表现出较低的催化活性。对比而言，蛋白质大分子作为人工酶的构架，不仅能提供容纳催化中心所需要的三维空间，而且为催化提供了良好的微环境，于是，蛋白质分子构架的人工酶能充分展现其催化能力。因此，利用天然蛋白质作为人工酶的研究工具，对于人工酶的研究与开发都具有十分重要的价值。
基于蛋白质分子构架的人工金属酶，金属活性中心的封装方法有共价键法和非共价键法。共价键法具有接近100％的高封装率，需要利用蛋白质分子的巯基等活性基团与金属配合物反应形成共价键，这种方法对金属配合物的基团种类及其反应性有特殊要求，而且金属配合物在蛋白质锚定位点，也局限在蛋白质分子的巯基等活性基团对应的区域。相反，非共价键法利用疏水作用、配位键、氢键和分子间力等形成金属配合物-蛋白质加合物，其特点是：金属活性中心尺寸越大或其亲和力越弱，封装成功率就越低。Ohash i等报道，利用非共价键法把Cr(sa l en)封装进脱辅基肌红蛋白内部的封装率低于15％，而Mn(sa len)则很难封装成功。
可见，共价键法和非共价键法都不能满足大规模生产要求，仍需要一种新的人工金属酶制备方法，经济、高效地把金属活性中心封装进蛋白质内部。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种蛋白质构架的人工金属酶的新制备方法和用途，高效地把金属活性中心封装进蛋白质内部。
为实现以上目的，本发明提供一种制备人工金属酶新方法，蛋白质变性-加合-复性三步法：
第一步通过变性手段把蛋白质的折叠构象变成张开构象；
第二步加入金属活性中心使之与张开构象的蛋白质分子形成加合物；
第三步解除变性，蛋白质在自主折叠过程中把金属活性中心封装进蛋白质内部。
优选的，所述人工金属酶的制备方法，包括以下步骤：
S1、变性，把1.8μmo l蛋白质溶于3mL变性剂中，室温放置2-6h，得到变性蛋白质溶液；
其中，耐酸金属活性中心所用的变性剂为5-8mo l/L尿素盐酸(0.1mo l/L)水溶液(有机变性剂A)；耐碱金属活性中心所用的变性剂为0.2-0.5mo l/L NaOH水溶液(无机变性剂B)。
S2、加合，把1.2-1.8μmo l金属活性中心加入步骤A所得的变性蛋白质溶液中，室温放置6-12h，得到变性蛋白质加合物溶液；
S3、复性,将步骤S2中所得的变性蛋白质加合物溶液进行复性，得到蛋白质构架人工金属酶溶液。
其中，变性剂A体系复性：步骤S2所得的变性蛋白质加合物溶液，按加合物溶液与水1.0-1.2体积比加水稀释，室温放置2-6h，然后在pH6.5-7.5磷酸缓冲溶液中透析2-4次除去尿素，得到蛋白质构架人工金属酶溶液；
变性剂B体系复性具体为：步骤S2所得的变性蛋白质加合物溶液，按变性蛋白质加合物溶液与乳酸水溶液1.0-2.5体积比加入0.2mo l/L乳酸水溶液中和至中性，室温放置2-6h，得到蛋白质构架人工金属酶溶液。
优选的，所述蛋白质为白蛋白，包括牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)。
优选的，所述金属活性中心为金属配合物，包括血红素(HEM，耐碱也耐酸)，二氯三(三苯基膦)钌(RuL5，耐酸)，叶绿素(Ch l a，耐碱)。
优选的，所述乳酸为外消旋体乳酸。
经实验检测，金属活性中心封装率高，原料价廉易得，方法工艺简便，对生产设备及环境条件要求不高，非常适合大规模工业化生产，可应用于化工领域和西药制备领域。
本发明提供了一种蛋白质构架的人工金属酶的新制备方法和用途。具备以下有益效果：
鉴于人工金属酶制备三步法具有诸多的优秀品质，便于开发更多人工金属酶新产品，并应用到工业生产中，使其得到充分的利用，对增加化工和西药制备行业的生产能力，提高化工和西药制备行业的竞争力具有重要意义。
附图说明
图1是本发明实施例1中HEM-BSA的紫外-可见吸收谱；
图2是本发明实施例2中HEM-HSA的紫外-可见吸收谱；
图3是本发明实施例3中HEM-BSA的紫外-可见吸收谱；
图4是本发明实施例4中RuL5-BSA的紫外-可见吸收谱；
图5是本发明实施例5中HEM-BSA的活性-pH关系图；
图6是本发明制备蛋白质构架的人工金属酶的原理示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：碱变性法制备人工过氧化物酶HEM-BSA
A.变性
把120mg BSA溶于3mL 0.2mo l/L NaOH水溶液中，室温放置6h。
B.加合
把150μL(1.8μmo l)HEM的2mo l/L氨水溶液，加入到步骤A所得的变性蛋白质溶液中，室温放置12h。
C.复性
步骤B所得的变性蛋白质加合物溶液(HEM-DBSA)，加入3mL 0.2mo l/L乳酸水溶液中和至中性，室温放置6h，得到人工过氧化物酶HEM-BSA溶液。
