CN101322932B - 偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学材料领域中偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料及应用，包括采用带有氨基或羟基的天然多糖及其衍生物或者化学合成多聚物为载体偶联配基构成，其特征在于该多聚物吸附材料分子具有式(I)的结构：式中，R选自粘均分子量范围为6KD～500KD的带有氨基或羟基的天然多糖及其衍生物或者化学合成多聚物；X选自带有O原子、N原子或者OH基团的C₀～C₆烷链；CD选自β-环糊精或取代的β-环糊精。将此吸附材料溶解于医用透析液后，可应用于对重症肝炎病人的血液净化治疗。本发明的优点在于同时除去中小分子蛋白结合毒素及水溶性毒素分子、治疗成本低，仅为分子吸附再循环系统的十分之一左右、对血浆蛋白非特异性吸附小。

Description

偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料及其应用

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，具体地说，涉及到用于去除血液中多种中小分子毒素的偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料，以及应用这种吸附材料对血液进行吸附性透析的方法。

背景技术

多种原因所致的重症肝炎、肝脏功能不全和肝脏功能衰竭在我国十分常见。肝功能衰竭，无论是急性起病还是慢性肝病急性发作引起，始终是严重威胁患者生命的临床综合症。其主要表现为大量的代谢毒素在体内蓄积，包括血氨、胆红素、胆汁酸等，可引起各种严重的并发症。

目前使用血液净化疗法清除肝病病人血液中的代谢毒素，特别是蛋白结合毒素主要通过血液灌流、分子吸附再循环系统(简写为MARS)和生物学透析治疗系统(简写为Biologic-DT)。

血液灌流是将血液引出，通过一个装有吸附剂的灌流柱，在灌流柱中血液与吸附剂接触时，致病分子被吸附除去的治疗方法。血液灌流存在的主要问题是吸附剂在吸附病人血浆中致病因子的同时，也吸附其它血浆蛋白，导致治疗的副作用较大。邹汉法等申请的专利(吸附胆红素的环糊精交联聚合物微球及其制备和应用，申请号03111583.7)采用二异氰酸酯为交联剂，与环糊精单体缩合制成固体吸附材料。由于这种材料在使用中直接与血浆成分接触，所以不能避免对血液中蛋白成分的非特异性吸附，不能满足临床应用的要求。

MARS系统是上世纪九十年代初发展起来的一种新型人工肝支持系统，是对传统血液净化方法的一种改进。它由血液循环、白蛋白循环透析系统及白蛋白再生系统三部分组成，血液中的毒素跨过MARS膜后扩散至透析液中，与透析液中白蛋白结合，从而被从血液中除去，白蛋白通过活性碳吸附器及阴离子交换树脂吸附器进行再生，脱去结合的毒素后进行循环使用，通过这样的一套系统，血液中的中小分子毒素被有效去除(文献STEFFEN R.MITZNER，JAN STANGE，SEBASTIAN KLAMMT，PIOTR PESZYNSKI，REINHARDT SCHMIDT and GABRIELE

Extracorporeal Detoxification Using the Molecular Adsorbent RecirculatingSystem for Critically Ill Patients with Liver Failure，J Am Soc Nephrol，12：S75-S82，2001)。分子吸附再循环系统的突出优点是具有同时清除蛋白结合毒素和水溶性毒素的作用，但是由于分子吸附再循环系统技术由其它国家所垄断，国内病人在利用该系统进行治疗时，不仅要依赖进口的仪器，还要使用专用的MARS膜、吸附柱及大量白蛋白，费用十分昂贵，严重限制了这一技术的推广使用。

Biologic-DT系统是将预先载荷定量支链氨基酸和葡萄糖的粉状活性炭和阳离子交换树脂加入平板透析机的透析液中，吸附从血液透出的毒素物质，并纠正氨基酸和葡萄代谢失衡，血液与吸附剂不发生接触，也不使用抗凝剂。但是这套系统设备较为复杂，经过修饰的粉状活性炭和阳离子树脂成本较高，造成治疗费用昂贵。

综上所述，目前针对重症肝炎的血液净化方法主要存在以下两方面的不足：1)血液灌流用固体吸附剂通过静电作用或疏水作用与致病因子结合，由于血液成分复杂，固体吸附剂在与血液接触时，一些血浆蛋白等人体必需成分也能够通过以上两种作用吸附到固体吸附剂表面，一方面了导致对血液中致病因子的清除能力显著降低，另一方面对血液中有用成分的清除也导致治疗的副作用增大；2)治疗的设备装置复杂，治疗费用昂贵。血液灌流系统一般需要血浆分离器和吸附柱两套装置，而MARS和Biologic-DT系统更为复杂，导致治疗的成本较高。

发明内容

本发明的主要目的和任务是要克服现有治疗重症肝炎血液净化方法中存在的：1)固体吸附剂吸附特异性差，治疗副作用较大；2)治疗的设备装置复杂，治疗费用昂贵的不足，提供一种廉价、高效的能够去除血液中多种中小分子毒素的吸附材料，特提出本发明偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料及其应用的技术解决方案。

本发明的构思是：利用现有技术中的高通量血液透析器代替MARS系统中的MARS膜透析器，利用化学合成的偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料代替MARS系统中的人血清白蛋白或者Biologic-DT系统中的粉状活性炭和阳离子交换树脂，将人工合成吸附材料廉价及MARS、Biologic-DT系统高效的优点结合起来，通过吸附透析的方法直接清除血液中的水溶性及血浆蛋白结合的中小分子毒素。

本发明所提出的偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料，其特征在于，该多聚物具有式(I)的结构：

式中，R选自粘均分子量范围为6KD～500KD(千道尔顿)的带有氨基或羟基的天然多糖及其衍生物或者化学合成多聚物；X选自带有O原子、N原子或者OH基团的C₀～C₆烷链；CD选自β-环糊精或取代的β-环糊精。

本发明的进一步特征在于：本发明所述带有氨基或羟基的天然多糖及其衍生物选自淀粉、羟甲基淀粉、羟乙基淀粉、羟丙基淀粉、右旋糖酐、壳聚糖、O-羟乙基壳聚糖或O-羟丙基壳聚糖；所述带有氨基或羟基的化学合成多聚物选自聚乙烯亚胺或聚乙烯醇。β-环糊精上羟基的氢原子被取代的基团为羧烷基、C₁～C₄烷基、羟烷基、磺酸基或亚烷磺酸基。

本发明所提出的偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料的应用方法，其特征在于，将偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料溶解于血液透析液中，配制成浓度为0.1％～30％(w/v)的吸附透析液；病人血液流过血液透析器中分布的中空纤维膜内腔，其流速为100～300ml/min；吸附透析液通过血液透析器外腔，流速为20～500ml/min，并与中空纤维膜内腔的血液进行溶质交换，吸附透析时间为4～8小时。所采用的血液透析液选自乳酸盐透析液、醋酸盐透析液或碳酸氢盐透析液。

本发明所选择的技术方案是考虑到：带有氨基或者羟基的天然多糖及其衍生物或者化学合成多聚物分子量分布很宽，本发明选用粘均分子量范围为6KD～500KD的多聚物作为吸附材料的载体分子。粘均分子量大于6KD是为了保证化学修饰后的多聚物分子足够大，从而不会穿过血液透析器内的中空纤维膜进入血液，粘均分子量小于500KD是为了保证化学修饰后的多聚物分子具有足够的溶解性，从而能够配制成一定浓度的吸附透析液，满足对吸附容量的需要。重症肝炎病人体内存在的胆红素、芳香族氨基酸等主要毒素分子都可以进入环糊精分子的空腔，形成稳定的包结复合物，所以选择了环糊精或取代的环糊精作为配基，对其进行吸附。

偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料的合成包括采用已有合成技术中的有机化学反应实现环糊精与多聚物载体的偶联。如通过高碘酸钠氧化环糊精，使环糊精上产生醛基，再通过醛基将环糊精偶联到具有氨基的大分子载体上；或者通过适当的连接臂分子(如环氧氯丙烷)，一侧偶联环糊精，另一侧偶联大分子载体。它们的共同特点是：在一定分子量范围的多聚物长链上均带有环糊精，其中，环糊精是这种吸附材料吸附血液中小分子毒素的关键，也是上述偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料具有吸附功能的基础。

将本发明所提出的偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料溶解于血液透析液中，配制成浓度为0.1％～30％(w/v)的吸附透析液，如果配制的浓度低于0.1％，则吸附材料对毒素分子不能产生足够强的吸附力，同时吸附容量不足；浓度高于30％，则吸附透析液粘度过高，不利于吸附的毒素分子在其中扩散，吸附速率慢。

目前的高通量血液透析器能够允许血液中的中小分子物质通过，在功能上能够部分代替MARS系统中的MARS膜透析器，并且价格低廉，能够满足血液净化的需要。作为吸附材料的水溶性多聚物的分子量须大于所选用的血液透析器的截留分子量，以保证吸附材料分子不会进入病人血液。吸附透析液与血液流动与血液透析器中空纤维膜两侧，通过中空纤维膜进行溶质交换，能够去除血液中的中小分子蛋白结合毒素及水溶性毒素。

本发明改进了血液灌流、MARS及Biologic-DT系统的一些不足之处，其主要优点是：

1)、通过对粘均分子量范围在6kD～500kD的多聚物进行化学修饰，合成了偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料，使吸附材料分子在水溶液中保持了自身的柔性，避免了固体吸附剂颗粒内部传质的限制。因此，偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料与固体吸附剂相比对血液中致病毒素的吸附速度更快、吸附作用更强；2)、由于偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料对重症肝炎病人血液中的疏水小分子毒素，如胆红素、芳香族氨基酸等，有很强的吸附作用，使这些致病毒素能快速地从血浆蛋白上脱附下来并与吸附材料结合，因此该方法吸附透析清除蛋白结合毒素的效果更为显著；3)、由于采用了吸附透析的方法，偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料与血液分别位于透析膜的两侧，吸附材料分子与血液中的蛋白成分及血细胞不发生接触，避免了固体吸附剂对血液中有用成分的非特异性吸附，提高了血液相容性；4)、由于采用廉价的偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料代替了MARS系统中的昂贵的白蛋白，并且省去了白蛋白的再生系统，采用廉价的高通量血液透析器替代MARS膜透析器，从而显著降低了成本，所需费用只是使用MARS系统的十分之一左右。

本发明共设1个附表

表1是各个实施例中不同吸附材料对肝病病人血液中主要毒素分子的去除率及与MARS系统的比较

取重症肝炎病人血浆置换下来的废弃血浆进行体外的模拟吸附透析实验。表中比较了各个实施例中所述的吸附材料对病人血浆中胆红素、胆汁酸、血氨、肌酐、尿素的去除率，并与MARS系统的平均治疗效果进行了对比。实验所用血浆相同，胆红素、胆汁酸、血氨、肌酐、尿素初始浓度分别为287mg/L、215.3μmol/L、84.8μmol/L、256μmol/L、15.84mmol/L。实验数据表明，所述实验条件下吸附材料都能够去除一定量的血液毒素，其中采用实施例10所述实验条件时去除率最高。对胆红素的去除率高于MARS系统平均去除率12个百分点，对胆汁酸、血氨、肌酐及尿素的去除率与MARS系统大体相当。本方法治疗成本只是MARS系统的十分之一左右。

附图说明

图1是血液透析器的结构示意图

血液从病人体内引出后，由血液进管1进入血液透析器2中分布的多个中空纤维膜4，再经由血液回管7返回病人体内再循环；而吸附透析液由泵驱动经过透析液进管6进入血液透析器外腔5，血液中的中小分子毒素在吸附及扩散的作用下透过中空纤维膜4，从血液中进入吸附透析液，从而随着吸附透析液的流动经过透析液出管3离开血液透析器被除去。通过吸附透析液的不断流动，血液中的毒素分子不断被去除，从而达到血液净化的目的。图中左侧的浅色箭头表示吸附透析液的进出流动方向，右侧深色箭头表示血液的进出流动方向，血液透析器内的小箭头表示毒素分子的运动方向(由中空纤维膜4内到血液透析器外腔5中的吸附透析液中)。

图2是吸附透析治疗原理的示意图

此图表示的是图1中血液透析器内发生溶质交换的过程。中空纤维膜壁10是中空纤维膜侧壁的一部分，其左侧是流动的吸附透析液，右侧是血液，两者通过中空纤维膜壁10进行溶质交换。血液中游离的或者与血浆蛋白9结合的中小分子毒素8在吸附及扩散的作用下透过中空纤维膜壁10，从血液中进入吸附透析液，与溶解于吸附透析液中的偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料分子11结合，并跟随吸附透析液的流动除去。图中左侧实线箭头表示的是吸附透析液的流动方向，右侧实线箭头表示血液的流动方向，虚线箭头表示的是中小分子毒素8的运动方向。

具体实施方式

实施例1.偶联β-环糊精的水溶性淀粉的合成及在血液净化中的应用

第一步，制备吸附材料

称取粘均分子量范围在400～500KD的淀粉10克放入烧瓶中，向其中加入100ml 1mol/L的氢氧化钠，5ml二甲基亚砜，3ml环氧氯丙烷，然后在30℃下反应5小时，得到环氧活化的淀粉。向反应体系中加入3克β-环糊精，反应过

夜。经过滤，清洗，干燥得到产品。反应式如下：

n＝2469～3087(对应淀粉分子量范围为400～500KD)。

第二步，透析吸附液的配制

将1克偶联β-环糊精的水溶性淀粉溶解于1000ml乳酸盐透析液中，配制成浓度为0.1％(w/v)的吸附透析液。

第三步，血液吸附透析方法及其效果

应用偶联β-环糊精的水溶性淀粉吸附透析液对重症肝炎病人血浆进行模拟吸附透析，方法及效果如下：

取重症肝炎病人血浆置换下来的废弃血浆进行体外的模拟吸附透析实验，血浆中胆红素、胆汁酸、血氨、肌酐、尿素初始浓度分别为287mg/L、215.3μmol/L、84.8μmol/L、256μmol/L、15.84mmol/L。选用尼普洛三醋酸空心纤维透析器SUREFLUX-130G；200ml重症肝炎病人血浆循环于血液透析器内的中空纤维膜中，流速为100ml/min；配制好的浓度为0.1％的吸附透析液，体积为1000ml，通过血液透析器外腔，流速为20ml/min，并与中空纤维膜内的血液进行溶质交换，吸附透析时间为4小时。实验结果表明，对各种毒素的去除率分别为胆红素22.6％、胆汁酸37.1％、血氨20.4％、肌酐41.8％、尿素13.3％。实施例2～6.其它含有羟基的多糖衍生物及合成多聚物与取代β-环糊精反应制备吸附材料及其应用

采用相同的反应方法，实施例1的反应同样适用于在羟甲基淀粉、羟乙基淀粉、羟丙基淀粉、右旋糖酐以及聚乙烯醇上偶联取代的β-环糊精。它们的用量及反应条件与实施例1相同。对应反应物及产物结构表示在下表中。由于它们的共同特征在于多聚物主链上具有环糊精基团，因此具有相同的功能。

采用上述方法合成的偶联环糊精的水溶性多聚物，使用与实施例1相同的配制方法，配制成吸附透析液，并应用于体外的模拟吸附透析实验。使用相同的血浆得到相似的效果(见表1)。

实施例7.偶联磺丁基-β-环糊精的水溶性壳聚糖的合成及其应用

第一步，制备吸附材料

称取粘均分子量范围在90～100KD的壳聚糖10克放入烧瓶中，向其中加入100ml 1mol/L的氢氧化钠，5ml二甲基亚砜，3ml环氧氯丙烷，然后在30℃下反应5小时，得到环氧活化的壳聚糖。向反应体系中加入3克磺丁基-β-环糊精，反应过夜。经过滤，清洗，干燥得到产品。反应式如下：

n＝559～622(对应壳聚糖分子量范围为90～100KD)。

第二步，透析吸附液的配制

将1克偶联磺丁基-β-环糊精的水溶性壳聚糖溶解于100ml醋酸盐透析液中，配置成浓度为1％(w/v)的吸附透析液。

第三步，血液吸附透析方法及其效果

应用偶联磺丁基-β-环糊精的水溶性壳聚糖吸附透析液对重症肝炎病人血浆进行模拟吸附透析，方法及效果如下：

取重症肝炎病人血浆置换下来的废弃血浆进行体外的模拟吸附透析实验，血浆中胆红素、胆汁酸、血氨、肌酐、尿素初始浓度分别为287mg/L、215.3μmol/L、84.8μmol/L、256μmol/L、15.84mmol/L。选用尼普洛三醋酸空心纤维透析器SUREFLUX-130G；200ml重症肝炎病人血浆循环于血液透析器内的中空纤维膜中，流速为150ml/min；配制好的浓度为1％的吸附透析液，体积为1000ml，通过血液透析器外腔，流速为200ml/min，并与中空纤维膜内的血液进行溶质交换，吸附透析时间为6小时。实验结果表明，对各种毒素的去除率分别为胆红素33.9％、胆汁酸51.0％、血氨36.1％、肌酐54.4％、尿素19.6％。

实施例8～9.壳聚糖衍生物与取代β-环糊精反应制备吸附材料及应用

采用相同的反应方法，实施例7的反应同样适用于在O-羟乙基壳聚糖、O-羟丙基壳聚糖上偶联取代的β-环糊精。它们的用量及反应条件与实施例7相同。对应反应物及产物结构表示在下表中。它们的共同特征在于多聚物主链上具有环糊精基团，因此具有相同的功能。

采用上述合成的血液透析用的水溶性多聚物使用与实施例7相同的配制方法，配制成吸附透析液，并应用于体外的模拟吸附透析实验。使用相同的血浆得到相似的效果(见表1)。

实施例10.偶联β-环糊精的水溶性聚乙烯亚胺的合成及在血液净化中的应用

第一步，制备吸附材料

称取10克β-环糊精放入烧瓶中，向其中加入1000ml水，1.95克高碘酸钠，pH 6反应4小时；反应结束后调节pH为8.5，向反应体系中加入粘均分子量范围在6～20KD的聚乙烯亚胺7克，反应过夜；加入硼氢化钠还原双键，经过滤，清洗，干燥得到产品。

第二步，透析吸附液的配制

将15克反应产物溶解于50ml碳酸氢盐透析液中，配置成浓度为30％(w/v)的吸附透析液。

第三步，血液吸附透析方法及其效果

应用配制的吸附透析液对重症肝炎病人血浆进行模拟吸附透析，方法及效果如下：

取重症肝炎病人血浆置换下来的废弃血浆进行体外的模拟吸附透析实验，血浆中胆红素、胆汁酸、血氨、肌酐、尿素初始浓度分别为287mg/L、215.3μmol/L、84.8μmol/L、256μmol/L、15.84mmol/L。选用尼普洛三醋酸空心纤维透析器SUREFLUX-130G；200ml重症肝炎病人血浆循环于血液透析器内的中空纤维膜中，流速为300ml/min；配制好的浓度为30％的吸附透析液，体积为1000ml，通过血液透析器外腔，流速为500ml/min，并与中空纤维膜内的血液进行溶质交换，吸附透析时间为8小时。实验结果表明，对各种毒素的去除率分别为胆红素35.7％、胆汁酸58.2％、血氨36.4％、肌酐52.0％、尿素26.5％。

表1不同吸附材料对肝病病人血液中主要毒素分子的去除率及与MARS系统的比较

^*MARS系统相关数据来自STEFFEN R.MITZNER，JAN STANGE，SEBASTIAN KLAMMT，PIOTR PESZYNSKI，REINHARDT SCHMIDT and GABRIELE 

Extracorporeal Detoxification Using the Molecular Adsorbent Recirculating System for CriticallyIll Patients with Liver Failure，JAm Soc Nephrol，12：S75-S82，2001

Claims (3)

1.一种偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料，其特征在于，该多聚物具有式(I)的结构：

式中，R选自粘均分子量范围为6KD～500KD的带有氨基或羟基的天然多糖及其衍生物或者化学合成多聚物；X选自带有O原子、N原子或者OH基团的C₀～C₆烷链；CD选自β-环糊精或取代的β-环糊精。

2.按照权利要求1所述的一种偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料，其特征在于，所述带有氨基或羟基的天然多糖及其衍生物选自淀粉、羟甲基淀粉、羟乙基淀粉、羟丙基淀粉、右旋糖酐、壳聚糖、O-羟乙基壳聚糖或O-羟丙基壳聚糖；所述带有氨基或羟基的化学合成多聚物选自聚乙烯亚胺或聚乙烯醇。

3.按照权利要求1所述的一种偶联环糊精的水溶性多聚物吸附材料，其特征在于，β-环糊精上羟基的氢原子被取代的基团为羧烷基、C₁～C₄烷基、羟烷基、磺酸基或亚烷磺酸基。

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