CN113308457B - 一种共价有机骨架封装酶的制备方法 - Google Patents

一种共价有机骨架封装酶的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种共价有机骨架封装酶的制备方法，将聚乙烯聚吡咯烷酮保护的酶溶液先与醛基配体溶液混合，再与氨基配体溶液混合，离心，所得沉淀为价有机骨架封装酶。所述的醛基配体为1,3,5‑三醛基均苯三酚，所述的氨基配体为联苯二胺。本发明方法采用一步合成法制备共价有机骨架封装酶，其操作简单、重复性好、稳定性高。相比传统固定化酶方法，本发明制备的晶态多孔共价有机骨架，能够克服传统酶固定造成的酶活性位点保留不完全的缺点。本发明的共价有机骨架封装酶可以增强游离酶的环境耐受性，提高游离酶的回收率和循环利用率。

Description

一种共价有机骨架封装酶的制备方法
技术领域
本发明属于纳米材料领域，具体涉及一种共价有机骨架封装酶的制备方法。
背景技术
酶是一类具有催化效率高、选择性好、环保经济的天然生物催化剂，大部分为蛋白质，在食品、医药、化工和环境领域有着广泛的应用。环境条件影响酶的稳定性和活性，酶可以在室温、适中的pH、水介质等温和的条件下表现较高的催化活性。传统的酶固定化技术是通过吸附、包埋、共价结合和交联等物理或化学方法，在一定程度上提高了游离酶的环境稳定性、回收率和循环利用率，但仍然存在不可忽视弊端，如酶固定不牢造成回收率低；酶活性位点未完全保留导致酶活性低等。因此迫切需要新固定方法以解决上述问题，多孔纳米材料原位封装酶是一种基于纳米材料自组装将酶封装在纳米材料形成的空腔内部，纳米材料通过这种封装方式保留了酶的活性位点，不影响酶的活性，同时纳米材料的多孔性有助于催化过程的传质效率，缩短酶反应时间。
Tp基共价有机骨架COFs材料是一种新型多孔纳米材料，有高的比表面积、可调的多孔结构、良好的化学与热稳定性，可以在溶液中自组装形成有序的晶态结构，目前已广泛应用于气体吸附分离、催化、储能和传感等。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种共价有机骨架封装酶的制备方法。
具体技术方案如下：
一种共价有机骨架封装酶的制备方法，其与现有技术的区别在于，通过一步合成法，将聚乙烯聚吡咯烷酮保护的酶溶液先与醛基配体溶液混合，再与氨基配体溶液混合，离心，所得沉淀为价有机骨架封装酶。
酶溶液、醛基配体和氨基配体添加顺序不能改变。
本发明为了解决传统酶固定化技术的不足，利用新材料-亚胺类共价有机骨架材料的高比表面积、可调的多孔结构以及良好的化学和热稳定性，通过原位自组装的合成方法，将酶封装在晶态多孔的共价有机骨架空腔内，晶态多孔共价有机骨架作为固定化酶载体，能够克服传统酶固定造成的酶活性位点保留不完全的缺点，同时可以增强游离酶的环境耐受性，提高游离酶的回收率和循环利用率。
进一步，所述的酶为葡萄糖氧化酶和/或辣根过氧化物酶。
进一步，所述的醛基配体为1,3,5-三醛基均苯三酚，所述的氨基配体为联苯二胺。
再进一步，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)将酶溶解于缓冲溶液中，得酶溶液；
(2)向步骤(1)获得的酶溶液中加入聚乙烯聚吡咯烷酮，搅拌均匀，得混合液A；
(3)将1,3,5-三醛基均苯三酚溶解于无水乙醇中，得溶液A；
(4)将步骤(3)获得的溶液A与步骤(2)获得的混合液A混合，搅拌0.5～2h，得混合液B；
(5)将联苯二胺溶解于无水乙醇中，得溶液B；
(6)将步骤(5)获得的溶液B与步骤(4)获得的混合液B混合，搅拌0.5～12h，得混合液C；
(7)将步骤(6)获得的混合液C离心，得沉淀，干燥后即为共价有机骨架封装酶。
具体地，步骤(6)获得的混合液C中，酶的终浓度为1～500μg/mL，优选为100μg/mL。
具体地，步骤(6)获得的混合液C中，聚乙烯聚吡咯烷酮的终浓度为1～700μg/mL，优选为150μg/mL。
具体地，步骤(6)获得的混合液C中，1,3,5-三醛基均苯三酚的终浓度为0.1～1.0mmol/L，优选为0.3mmol/L。
具体地，步骤(6)获得的混合液C中，联苯二胺的终浓度为0.3～1.5mmol/L，优选为0.45mmol/L。
具体地，步骤(1)中，所述的缓冲液为pH 7.4的PBS溶液。
具体地，步骤(3)与步骤(5)中，优选进行超声溶解。
具体地，步骤(4)中，搅拌时间优选为1h。
具体地，步骤(6)中，搅拌时间优选为1h。
具体地，步骤(6)在常温下进行。所述的常温为20℃±5℃。
具体地，步骤(7)中，所述的离心的条件优选为4℃在10000rpm转速下离心5～30min。
具体地，步骤(7)中，所述的干燥优选为冷冻干燥。
本发明的有益效果如下：
本发明方法采用一步合成法制备共价有机骨架封装酶，其操作简单、重复性好、稳定性高。相比传统固定化酶方法，本发明制备的晶态多孔共价有机骨架，能够克服传统酶固定造成的酶活性位点保留不完全的缺点。本发明的共价有机骨架封装酶可以增强游离酶的环境耐受性，提高游离酶的回收率和循环利用率。
附图说明
图1为对比例1中共价有机骨架的荧光显微镜图像(图中，A部分是无荧光条件下的图像，B部分是有荧光条件下的图像)；
图2为实施例1中获得的共价有机骨架封装FITC标记的葡萄糖氧化酶的荧光显微镜图像(图中，A部分是无荧光条件下的图像，B部分是有荧光条件下的图像)。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
对比例1
1、制备共价有机骨架，步骤如下：
(1)常温下，取250mL圆底烧瓶，将1,3,5-三醛基均苯三酚溶解于25mL无水乙醇中，得溶液A；
(2)常温下，将联苯二胺溶解于25mL无水乙醇中，得溶液B；
(3)将步骤(2)获得的溶液B加入步骤(1)获得的溶液A中，常温搅拌1h，得混合液C；混合液C中，1.3.5-三醛基均苯三酚的终浓度为0.3mmol/L，联苯二胺的终浓度为0.45mmol/L；
(4)将步骤(3)获得的混合液C在4℃、转速10000rpm下离心15min，得沉淀，将沉淀洗涤并重复离心洗涤操作两次(共三次)，真空冷冻干燥后即为共价有机骨架。
2、对对比例1获得的共价有机骨架进行荧光显微镜观察，得到结果如图1所示。
实施例1
1、制备共价有机骨架封装酶(有机骨架封装单酶)，步骤如下：
(1)常温下，将葡萄糖氧化酶溶解于50mL PBS缓冲液(pH7.4)中，得酶溶液；
(2)常温下，向步骤(1)获得的酶溶液中加入聚乙烯聚吡咯烷酮，搅拌均匀，得混合液A；
(3)常温下，取250mL圆底烧瓶，将1,3,5-三醛基均苯三酚溶解于25mL无水乙醇中，得溶液A；
(4)常温下，将步骤(2)获得的混合液A加入步骤(3)获得的溶液A中，常温搅拌1h，得混合液B；
(5)常温下，将联苯二胺溶解于25mL无水乙醇中，得溶液B；
(6)将步骤(5)获得的溶液B加入步骤(4)获得的混合液B中，常温搅拌1h，得混合液C；混合液C中，葡萄糖氧化酶的终浓度为100μg/mL，聚乙烯聚吡咯烷酮的终浓度为150μg/mL，1.3.5-三醛基均苯三酚的终浓度为0.3mmol/L，联苯二胺的终浓度为0.45mmol/L；
(7)将步骤(6)获得的混合液C在4℃、转速10000rpm下离心15min，得沉淀，将沉淀洗涤并重复离心洗涤操作两次(共三次)，真空冷冻干燥后即为共价有机骨架封装酶。
2、收集步骤(7)离心的上清液，并用BCA蛋白质定量试剂盒测定未固定的酶浓度，测得共价有机骨架封装酶对于葡萄糖氧化酶的固载率为86.4％。
3、将步骤(1)中使用的葡萄糖氧化酶用异硫氰酸荧光素(FITC)进行荧光标记，其他步骤与(2)-(7)相同，得到共价有机骨架封装FITC标记的葡萄糖氧化酶，并进行荧光显微镜观察，得到结果如图2所示，通过与对比例1对比，可发现酶封装在共价有机骨架中。
4、对步骤1获得的封装单酶进行不同pH、温度的活性和重复利用率的测定。对于pH稳定性实验，将封装酶分散于不同pH的水溶液中，2h后用葡萄糖测试方法测定封装酶的活性，即1μM葡萄糖的PBS缓冲溶液与0.5mg/mL不同pH处理之后的封装酶、532μM的2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，7.5mg/mL辣根过氧化物酶混合均匀,室温反应15min,用紫外分光光度计测定415nm的吸光度值；对于温度稳定性实验，与pH稳定性实验类似，将封装酶置于不同温度中，0.5h后用葡萄糖标准测试方法测定封装酶的活性；重复利用是酶生物应用的重要指标，通过PBS缓冲溶液对测试完的封装酶的清洗和离心，利用葡萄糖氧化酶活性测定方法对封装酶活性重复测定10次。实验发现共价有机骨架封装葡萄糖氧化酶的在pH 3-10，温度30-90℃均表现出良好的活性，重复实验10次仍能保持90％的酶活。
实施例2
1、制备共价有机骨架封装酶(有机骨架封装双酶)，步骤如下：
(1)常温下，将葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶溶解于50mL PBS缓冲液(pH7.4)中，得酶溶液；
(2)常温下，向步骤(1)获得的酶溶液中加入聚乙烯聚吡咯烷酮，搅拌均匀，得混合液A；
(3)常温下，取250mL圆底烧瓶，将1.3.5-三醛基均苯三酚溶解于25mL无水乙醇中，得溶液A；
(4)常温下，将步骤(2)获得的混合液A加入步骤(3)获得的溶液A中，常温搅拌1h，得混合液B；
(5)常温下，将联苯二胺溶解于25mL无水乙醇中，得溶液B；
(6)将步骤(5)获得的溶液B加入步骤(4)获得的混合液B中，常温搅拌1h，得混合液C；混合液C中，葡萄糖氧化酶的终浓度为100μg/mL，辣根过氧化物酶的终浓度为150μg/mL，聚乙烯聚吡咯烷酮的终浓度为300μg/mL，1.3.5-三醛基均苯三酚的终浓度为0.3mmol/L，联苯二胺的终浓度为0.45mmol/L；
(7)将步骤(6)获得的混合液在4℃、转速10000rpm下离心5min，得沉淀，将沉淀洗涤并重复离心洗涤操作两次(共三次)，真空冷冻干燥后即为共价有机骨架封装酶。
2、收集步骤(7)离心的上清液，并用BCA蛋白质定量试剂盒测定未固定的酶浓度，测得共价有机骨架封装酶对于酶的固载率为83.7％。
3、对封装双酶进行活性和重复利用率的测定。封装双酶的活性测试，以葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶为例，即1μM葡萄糖的PBS缓冲溶液与0.5mg/mL封装双酶、532μM的ABTS混合均匀,室温反应15min,用紫外分光光度计测定415nm的吸光度值；重复利用是率的测试方法是通过PBS缓冲溶液对测试完的封装双酶的清洗和离心，利用双酶活性测定方法对封装酶活性重复测定10次。实验发现共价有机骨架封装葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶对葡萄糖的降解速率是游离葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的2.3倍，重复实验8次仍能保持80％的酶活。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种共价有机骨架封装酶的制备方法，其特征在于，将聚乙烯聚吡咯烷酮保护的酶溶液先与醛基配体溶液混合，再与氨基配体溶液混合，离心，所得沉淀为共价有机骨架封装酶；
所述的酶为葡萄糖氧化酶和/或辣根过氧化物酶；所述的醛基配体为1,3,5-三醛基均苯三酚，所述的氨基配体为联苯二胺；
包括如下步骤：
(1)将酶溶解于缓冲溶液中，得酶溶液；
(2)向步骤(1)获得的酶溶液中加入聚乙烯聚吡咯烷酮，搅拌均匀，得混合液A；
(3)将1,3,5-三醛基均苯三酚溶解于无水乙醇中，得溶液A；
(4)将步骤(3)获得的溶液A与步骤(2)获得的混合液A混合，搅拌0.5～2h，得混合液B；
(5)将联苯二胺溶解于无水乙醇中，得溶液B；
(6)将步骤(5)获得的溶液B与步骤(4)获得的混合液B混合，搅拌0.5～12h，得混合液C；
(7)将步骤(6)获得的混合液C离心，得沉淀，干燥后即为共价有机骨架封装酶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)获得的混合液C中，酶的终浓度为1～500μg/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)获得的混合液C中，聚乙烯聚吡咯烷酮的终浓度为1～700μg/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)获得的混合液C中，1,3,5-三醛基均苯三酚的终浓度为0.1～1.0mmol/L。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)获得的混合液C中，联苯二胺的终浓度为0.3～1.5mmol/L。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所述的离心的条件为4℃在10000rpm转速下离心5～30min。
7.一种共价有机骨架封装酶，其特征在于，使用如权利要求1～6任一项所述的制备方法获得。
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