CN114540332B - 一种尿酸酶固定化树脂的制备方法及其应用 - Google Patents

一种尿酸酶固定化树脂的制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114540332B
CN114540332B CN202210194087.5A CN202210194087A CN114540332B CN 114540332 B CN114540332 B CN 114540332B CN 202210194087 A CN202210194087 A CN 202210194087A CN 114540332 B CN114540332 B CN 114540332B
Authority
CN
China
Prior art keywords
uricase
solution
reaction
resin particles
temperature
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210194087.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114540332A (zh
Inventor
顾凌巍
陆雪峰
陈情忠
王蕾
丁小燕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Qirui Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Jiangsu Qirui Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Qirui Biotechnology Co ltd filed Critical Jiangsu Qirui Biotechnology Co ltd
Priority to CN202210194087.5A priority Critical patent/CN114540332B/zh
Publication of CN114540332A publication Critical patent/CN114540332A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114540332B publication Critical patent/CN114540332B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/3679—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits by absorption
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/3687—Chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12N9/0048—Uricase (1.7.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
    • C12Y107/03—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12Y107/03003—Factor-independent urate hydroxylase (1.7.3.3), i.e. uricase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M2207/00—Methods of manufacture, assembly or production

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一种尿酸酶固定化树脂的制备方法，主要步骤可分为：(1)尿酸酶铜离子Cu2+置换为锌离子Zn2+；(2)树脂颗粒氨基化；(3)右旋糖酐修饰尿酸酶；(4)氨基化树脂颗粒与尿酸酶表面的右旋糖酐二醛连接；(5)壳聚糖包裹成品树脂。本发明提供的尿酸酶固定化树脂，通过对尿酸酶进行修饰优化，增加尿酸酶的稳定性，使尿酸酶能够耐受较为剧烈的反应环境，将优化后的尿酸酶表面基团与氨基化的聚苯乙烯树脂颗粒通过右旋糖酐二醛进行交联结合，来达到尿酸酶的固定化，再用壳聚糖包裹固定化酶的树脂颗粒，使酶空间结构进一步稳定，耐受辐照灭菌，在常规剂量辐照灭菌后，壳聚糖分子链断裂，降解脱落。

