CN109174022B - 一种血液净化用吸附材料的固定化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血液净化用吸附材料的固定化方法,吸附材料在固定化配基分子的过程中,在缓冲液中添加高浓度的无机盐。这种方法一方面可以极大程度地提升配基分子的固定化效率,一方面可以提升吸附材料的吸附性能,另一方面可以减少配基投料量从而节省生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及医疗器械领域,具体涉及一种血液净化用吸附材料的固定化方法。
背景技术
血液净化,即把患者血液引出体外并通过一种净化装置,除去其中的某些致病物质,净化血液,达到治疗疾病的目的,这个过程称为血液净化。血液净化包括:血液透析、血液滤过、血液透析滤过、血浆置换、血液灌流和免疫吸附。血液净化疗法是在血液透析的基础上发展起来的,血液透析雏形发展至今已有约百年的历史,而血液净化其他疗法的出现仅30年左右。
血液透析、血液滤过、血液透析滤过、血浆置换这几种模式都是基于中空纤维膜来实现其治疗效果的。而血液灌流和免疫吸附则是基于吸附材料来实现的。中空纤维膜利用其孔径大小,选择性“过滤”掉血液中分子量过大或过小的物质,其“过滤”原理具有非特异性;而吸附材料则是利用材料分子本身或固定化在材料分子表面的配基分子的亲和、静电、疏水、范德华力等作用力,“吸附”血液中的致病物质,其“吸附”原理具有特异性或相对特异性。
血液灌流和免疫吸附因为其对血液治病物质的清除具有特异性或相对特异性,而对血液中的正常成分如血细胞、蛋白等影响较小,在越来越重视精准治疗的今天成为了血液净化领域的研究热点。
吸附材料的制备是血液灌流和免疫吸附的核心技术,吸附材料的关键评价指标是材料的吸附性能和安全性能。而关系到产品能否实现工业化生产以及能否具有市场竞争力的关键因素则是吸附材料的制备成本。目前市场上常见的吸附柱,售价较高者可达十万人民币。
专利CN 1332718C公开了一种硅胶载体蛋白A免疫吸附材料,在其实施例4中可算出蛋白A配基分子在不同条件下的固定化效率分别为32.5%和25.5%。专利CN 104525155B公开了一种低密度脂蛋白吸附剂材料,在其实施例1中可算出硫酸葡聚糖配基分子的固定化效率仅为0.79%。专利CN 101322933B公开了一种内毒素吸附材料,在其实施例中可算出多粘菌素B配基分子在不同条件下的固定化效率分别为11.4%、15.2%和9.5%。专利CN108246264 A公开了一种DNA免疫吸附材料,在其实施例中可算出DNA配基分子在不同条件下的固定化效率分别为16.5%、18.6%和25.2%。
通过上述专利对比可知,现有技术固定化效率普遍较低,不同配基分子的固定化效率存在差异,配基分子是通过其氨基、羟基等活性基团与载体共价偶联,而不同基团在活性上存在极大差异。一般来说,基团越活泼,固定化效率越高,此外,活性基团越多,固定化效率也越高。这就是上述专利中蛋白A分子的固定化效率可达32.5%,而硫酸葡聚糖的固定化效率仅为0.79%的原因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血液净化用吸附材料的固定化方法,采用这种固定化方法制备的吸附材料,具有吸附性能优异,生产成本及治疗成本低的特点。
为实现上述目的,血液净化用吸附材料的固定化方法是使配基分子与吸附材料在添加有0.5~3M的氯化物和/或硫酸盐的溶液环境中进行偶联反应。
优选地,所述氯化物和/或硫酸盐为氯化钠、氯化铵、硫酸钠、硫酸铵中的一种或几种的组合。
优选地,所述吸附材料为DNA吸附材料、蛋白A吸附材料、内毒素吸附材料、低密度脂蛋白吸附材料。
本发明所述血液净化用吸附材料的固定化方法的步骤为,首先将吸附材料进行活化,然后将配基分子与已活化的吸附材料在包含0.5~3M的氯化物和/或硫酸盐的缓冲液中进行偶联反应,最后洗去未反应的配基及杂质,即得。
这种方法一方面可以极大程度地提升配基分子的固定化效率,一方面可以提升吸附材料的吸附性能,另一方面可以减少配基投料量从而节省生产成本。
高浓度的无机盐之所以能够起到提升固定化效率的作用,可能类似蛋白质的盐析原理。盐析是指在蛋白质水溶液中加入中性盐,随着盐浓度增大而使蛋白质沉淀出来的现象。中性盐是强电解质,溶解度又大,在蛋白质溶液中,一方面与蛋白质争夺水分子,破坏蛋白质胶体颗粒表面的水膜;另一方面又大量中和蛋白质颗粒上的电荷,从而使水中蛋白质颗粒积聚而沉淀析出。
在偶联反应过程中,参与反应的配基分子(不限于蛋白分子),在高浓度无机盐的作用下,配基分子失去水膜,活性基团得以暴露,从而更容易与活性载体发生反应。经过实验研究发现氯化物、硫酸盐,特别是包含有氯化钠、氯化铵、硫酸钠、硫酸铵这几种(或其中一种)的高浓度缓冲液能够起到较好效果,但是具体原理尚未完全研究清楚。
本发明的有益效果:1、提升配基分子的固定化效率,提升配基分子的利用率;2、提升吸附材料的吸附性能;3、降低配基分子的投料量,降低生产成本。
附图说明
图1为不同浓度NaCl为缓冲液条件下制备的DNA免疫吸附材料上配基分子固定化情况。
图2为不同浓度NH4Cl为缓冲液条件下制备的DNA免疫吸附材料上配基分子固定化情况。
图3为不同浓度Na2SO4为缓冲液条件下制备的DNA免疫吸附材料上配基分子固定化情况。
图4为不同浓度(NH4)2SO4为缓冲液条件下制备的DNA免疫吸附材料上配基分子固定化情况。
图5为不同浓度NaCl与Na2SO4混合缓冲液条件下制备的DNA免疫吸附材料上配基分子固定化情况。
图6为不同浓度NaCl为缓冲液条件下制备的蛋白A免疫吸附材料配基分子固定化情况。
图7为不同浓度NaCl为缓冲液条件下制备的内毒素吸附材料上配基分子固定化情况
图8为不同浓度NaCl为缓冲液条件下制备的低密度脂蛋白吸附材料上配基分子固定化情况。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
对照例1
本实施例提供常规的DNA免疫吸附材料固定化方法。
1)将10mL球形纤维素抽干,转移至锥形瓶中,加入10mL 2M NaOH溶液和3ML环氧氯丙烷,
2)于40℃、150rpm条件下反应2h;
3)大量水冲洗,抽干后与10mL小牛胸腺DNA(DNA配基)缓冲溶液混合(配基浓度10mg/mL,0.1M Tris-HCl缓冲液,pH=8.0);
4)于80℃,150rpm条件下反应16h;
5)先后顺序采用pH 4.0的醋酸缓冲液、pH 8.0的Tris缓冲液、1M NaCl溶液冲洗,最后用大量水冲洗,即得免疫吸附剂。
实施例1
本实施例提供在本发明构思下,缓冲液中添加了高浓度NaCl的吸附材料固定化方法。
步骤1)、2)、4)、5)与对照例1相同,步骤3)配基缓冲液条件改变如下:配基浓度10mg/mL,0.1M Tris-HCl缓冲液,pH=8.0,NaCl浓度分别为0.2M、0.5M、1.0M、2.0M、3.0M。
实验结果见图1,根据图1可知,缓冲液中随着NaCl浓度的提升,配基的固定化效率也得到提升,缓冲液中未添加NaCl时,配基的固定效率为41.6%,缓冲液中加入0.5M NaCl时,配基的固定效率为56.2%,缓冲液中加入3.0M NaCl时,配基的固定效率可达82.7%。
实施例2
本实施例提供在本发明构思下,缓冲液中添加了高浓度NH4Cl的吸附材料固定化方法。
步骤1)、2)、4)、5)与对照例1相同,步骤3)配基缓冲液条件改变如下:10mg/mL,0.1M Tris-HCl缓冲液,pH=8.0,NH4Cl浓度分别为0.2M、0.5M、1.0M、2.0M、3.0M。
实验结果见图1,根据图1可知,缓冲液中随着NH4Cl浓度的提升,配基的固定化效率也得到提升,缓冲液中未添加NH4Cl时,配基的固定效率为41.6%,缓冲液中加入0.5MNH4Cl时,配基的固定效率为57.4%,缓冲液中加入3.0M NH4Cl时,配基的固定效率可达84.6%。
实施例3
本实施例提供在本发明构思下,缓冲液中添加了高浓度Na2SO4的吸附材料固定化方法。
步骤1)、2)、4)、5)与对照例1相同,步骤3)配基缓冲液条件改变如下:10mg/mL,0.1M Tris-HCl缓冲液,pH=8.0,Na2SO4浓度分别为0.2M、0.5M、1.0M、2.0M、3.0M。
实验结果见图1,根据图1可知,缓冲液中随着Na2SO4浓度的提升,配基的固定化效率也得到提升,缓冲液中未添加Na2SO4时,配基的固定效率为41.6%,缓冲液中加入0.5MNa2SO4时,配基的固定效率为78.9%,缓冲液中加入3.0M Na2SO4时,配基的固定效率可达87.8%。
实施例4
本实施例提供在本发明构思下,缓冲液中添加了高浓度(NH4)2SO4的吸附材料固定化方法。
步骤1)、2)、4)、5)与对照例1相同,步骤3)配基缓冲液条件改变如下:10mg/mL,0.1M Tris-HCl缓冲液,pH=8.0,(NH4)2SO4浓度分别为0.2M、0.5M、1.0M、2.0M、3.0M。
实验结果见图1,根据图1可知,缓冲液中随着(NH4)2SO4浓度的提升,配基的固定化效率也得到提升,缓冲液中未添加(NH4)2SO4时,配基的固定效率为41.6%,缓冲液中加入0.5M(NH4)2SO4时,配基的固定效率为48.5%,缓冲液中加入3.0M(NH4)2SO4时,配基的固定效率可达66.4%。
实施例5
本实施例提供在本发明构思下,缓冲液中添加了高浓度NaCl与Na2SO4混合物的吸附材料固定化方法。
步骤1)、2)、4)、5)与对照例1相同,步骤3)配基缓冲液条件改变如下:10mg/mL,0.1M Tris-HCl缓冲液,pH=8.0,NaCl与Na2SO4按1比1的摩尔比混合,最终混合浓度分别为0.2M、0.5M、1.0M、2.0M、3.0M。
实验结果见图1,根据图1可知,缓冲液中随着NaCl与Na2SO4混合物浓度的提升,配基的固定化效率也得到提升,缓冲液中未添加混合盐时,配基的固定效率为41.6%,缓冲液中加入0.5M混合盐时,配基的固定效率为66.4%,缓冲液中加入3.0M混合盐时,配基的固定效率可达85.5%。
对照例2
本实施例提供常规的以聚乙烯醇微球为载体,高碘酸盐氧化法制备蛋白A免疫吸附材料固定化方法。
1)将10mL聚乙烯醇微球抽干,转移至锥形瓶中,加入10mL 0.3M NaIO4溶液;
2)于40℃、150rpm条件下反应4h;
3)大量水冲洗,抽干后与10mL蛋白A配基缓冲溶液混合(配基浓度10mg/mL,0.1MTris-HCl缓冲液,pH=8.0);
4)于80℃,150rpm条件下反应16h;
5)先后顺序采用pH 4.0的醋酸缓冲液、pH 8.0的Tris缓冲液、1M NaCl溶液冲洗,最后用大量水冲洗,即得蛋白A免疫吸附剂。
实施例6
本实施例提供在本发明构思下,缓冲液中添加了高浓度NaCl的吸附材料固定化方法。
步骤1)、2)、4)、5)与对照例2相同,步骤3)配基缓冲液条件改变如下:配基浓度10mg/mL,0.1M Tris-HCl缓冲液,pH=8.0,NaCl浓度分别为0.2M、0.5M、1.0M、2.0M、3.0M。
实验结果见图6,根据图6可知,缓冲液中随着NaCl浓度的提升,配基的固定化效率也得到提升,缓冲液中未添加NaCl时,配基的固定效率为61.5%,缓冲液中加入0.5M NaCl时,配基的固定效率为81.2%,缓冲液中加入3.0M NaCl时,配基的固定效率可达93.3%。
对照例3
本实施例提供常规的以聚苯乙烯微球为载体,卤醇法制备内毒素吸附材料固定化方法。
1)将10mL聚苯乙烯树脂抽干,转移至锥形瓶中,加入10mL0.2M的次氯酸钠溶液、10ml 0.2M的NaBr溶液和10ml 2M的H2SO4溶液,于60℃、150rpm条件下反应4h;
2)大量水冲洗,抽干后加入20ml 4M的NaOH溶液,于50℃、150rpm条件下反应4h。
3)大量水冲洗,抽干后与10mL PMB缓冲溶液混合(配基浓度40mg/mL,0.1M Tris-HCl缓冲液,pH=9.0);
4)于50℃,150rpm条件下反应16h;
先后顺序采用pH 4.0的醋酸缓冲液、pH 8.0的Tris缓冲液、1M NaCl溶液冲洗,最后用大量水冲洗,即得内毒素吸附剂。
实施例7
本实施例提供在本发明构思下,缓冲液中添加了高浓度NaCl的吸附材料固定化方法。
步骤1)、2)、4)、5)与对照例3相同,步骤3)配基缓冲液条件改变如下:配基浓度40mg/mL,0.1M Tris-HCl缓冲液,pH=9.0,NaCl浓度分别为0.2M、0.5M、1.0M、2.0M、3.0M。
实验结果见图7,根据图7可知,缓冲液中随着NaCl浓度的提升,配基的固定化效率也得到提升,缓冲液中未添加NaCl时,配基的固定效率为10.8%,缓冲液中加入0.5M NaCl时,配基的固定效率为46.5%,缓冲液中加入3.0M NaCl时,配基的固定效率可达50.5%。
对照例4
本实施例提供常规的以琼脂糖微球为载体,环氧法制备低密度脂蛋白吸附材料的固定化方法。
1)将10mL琼脂糖微球抽干,转移至锥形瓶中,加入10mL 2M NaOH溶液和3ML环氧氯丙烷,
2)于40℃、150rpm条件下反应2h;
3)大量水冲洗,抽干后与10mL硫酸葡聚糖配基缓冲溶液混合(配基浓度50mg/mL,0.1M Tris-HCl缓冲液,pH=10.0);
4)于80℃,150rpm条件下反应16h;
5)先后顺序采用pH 4.0的醋酸缓冲液、pH 8.0的Tris缓冲液、1M NaCl溶液冲洗,最后用大量水冲洗,即得低密度脂蛋白吸附剂。
实施例8
本实施例提供在本发明构思下,缓冲液中添加了高浓度NaCl的吸附材料固定化方法。
步骤1)、2)、4)、5)与对照例4相同,步骤3)配基缓冲液条件改变如下:配基浓度50mg/mL,0.1M Tris-HCl缓冲液,pH=10.0,NaCl浓度分别为0.2M、0.5M、1.0M、2.0M、3.0M。
实验结果见图8,根据图8可知,缓冲液中随着NaCl浓度的提升,配基的固定化效率也得到提升,缓冲液中未添加NaCl时,配基的固定效率为0.2%,缓冲液中加入0.5M NaCl时,配基的固定效率为7.3%,缓冲液中加入3.0M NaCl时,配基的固定效率可达8.6%。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (2)
1.一种血液净化用吸附材料的固定化方法,其特征在于:所述固定化方法是使配基分子与吸附材料在添加有2~3M的氯化物和/或硫酸盐的溶液环境中进行偶联反应;所述氯化物和/或硫酸盐为氯化钠、氯化铵、硫酸钠、硫酸铵中的一种或几种的组合。
2.根据权利要求1所述血液净化用吸附材料的固定化方法,其特征在于:所述固定化方法的步骤为,首先将吸附材料进行活化,然后将配基分子与已活化的吸附材料在包含2~3M的氯化物和/或硫酸盐的缓冲液中进行偶联反应,最后洗去未反应的配基及杂质,即得。
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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