CN116376892A - 一种基于亲水中空层状双金属氢氧化物原位封装酶的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于亲水中空层状双金属氢氧化物原位封装双酶的方法，属于固定化酶制备领域。本发明首先制备出单链DNA(ssDNA)功能化的葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根过氧化物酶(HRP)；其次将GOX‑ssDNA复合物、HRP‑ssDNA复合物与硝酸锌和2‑甲基咪唑溶液共同孵育，制备预封装双酶的自牺牲模板；将该模板添加进硝酸钴溶液共同搅拌，通过同步进行的模板刻蚀和离子在模板表面共沉淀，形成层状双金属氢氧化物中空壳层将双酶无损封装在内部，实现多酶原位封装系统的构建。本发明克服了酶易脱落、酶结构不可逆破坏以及酶活性位点可及性差的局限性，打破了酶的尺寸限制，改善了酶的稳定性和催化活性之间的不相容性，过程简单，级联效率高。
Description
技术领域
本发明属于固定化多酶系统制备技术领域，具体涉及酶通过生物矿化作用预封装在ZIF-L中形成牺牲模板和硝酸钴溶液刻蚀模板并于表面原位生成亲水中空层状双金属氢氧化物(ZnCo-LDH)将酶封装在壳层内部。
背景技术
目前，涉及化学合成和生物技术的工业领域正面临向生态友好、成本效益高的路线转型，以实现地球的可持续发展。酶具有独特的选择性、高催化效率、温和的作用条件和生物降解性，是绿色生物制造的"钥匙"，可以实现社会和生态效益最大化。但是酶自身的脆弱性(易受恶劣的实际条件影响)和不可回收利用性大大限制了其实际应用。酶固定化是克服这些固有缺陷的有效解决方案。通过使用各种材料(例如聚合物，二氧化硅，金属氧化物)作为载体基质，利用吸附、共价结合和交联等策略构建高效的酶固定化系统已经在生物技术产业化领域获得显著优势。然而，并非所有的固定化策略和载体都能使酶的实际应用获得效益最大化。该领域仍然存在重大挑战，如酶泄漏、酶结构的不可逆破坏以及酶活性位点的可及性差等。受自然生物矿化启发，原位酶封装策略能够在温和的条件下同时实现酶的固定化和载体的合成，有效地克服了上述传统后固定化策略的缺点。此外，原位封装兼顾了酶的特性，打破了酶的尺寸限制，并解决了酶对恶劣应用环境的敏感性。
但为了匹配酶自身脆弱的特性，原位封装策略要求载体具有温和的合成条件，这极大地限制了可用的载体种类。早期原位酶固定化载体主要集中在无定形或无孔的凝胶或有机无机纳米复合材料，底物的传质受限，表现出低酶催化效率。随着多孔网络化学的发展，金属有机骨架(MOFs)和共价有机骨架(COFs)这类具有明确有序结构的新一代多孔材料的出现开辟了酶封装领域的新时代。但近期研究表明，以有机配体(2-甲基咪唑)为骨架的ZIFs材料的疏水内部微环境往往会引起构象变化，从而使蛋白质变性。此外，酶被紧紧包裹在具有狭窄的晶体孔径
ZIFs中，由于缺乏构象自由且存在较大的传质阻力，表现出低催化活性和分子识别特性。与MOFs相比，由强共价键(由轻元素组成)形成的COFs具有更容易功能化的有机结构、合适的介孔尺寸、更强的稳定性和生物相容性，可为酶提供优越的实际工作能力和传质效率。但高结晶COFs的疏水苯环结构以及不可分割的有机溶剂和高温合成条件与生物分子的无损原位封装不兼容。更重要的是，MOFs和COFs固有的低导电性阻碍了电荷载体的传导，这对酶催化反应(主要是氧化还原反应)中的电子转移是不利的。因此，迫切需要构建一种具有高酶活性和稳定性的非破坏性原位封装策略。该策略的关键点在于开发一种具有合适孔径大小、优良电学性能和非限域性空腔结构的新型封装载体，以解决质量和电子转移率低以及酶结构差的问题。
层状双金属氢氧化物(LDHs)具有较大的表面积、可调控的孔径和良好的生物相容性。由于其亲水性、耐温性和允许快速质量和电子传输的能力，LDHs也被研究人员选择作为酶固定化的友好载体。传统的LDHs是典型的二维层状结构，酶大多通过吸附的方式固定在其表面，或者通过共沉淀的方式穿插在层间，有可能酶泄漏或失活的风险。受到酶封装优势的启发，可以预见，利用具有独特性能的三维LDHs进行酶的封装，可以极大地提高酶的催化活性，克服目前封装载体的一些缺陷。然而，LDHs很少被探索以封装方式固定化酶的载体。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单温和的方法构建亲水中空层状双金属氢氧化物封装酶策略。通过自牺牲模板法改善了传统LDHs的苛刻合成条件。本发明所合成的亲水中空层状双金属氢氧化物为内部封装的酶提供了抵御外界苛刻应用条件的保护性外壳和能够维持类天然酶构象的非限域性亲水微环境，极大地协助了酶反应中的电子和质量传输。本发明的多酶封装系统制备简单，条件温和，酶催化反应效率高，且具有极佳的稳定性和重复使用性。本发明以葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根过氧化物酶(HRP)为模型来证明该多酶封装体系的优良性能。
该方法首先合成GOX-ssDNA复合物及HRP-ssDNA复合物，其次酶-DNA复合物与硝酸锌和2-甲基咪唑水溶液共同孵育，在温和可控的反应条件下，形成预封装酶的可消化牺牲模板，最后将该牺牲模板与刻蚀剂硝酸钴共同孵育，通过两个共同进行的过程，即模板被硝酸钴水解的氢质子刻蚀和模板表面多种离子共沉淀作用形成层状双金属氢氧化物壳层，将双酶封装在内部。
为了达到上述目的，本发明按照以下技术方案实现：
一种基于亲水中空层状双金属氢氧化物原位封装双酶的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)称取葡萄糖氧化酶(GOX)于Buffer中涡旋至完全溶解；称取磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(suflo-SMCC)用Buffer超声溶解，并加入到上述GOX溶液中；将混合液置于摇床中孵育3h(37℃,400rpm)；反应结束后，将混合液用10K超滤管过滤洗涤8次(10000rpm,5min/次)，除去未反应的suflo-SMCC；反离心(6500rpm,5min)1次，收集GOX-SMCC浓缩液。将单链DNA(ssDNA)用Buffer涡旋至完全溶解；称取三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)于Buffer中超声溶解；将上述两者溶液混合并于摇床中孵育3h(37℃,400rpm)；反应结束后，混合物用3K超滤管过滤洗涤8次(10000rpm,10min/次)，除去未参加反应的TCEP-HCl；反离心(6500rpm,5min)1次，收集去二聚化的ssDNA浓缩液。将过滤好的GOX-SMCC溶液和ssDNA溶液混合，放置于摇床中孵育12h(29℃,400rpm)；反应结束后，用10K超滤管过滤洗涤6次(10000rpm,5min/次)，除去未反应的ssDNA，反离心(6500rpm,5min)1次，将得到的GOX-ssDNA复合物保存于4℃的Buffer中。GOx、suflo-SMCC、ssDNA和TCEP-HCl加入的质量比为5000:2500:33:208
(2)进一步，称取辣根过氧化物酶(HRP)于Buffer中涡旋至完全溶解；称取suflo-SMCC用Buffer超声溶解，并加入到上述HRP溶液中；将混合液置于摇床中孵育3h(37℃,400rpm)；反应结束后，将混合液用10K超滤管过滤洗涤8次(10000rpm,5min/次)，除去未反应的suflo-SMCC；反离心(6500rpm,5min)1次，收集HRP-SMCC浓缩液。将ssDNA用Buffer涡旋至完全溶解；称取TCEP-HCl于Buffer中超声溶解；将上述两者溶液混合并于摇床中孵育3h(37℃,400rpm)；反应结束后，混合物用3K超滤管过滤洗涤8次(10000rpm,10min/次)，除去未参加反应的TCEP-HCl；反离心(6500rpm,5min)1次，收集去二聚化的ssDNA浓缩液。将过滤好的HRP-SMCC溶液和ssDNA溶液混合，于摇床中孵育12h(29℃,400rpm)；反应结束后，用10K超滤管过滤洗涤6次(10000rpm,5min/次)，除去未反应的ssDNA，反离心(6500rpm,5min)1次，将得到的HRP-ssDNA复合物保存于4℃的Buffer中。HRP、suflo-SMCC、ssDNA和TCEP-HCl加入的质量比为5000:2500:33:208。
(3)进一步，在磁力搅拌条件下，向2-甲基咪唑水溶液中加入硝酸锌(Zn(NO3)2·6H2O)水溶液溶液，并注入步骤(1)、(2)中制备的酶-单链DNA复合物(GOX-ssDNA:HRP-ssDNA＝1:1)，继续搅拌(150rpm)30min；GOX-ssDNA复合物、HRP-ssDNA复合物、Zn(NO3)2·6H2O和2-甲基咪唑的质量比为13:13:600:2600，其中GOX-ssDNA复合物、HRP-ssDNA复合物的质量是以Bradford法测定出的蛋白质含量为基准。反应结束后，通过离心(8000rpm,10min)收集纳米晶体，用去离子水清洗3次(5.0mL/次)，得到预封装双酶的模板ZIF-L@DNA@GOX&HRP，将其于Buffer中分散均匀置于4℃环境中保存待用。
(4)进一步，以乙醇与水体积比为1:2混合的溶液为溶剂，配制Co(NO3)2溶液(5mgmL-1)；边搅拌(200rpm)边向Co(NO3)2溶液(5mg mL-1)中加入ZIF-L@DNA@GOX&HRP，然后继续磁力搅拌3min(90rpm)；ZIF-L@DNA@GOX&HRP和Co(NO3)2·6H2O质量比为26:375。反应结束后离心(7000rpm,10min)，产物用去离子水洗涤3次(10mL/次)，洗涤结束后，将得到的原位封装双酶(ZnCo-LDH@DNA@GOX@HRP)密封保存于4℃的Buffer中待用。
进一步，步骤(1)至(2)中所述的ssDNA的序列为5′-SH-C6-CTCCAGGCGCGCTCTCTCACCCGT-3′。
进一步，步骤(1)至(4)中所述的Buffer为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液，10mM，pH7.4，其它药品的溶剂如无特殊说明均为去离子水。
进一步，制备的预封装双酶的模板ZIF-L@DNA@GOX&HRP为尺寸范围在0.8-1.0μm且在三个维度均为十字花样的纳米粒子。
进一步，制备的双酶封装系统的形貌为表面带有褶皱的十字花样中空结构。
进一步，制备的酶-DNA复合物(GOX-ssDNA,HRP-ssDNA)分布于十字花样的亲水中空层状双金属氢氧化物内部。
进一步，所述双酶封装系统不仅较好的保持了酶的天然构象，并且由于载体自身优异的性质加速了级联催化中的电子和质量传输，其催化效率远远高于天然酶和其它多孔材料的封装酶系统；
进一步，所述双酶封装系统中的天然酶模型为GOX和HRP，此封装方法可操作性强，可以扩展到其他中空层状双金属氢氧化物封装酶系统，具有广泛的应用范围和产业化应用。
本发明的优点在于：
(1)创新地使用三维空心LDH进行酶的原位封装，打破了封装材料的种类限制。
(2)固定化方法简单温和且高效。利用自模板牺牲法，通过一种“先封装后刻蚀”的策略实现了酶的高负载无损封装。ssDNA的引入增大了酶在预封装过程中的固载量，并防止了酶在刻蚀过程中的泄漏。
(3)显著提高了酶催化活性。该中空层状双金属氢氧化物内部亲水的空腔结构为封装酶提供了友好的微环境，有利于保持酶的天然构象；其自身固有的丰富介孔结构和优异的电学性质可以加速酶促反应中的电子和质量传输，催化效率得到极大提升。
(4)有效提高了酶的稳定性和重复使用性，大幅降低了酶的应用的成本。作为封装酶的外部盔甲，该亲水中空层状双金属氢氧化物优异的热稳定性和生物相容性有效保持了酶在外界苛刻应用条件中的三级结构，提升了酶的耐受性。
(5)本发明以GOX和HRP为模型酶，可广泛应用于不同类型单酶或多酶的封装，是一种通用型制备策略。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明，但并不构成对本发明的限制。
实施例1：酶-ssDNA复合物(GOX-ssDNA,HRP-ssDNA)的制备。
(1)GOX-ssDNA的制备：分别将GOX溶液(4mg mL-1,500μL)和SMCC溶液(2mg mL-1,500μL)，0.4OD ssDNA溶液(0.022mg mL-1,600μL)和TCEP-HCl溶液(0.60mM,240μL)混合均匀，于摇床中孵育3h(37℃,400rpm)。反应结束后，使用3K超滤管将ssDNA离心8次(10000rpm,5min/次)，GOX-SMCC则使用10K超滤管离心8次(10000rpm,10min/次)，超滤离心完成后反离心1次(6500rpm,5min)。将离心所得的ssDNA和GOX-SMCC溶液混合于摇床中孵育12h(29℃,400rpm)。反应完成后使用10K超滤管对溶液进行6次超滤离心(10000rpm,5min/次)，1次反离心(6500rpm,5min)。产物经密封置于4℃的Buffer环境中保存待用。
(2)HRP-ssDNA的制备：分别将HRP溶液(4mg mL-1,500μL)和SMCC溶液(2mg mL-1,500μL)，0.4OD ssDNA溶液(0.022mg mL-1,600μL)和TCEP-HCl溶液(0.60mM,240μL)混合均匀，于摇床中孵育3h(37℃,400rpm)。反应结束后，使用3K超滤管将ssDNA离心8次(10000rpm,5min/次)，HRP-SMCC则使用10K超滤管离心8次(10000rpm,10min/次)，超滤离心完成后反离心1次(6500rpm,5min)。将离心所得的ssDNA和HRP-SMCC溶液混合于摇床中孵育12h(29℃,400rpm)。反应完成后使用10K超滤管对溶液进行6次超滤离心(10000rpm,5min/次)，1次反离心(6500rpm,5min)。产物经密封置于4℃的Buffer环境中保存待用。
实施例2：合成预封装双酶的模板ZIF-L@DNA@GOX&HRP。
(1)GOX-ssDNA、HRP-ssDNA的制备同实施例1
(2)在磁力搅拌条件下，向2-甲基咪唑溶液(3.16mM,8.0mL)中加入Zn(NO3)2溶液(0.50mM,1.0mL)，并注入实例1中制备的两种酶-ssDNA复合物，继续搅拌(150rpm)30min。通过离心(8000rpm,10min)收集纳米晶体，用去离子水清洗3次(5.0mL/次)，将产物用1.0mL的Buffer分散均匀置于4℃环境中保存待用。
实施例3：基于亲水中空层状双金属层状双金属氢氧化物封装双酶系统的构建
(1)GOX-ssDNA、HRP-ssDNA的制备和预封装双酶模板ZIF-L@DNA@GOX&HRP的合成：同实施例1和实施例2。
(2)以乙醇与水体积比为1:2混合的溶液为溶剂，配制Co(NO3)2溶液(5mg mL-1)；边搅拌(200rpm)边向Co(NO3)2溶液(5mg mL-1)中加入500μL实例2合成的预封装双酶的模板储备液，继续磁力搅拌3min(200rpm)。反应结束后离心(7000rpm,10min)，产物用去离子水洗涤3次(10mL/次)，密封保存于4℃环境中待用。
实施例4：封装双酶系统酶促反应条件的优化及动力学考察
(1)酶促反应效果受温度、底物浓度和孵育时间等条件的影响，因此本发明对所制备封装双酶系统的酶促反应条件进行了考察。
(2)将得到的封装双酶系统均匀分散在3.0mL Buffer中；取封装酶储备液(酶含量0.30mg mL-1,20μL)加入葡萄糖(125.0mM,800μL)和ABTS(2.500mM,200μL)，于摇床(37℃,400rpm)中孵育不同的时间(2.5、5.0、7.5、10、15、20min)，用UV-vis检测上清液在415nm处的吸光度；得到最佳酶促反应时间为10min。
(3)进一步，在(2)中得到的最佳酶促反应时间下，考察了底物浓度对酶促反应效果的影响。以葡萄糖浓度为例，设计葡萄糖浓度梯度为1.953、3.906、7.812、15.62、31.25、62.50、125.0、500.0、1000mM。取封装酶储备液(酶含量0.30mg mL-1,20μL)，加入1.0mL由不同浓度葡萄糖溶液(200μL)和ABTS(2.500mM,200μL)，于摇床(37℃,400rpm)中孵育10min。反应结束后离心(6500rpm,5min)，用UV-vis检测上清液在415nm处的吸光度；得到最佳葡萄糖浓度为31.25mM。ABTS浓度对酶促反应效果的影响与上述操作步骤基本相同。
(4)进一步，在(1)和(2)中得到的最佳酶促反应时间合葡萄糖浓度下，设计一系列浓度梯度的ABTS溶液(0.3125、0.6250、1.250、2.500、5.000、7.500、10.00、20.00、40.00mM)与封装酶储备液(酶含量0.30mg mL-1,20μL)和葡萄糖(31.25mM,800μL)混合于摇床(37℃,400rpm)中孵育10min。反应结束后离心(6500rpm,5min)，用UV-vis测量产物上清液在415nm处的吸光度；结果表明在ABTS浓度为20mM时获得了最高的相对活性，但出于环境和节约成本的考虑，后续实验条件中选择ABTS浓度为5.000mM。
(5)基于(1)至(3)中最佳酶促反应时间和底物浓度条件下，取封装酶储备液(酶含量0.30mg mL-1,20μL)，加入1.0mL由葡萄糖(125.0mM,800μL)和ABTS(5.000mM,200μL)组成的底物溶液，于设置了不同温度的摇床(400rpm)中孵育10min。反应结束后离心(6500rpm,5min)，用UV-vis测量产物上清液在415nm处的吸光度，以测量级联催化活性。结果表明最佳孵育温度为37℃。
(6)在最佳酶促反应条件下对封装多酶系统进行动力学考察。根据米氏方程(Michaelis-Menten equation)分别考察本发明和自由双酶(GOX&HRP)的动力学参数。以封装双酶系统中GOX为模型酶衡量对比不同双酶系统的动力学参数。结果表明，本发明和游离酶的米氏常数(Km)分别为0.6133和8.858mM，对特定底物的催化效率kcat/Km分别为17.98和3.235M-1s-1，表明与自由双酶相比，本发明封装双酶系统具有极好的底物亲和性力和催化效率。
实施例5：封装双酶系统的稳定性及重复使用性测试
(1)封装双酶系统的制备：同实施例1-3。
(2)热稳定性考察：将得到的封装双酶系统均匀分散在3.0mL Buffer中；分别取封装酶储备液和游离酶(GOX&HRP)溶液(酶含量0.30mg mL-1,1.0mL)于5mL离心管中，置于50℃的电热鼓风干燥箱中孵育。每间隔一段时间取出定量的酶溶液(20μL)冷却，加入1.0mL由葡萄糖(31.25mM,800μL)和ABTS(5.000mM,200μL)组成的底物溶液，于摇床中孵育10min(37℃,400rpm)。反应结束后离心(6500rpm,5min)，用UV-vis测量产物上清液在415nm处的吸光度，以测量级联催化活性。同时用荧光光谱检测热处理后的封装双酶系统和游离酶在335nm的荧光信号以表征GOX三级结构的变化。活性测试结果表明，封装双酶系统和游离酶的酶促活性随热处理时间的增加而有所下降，但在50℃中孵育100min后，封装双酶系统和游离酶分别保持了初始活性的70％和35％的初始酶活性，是相同条件下游离酶活性的2.0倍。荧光测试结果表明，封装双酶系统在50℃环境中孵育100min依旧展示出与游离GOX未经热处理基本相同的发射谱线；然而，游离GOx&HRP在热处理后λmax红移至341nm。活性与结构表征的综合结果表明，该封装双酶系统与游离酶相比具有更好的热稳定性。
(3)有机溶剂稳定性考察：将得到的封装双酶系统均匀分散在3.0mL Buffer中；以有机溶剂和Buffer体积比为1:1配制不同种类(N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙二醇、乙酸乙酯、1,4-二氧六环、四氢呋喃、甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇)的有机溶液。取封装双酶的储备液或等量游离酶(GOX&HRP)溶液(酶含量0.30mg mL-1,200μL)分别与不同种类的有机溶液(200μL)混合均匀，置于摇床中孵育90min(37℃,400rpm)。待孵育结束后，每份移取定量的酶溶液(20μL)加入1.0mL由葡萄糖(31.25mM,800μL)和ABTS(5.000mM,200μL)组成的底物溶液。反应结束后离心(6500rpm,5min)，用UV-vis检测上清液在415nm处的吸光度，记录数据。同时用荧光光谱检测有机溶剂处理后的封装双酶系统和游离酶在335nm的荧光信号以表征GOX三级结构的变化。结果表明固定化酶均保持了高于游离酶近两倍以上的催化活性。相对应的荧光光谱表征中，与游离GOx&HRP被不同的有机溶剂处理后的λmax或蓝移10nm或红移3nm相反，封装双酶系统几乎均保持了与游离GOX相同的发射谱线。活性与结构表征的综合结果表明，该封装双酶系统与游离酶相比具有优异的有机溶剂稳定性。
(4)储存稳定性考察：将得到的封装双酶系统均匀分散在3.0mL Buffer中；分别取封装酶储备液和游离酶(GOX&HRP)溶液(酶含量0.30mg mL-1,1.0mL)于5mL离心管中，置于4℃的Buffer环境中储存45天。储存结束后，移取定量的封装酶和游离酶溶液(20μL)加入1.0mL由葡萄糖(31.25mM,800μL)和ABTS(5.000mM,200μL)组成的底物溶液并于摇床中孵育10min(37℃,400rpm)。反应结束后离心(6500rpm,5min)，用UV-vis测量产物上清液在415nm处的吸光度以测量级联催化活性。同时用荧光光谱检测封装酶和游离酶在335nm的荧光信号以表征GOX三级结构的变化。测试结果表明，封装双酶系统保持了近100％初始活性和与未经任何处理的天然酶相同的三级结构，然而自由酶在相同条件下酶活性下降了20％且三级结构发生改变。
(5)重复使用性考察：将得到的封装双酶系统均匀分散在3.0mL Buffer中；取封装酶储备液(酶含量0.30mg mL-1,1.0mL)于5mL离心管中，离心(11500rpm,5min)移去上清液；加入1.0mL由葡萄糖(31.25mM,800μL)和ABTS(5.000mM,200μL)组成的底物溶液并于摇床中孵育10min(37℃,400rpm)。反应结束后离心(6500rpm,5min)，用UV-vis测量产物上清液在415nm处的吸光度以测量级联催化活性，并将离心的后底物用Buffer充分洗涤，去除其表面粘有的底物溶液，反复批次催化1.0mL由葡萄糖(31.25mM,800μL)和ABTS(5.000mM,200μL)组成的底物溶液，考察人造多酶系统的重复使用性。结果表明，本发明制备的封装多酶系统拥有很好的重复使用性。重复使用10次后仍可保持原酶活性的85％。
实施例6：封装双酶系统用于葡萄糖检测
(1)封装双酶系统的制备：同实施例1-3。
(2)葡萄糖的选择性考察：将得到的封装双酶系统均匀分散在3.0mL Buffer中；取封装酶储备液(酶含量0.30mg mL-1,20μL)分别加入1.0mL由葡萄糖(20.00mM)或不同干扰物溶液(200.0mM,800μL)和ABTS(5.000mM,200μL)组成的底物溶液，于摇床中孵育10min(37℃,400rpm)。反应结束后离心(6500rpm,5min)，用UV-vis测量产物上清液在415nm处的吸光度。
(3)进一步，(2)中所用的不同干扰物溶液是：果糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、抗坏血酸、尿素和木糖醇。实验表明，尽管干扰物质的浓度比葡萄糖浓度高10倍，但是基本上没有吸收值，然而制备的封装双酶系统催化葡萄糖具有较高的吸光度。进而表明，制备的封装双酶系统对葡萄糖具有较好的选择性。
(5)进一步，利用具有高选择性的封装双酶系统绘制葡萄糖标准曲线：取封装酶储备液(酶含量0.30mg mL-1,20μL)分别加入1.0mL由不同浓度葡萄糖(800μL)和ABTS(5.000mM,200μL)组成的底物溶液，于摇床中孵育10min(37℃,400rpm)。反应结束后离心(6500rpm,5min)，用UV-vis测量产物上清液在415nm处的吸光度。将得到的吸光度与相应浓度的葡萄糖做线性拟合，得到葡萄糖标准曲线方程为A415nm＝0.0652CGLU+0.0016，R2＝0.9970。线性良好且具有较宽的线性范围(0.12-7.81mM)和较高的灵敏度。
(5)进一步，取封装酶储备液(酶含量0.30mg mL-1,20μL)分别加入稀释的不同血清样本(800μL)和ABTS(5.000mM，200μL)，于摇床中孵育10min(37℃,400rpm)。反应结束后离心(6500rpm,5min)，用UV-vis测量产物上清液在415nm处的吸光度。通过(4)中绘制的标准曲线得到血清样本中葡萄糖的含量，得到的检测结果与医院高度一致，说明该封装双酶系统在生物检测平台有着广阔的应用前景。
Claims (4)
1.一种基于亲水中空层状双金属氢氧化物原位封装双酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)(a)称取葡萄糖氧化酶GOX于Buffer中涡旋至完全溶解；称取磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐suflo-SMCC用Buffer超声溶解，并加入到上述GOX溶液中；将混合液置于37℃的摇床中孵育3h；反应结束后，混合物用10K超滤管过滤洗涤除去未反应的suflo-SMCC；
(b)称取辣根过氧化酶HRP于Buffer中涡旋至完全溶解；称取suflo-SMCC用Buffer超声溶解，并加入到上述HRP溶液中；将混合液置于37℃的摇床中孵育3h；反应结束后，混合物用10K超滤管过滤洗涤除去未反应的suflo-SMCC；
(c)将单链DNA即ssDNA用Buffer涡旋至完全溶解；称取三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP-HCl于Buffer中超声溶解；将上述两者溶液混合，于摇床中37℃,400rpm孵育3h；反应结束后，混合物用3K超滤管过滤洗涤除去未参加反应的TCEP；
(d)将步骤(a)和(b)中过滤好的GOX溶液和HRP溶液分别与(c)中过滤好的ssDNA溶液混合，于摇床中29℃,400rpm孵育12h；反应结束后，用10K超滤管过滤洗涤除去未反应的ssDNA，得到GOX-ssDNA复合物和HRP-ssDNA复合物保存于4℃的Buffer中待用；
(2)在磁力搅拌条件下，向2-甲基咪唑溶液中加入硝酸锌(Zn(NO3)2·6H2O)溶液，而后注入GOX-ssDNA和HRP-ssDNA复合物，继续搅拌(150rpm)30min，用去离子水洗涤，得到预封装双酶的模板ZIF-L@DNA@GOX&HRP；
(3)将乙醇与水以一定比例混合用于配制硝酸钴(Co(NO3)2·6H2O)溶液，边搅拌边向Co(NO3)2溶液中加入ZIF-L@DNA@GOX&HRP，然后继续90rpm磁力搅拌3min；反应结束后用Buffer洗涤，得到基于亲水中空层状双金属氢氧化物的原位封装双酶系统；
步骤(1)中GOX、suflo-SMCC、ssDNA和TCEP-HCl加入的质量比为5000:2500:33:208；HRP、suflo-SMCC、ssDNA和TCEP-HCl加入的质量比为5000:2500:33:208；
步骤(1)中ssDNA的序列为5′-SH-C6-CTCCAGGCGCGCTCTCTCACCCGT-3′；
步骤(2)中GOX-ssDNA复合物、HRP-ssDNA复合物、Zn(NO3)2·6H2O和2-甲基咪唑的质量比为13:13:600:2600，其中GOX-ssDNA复合物、HRP-ssDNA复合物的质量是基于Bradford法测定出的蛋白质含量为基准；
步骤(3)中ZIF-L@DNA@GOX&HRP和Co(NO3)2·6H2O质量比为26:375；
步骤(3)中配制Co(NO3)2溶液所用的溶剂是乙醇与水的体积比为1:2的混合溶液。
2.按照权利要求1所述的一种基于亲水中空层状双金属氢氧化物原位封装双酶的方法，其特征在于，所述的Buffer为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液，10mM，pH 7.4，其它药品的溶剂如无特殊说明均为去离子水。
3.按照权利要求1所述的一种基于亲水中空层状双金属氢氧化物原位封装双酶的方法，其特征在于，制备的预封装双酶的模板ZIF-L@DNA@GOX&HRP为尺寸范围在0.8-1.0μm且在三个维度均为十字花样的纳米粒子；制备的封装双酶系统为表面带有褶皱的十字花样的中空结构。
4.按照权利要求1-3任一项所述方法制备的原位封装双酶系统。
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| CN202310230998.3A CN116376892A (zh) | 2023-03-12 | 2023-03-12 | 一种基于亲水中空层状双金属氢氧化物原位封装酶的方法 |
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| CN (1) | CN116376892A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117511899A (zh) * | 2023-11-06 | 2024-02-06 | 西安工程大学 | 一种Zn-NiMOF材料固定化的糖基转移酶及其制备方法与应用 |
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2023
- 2023-03-12 CN CN202310230998.3A patent/CN116376892A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
| CN117511899A (zh) * | 2023-11-06 | 2024-02-06 | 西安工程大学 | 一种Zn-NiMOF材料固定化的糖基转移酶及其制备方法与应用 |
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