Description

一种尿酸酶固定化树脂的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于酶固定技术领域，具体涉及一种尿酸酶固定化树脂的制备方法及其应用。
背景技术
酶是一种具有催化活性和高度选择性的生物大分子。相比于传统的化学催化剂，酶催化具有高效性、底物专一性、反应条件温和等优点，被广泛应用于生物医药产品的合成、环境监测、食品加工和生物传感器等领域。然而，大多数酶中蛋白质的高级结构部分，在强酸、强碱、高温、有机溶剂的环境中极不稳定，游离酶在这些反应条件下易失活，这极大地限制了酶的实际应用范围。此外，酶在水溶液中的活性虽然很高，但是溶解酶不易从反应体系中分离出来，这导致其重复利用性能很差，使用寿命较短。为了克服上述酶在实际应用中的局限性，将酶束缚于水不溶性的载体上或一定的空间内，限制游离酶的自由流动，并能使酶发挥催化作用，且在反应结束后能轻易地将酶与底物、产物分开，进而重复使用，选择性能优良的载体材料并设计出合理有效的固定化方法适用于特定领域已成为当今固定化酶领域的主要研究内容。
血液灌流是将患者的血液引入装有固态吸附剂的灌流器中，通过吸附作用，清除血液中透析不能清除的外源性或内源性毒素、药物或代谢废物的一种血液净化技术。主要用于抢救药物和毒物中毒，也可与血液透析合用以清除慢性肾功能衰竭维持性透析患者体内的大分子毒素。
由于内部填充的固态吸附剂材质均为聚苯乙烯树脂或活性炭，目前大多依赖于供应商的直接供应，使用者的自主研发较少，吸附剂所能吸附的物质类型有限，被吸附的物质分子量不能较为准确的控制，使得血液灌流器大多为非特异性吸附。血液灌流器在临床的使用过程中，经常会发生将某些致病物质有效吸附的同时，把分子量大小近似的其余体液成分也一并吸附的情况。这样会导致人体有益体液成分的丢失，引起一些潜在的健康风险。
目前有部分使用者对固态吸附剂做出了不同程度的修饰和再加工，但由于血液灌流器属于三类医疗器械，灭菌后一次性使用，处理后的吸附剂在剧烈的灭菌环境下难以稳定的保持其吸附性能，同时修饰后的吸附剂经过灭菌及长期储存后，修饰的化学结构会发生不同程度的破坏，从而影响吸附性能，达不到最初的吸附效果。且树脂本身的基础结构并没有发生根本的变化，非特异性吸附的问题没有得到很好的解决。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种尿酸酶固定化树脂的制备方法，增加尿酸酶的稳定性，使尿酸酶能够耐受较为剧烈的反应环境，同时提升其活力，使其更大的发挥催化效能。本发明的另一目的在于将上述尿酸酶固定化树脂作为填料装柱，组装成能特异性分解尿酸的血液灌流器。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种尿酸酶固定化树脂的制备方法，包括以下步骤：
(1)在室温下将纯化的重组尿酸酶配置成的酶溶液，继续加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液、EDTA溶液，振荡混匀30-60min，接着通过分子筛层析将EDTA-Cu2+螯合物从反应液中除去，得到不含Cu2+的尿酸酶液，随后加入硫酸锌溶液，进行恒温振荡，分离纯化得到Zn2+置换后的尿酸酶；
(2)将聚苯乙烯树脂颗粒分散于水中，随后加入浓硝酸和浓硫酸，在45-50℃下反应10-14h，反应完成后进行离心、洗涤，将固体颗粒加入氢氧化钠溶液中，继续加入连二亚硫酸钠粉末，进行恒温反应，反应完成后进行离心、洗涤，得到氨基化聚苯乙烯树脂颗粒；
(3)将5g右旋糖酐溶于50mL蒸馏水中，随后加入5mL质量浓度为12％的高碘酸钠溶液，于4℃恒温避光反应8-10h，反应完成后继续滴加5mL质量浓度为5％亚硫酸氢钠溶液，随后用蒸馏水透析反应液8-12h，接着用聚乙二醇反透析，将体积浓缩至40ml，得到右旋糖酐二醛溶液；接着加入0.1mmol/L的碳酸钠缓冲液100ml和步骤(1)所得Zn2+置换后的尿酸酶，进行恒温反应，得到混合溶液；
(4)在步骤(3)所得混合溶液中加入步骤(2)所得氨基化聚苯乙烯树脂颗粒，进行恒温水浴反应，反应完成后，将树脂颗粒滤出、洗涤，4℃晾干，得到尿酸酶/聚苯乙烯树脂颗粒；
(5)将壳聚糖溶于体积分数2％的醋酸溶液中，配制成质量分数为3％的壳聚糖溶液，静置4-6h脱泡，随后加入步骤(4)所得尿酸酶/聚苯乙烯树脂颗粒，充分摇匀后抽滤，于4℃下晾干3-6h，接着浸入质量分数2％的氢氧化钠溶液中，洗涤至中性，4℃自然干燥，即得所述尿酸酶固定化树脂。
优选的，所述步骤(1)中酶溶液的质量浓度为2-4g/L，EDTA溶液的浓度为8-12mmol/L，硫酸锌溶液的浓度为8-12mmol/L；所述酶溶液、磷酸盐缓冲液、EDTA溶液、硫酸锌溶液的体积比为1：3：2-3：6-8。
优选的，所述步骤(1)中恒温振荡温度为20-25℃，反应时间为1-2h。
优选的，所述步骤(2)中聚苯乙烯树脂颗粒、浓硝酸、浓硫酸和连二亚硫酸钠的质量比为7：3-5：1-3：0.4-0.6。
优选的，所述步骤(2)中恒温反应温度为70-80℃，反应时间为2-6h。
优选的，所述步骤(3)中右旋糖酐二醛溶液、Zn2+置换后的尿酸酶的体积比为4：5-7；恒温反应条件为：4-6℃下避光反应20-24h。
优选的，所述步骤(4)中混合溶液、氨基化聚苯乙烯树脂颗粒质量体积比为90mL：70-90g；恒温水浴反应温度为25-35℃，反应时间为1-2h。
优选的，所述步骤(5)中壳聚糖、尿酸酶/聚苯乙烯树脂颗粒的质量比为3-9：70。
本发明还保护一种利用上述制备方法制备得到的尿酸酶固定化树脂。
本发明还保护一种上述尿酸酶固定化树脂在血液灌流器中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
(1)本发明提供的尿酸酶固定化树脂，通过将重组尿酸酶进行修饰优化，增加尿酸酶的稳定性，使尿酸酶能够耐受较为剧烈的反应环境。同时提升其活力，使其更大的发挥催化效能。将优化后的尿酸酶表面基团与氨基化的聚苯乙烯树脂颗粒通过右旋糖酐二醛进行交联结合，来达到尿酸酶的固定化。再用壳聚糖包裹固定化酶的树脂颗粒，使酶空间结构进一步稳定，耐受辐照灭菌，在常规剂量辐照灭菌后，壳聚糖分子链断裂，降解脱落。
(2)本发明提供的尿酸酶固定化树脂，将重组尿酸酶中所含的铜离子置换为锌离子，酶活性更高，生物相容性更好；以浓HNO3/浓H2SO4混合酸为硝化试剂，对聚苯乙烯进行硝化，生成聚对硝基苯乙烯，然后通过强还原剂连二亚硫酸钠，将聚对硝基苯乙烯还原为聚对氨基苯乙烯，从而使聚苯乙烯树脂颗粒的表面连接上氨基，为下一步氨基与右旋糖酐二醛反应做准备；接着把右旋糖酐氧化为右旋糖酐二醛，尿酸酶表面的一个氨基与右旋糖酐二醛的一个醛基反应；然后将氨基化聚苯乙烯树脂颗粒表面的氨基与右旋糖酐二醛的另一个醛基反应，这样通过右旋糖酐二醛作为桥梁，把尿酸酶和聚苯乙烯树脂颗粒连接起来；最后把壳聚糖凝固包膜在上述固定了尿酸酶的树脂颗粒表面，使其结构稳定耐受辐照灭菌。
(3)本发明提供的尿酸酶固定化树脂作为血液灌流器的填料装柱，与传统一与次性使用血液灌流器填料相比，本发明填料树脂单纯作用于血液中的尿酸分解，对血液中的其他物质成分没有影响，特异性更强；树脂与血液中尿酸的反应更为高效，缩短整体血液灌流的治疗时间，减少治疗风险发生的可能性，提高医疗资源利用率，创造更大的经济效益和社会效益；同时树脂无大孔结构，无需依赖于大孔树脂本身的吸附作用，血流动力学更稳定，减少血栓形成，降低患者血栓风险；还可以很好的耐受辐照灭菌条件，在充分灭菌的同时不破坏固定化酶树脂的原有结构，应用前景广阔。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
其中，实施例和对比例中所用纯化的重组尿酸酶均购自卡迈舒(上海)生物科技有限公司。
实施例1
一种尿酸酶固定化树脂的制备方法，包括以下步骤：
(1)在室温下将纯化的重组尿酸酶配置成25mL浓度为2g/L的酶溶液，随后加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液(75mL)、浓度为8mmol/LEDTA溶液(50mL)，振荡混匀30min，接着通过分子筛层析将EDTA-Cu2+螯合物从反应液中除去，得到不含Cu2+的尿酸酶液，继续加入浓度为8mmol/L硫酸锌溶液(150mL)，在20℃下恒温振荡1h，分离纯化得到Zn2+置换后的尿酸酶；
(2)将70g聚苯乙烯树脂颗粒分散于水中，随后加入30mL浓硝酸和10mL浓硫酸，在45℃下反应12h，反应完成后进行离心，用超纯水洗涤至中性后，将固体颗粒加入100mL、浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液中，继续加入4g连二亚硫酸钠粉末，在75℃下恒温反应4h，反应完成后进行离心，用去离子水洗涤3次，乙醇洗涤2次，得到氨基化聚苯乙烯树脂颗粒；
(3)将5g右旋糖酐溶于50mL蒸馏水中，随后加入5mL质量浓度为12％的高碘酸钠溶液，于4℃恒温避光反应8h，反应完成后继续滴加5mL质量浓度为5％亚硫酸氢钠溶液还原过量的高碘酸钠，随后用蒸馏水透析反应液8h，接着用聚乙二醇反透析，将体积浓缩至40ml，得到右旋糖酐二醛溶液；接着加入0.1mmol/L的碳酸钠缓冲液100ml和步骤(1)所得Zn2+置换后的尿酸酶(50mL)，在4℃下恒温避光反应20h，得到混合溶液；
(4)在步骤(3)所得混合溶液(90mL)中加入步骤(2)所得氨基化聚苯乙烯树脂颗粒(70g)，在30℃下恒温水浴反应1h，反应完成后，将树脂颗粒滤出，用超纯水洗涤3次，于4℃晾干，得到尿酸酶/聚苯乙烯树脂颗粒；
(5)将3g壳聚糖溶于100mL体积分数2％的醋酸溶液中，静置4h脱泡，随后加入步骤(4)所得尿酸酶/聚苯乙烯树脂颗粒(70g)，充分摇匀后抽滤，于4℃下晾干3h，接着浸入质量分数2％的氢氧化钠溶液中，以中和残留酸，用超纯水洗涤至中性，4℃自然干燥，即得所述尿酸酶固定化树脂。
实施例2
一种尿酸酶固定化树脂的制备方法，包括以下步骤：
(1)在室温下将纯化的重组尿酸酶配置成25mL浓度为4g/L的酶溶液，随后加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液(75mL)、浓度为12mmol/L EDTA溶液(60mL)，振荡混匀45min，接着通过分子筛层析将EDTA-Cu2+螯合物从反应液中除去，得到不含Cu2+的尿酸酶液，继续加入浓度为12mmol/L硫酸锌溶液(175mL)，在25℃下恒温振荡1.5h，分离纯化得到Zn2+置换后的尿酸酶；
(2)将70g聚苯乙烯树脂颗粒分散于水中，随后加入50mL浓硝酸和30mL浓硫酸，在50℃下反应14h，反应完成后进行离心，用超纯水洗涤至中性后，将固体颗粒加入100mL、浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液中，继续加入6g连二亚硫酸钠粉末，在80℃下恒温反应6h，反应完成后进行离心，用去离子水洗涤5次，乙醇洗涤1次，得到氨基化聚苯乙烯树脂颗粒；
(3)将5g右旋糖酐溶于50mL蒸馏水中，随后加入5mL质量浓度为12％的高碘酸钠溶液，于4℃恒温避光反应10h，反应完成后继续滴加5mL质量浓度为5％亚硫酸氢钠溶液还原过量的高碘酸钠，随后用蒸馏水透析反应液12h，接着用聚乙二醇反透析，将体积浓缩至40ml，得到右旋糖酐二醛溶液；接着加入0.1mmol/L的碳酸钠缓冲液100ml和步骤(1)所得Zn2+置换后的尿酸酶(70mL)，在6℃下恒温避光反应24h，得到混合溶液；
(4)在步骤(3)所得混合溶液(90mL)中加入步骤(2)所得氨基化聚苯乙烯树脂颗粒(90g)，在35℃下恒温水浴反应1.5h，反应完成后，将树脂颗粒滤出，用超纯水洗涤3次，于4℃晾干，得到尿酸酶/聚苯乙烯树脂颗粒；
(5)将9g壳聚糖溶于300mL体积分数2％的醋酸溶液中，静置6h脱泡，随后加入步骤(4)所得尿酸酶/聚苯乙烯树脂颗粒(70g)，充分摇匀后抽滤，于4℃下晾干6h，接着浸入质量分数2％的氢氧化钠溶液中，以中和残留酸，用超纯水洗涤至中性，4℃自然干燥，即得所述尿酸酶固定化树脂。
实施例3
一种尿酸酶固定化树脂的制备方法，包括以下步骤：
(1)在室温下将纯化的重组尿酸酶配置成25mL浓度为3g/L的酶溶液，随后加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液(75mL)、浓度为10mmol/L EDTA溶液(75mL)，振荡混匀30-60min，接着通过分子筛层析将EDTA-Cu2+螯合物从反应液中除去，得到不含Cu2+的尿酸酶液，继续加入浓度为10mmol/L硫酸锌溶液(200mL)，在20℃下恒温振荡2h，分离纯化得到Zn2+置换后的尿酸酶；
(2)将70g聚苯乙烯树脂颗粒分散于水中，随后加入40mL浓硝酸和20mL浓硫酸，在45℃下反应10h，反应完成后进行离心，用超纯水洗涤至中性后，将固体颗粒加入100mL、浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液中，继续加入5g连二亚硫酸钠粉末，在70℃下恒温反应6h，反应完成后进行离心，用去离子水洗涤5次，乙醇洗涤2次，得到氨基化聚苯乙烯树脂颗粒；
(3)将5g右旋糖酐溶于50mL蒸馏水中，随后加入5mL质量浓度为12％的高碘酸钠溶液，于4℃恒温避光反应9h，反应完成后继续滴加5mL质量浓度为5％亚硫酸氢钠溶液还原过量的高碘酸钠，随后用蒸馏水透析反应液10h，接着用聚乙二醇反透析，将体积浓缩至40ml，得到右旋糖酐二醛溶液；接着加入0.1mmol/L的碳酸钠缓冲液100ml和步骤(1)所得Zn2+置换后的尿酸酶(60mL)，在5℃下恒温避光反应22h，得到混合溶液；
(4)在步骤(3)所得混合溶液(90mL)中加入步骤(2)所得氨基化聚苯乙烯树脂颗粒(80g)，在30℃下恒温水浴反应2h，反应完成后，将树脂颗粒滤出，用超纯水洗涤4次，于4℃晾干，得到尿酸酶/聚苯乙烯树脂颗粒；
(5)将6g壳聚糖溶于200mL体积分数2％的醋酸溶液中，静置5h脱泡，随后加入步骤(4)所得尿酸酶/聚苯乙烯树脂颗粒(70g)，充分摇匀后抽滤，于4℃下晾干4h，接着浸入质量分数2％的氢氧化钠溶液中，以中和残留酸，用超纯水洗涤至中性，4℃自然干燥，即得所述尿酸酶固定化树脂。
对比例1
一种尿酸酶固定化树脂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将70g聚苯乙烯树脂颗粒分散于水中，随后加入30mL浓硝酸和10mL浓硫酸，在45℃下反应12h，反应完成后进行离心，用超纯水洗涤至中性后，将固体颗粒加入100mL、浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液中，继续加入4g连二亚硫酸钠粉末，在75℃下恒温反应4h，反应完成后进行离心，用去离子水洗涤3次，乙醇洗涤2次，得到氨基化聚苯乙烯树脂颗粒；
(2)将5g右旋糖酐溶于50mL蒸馏水中，随后加入5mL质量浓度为12％的高碘酸钠溶液，于4℃恒温避光反应8h，反应完成后继续滴加5mL质量浓度为5％亚硫酸氢钠溶液还原过量的高碘酸钠，随后用蒸馏水透析反应液8h，接着用聚乙二醇反透析，将体积浓缩至40ml，得到右旋糖酐二醛溶液；接着加入0.1mmol/L的碳酸钠缓冲液(100ml)和纯化的重组尿酸酶(50mL)，在4℃下恒温避光反应20h，得到混合溶液；
(3)在步骤(2)所得混合溶液(90mL)中加入步骤(2)所得氨基化聚苯乙烯树脂颗粒(70g)，在30℃下恒温水浴反应1h，反应完成后，将树脂颗粒滤出，用超纯水洗涤3次，于4℃晾干，得到尿酸酶/聚苯乙烯树脂颗粒；
(4)将3g壳聚糖溶于100mL体积分数2％的醋酸溶液中，静置4h脱泡，随后加入步骤(4)所得尿酸酶/聚苯乙烯树脂颗粒(70g)，充分摇匀后抽滤，于4℃下晾干3h，接着浸入质量分数2％的氢氧化钠溶液中，以中和残留酸，用超纯水洗涤至中性，4℃自然干燥，即得所述尿酸酶固定化树脂。
对比例2
一种尿酸酶固定化树脂的制备方法，包括以下步骤：
(1)在室温下将纯化的重组尿酸酶配置成25mL浓度为2g/L的酶溶液，随后加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液(75mL)、浓度为8mmol/LEDTA溶液(50mL)，振荡混匀30min，接着通过分子筛层析将EDTA-Cu2+螯合物从反应液中除去，得到不含Cu2+的尿酸酶液，继续加入浓度为8mmol/L硫酸锌溶液(150mL)，在20℃下恒温振荡1h，分离纯化得到Zn2+置换后的尿酸酶；
(2)将5g右旋糖酐溶于50mL蒸馏水中，随后加入5mL质量浓度为12％的高碘酸钠溶液，于4℃恒温避光反应8h，反应完成后继续滴加5mL质量浓度为5％亚硫酸氢钠溶液还原过量的高碘酸钠，随后用蒸馏水透析反应液8h，接着用聚乙二醇反透析，将体积浓缩至40ml，得到右旋糖酐二醛溶液；接着加入0.1mmol/L的碳酸钠缓冲液100ml和步骤(1)所得Zn2+置换后的尿酸酶(50mL)，在4℃下恒温避光反应20h，得到混合溶液；
(3)在步骤(2)所得混合溶液(90mL)中加入聚苯乙烯树脂颗粒(70g)，在30℃下恒温水浴反应1h，反应完成后，将树脂颗粒滤出，用超纯水洗涤3次，于4℃晾干，得到尿酸酶/聚苯乙烯树脂颗粒；
(4)将3g壳聚糖溶于100mL体积分数2％的醋酸溶液中，静置4h脱泡，随后加入步骤(3)所得尿酸酶/聚苯乙烯树脂颗粒(70g)，充分摇匀后抽滤，于4℃下晾干3h，接着浸入质量分数2％的氢氧化钠溶液中，以中和残留酸，用超纯水洗涤至中性，4℃自然干燥，即得所述尿酸酶固定化树脂。
对比例3
一种尿酸酶固定化树脂的制备方法，包括以下步骤：
(1)在室温下将纯化的重组尿酸酶配置成25mL浓度为2g/L的酶溶液，随后加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液(75mL)、浓度为8mmol/LEDTA溶液(50mL)，振荡混匀30min，接着通过分子筛层析将EDTA-Cu2+螯合物从反应液中除去，得到不含Cu2+的尿酸酶液，继续加入浓度为8mmol/L硫酸锌溶液(150mL)，在20℃下恒温振荡1h，分离纯化得到Zn2+置换后的尿酸酶；
(2)将70g聚苯乙烯树脂颗粒分散于水中，随后加入30mL浓硝酸和10mL浓硫酸，在45℃下反应12h，反应完成后进行离心，用超纯水洗涤至中性后，将固体颗粒加入100mL、浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液中，继续加入4g连二亚硫酸钠粉末，在75℃下恒温反应4h，反应完成后进行离心，用去离子水洗涤3次，乙醇洗涤2次，得到氨基化聚苯乙烯树脂颗粒；
(3)将5g右旋糖酐溶于50mL蒸馏水中，随后加入5mL质量浓度为12％的高碘酸钠溶液，于4℃恒温避光反应8h，反应完成后继续滴加5mL质量浓度为5％亚硫酸氢钠溶液还原过量的高碘酸钠，随后用蒸馏水透析反应液8h，接着用聚乙二醇反透析，将体积浓缩至40ml，得到右旋糖酐二醛溶液；接着加入0.1mmol/L的碳酸钠缓冲液100ml和步骤(1)所得Zn2+置换后的尿酸酶(50mL)，在4℃下恒温避光反应20h，得到混合溶液；
(4)在步骤(3)所得混合溶液(90mL)中加入步骤(2)所得氨基化聚苯乙烯树脂颗粒(70g)，在30℃下恒温水浴反应1h，反应完成后，将树脂颗粒滤出，用超纯水洗涤3次，于4℃晾干，即得所述尿酸酶固定化树脂。
将实施例1-3和对比例1-2制备得到的尿酸酶固定化树脂进行测试，根据YYT1207-2013尿酸测定试剂盒(尿酸酶过氧化物酶偶联法)测试酶活性，通过酶活性表征尿酸酶固定化树脂的热稳定性和重复使用率(20次)，重复使用率为重复使用20次后酶活性与初始酶活性的比例；同时，将实施例1-3和对比例1-2制备得到的尿酸酶固定化树脂填装至血液灌流器中，对血液模拟液(尿酸含量为5mmol/L)进行净化，检测尿酸吸附清除率，测试结果如下表1：
表1尿酸酶固定化树脂的性能测试结果
对于游离酶而言，在温度为50℃、反应时间为180min时，酶相对活性为35.6％。
从表1中可见，本实施例1-3制备的尿酸酶固定化树脂的热稳定性相对于游离酶均有较高增加，且重复使用率、尿酸吸附清除率均较高，这一方面说明酶在载体树脂中比较稳定，另一方面说明在尿酸酶固定树脂重复使用过程中，壳聚糖凝固包膜在上述固定了尿酸酶的树脂颗粒表面，使其结构稳定耐受辐照灭菌，从而较好的保护了灭菌过程中酶的活性。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种尿酸酶固定化树脂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在室温下将纯化的重组尿酸酶配置成的酶溶液，继续加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液、EDTA溶液，振荡混匀30-60min，接着通过分子筛层析将EDTA-Cu2+螯合物从反应液中除去，得到不含Cu2+的尿酸酶液，随后加入硫酸锌溶液，进行恒温振荡，分离纯化得到Zn2+置换后的尿酸酶；
(2)将聚苯乙烯树脂颗粒分散于水中，随后加入浓硝酸和浓硫酸，在45-50℃下反应10-14h，反应完成后进行离心、洗涤，将固体颗粒加入氢氧化钠溶液中，继续加入连二亚硫酸钠粉末，进行恒温反应，反应完成后进行离心、洗涤，得到氨基化聚苯乙烯树脂颗粒；
(3)将5g右旋糖酐溶于50mL蒸馏水中，随后加入5mL质量浓度为12％的高碘酸钠溶液，于4℃恒温避光反应8-10h，反应完成后继续滴加5mL质量浓度为5％亚硫酸氢钠溶液，随后用蒸馏水透析反应液8-12h，接着用聚乙二醇反透析，将体积浓缩至40ml，得到右旋糖酐二醛溶液；接着加入0.1mmol/L的碳酸钠缓冲液100ml和步骤(1)所得Zn2+置换后的尿酸酶，进行恒温反应，得到混合溶液；
(4)在步骤(3)所得混合溶液中加入步骤(2)所得氨基化聚苯乙烯树脂颗粒，进行恒温水浴反应，反应完成后，将树脂颗粒滤出、洗涤，4℃晾干，得到尿酸酶/聚苯乙烯树脂颗粒；
(5)将壳聚糖溶于体积分数2％的醋酸溶液中，配制成质量分数为3％的壳聚糖溶液，静置4-6h脱泡，随后加入步骤(4)所得尿酸酶/聚苯乙烯树脂颗粒，充分摇匀后抽滤，于4℃下晾干3-6h，接着浸入质量分数2％的氢氧化钠溶液中，洗涤至中性，4℃自然干燥，即得所述尿酸酶固定化树脂。
2.根据权利要求1所述一种尿酸酶固定化树脂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中酶溶液的质量浓度为2-4g/L，EDTA溶液的浓度为8-12mmol/L，硫酸锌溶液的浓度为8-12mmol/L；所述酶溶液、磷酸盐缓冲液、EDTA溶液、硫酸锌溶液的体积比为1：3：2-3：6-8。
3.根据权利要求1所述一种尿酸酶固定化树脂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中恒温振荡温度为20-25℃，反应时间为1-2h。
4.根据权利要求1所述一种尿酸酶固定化树脂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中聚苯乙烯树脂颗粒、浓硝酸、浓硫酸和连二亚硫酸钠的质量比为7：3-5：1-3：0.4-0.6。
5.根据权利要求1所述一种尿酸酶固定化树脂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中恒温反应温度为70-80℃，反应时间为2-6h。
6.根据权利要求1所述一种尿酸酶固定化树脂的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中右旋糖酐二醛溶液、Zn2+置换后的尿酸酶的体积比为4：5-7；恒温反应条件为：4-6℃下避光反应20-24h。
7.根据权利要求1所述一种尿酸酶固定化树脂的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中混合溶液、氨基化聚苯乙烯树脂颗粒质量体积比为90mL：70-90g；恒温水浴反应温度为25-35℃，反应时间为1-2h。
8.根据权利要求1所述一种尿酸酶固定化树脂的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中壳聚糖、尿酸酶/聚苯乙烯树脂颗粒的质量比为3-9：70。
9.一种利用权利要求1-8任一项所述制备方法制备得到的尿酸酶固定化树脂。
10.一种权利要求9所述尿酸酶固定化树脂在血液灌流器中的应用。
CN202210194087.5A 2022-03-01 2022-03-01 一种尿酸酶固定化树脂的制备方法及其应用 Active CN114540332B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210194087.5A CN114540332B (zh) 2022-03-01 2022-03-01 一种尿酸酶固定化树脂的制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210194087.5A CN114540332B (zh) 2022-03-01 2022-03-01 一种尿酸酶固定化树脂的制备方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114540332A CN114540332A (zh) 2022-05-27
CN114540332B true CN114540332B (zh) 2023-07-21

Family

ID=81662274

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210194087.5A Active CN114540332B (zh) 2022-03-01 2022-03-01 一种尿酸酶固定化树脂的制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114540332B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2033399A (en) * 1978-10-16 1980-05-21 Uop Inc Support Matrices for Immobilized Enzymes
CN113509606A (zh) * 2021-08-13 2021-10-19 江苏恰瑞生物科技有限公司 一种降低体内尿酸的装置

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2033399A (en) * 1978-10-16 1980-05-21 Uop Inc Support Matrices for Immobilized Enzymes
CN113509606A (zh) * 2021-08-13 2021-10-19 江苏恰瑞生物科技有限公司 一种降低体内尿酸的装置

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Oxidized Dextran as a Macromolecular Crosslinker Stabilizes the Zein/Caseinate Nanocomplex for the Potential Oral Delivery of Curcumin;Nikolas J. Rodriguez 等;Molecules;第24卷(第22期);No.4061 *
The nitration of polystyrene;Aristides Philippides 等;Polymer;第34卷(第16期);3509-3513 *
壳聚糖固定化酶研究进展;夏文水 等;食品与机械;第23卷(第6期);7-10,30 *
微杆菌属ZZJ4-1菌株的耐热尿酸氧化酶基因的克隆及重组酶性质;张鹏程;卢向锋;李倩延;林小清;刘辉;马晓航;;生物工程学报(第07期);813−822 *
电子束辐照对壳聚糖分子量和结构的影响;马菲 等;核农学报;第27卷(第7期);946-951 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114540332A (zh) 2022-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106984290A (zh) 可吸附重金属离子的壳聚糖/海藻酸钠磁性复合微球的制备方法
CN108855083B (zh) 一种用改性沸石活化过氧乙酸去除水中磺胺类药物的方法
JPS59192958A (ja) 表面がグラフト化された粒子状支持体及びその製法並びに該支持体を含むアフイニテイクロマトグラフイ用吸着体及びその生物学的使用
CN105107474A (zh) 一种用于血液净化的螯合型吸附剂及制备方法
CN109692372B (zh) 一种五层血液灌流器及血液灌流方法
CN114540332B (zh) 一种尿酸酶固定化树脂的制备方法及其应用
CN109734839A (zh) 一种高抗凝型聚苯乙烯微球及其制备方法与应用
CN112871139A (zh) 一种全血灌流吸附剂、其制备方法及应用
CN109248668B (zh) 用于血液体外循环去除ldl的吸附剂及其制备方法和灌流器
Chang et al. Effects of glucose dehydrogenase in converting urea and ammonia into amino acid using artificial cells
CN109174022B (zh) 一种血液净化用吸附材料的固定化方法
CN101942107A (zh) 羧甲基壳聚糖与壳聚糖的蛋白质印迹聚合物的制备方法
CN101575135B (zh) 载酶硅基介孔分子筛sba-15催化氧化析出水中酚类物质的方法
CN113477232B (zh) 用于焦化废水处理的净水剂及其制备方法
CN111250045A (zh) 一种h2so4改性颗粒无烟煤的制备方法和h2so4改性颗粒无烟煤及应用
JP2019181446A (ja) 常温でアンモニウムイオンおよび尿素を分解する触媒の製造方法および汚水浄化への適用方法
CN114306790B (zh) 一种固定化尿酸酶灌流器及其应用
SU844569A1 (ru) Способ получени гемосовместимыхАдСОРбЕНТОВ дл ОчиСТКи КРОВиОТ ТОКСиНОВ
CN102527359A (zh) 一种用于血液灌流的活性炭改性方法
CN112569910B (zh) 用于血液体外循环清除ldl的吸附剂的制备方法及灌流器
CN108743924B (zh) 一种固定化蛇毒凝血因子激活剂及活化凝血因子的制备方法
CN116492991B (zh) 可清除血液中TNF-α的血液灌流器填料制备方法
JPH01250331A (ja) グリセリンの精製法
CN114684926B (zh) 一种微生物固定化材料及其制备方法和应用
CN114733492A (zh) 用于吸附分离河豚毒素的微晶纤维素凝胶吸附剂及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220804

Address after: No. 88, Xicha Village, Xicha Town, Gaolan County, Lanzhou New District, Lanzhou City, Gansu Province 730300

Applicant after: Gu Lingwei

Address before: E303, e305, E307 and E309, Liye building, No. 20 Qingyuan Road, Xinwu District, Wuxi City, Jiangsu Province, 214000

Applicant before: Jiangsu Qirui Biotechnology Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20230621

Address after: E303, e305, E307 and E309, Liye building, No. 20 Qingyuan Road, Xinwu District, Wuxi City, Jiangsu Province, 214000

Applicant after: Jiangsu Qirui Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: No. 88, Xicha Village, Xicha Town, Gaolan County, Lanzhou New District, Lanzhou City, Gansu Province 730300

Applicant before: Gu Lingwei

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant