CN111534506A - 一种离子液体再生纤维素固定化酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及酶的固定化技术领域，尤其涉及一种离子液体再生纤维素固定化酶的制备方法。其包括以下步骤：以离子液体作为溶剂、溶解纤维素以制成离子液体再生纤维素微球载体；通过高碘酸钠对微球载体进行改性；通过还原型谷胱甘肽对酶进行激活处理；最后将酶和微球载体混合负载，得到固定化酶。通过本发明的制备方式能够有效提高酶的固定化率和酶活。
Description
技术领域
本发明涉及酶的固定化技术领域，尤其涉及一种离子液体再生纤维素固定化酶的制备方法。
背景技术
γ-氨基丁酸（GABA）是一种天然存在的功能性氨基酸，具有治疗高血压、癫痫和帕金森病，防止动脉硬化、调节心律失常、镇痛、抗皮肤衰老等功能，在医疗、保健上有非常重要的价值。生物体内的GABA大多由谷氨酸脱羧酶（GAD）催化谷氨酸脱羧产生，其辅酶是5-磷酸吡哆醛。作为药品或保健品原理的GABA制备方法主要有化学合成法、分离提取法和生物合成法3种，生物合成法成为主流技术。生物合成法是利用固定化谷氨酸脱羧酶（IGAD）转化谷氨酸得到GABA。
酶的固定化是将酶束缚在载体材料上，使其与整体相分隔，但仍能与底物反应，这种固定化酶不但具有酶的专一性、高效性等特性，且具有可回收、反复使用等优点，使用寿命和存储寿命都比游离酶长。载体材料作为固定化酶的一个重要部分，其自身的结构和性能对固定化酶的各种性能有及其重大的影响，目前常用的固定化载体大多为水凝胶、碳纤维、纤维素等。其中，纤维素是自然界分布最广、含量最高的一种有机资源，用天然纤维素制得的制品可生物降解，符合现代环保、绿色化学和可持续发展的要求。但是纤维素大分子为无支链直线分子，分子链及分子内存在大量的氢键，由于氢键的大量存在及结晶区和非晶区共存的复杂形态结构，天然纤维素具有不熔化和大多数溶剂不溶解的问题，成为天然纤维素应用的最大局限。
离子液体又称低温熔融盐，在室温或接近室温下呈现液态，是完全由阴阳离子所组成的盐。它一般由有机阳离子和无机阴离子组成，常见的阳离子有季鏻盐离子、季铵盐离子、吡咯盐离子和咪唑盐离子等，阴离子有卤素离子、六氟磷酸根离子、四氟硼酸根离子等。离子液体具有无毒性、良好的溶解性、不挥发、较好的热稳定性、较宽的液态温度区、不易燃和可重复利用等优点，可替代传统的易挥发、易污染的溶剂。离子液体可作为纤维素的溶解，为生物活性大分子的固定化提供了基殿。
公开号为CN103667243A的专利文件公开了这样一种用离子液体和修饰剂处理后的秸秆制备纤维素酶固定化载体的方法，包括如下步骤：秸秆的预处理、秸秆的修饰以及载体干燥成型。该申请采用离子液体和修饰剂修饰秸秆得到的纤维素材料来制备酶固定化载体，其存在载体上吸附的酶容易脱落、固定化酶稳定性和活性不高的问题。
发明内容
本发明要解决上述问题，提供一种离子液体再生纤维素固定化酶的制备方法。
本发明解决问题的技术方案是，提供一种离子液体再生纤维素固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
（1）载体制备：将纤维素溶解于离子液体中，得到离子液体/纤维素混合溶液；然后将离子液体/纤维素混合溶液用注射器滴加至去离子水中，使得离子液体/纤维素混合溶液再生成小球；将小球用去离子水冲洗后自然晾干，得到微球载体；
（2）载体改性：将所述微球载体加入到高碘酸钠溶液中，改性结束后取出微球载体，直接冷冻冻干，得到高碘酸钠改性的微球载体；
（3）酶处理：于酶液中加入还原型谷胱甘肽，并使得还原型谷胱甘肽的浓度为0.3~0.8mg/mL，得到活性处理后的酶液；
（4）载酶：将改性的微球载体加入到活性处理后的酶液中，密封、并置于25~30℃水浴震荡12~16h，然后取出微球载体、并用去离子冲洗，冷冻冻干得到固定化酶。
本申请步骤（2）中，采用高碘酸钠对微球载体进行改性，高碘酸钠的氧化作用能够使得纤维素的连二醇基断裂产生醛基（-CHO），醛基可与酶分子中的氨基（-NH2）以共价键形式结合，从而能够提高固定化酶酶活性。同时，步骤（2）中，改性结束后的微球载体不经过去离子水清洗、直接冻干，这就使得部分高碘酸钠附着在微球载体上，为后续步骤做准备。
凡能增强酶的活性、加快酶促反应速度的物质，称为激活剂。激活剂种类很多，有①无机阳离子，如钠离子、钾离子、铜离子、钙离子等；②无机阴离子，如氯离子、溴离子、碘离子、硫酸盐离子磷酸盐离子等；③有机化合物，如维生素C、半胱氨酸、还原性谷胱甘肽等。本申请步骤（3）中，采用还原形谷胱甘肽作为酶刺激剂，能够激发酶的活性。
本申请步骤（4）中，将含有高碘酸钠的微球载体加入到含有还原性谷胱甘肽的酶液中，还原性谷胱甘肽的结构中含有一个活泼的巯基-SH，易被氧化脱氢；高碘酸钠可以将硫化物选择性地氧化成亚砜，在高温或加入过量的高碘酸钠的情况下，会将硫化物氧化为砜。因此在高碘酸钠的选择性氧化作用下，巯基被氧化为亚砜基甚至砜基，亚砜基和砜基均具有很强的吸电子性，而纤维素中具有供电子基团-OH，酶中具有供电子基-NH2。因此发生氧化后的谷胱甘肽成为中间连接结构，通过吸电子基团分别与纤维素供电子基团和酶的供电子基团结合，这就使得酶被牢牢地负载在微球载体上，从而有效提高固定化的稳定性和酶活性。
随着高碘酸钠浓度的不断增加，纤维素断裂的连二醇基增多，产生的醛基也会增加，同时固定化酶酶活也随之提高；但高碘酸钠的浓度也不是越高越好，其有一定的饱和值，达到饱和值时固定化酶活力达到最大值。因此作为本发明的优选，步骤（2）中，采用浓度为0.5~1mol/L的高碘酸钠。
作为本发明的优选，步骤（2）中，微球载体和高碘酸钠的投加比例为1g：（0.05~0.1）mol。
作为本发明的优选，步骤（2）中，微球载体加入到高碘酸钠溶液中反应90~120min。
初始酶的浓度对酶活也有一定的影响，较大的初始酶浓度会导致酶分子质检的位阻增大，酶之间的竞争剧烈，从而导致酶的固载率较少，表现出固定化酶活下降，因此作为本发明的优选，步骤（3）中，所述酶液的浓度为4~7mg/mL。
作为本发明的优选，步骤（4）中，酶和微球载体的混合质量比为（0.25~0.3）：1。
作为本发明的优选，冷冻冻干条件均为：以液氮于-85℃~-75℃下冷冻干燥18~24h。
作为本发明的优选，步骤（1）中，纤维素和离子液体的投加质量比为（10~15）：100。
作为本发明的优选，步骤（1）中，将纤维素溶解于离子液体中，置于100~120℃下磁力搅拌溶解5~7h后静置12~16h，得到离子液体/纤维素混合溶液。
作为本发明的优选，所述离子液体选用[BMIM]Cl、[C4MIM]Cl中的一种。
本发明的有益效果：
1.本申请通过离子液体预处理后的再生纤维素作为固定酶载体，具有易回收、易生物降解、绿色环保的优点。
2.本申请通过高碘酸钠修饰载体，能够有效提高酶负载于载体的负载率以及酶活。
3.本申请通过还原性谷胱甘肽刺激酶活性，进一步提高酶活。
4.本申请通过高碘酸钠能够将硫化物氧化为亚砜的特性，得到吸电子基团，通过与供电子基团的结合从而将酶稳定地负载在载体上，使得固定化酶不易脱落。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施方式，并对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
一种离子液体再生纤维素固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
（1）载体制备：将1.2g微晶纤维素溶解于10g [BMIM]Cl离子液体中，置于110℃下磁力搅拌溶解6h后静置15h，得到离子液体/纤维素混合溶液。然后将离子液体/纤维素混合溶液用注射器滴加至去离子水中，使得离子液体/纤维素混合溶液再生成小球；将小球浸泡在去离子水中48h，期间多次换水，然后用去离子水冲洗后自然晾干，得到微球载体。
（2）载体改性：将上述得到的微球载体取0.5g加入到 50mL浓度为0.8mol/L高碘酸钠溶液中，置于32℃恒温下反应100min。改性结束后取出微球载体，直接以液氮于-80℃下冷冻干燥20h，得到高碘酸钠改性的微球载体。
（3）酶处理：选用木瓜蛋白酶，将其配置成浓度为5mg/mL酶液，取 10mL的酶液，并向其中加入5mg还原型谷胱甘肽，搅拌均匀，得到活性处理后的酶液。
（4）载酶：取0.18g改性的微球载体加入到上述10mL活性处理后的酶液中，密封、并置于28℃水浴震荡5h，然后取出微球载体、并用去离子冲洗，以液氮于-80℃下冷冻干燥20h，得到固定化酶。
木瓜蛋白酶酶活测定：
制定标准曲线：准备7支试管，分别加入不同浓度的酪氨酸溶液。然后分别加入1%酪蛋白溶液1mL，于40℃水浴中保温15min，取出后，加入0.4mol/L三氯醋酸3mL，充分摇匀后过滤。分别吸取滤液1mL，与5mL的0.4mol/L NaCO3、1mL福林试剂于另一试管中混合，充分摇匀，于40℃水浴中保温15min，然后于每管中各加入3mL蒸馏水，充分摇匀。用721型分光光度计，在680nm处测定。以测定值为纵坐标、酪氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线。
取1mL、1%酪蛋白溶液、0.1g固定化酶混合于40℃水浴中保温15min后，加入3mL0.4mol/L的三氯醋酸溶液，停止酶作用。过滤除去沉淀的蛋白后，取1mL滤液与5mL的0.4mol/L NaCO3、1mL福林试剂混合，在40℃水浴保温15min显色，在680nm处测定其吸光值。定义1min内转化1微摩尔底物所需的酶量为一个活力单位（U），根据标准曲线计算得到酶活见下表1。
负载率计算：
将步骤（4）中取出微球载体后剩余的酶液、以及对微球载体的冲洗液混合，测定其中酶含量。负载率=（原酶含量-测定酶含量）/原酶含量，计算得到的负载率结果见下表1。
实施例2
一种离子液体再生纤维素固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
（1）载体制备：将1g纤维素溶解于10g [C4MIM]Cl离子液体中，置于100℃下磁力搅拌溶解5h后静置12h，得到离子液体/纤维素混合溶液。然后将离子液体/纤维素混合溶液用注射器滴加至去离子水中，使得离子液体/纤维素混合溶液再生成小球；将小球浸泡在去离子水中48h，期间多次换水，然后用去离子水冲洗后自然晾干，得到微球载体。
（2）载体改性：将上述得到的微球载体取0.5g加入到50mL浓度为0.5mol/L高碘酸钠溶液中，置于30℃恒温下反应90min。改性结束后取出微球载体，直接以液氮于-85℃下冷冻干燥18h，得到高碘酸钠改性的微球载体。
（3）酶处理：选用谷氨酸脱羧酶，将其配置成浓度为4mg/mL酶液，取10mL的酶液，并向其中加入3mg还原型谷胱甘肽，使得还原型谷胱甘肽的质量浓度为0.8%，得到活性处理后的酶液。
（4）载酶：取0.16g改性的微球载体加入到上述10mL活性处理后的酶液中，密封、并置于25℃水浴震荡12h，然后取出微球载体、并用去离子冲洗，以液氮于-85℃下冷冻干燥18h，得到固定化酶。
谷氨酸脱羧酶酶活测定：
制定标准曲线：准备7支试管，分别加入不同浓度的氨基丁酸溶液。然后分别加入1%谷氨酸溶液1mL，于40℃水浴保温20min，然后置于冰浴中，用硼酸缓冲溶液稀释一定倍数后，加入2mL、0.2mol/L、pH为9.0的硼酸缓冲液，再加入1mL6.0%苯酚和4.0mL次氯酸钠溶液，充分震荡后，于沸水浴中反应10min，迅速放于冰浴中冷却5min，在640nm处测定其吸光值，以测定值为纵坐标、氨基丁酸含量为横坐标，绘制标准曲线。
取1mL、1%谷氨酸溶液、0.1g固定化酶混合，在40℃反应20min，然后置于冰浴中终止酶反应，用硼酸缓冲溶液稀释一定倍数后，加入2mL、0.2mol/L、pH为9.0的硼酸缓冲液，再加入1mL6.0%苯酚和4.0mL次氯酸钠溶液，充分震荡后，于沸水浴中保温10min，迅速放于冰浴中冷却5min，在640nm处测定其吸光值，定义1min内转化1微摩尔底物所需的酶量为一个活力单位（U），通过标准溶液曲线计算的酶活见下表1。
以实施例1中的负载率计算方式计算负载率，结果见下表1。
实施例3
一种离子液体再生纤维素固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
（1）载体制备：将1.5g纤维素溶解于10g[BMIM]Cl离子液体中，置于120℃下磁力搅拌溶解7h后静置16h，得到离子液体/纤维素混合溶液。然后将离子液体/纤维素混合溶液用注射器滴加至去离子水中，使得离子液体/纤维素混合溶液再生成小球；将小球浸泡在去离子水中48h，期间多次换水，然后用去离子水冲洗后自然晾干，得到微球载体。
（2）载体改性：将上述得到的微球载体取0.5g加入到 50mL浓度为1mol/L高碘酸钠溶液中，置于35℃恒温下反应120min。改性结束后取出微球载体，直接以液氮于-75℃下冷冻干燥24h，得到高碘酸钠改性的微球载体。
（3）酶处理：选用木瓜蛋白酶，将其配置成浓度为7mg/mL酶液，取10mL的酶液，并向其中加入8mg还原型谷胱甘肽，使得还原型谷胱甘肽的质量浓度为1%，搅拌均匀，得到活性处理后的酶液。
（4）载酶：取0.233g微球载体加入到上述10mL活性处理后的酶液中，密封、并置于30℃水浴震荡16h，然后取出微球载体、并用去离子冲洗，以液氮于-75℃下冷冻干燥24h，得到固定化酶。
以实施例1中的方式进行木瓜蛋白酶酶活测定，测定结果见下表1。
以实施例1中的负载率计算方式计算负载率，结果见下表1。
实施例4
一种离子液体再生纤维素固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
（1）载体制备：将1.1g纤维素溶解于10g [C4MIM]Cl离子液体中，置于115℃下磁力搅拌溶解5.5h后静置13h，得到离子液体/纤维素混合溶液。然后将离子液体/纤维素混合溶液用注射器滴加至去离子水中，使得离子液体/纤维素混合溶液再生成小球；将小球浸泡在去离子水中48h，期间多次换水，然后用去离子水冲洗后自然晾干，得到微球载体。
（2）载体改性：将上述得到的微球载体取0.5g加入到50mL浓度为1mol/L高碘酸钠溶液中，置于30℃恒温下反应100min。改性结束后取出微球载体，直接以液氮于-75℃下冷冻干燥22h，得到高碘酸钠改性的微球载体。
（3）酶处理：选用谷氨酸脱羧酶，将其配置成浓度为6mg/mL酶液，取10mL的酶液，并向其中加入6mg还原型谷胱甘肽，搅拌均匀，得到活性处理后的酶液。
（4）载酶：取0.2g改性的微球载体加入到上述10mL活性处理后的酶液中，密封、并置于29℃水浴震荡14h，然后取出微球载体、并用去离子冲洗，以液氮于-80℃下冷冻干燥23h，得到固定化酶。
以实施例2中的方式进行谷氨酸脱羧酶酶活测定，测定结果见下表1。
以实施例1中的负载率计算方式计算负载率，结果见下表1。
对比例1
对比例中，固定化酶的制备方法包括以下步骤：
（1）选取实施例1中得到的高碘酸钠改性的微球载体，取0.18g。
（2）选用木瓜蛋白酶，将其配置成浓度为5mg/mL酶液，取10mL的酶液。
（3）载酶：取微球载体加入到上述10mL酶液中，密封、并置于28℃水浴震荡5h，然后取出微球载体、并用去离子冲洗，以液氮于-80℃下冷冻干燥20h，得到固定化酶。
以实施例1中的方式进行木瓜蛋白酶酶活测定，测定结果见下表1。
以实施例1中的负载率计算方式计算负载率，结果见下表1。
表1.
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
Claims (10)
1.一种离子液体再生纤维素固定化酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
载体制备：将纤维素溶解于离子液体中，得到离子液体/纤维素混合溶液；然后将离子液体/纤维素混合溶液用注射器滴加至去离子水中，使得离子液体/纤维素混合溶液再生成小球；将小球用去离子水冲洗后自然晾干，得到微球载体；
载体改性：将所述微球载体加入到高碘酸钠溶液中，改性结束后取出微球载体，直接冷冻冻干，得到高碘酸钠改性的微球载体；
酶处理：于酶液中加入还原型谷胱甘肽，并使得还原型谷胱甘肽的浓度为0.3~0.8mg/mL，得到活性处理后的酶液；
载酶：将改性的微球载体加入到活性处理后的酶液中，密封、并置于25~30℃水浴震荡12~16h，然后取出微球载体、并用去离子冲洗，冷冻冻干得到固定化酶。
2.根据权利要求1所述的一种离子液体再生纤维素固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，采用浓度为0.5~1mol/L的高碘酸钠溶液。
3.根据权利要求1所述的一种离子液体再生纤维素固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，微球载体和高碘酸钠的投加比例为1g：（0.05~0.1）mol。
4.根据权利要求1所述的一种离子液体再生纤维素固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，微球载体加入到高碘酸钠溶液中反应90~120min。
5.根据权利要求1所述的一种离子液体再生纤维素固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述酶液的浓度为4~7mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种离子液体再生纤维素固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，酶和微球载体的混合质量比为（0.25~0.3）：1。
7.根据权利要求1所述的一种离子液体再生纤维素固定化酶的制备方法，其特征在于：冷冻冻干条件均为：以液氮于-85℃~-75℃下冷冻干燥18~24h。
8.根据权利要求1所述的一种离子液体再生纤维素固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，纤维素和离子液体的投加质量比为（10~15）：100。
9.根据权利要求1所述的一种离子液体再生纤维素固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，将纤维素溶解于离子液体中，置于100~120℃下磁力搅拌溶解5~7h后静置12~16h，得到离子液体/纤维素混合溶液。
10.根据权利要求1所述的一种离子液体再生纤维素固定化酶的制备方法，其特征在于：所述离子液体选用[BMIM]Cl、[C4MIM]Cl中的一种。
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Application publication date: 20200814 Assignee: Fuzhou Yinuowei Biological Technology Co.,Ltd. Assignor: Fuzhou Sanheyuan Biotechnology Co.,Ltd. Contract record no.: X2024980002954 Denomination of invention: A Preparation Method for Immobilizing Cellulose Enzymes through Ionic Liquid Regeneration Granted publication date: 20230825 License type: Common License Record date: 20240401 |
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