HEM-BSA溶液的紫外-可见吸收谱如图1所示，表明HEM已封装进BSA内部。
实施例2：碱变性法制备人工过氧化物酶HEM-HSA
A.变性
把120mg HSA溶于3mL 0.2mo l/L NaOH水溶液中，室温放置6h。
B.加合
把150μL(1.8μmo l)HEM的2mo l/L氨水溶液，加入到步骤A所得的变性蛋白质溶液中，室温放置12h。
C.复性
步骤B所得的变性蛋白质加合物溶液(HEM-DHSA)，加入3mL 0.2mo l/L乳酸水溶液中和至中性，室温放置6h，得到人工过氧化物酶HEM-HSA溶液。
HEM-HSA溶液的紫外-可见吸收谱如图2所示，表明HEM已封装进HSA内部。
实施例3:酸变性法制备人工过氧化物酶HEM-BSA
A.变性
把120mg BSA溶于3mL 8mo l/L尿素盐酸(0.1mo l/L)水溶液中，室温放置6h。
B.加合
把150μL(1.8μmo l)HEM的2mo l/L氨水溶液，加入到步骤A所得的变性蛋白质溶液中，室温放置12h。
C.复性
步骤B所得的变性蛋白质加合物溶液，加入3mL水稀释，室温放置6h，然后在pH7.0磷酸缓冲溶液中透析3次除去尿素，得到人工过氧化物酶HEM-BSA溶液。
HEM-BSA溶液的紫外-可见吸收谱如图3所示，其中HEM+BSA为HEM的2mo l/L氨水溶液与BSA的pH7.0磷酸缓冲溶液简单混合，表明HEM-BSA溶液中HEM已封装进BSA内部。
实施例4:酸变性法制备人工金属酶RuL5-BSA
A.变性
把120mg BSA溶于3mL 8mo l/L尿素盐酸(0.1mo l/L)水溶液中，室温放置6h。
B.加合
把150μL(1.8μmo l)RuL5的DMSO溶液，加入到步骤A所得的变性蛋白质溶液中，室温放置12h。
C.复性
步骤B所得的变性蛋白质加合物溶液，加入3mL水稀释，室温放置6h，然后在pH7.0磷酸缓冲溶液中透析3次除去尿素，得到人工过氧化物酶RuL5-BSA溶液。
RuL5-BSA溶液的紫外-可见吸收谱如图4所示，表明RuL5已封装进BSA内部。
实施例5：人工过氧化物酶HEM-BSA活性-pH关系测定
在室温(20℃)下，将50μL实施例1所得的HEM-BSA溶液(0.045μmo l)加到500μL1mo l/L愈创木酚的磷酸缓冲溶液中,再加进15μL过氧化氢(0.15mo l/L)溶液启动反应，于470nm处记录1min内吸光度的变化，测定初速率(r0)，确定最大初速率(rmax)，以r0/rmax对pH作图得到人工过氧化物酶HEM-BSA的活性-pH关系图(见图5)。
活性实验表明，实施例1所得的HEM-BSA具有过氧化物酶的功能，且与天然酶类似，也具有最适pH。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种蛋白质构架的人工金属酶，其特征在于：所述蛋白质的变性是可逆的，由以下步骤制备：
S1、变性，将蛋白质溶于变性剂A或变性剂B中，室温放置2-6小时，得到变性蛋白质溶液；所述变性剂A为尿素盐酸水溶液，其中尿素浓度为5-8mol/L，盐酸浓度为0.1mol/L；所述变性剂B为0.2-0.5mol/L NaOH水溶液；
S2、加合，将1.2-1.8μmol金属活性中心加入至步骤S1所得的变性蛋白质溶液中，室温放置6-12小时，形成变性蛋白质加合物溶液；
S3、复性，将步骤S2中所得的变性蛋白质加合物溶液进行复性，具体包括：
对于采用变性剂A变性的耐酸金属活性中心：将加合物溶液与水按1.0-1.2：1体积比加水稀释，室温放置2-6小时，然后在pH 6.5-7.5的磷酸缓冲溶液中透析2-4次除去尿素；
对于采用变性剂B变性的耐碱金属活性中心：将加合物溶液与乳酸水溶液按1.0-2.5：1体积比加入0.2mol/L乳酸水溶液中和至中性，室温放置2-6小时；
得到蛋白质构架人工金属酶溶液；
所述金属活性中心为金属配合物，包括血红素，二氯三(三苯基膦)钌或叶绿素。
2.根据权利要求1所述的蛋白质构架的人工金属酶，其特征在于：所述蛋白质为白蛋白。
3.根据权利要求2所述的蛋白质构架的人工金属酶，其特征在于：所述白蛋白包括牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
4.根据权利要求1所述的蛋白质构架的人工金属酶，其特征在于：所述乳酸为外消旋体乳酸。
5.根据权利要求1-4任一项所述蛋白质构架的人工金属酶的用途，其特征在于，将其用作为催化剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310145419.5A CN116174044B (zh) | 2023-02-21 | 2023-02-21 | 一种蛋白质构架的人工金属酶的新制备方法和用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310145419.5A CN116174044B (zh) | 2023-02-21 | 2023-02-21 | 一种蛋白质构架的人工金属酶的新制备方法和用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116174044A CN116174044A (zh) | 2023-05-30 |
| CN116174044B true CN116174044B (zh) | 2024-07-02 |
Family
ID=86437963
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310145419.5A Active CN116174044B (zh) | 2023-02-21 | 2023-02-21 | 一种蛋白质构架的人工金属酶的新制备方法和用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116174044B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105085607A (zh) * | 2015-09-30 | 2015-11-25 | 河南科技大学 | 一种利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白的方法 |
| CN113244965A (zh) * | 2020-02-12 | 2021-08-13 | 福建医科大学 | 一种由牛血清白蛋白介导合成的二氧化钌纳米粒子及其过氧化物模拟酶活性 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU7715898A (en) * | 1997-05-27 | 1998-12-30 | Duke University | Synthetic metalloproteins and method of preparation thereof |
| CN1219793C (zh) * | 2002-12-16 | 2005-09-21 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种复性蛋白质的方法 |
| KR101436614B1 (ko) * | 2012-12-27 | 2014-09-11 | 한남대학교 산학협력단 | 금속 기반 이온성 액체를 이용한 금속 단백질 재접힘 방법 |
| CN104725464A (zh) * | 2013-12-20 | 2015-06-24 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种蛋白质产品重复利用的方法 |
| CN105675598B (zh) * | 2016-01-20 | 2018-11-02 | 曲阜师范大学 | 一种基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法及应用 |
| CN111315874A (zh) * | 2017-09-14 | 2020-06-19 | 北京泰德制药股份有限公司 | 一种重组人铜锌超氧化物歧化酶活性恢复的方法 |
| TW202110482A (zh) * | 2019-05-24 | 2021-03-16 | 日商糖鎖工學研究所股份有限公司 | 新穎的人工蛋白質觸媒 |
| CN110357970A (zh) * | 2019-07-10 | 2019-10-22 | 杭州纽龙日尚生物制品有限公司 | 一种易于纯化的人表皮生长因子融合蛋白及其核酸分子、一种人表皮生长因子制备方法 |
| CN111229327B (zh) * | 2020-03-10 | 2022-11-29 | 南华大学 | 一种人工金属酶及其制备方法与应用 |
-
2023
- 2023-02-21 CN CN202310145419.5A patent/CN116174044B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105085607A (zh) * | 2015-09-30 | 2015-11-25 | 河南科技大学 | 一种利用蛋白变性分离特定金属结合蛋白的方法 |
| CN113244965A (zh) * | 2020-02-12 | 2021-08-13 | 福建医科大学 | 一种由牛血清白蛋白介导合成的二氧化钌纳米粒子及其过氧化物模拟酶活性 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Hemin-Caged Ferritin Acting as a Peroxidase-like Nanozyme for the Selective Detection of Tumor Cells;Manman Liu等;Inorg. Chem.;20210910;第60卷;14515-14519 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116174044A (zh) | 2023-05-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bezbradica et al. | Novel support for enzyme immobilization prepared by chemical activation with cysteine and glutaraldehyde | |
| CN102108353A (zh) | 磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶及其制备方法和应用 | |
| CN110540984B (zh) | 一种HRP/Co3O4@ZIF-8复合催化剂及其制备方法 | |
| CN101775386A (zh) | 一种壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法 | |
| CN110669756B (zh) | 一种蛋白质与掺杂多糖的金属有机骨架复合物及其制备方法 | |
| CN112553189A (zh) | 一种基于磁性层状双金属氢氧化物和酶-dna复合物构建多模式催化系统的方法 | |
| CN109576256B (zh) | 一种磁性dna水凝胶封装双酶的方法 | |
| CN116174044B (zh) | 一种蛋白质构架的人工金属酶的新制备方法和用途 | |
| CN108740997A (zh) | 一种蛋白酶壳聚糖微球的制备方法 | |
| Willner et al. | Photoinduced enzyme-catalyzed reduction of nitrate (NO3-) and nitrite (NO2-) to ammonia (NH3) | |
| CN107312767B (zh) | 一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法 | |
| CN110801866B (zh) | 一种制备单原子铜人工模拟过氧化物酶的方法 | |
| CN103436501B (zh) | 一种基于氨基酸末端羧基的漆酶改性方法及应用 | |
| CN111921563B (zh) | 一种钴基模拟酶及其制备方法和应用 | |
| CN107488652B (zh) | 一种利用双水相体系萃取木瓜蛋白酶的方法 | |
| CN105923947B (zh) | 污泥处理剂及采用此污泥处理剂进行污泥处理的方法 | |
| CN110592065B (zh) | 一种辣根过氧化物酶@金属有机骨架球形颗粒催化剂及其制备方法 | |
| CN109852603B (zh) | 一种含木瓜蛋白酶的铁-铜复合磁性纳米花及其制备方法和应用 | |
| CN116376892A (zh) | 一种基于亲水中空层状双金属氢氧化物原位封装酶的方法 | |
| CN116286776A (zh) | L-天冬氨酸改性的双金属介孔mof固定化酶材料及其应用 | |
| US4551431A (en) | The use of gallium and indium salts for the immobilization of proteins | |
| CN105039299A (zh) | 一种固定化辣根过氧化物酶载体及其制备、应用方法 | |
| CN106011206A (zh) | 用复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶制备活性肽的方法 | |
| CN101250514A (zh) | 一种化学试剂修饰木瓜蛋白酶的方法 | |
| CN101307307A (zh) | 一种乙醇酸氧化酶制剂、制备方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |