CN110438114A - 一种纳米纤维素/光固化树脂制备固定化酶的方法及制得的固定化酶与应用 - Google Patents

一种纳米纤维素/光固化树脂制备固定化酶的方法及制得的固定化酶与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纳米纤维素/光固化树脂制备固定化酶的方法及制得的固定化酶。该制备方法包括以下步骤：（1）在纳米纤维素的水分散液中，依次加入酶粉、水性光敏树脂和光引发剂，通过磁力搅拌和超声处理混合均匀，获得光固化共混液，将该共混液避光保存；（2）在紫外光照射下，对所述共混液进行固化，正反面各照射一次；（3）光光固化过程完成后，用蒸馏水反复洗涤，以除去未固定的游离酶、未反应的树脂及光引发剂，得到所述固定化酶。该方法操作工艺简单、条件温和，酶活损失小，所制备得到的固定化酶具有良好的酶负载率（86%~96%）、酶活力（1012‑2290U/g）、储存稳定性和重复操作稳定性，以及良好的催化效果。

Description

一种纳米纤维素/光固化树脂制备固定化酶的方法及制得的 固定化酶与应用
技术领域
本发明涉及固定化酶技术领域，具体涉及一种纳米纤维素/光固化树脂制备固定化酶的方法及制得的固定化酶。
背景技术
纳米纤维素结合了纤维素的天然高分材料性质和纳米材料特性的优点，具有良好的生物相容性、高比表面、高长径比、高强度、易改性以及易形成多孔网络结构的能力，在组织工程支架、药物释放及酶固定化等生物医学领域具有巨大的潜力。将纳米纤维素作为固定化酶的载体，具有高比表面积、多官能团及低传质阻力等优势，引起了研究者广泛的研究兴趣。
纳米纤维素是直径或宽度小于100nm的纤维素棒状或线状材料，制备方法有机械法、化学法、化学预处理+机械处理法、酶预处理+机械处理法等。处理方法不同，得到的产品的形貌、表面电荷也不同。通常机械法制备的纳米纤维素直径较大(几十纳米至几百纳米)，长度较长(微米级)，表面电荷是羟基；化学法通常指的的是酸水解法，得到的是纤维素纳米晶，直径和长度都比较小，其直径低至几个纳米，长度也是纳米级(几十纳米)，表面电荷跟所用的酸种类有关，硫酸水解法带磺酸基团；化学+机械法，根据不同化学预处理，带有不同基团，如TEMPO氧化法+机械处理得到的纳米纤维素带羧基，但也是部分羟基被氧化，仍然保留有大量的羟基，直径在几纳米-几十纳米之间，长度比纳米晶要长，几百纳米到微米级都有。
纳米纤维素用于酶的固定化，吸附法和共价结合法是常见的固定化方法。Mohammad等 (Rahman M A,Culsum U,Kumar A,et al.Immobilization of a novel coldactive esterase onto Fe3O4～cellulose nano-composite enhances catalyticproperties[J].International journal of biological macromolecules,2016,87:488-497.)将酯酶通过吸附法负载于Fe3O4-纤维素纳米复合材料上，在经历了8个批次的反应后，仅保留了50％左右的活力；Wu等(Wu S C,Wu S M, Su F M.Novel process forimmobilizing an enzyme on a bacterial cellulose membrane through repeatedabsorption[J].Journal of Chemical Technology&Biotechnology,2017,92(1):109-114)先通过戊二醛将细菌纤维素进行活化，再将脂肪酶通过吸附法负载于细菌纤维素膜上，在重复8个批次反应时，其剩余酶活约75％左右；专利文献CN 105524911 A是采用物理共混结合冷冻干燥的方式，由于吸附法中酶与载体间微弱的结合力，导致固定化酶的操作稳定性效果不佳。Xiao等(Huang X-J,Chen P-C,Huang F,et al.Immobilization ofCandida rugosa lipase on electrospun cellulose nanofiber membrane[J].Journalof Molecular Catalysis B:Enzymatic,2011, 70(3-4):95-100.)化学结合法，由于条件苛刻，导致酶活下降较为严重，且有机溶剂的使用不利于酶活，因此化学结合法在固定化酶的应用中具有一定的限制。采用静电纺丝法制备醋酸纳米纤维素膜，然后引入醛基与脂肪酶进行偶联，与游离酶相比，固定化酶的储存稳定性、热稳定性及操作稳定性均有所提高，但其酶活性较低(29.6U/g)。对于纳米纤维素固定化酶技术，如何兼顾酶的活力与稳定性是目前存在的主要问题。
紫外光固化，作为一种新型的酶固定化方法，具有快速、能耗低、条件温和无溶剂排放等优点。由于固化时间短，对酶的活性损伤较小，且在固化过程中树脂材料形成交联网络结构，利于固定化酶的稳定性，因此利用该法固定化酶成为近几年的研究热点。专利文献CN 102925425A将聚乙二醇二丙烯酸酯、丙烯酰胺和酶组成光固化共混液，通过紫外光固化将葡萄糖酶固定于双向拉伸聚丙烯BOPP膜和低密度聚乙烯LDPE膜之间，经测定固定化酶的活力保持率为65％～80％之间；专利CN 107828770A将有机磷水解酶加入到聚乙二醇二丙烯酸酯和乙氧化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯中建立光固化共混液，通过紫外光照将酶固定于无纺布上，酶活最高为64.65U/g；以上专利虽然都是采用了光固化技术，但是都是通过先将含有酶的光固化混合液涂覆成膜或者涂覆在基材上，再通过光固化进行固定化，制备的固定化酶虽然具有较高的酶活回收率，但是局限于基材特性，固定化酶单位质量的酶活力偏低。专利CN 107619824A将PEGDA、有机磷水解酶及光引发剂组成光固化共混液，并将其注入到聚四氟乙烯板中，通过紫外光对其进行固定化，酶活回收可高达92.3％，重复利用10次后酶活最高还保持初始酶活的81.1％，表明采用紫外光固化法制备得到的固定化酶水凝胶具有良好的酶活回收及酶学稳定性。然而，该专利是直接将纯的PEGDA对酶进行固定化，由于纯的PEGDA 水凝胶的结构十分致密，使得其在催化应用中对底物具有较高的传质阻力。而纳米纤维素的添加，除了能与酶发生静电吸附作用，同时还能对PEGDA水凝胶的孔隙结构起到调控作用，且国内外目前将纳米纤维素材料与光固化技术相结合，用于酶的固定化的研究尚未见报道。
发明内容
针对目前纳米纤维素用于酶固定化的方法难以同时兼顾酶活与稳定性的问题，本发明提出一种纳米纤维素/光固化树脂制备固定化酶的方法及制得的固定化酶，该方法是将纳米纤维素材料与紫外光固化技术的优势相结合，通过紫外光固化对酶进行原位包埋，其中纳米纤维素的羧基将利于酶的吸附，而光敏树脂在固化过程中形成的交联网络结构利于进一步提高酶的稳定性。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
一种纳米纤维素/水性光固化树脂材料制备固定化酶的方法，包括以下步骤：
(1)在纳米纤维素的水分散液中，依次加入酶粉、水性光敏树脂和光引发剂，通过磁力搅拌和超声处理混合均匀，获得光固化共混液，将该共混液避光保存；
(2)在紫外光照射下，对所述共混液进行固化，正反面各照射一次；
(3)光固化过程完成后，用蒸馏水反复洗涤，以除去未固定的游离酶、未反应的树脂及光引发剂，得到所述固定化酶。
进一步的，所述步骤(1)中的纳米纤维素的分子结构中带有羧基、羧甲基或磺酸基团；纳米纤维素在光固化共混液中的质量分数为0.5wt％～1.5wt％。所述纳米纤维素水分散液是经过TEMPO氧化法、羧甲基化法结合机械处理或酸水解法制备得到的。
进一步的，所述步骤(1)中的水性光敏树脂为水性聚乙二醇双丙烯酸酯、水性环氧丙烯酸酯类、水性聚氨酯丙烯酸酯类、水性聚酯丙烯酸酯类、水性硅烷基改性丙烯酸树脂或水性聚丙烯酸酯类中的一种或两种以上；水性光固化树脂在光固化共混液中的质量分数为10wt％～25wt％。
进一步的，所述步骤(1)中的光引发剂为苯乙酮衍生物、芳香酮类、甲基苯丙酮类、烷基苯酮、二芳基碘鎓盐、三芳基碘鎓盐或三芳基硫鎓盐中的一种或两种以上；光引发剂在光固化共混液中的质量分数为0.5wt％～1.0wt％。
进一步的，所述步骤(1)中的酶为脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、果胶酶或漆酶中的一种或两种以上；酶在光固化共混液中的质量分数为1.0wt％～2.5wt％。
进一步的，步骤(1)中搅拌时间5～30min；超声处理时间为5～20min。
进一步的，所述步骤(2)中的紫外光波长为200～400nm；固化的时间为20s～90s。
进一步的，得到固定化酶后再干燥得到固定化酶干凝胶，所述干燥为自然干燥、真空干燥或冷冻干燥。其中，自然干燥：在室温条件下干燥5～10天；真空干燥：在45℃真空干燥箱里干燥24h；冷冻干燥：先将水凝胶放入-20℃冰箱冷冻24h，然后放入-50℃冷冻干燥机中干燥48h。而且干燥后产品水分3.95％(自然干燥)、3.70％(真空干燥)和3.98％(冷冻干燥)。
由上述任意一种方法制得的固定化酶。
对于上述固定化酶，当固定的是脂肪酶时，可以用于己酸乙酯的催化合成；如固定的是淀粉酶，得到的固定化酶可用作果汁加工、糖浆制造中的淀粉分解，以提高过滤速度；如果固定化木聚糖酶可应用于纸浆漂白过程，清除部分再沉积下来的木聚糖，增大纸浆基质孔隙，使被困的可溶性木质素释放出来，同时也使得化学漂白剂能更有效地渗透进入到纸浆中，提高纸浆的漂白率，减少化学漂白剂的用量；固定化蛋白酶能催化蛋白质水解，生产小分子肽和氨基酸；固定化果胶酶应用在水果加工中，处理破碎果实，可加速果汁过滤，促进澄清等。也可应用在制浆造纸中，对树皮、麻类等果胶含量高的植物原料进行脱果胶处理；固定化漆酶漆酶能选择性地催化氧化某些多酚物质，并使其发生聚合，然后通过澄清工序去除，因此可用于葡萄酒的澄清处理，不引起葡萄酒其他感官性状的不良改变。
本发明相对于现有技术，具有以下优势：
(1)本发明利用TEMPO氧化法、羧甲基化法结合机械处理或酸水解法制备的纳米纤维素所带表面电荷——羧基、羧甲基或磺酸基酶蛋白氨基酸的静电吸附和偶联作用，有利于酶的吸附、负载和酶稳定性的提高，以及纳米纤维素本身对酶的亲和力和大的比表面积等特性，将有利于酶负载率的提高及传质阻力的降低；
(2)本发明利用光敏树脂在光照条件下发生的交联作用对酶进行固定化，对酶活损失小，能快速有效地将酶包埋于树脂材料内部，且酶不易泄露；
(3)本发明将纳米纤维素与光固化技术相结合，该方法一步集成静电吸附、光固化交联固定、原位包埋等多种优势，具有条件温和、快速、无溶剂排放及操作简单等优点；
(4)本发明制备得到的固定化酶水凝胶具有较高的酶负载率(86％～96％)，且具有较高的酶活力，依据酶在光固化体系中的质量分数及固定化条件不同，固定化酶的酶活力在 1012-2290U/g范围变化，最高达2290U/g。
(5)本发明制备的固定化酶具有良好的储存稳定性和操作稳定性，在储存20天后，剩余酶活约86％；在重复反应8次后，剩余酶活约75％，即仍保留了初始酶活的84.86％。
(6)将制备的固定化脂肪酶水凝胶、干凝胶应用于催化合成己酸乙酯中，己酸乙酯的首次转化率分别为76.33％、84.96％，重复催化5次后转化率仍分别高达72.94％、83.08％。
附图说明
图1实施例2的固定化酶的储存稳定性曲线图；
图2实施例2的固定化酶的重复操作性曲线图；
图3实施例6的固定化酶催化合成己酸乙酯的重复稳定性示意图；
图4实施例7的经自然干燥的固定化酶干凝胶催化合成己酸乙酯的重复稳定性示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实例，对本发明进行详细描述，但本发明的实施方案和保护范围不限于此。
实施例1
(1)光固化混合液的配制：依次在烧杯中加入纳米纤维素(0.5wt％)、南极假丝酵母脂肪酶(2.0wt％)、光固化树脂PEGDA(15wt％)及光引发剂Irgacure 2959(0.5wt％)，通过磁力搅拌20min和超声处理10min使其混合均匀，将获得的纳米纤维素/PEGDA/脂肪酶光固化共混液避光保存。
(2)以直径为4mm、厚度为2mm的硅胶板为模具，将一片透明的载玻片置于硅胶板背面，将纳米纤维素/PEGDA/脂肪酶光固化共混液注入到硅胶板液槽中，再用另一片透明载玻片覆盖液槽并压紧，放置于紫外固化机光源的正上方。通过计算机软件程序控制固化机的开关及固化时间，在波长范围200nm～400nm、光强9.5mw/cm2条件下，对光固化共混液进行固化，正反面各照射30s。
(3)将配制的光固化共混液一部分保存备用，一部分用来制备光固化样品，光固化完成后用蒸馏水反复洗涤，以除去水凝胶表面未固定的游离酶得到固定化酶水凝胶。将保存的光固化混合液和经过洗涤的固定化酶水凝胶样品放入-20℃冰箱内冷冻12h，然后放入-50℃冷冻干燥器中干燥48h。将干燥后的样品剪碎，利用元素分析测量样品N含量，根据公式得到固定化酶的负载率(wt％)。根据该方法得到固定化酶水凝胶的酶负载率为96.40％。
固定化酶的酶活力是根据吸光光度法，通过酶标仪进行测量。取1个固定化酶水凝胶样品(20mg)于1.5mL离心管中，加入930μL pH＝8的缓冲溶液，置于45℃，800r/min的恒温震荡仪中恒温5min，再取50μL底物对硝基苯酚于离心管中，继续在该条件下的恒温震荡仪中反应5min。反应完成后离心1min，转速为12000r/min，然后用移液枪取200μL上清液于 96孔板中，在405nm处测量其吸光度。取950μL pH＝8的缓冲溶液和50μL底物当作空白样 (空白样中没有加入固定化酶水凝胶，其他条件与前面相同)。定时取样检测，每个样品重复三次，结果取平均值。根据该方法测得固定化酶水凝胶的酶活力为1900U/g。
实施例2
(1)光固化混合液的配制：依次在烧杯中加入纳米纤维素(1.0wt％)、南极假丝酵母脂肪酶(2.0wt％)、光固化树脂PEGDA(15wt％)及光引发剂Irgacure 2959(0.5wt％)，通过磁力搅拌20min和超声处理10min使其混合均匀，将获得的纳米纤维素/PEGDA/脂肪酶光固化共混液避光保存。
(2)以直径为4mm、厚度为2mm的硅胶板为模具，将纳米纤维素/PEGDA/脂肪酶光固化共混液注入到硅胶板液槽中。通过计算机软件程序控制固化机的开关及固化时间，在波长范围200nm～400nm、光强9.5mw/cm2条件下，对光固化共混液进行固化，正反面各照射60s。光固化完成后用蒸馏水反复洗涤，以除去水凝胶表面未固定的游离酶得到固定化酶水凝胶。
(3)将固定化酶水凝胶储存于4℃冰箱中，每隔5天取出测酶活，观察相对酶活的变化；将固定化酶水凝胶重复测酶活力步骤，每次测完用pH＝8的PBS反复冲洗固定化酶，以除去表面残留的底物和酶，重复操作8次并记录酶活变化。
根据实施例1中酶负载率和酶活的测量方法得到实施例2中固定化酶的酶负载率为 95.89％，酶活力为1970U/g。通过储存稳定性(如图1所示)和重复使用性(如图2所示)的测试，实施例2中得到的固定化酶在4℃冰箱中储存20天后相对酶活为86.37％，在重复使用8次后仍保留了初始酶活的84.86％。
实施例3
(1)光固化混合液的配制：依次在烧杯中加入纳米纤维素(1.5wt％)、南极假丝酵母脂肪酶(2.0wt％)、光固化树脂PEGDA(15wt％)及光引发剂Irgacure 2959(0.5wt％)，通过磁力搅拌20min和超声处理15min使其混合均匀，将获得的纳米纤维素/PEGDA/脂肪酶光固化共混液避光保存。
(2)以直径为4mm、厚度为2mm的硅胶板为模具，将纳米纤维素/PEGDA/脂肪酶光固化共混液注入到硅胶板液槽中。通过计算机软件程序控制固化机的开关及固化时间，在波长范围200nm～400nm、、光强9.5mw/cm2条件下，对光固化共混液进行固化，正反面各照射90s。光固化完成后用蒸馏水反复洗涤，以除去水凝胶表面未固定的游离酶得到固定化酶。
根据实施例1中酶负载率和酶活的测量方法得到该实施例中的固定化酶的酶负载率为 86.56％，酶活力为2040U/g。
实施例4
(1)光固化混合液的配制：依次在烧杯中加入纳米纤维素(1.5wt％)、南极假丝酵母脂肪酶(2.0wt％)、光固化树脂PEGDA(10wt％)及光引发剂Irgacure 2959(0.5wt％)，通过磁力搅拌20min和超声处理10min使其混合均匀，将获得的纳米纤维素/PEGDA/脂肪酶光固化共混液避光保存。
(2)以直径为4mm、厚度为2mm的硅胶板为模具，将纳米纤维素/PEGDA/脂肪酶光固化共混液注入到硅胶板液槽中。通过计算机软件程序控制固化机的开关及固化时间，在波长范围200nm～400nm、光强9.5mw/cm2条件下，对光固化共混液进行固化，正反面各照射60s。光固化完成后用蒸馏水反复洗涤，以除去水凝胶表面未固定的游离酶得到固定化酶。
根据实施例1中酶负载率和酶活的测量方法得到该实施例中的固定化酶的酶负载率为 89.85％，酶活力为2290U/g。
实施例5
(1)光固化混合液的配制：依次在烧杯中加入纳米纤维素(1.5wt％)、南极假丝酵母脂肪酶(2.0wt％)、光固化树脂PEGDA(20wt％)及光引发剂Irgacure 2959(0.5wt％)，通过磁力搅拌20min和超声处理20min使其混合均匀，将获得的纳米纤维素/PEGDA/脂肪酶光固化共混液避光保存。
(2)以直径为4mm、厚度为2mm的硅胶板为模具，取一定量的纳米纤维素/PEGDA/脂肪酶光固化共混液注入到硅胶板液槽中。通过计算机软件程序控制固化机的开关及固化时间，在光强9.5mw/cm2条件下，对光固化共混液进行固化，正反面各照射60s。光固化完成后用蒸馏水反复洗涤，以除去水凝胶表面未固定的游离酶得到固定化酶。
根据实施例1中酶负载率和酶活的测量方法得到该实施例中的固定化酶的酶负载率为 95.56％，酶活力为1650U/g。
实施例6
(1)光固化混合液的配制：依次在烧杯中加入纳米纤维素(1.0wt％)、南极假丝酵母脂肪酶(2.0wt％)、光固化树脂PEGDA(25wt％)及光引发剂Irgacure 2959(0.5wt％)，通过磁力搅拌20min和超声处理10min使其混合均匀，将获得的纳米纤维素/PEGDA/脂肪酶光固化共混液避光保存。
(2)以直径为4mm、厚度为3mm的硅胶板为模具，将纳米纤维素/PEGDA/脂肪酶光固化共混液注入到硅胶板液槽中。通过计算机软件程序控制固化机的开关及固化时间，在波长范围200nm～400nm、光强9.5mw/cm2条件下，对光固化共混液进行固化，正反面各照射60s。光固化完成后用蒸馏水反复洗涤，以除去水凝胶表面未固定的游离酶得到固定化酶水凝胶。
(3)将固定化酶水凝胶储存于4℃冰箱中，每隔5天取出测酶活，观察相对酶活的变化；将固定化酶水凝胶重复测酶活力步骤，每次测完用pH＝8的PBS反复冲洗固定化酶，以除去表面残留的底物和酶，重复操作8次并记录酶活变化。
根据实施例1中酶负载率和酶活的测量方法得到实施例6中固定化酶的酶负载率为 90.05％，酶活力为1930U/g。
实施例7
(1)光固化混合液的配制：依次在烧杯中加入纳米纤维素(1.0wt％)、南极假丝酵母脂肪酶(1.0wt％)、光固化树脂PEGDA(15wt％)及光引发剂Irgacure 2959(0.5wt％)，通过磁力搅拌20min和超声处理10min使其混合均匀，将获得的纳米纤维素/PEGDA/脂肪酶光固化共混液避光保存。
(2)以直径为4mm、厚度为3mm的硅胶板为模具，将纳米纤维素/PEGDA/脂肪酶光固化共混液注入到硅胶板液槽中。通过计算机软件程序控制固化机的开关及固化时间，在波长范围200nm～400nm、光强9.5mw/cm2条件下，对光固化共混液进行固化，正反面各照射60s。光固化完成后用蒸馏水反复洗涤，以除去水凝胶表面未固定的游离酶得到固定化酶水凝胶。
(3)将固定化酶水凝胶储存于4℃冰箱中，每隔5天取出测酶活，观察相对酶活的变化；将固定化酶水凝胶重复测酶活力步骤，每次测完用pH＝8的PBS反复冲洗固定化酶，以除去表面残留的底物和酶，重复操作8次并记录酶活变化。
根据实施例1中酶负载率和酶活的测量方法得到实施例6中固定化酶的酶负载率为 89.6％，酶活力为1012U/g。
实施例8
(1)光固化混合液的配制：依次在烧杯中加入纳米纤维素(1.0wt％)、南极假丝酵母脂肪酶(2.5wt％)、光固化树脂PEGDA(15wt％)及光引发剂Irgacure 2959(0.5wt％)，通过磁力搅拌20min和超声处理10min使其混合均匀，将获得的纳米纤维素/PEGDA/脂肪酶光固化共混液避光保存。
(2)以直径为4mm、厚度为3mm的硅胶板为模具，将纳米纤维素/PEGDA/脂肪酶光固化共混液注入到硅胶板液槽中。通过计算机软件程序控制固化机的开关及固化时间，在波长范围200nm～400nm、光强9.5mw/cm2条件下，对光固化共混液进行固化，正反面各照射60s。光固化完成后用蒸馏水反复洗涤，以除去水凝胶表面未固定的游离酶得到固定化酶水凝胶。
(3)将固定化酶水凝胶储存于4℃冰箱中，每隔5天取出测酶活，观察相对酶活的变化；将固定化酶水凝胶重复测酶活力步骤，每次测完用pH＝8的PBS反复冲洗固定化酶，以除去表面残留的底物和酶，重复操作8次并记录酶活变化。
根据实施例1中酶负载率和酶活的测量方法得到实施例6中固定化酶的酶负载率为 95.35％，酶活力为1690U/g。
实施例9
(1)按实施例2中所示方法制备固定化酶水凝胶，将其应用于催化合成己酸乙酯中，具体方法如下：取一定量的正庚烷溶剂于50mL锥形瓶中，反应体系共10mL，依次加入5.0g 固定化酶和0.80mol/L己酸，再将锥形瓶放入55℃摇床中恒温10min，加入乙醇，使乙醇初始浓度为0.88mol/L，随后置于55±0.1℃，200r/min的恒温摇床中进行反应。相同条件下不加固定化酶，只加底物和溶剂的反应液作为空白样。定时取样检测，每个样品重复三次，结果取平均值。重复操作5个批次，其中每个批次完成后用正庚烷溶剂反复冲洗，晾干后再进行下一个批次的操作。
(2)定时取100μL反应液上清液于25mL烧杯中，滴几滴酚酞，用5mmol/L标准氢氧化钠进行滴定，计算滴定终点所消耗的氢氧化钠体积，记为Vt，空白组消耗的氢氧化钠体积记为 V0，根据己酸的消耗量，由公式计算得到己酸乙酯的转化率(％)。结果显示(图3)，首次转化率为76.33％，固定化酶经5次重复使用转化率仍高达72.94％。
将实施列2得到的固定化脂肪酶水凝胶，在室温(25℃，相对湿度65％)条件下干燥5 天，得到固定化酶干凝胶，按照实施例6的方法对固定化脂肪酶干凝胶催化合成己酸乙酯的重复性进行测定，结果显示(图4)经自然干燥的固定化脂肪酶干凝胶催化合成己酸乙酯的首次转化率为84.96％，重复催化5次后，固定化脂肪酶干凝胶催化合成己酸乙酯的转化率为 83.08％，与首次转化率相比，仅下降1.86％。与未干燥的固定化酶水凝胶相比，由于水分的去除，消除了水对催化反应的不利影响，因此固定化酶干凝胶的催化效率显著提高(由76.33％提高到84.96％)。此外干凝胶解决了水凝胶在储存过程的酶稳定性下降问题，同时有利于长期储存和运输。
表1固定化酶水凝胶的酶负载率和酶活力
表1数据显示，随着纳米纤维素(CNF)用量增加，固定化酶的酶负载率降低，但酶活力提高。随着PEGDA用量由10％增加到15％，固定化酶的酶负载率由89.85％提高至95.89％，酶活力由2290U/g降低至1970U/g；进一步增加PEGDA用量到25％，负载率下降到90.05％，而且酶活力也降低到1530U/g。随着脂肪酶用量由1.0％增加到2.0％增加，酶负载率由89.06％提高到95.89％，酶活力由1012U/g增加到1970U/g；进一步提高脂肪酶用量到2.5％，酶负载率为95.35％，而酶活力降至1690U/g。说明给酶量过高，脂肪酶容易大量聚集，造成孔隙通道的堵塞，脂肪酶活力反而下降。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限定。凡本领域的技术人员利用本发明的技术方案对上述实施例作出的任何等同的变动、修饰或演变等，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种纳米纤维素/光固化树脂制备固定化酶的方法，其特征在于，包含如下步骤：
（1）在纳米纤维素的水分散液中，依次加入酶粉、水性光敏树脂和光引发剂，通过磁力搅拌和超声处理混合均匀，获得光固化共混液，将该共混液避光保存；
（2）在紫外光照射下，对所述共混液进行固化，正反面各照射一次；
（3）光固化过程完成后，用蒸馏水反复洗涤，以除去未固定的游离酶、未反应的树脂及光引发剂，得到所述固定化酶。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤（1）中的纳米纤维素的官能团为羧基、羧甲基或磺酸基，纳米纤维素在光固化共混液中的质量分数为0.5wt%~1.5wt%。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤（1）中的水性光敏树脂为水性聚乙二醇双丙烯酸酯、水性环氧丙烯酸酯类、水性聚氨酯丙烯酸酯类、水性聚酯丙烯酸酯类、水性硅烷基改性丙烯酸树脂或水性聚丙烯酸酯类中的一种或两种以上；水性光固化树脂在光固化共混液中的质量分数为10wt%~25wt%。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤（1）中的光引发剂为苯乙酮衍生物、芳香酮类、甲基苯丙酮类、烷基苯酮、二芳基碘鎓盐、三芳基碘鎓盐或三芳基硫鎓盐中的一种或两种以上；光引发剂在光固化共混液中的质量分数为0.5wt%~1.0wt%。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤（1）中的酶为脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、果胶酶或漆酶中的一种或两种以上；酶在光固化共混液中的质量分数为1.0wt%~2.5wt%。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（1）中搅拌时间5~30min；超声处理时间为5~20min。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤（2）中的紫外光波长为200~400nm；固化的时间为20s~90s。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，得到固定化酶后再干燥得到固定化酶干凝胶，所述干燥为自然干燥、真空干燥或冷冻干燥；其中，自然干燥：在室温下干燥5~10天。
9.权利要求1-8任一项所述方法制得的固定化酶。
10.权利要求9所述固定化酶在催化合成己酸乙酯的应用，其特征在于，固定的酶为脂肪酶。
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