CN111250055B - 基于壳聚糖的血液灌流吸附剂及其在制备用于脓毒血症血液净化的血液灌流器中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于壳聚糖的血液灌流吸附剂，属于血液接触材料技术领域，该基于壳聚糖的血液灌流吸附剂为交联壳聚糖微球，本发明还公开了上述的基于壳聚糖的血液灌流吸附剂在制备用于脓毒血症血液净化的血液灌流器中的应用；本发明的血液灌流吸附剂具有较高的内毒素及细菌吸附能力和良好的机械强度，可高效地清除脓毒血症患者血液中的内毒素及致病细菌如金黄色葡萄球菌及大肠埃希氏菌，是一种具有应用前景的专用于脓毒血症患者血液净化治疗的新型吸附剂。

Description

基于壳聚糖的血液灌流吸附剂及其在制备用于脓毒血症血液 净化的血液灌流器中的应用
本申请为专利申请号：201910758030.1、发明名称：基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂、其制备方法及应用、申请日：2019.08.16的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物材料/血液接触材料技术领域，尤其涉及一种基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂、其制备方法及应用。
背景技术
脓毒血症指继发于感染的威胁生命的多器官功能衰竭，它是重症监护病房中导致患者急性肾损伤的最主要原因，其在全球范围内年发病人数超过3150万，每年致死人数超530万。脓毒血症的传统治疗方式包括广谱抗生素的使用、及时的液体复苏及必要时血管升压药的应用。然而，即使广谱抗生素已在脓毒血症患者的治疗中广泛运用，脓毒血症患者的死亡率仍高达20-50％。在脓毒血症中，血液中较高的内毒素浓度和细菌负荷均与患者多器官功能衰竭严重程度及病死率均密切相关。既往研究证实，包括内毒素吸附在内的诸多血液净化技术是脓毒血症患者危重状况下(进展至重症脓毒血症和脓毒性休克)重要的辅助治疗。目前，商业化的内毒素吸附材料包括Oxiris膜及多粘菌素B吸附柱等。多项随机对照临床试验结果表明，多粘菌素B吸附柱用于脓毒血症患者治疗时无法显著地改善患者28天生存率，具体原因可能是多粘菌素B吸附柱在治疗过程中无法实现对内毒素及致病细菌的有效清除，单一的内毒素吸附治疗模式可能严重影响其对脓毒血症的治疗效果。(Dellinger RP,Bagshaw SM,Antonelli M,et al.Effect of Targeted Polymyxin BHemoperfusion on28-Day Mortality in Patients With Septic Shock and ElevatedEndotoxin Level:The EUPHRATES Randomized Clinical Trial[J].JAMA.2018；320(14):1455–1463.)。
解决脓毒血症血液净化难点的突破点可能在于研发可同时从血液中有效清除内毒素及致病细菌的血液灌流吸附剂。这种杂合的治疗模式可最大程度地通过血液灌流减少脓毒血症发病及进展中的两个关键致病因子：内毒素及致病细菌。目前，仅有部分科研人员研发出有望应用于临床实践的兼顾内毒素吸附及细菌捕获功能的血液净化设备。如，(Kang,J.H.et al.An extracorporeal blood-cleansing device for sepsis therapy[J].Nat.Med.20,1211–1216(2014).)但这种新型的血液净化设备也存在着缺陷：基于磁性纳米粒子的血液灌流吸附剂可能随着血流进入人体内部，在体内代谢过程中可能引起人体额外的器官功能损害。因而，研发具有宏观结构的兼有内毒素吸附及细菌捕获功能的血液灌流吸附剂具有重要的临床意义及巨大的经济社会价值。
同时，在传统血液灌流治疗过程中，需要注射肝素来防止血液凝结，这不仅增加了治疗成本，而且增加了患者因系统性抗凝导致的严重大出血的风险；考虑到脓毒血症患者病程中常常并发凝血功能障碍这一特殊临床问题，具有自抗凝特性的血液灌流吸附剂相较于传统治疗模式能更小程度地影响患者凝血系统功能，更好地防止血液净化过程中(后)严重大出血的发生。
目前内毒素吸附剂研发的主要方向仍停留于将带正电荷的配体(如多粘菌素B、丝氨酸及聚乙烯亚胺等)通过化学反应接枝在基材表面通过静电作用实现对带负电荷的内毒素的吸附。如Mariia Vorobii等人将多粘菌素B接枝在聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球表面实现了从血浆中吸附内毒素(Mariia Vorobii,et al.Antifouling Microparticles ToScavenge Lipopolysaccharide from Human Blood Plasma[J].Biomacromolecules,2019,20:959-968)；Tiefan Huang等人则将丝氨酸接枝在聚砜膜表面制备了对内毒素具有亲和吸附作用的血液接触材料，有望从血浆中吸附内毒素(Tiefan Huang,et al.A novelpolysulfone-based affinity membrane with high hemocompatibility:preparationand endotoxin elimination performance[J].RSC Adv.,2013,3,25982)。但这些技术最主要的缺陷在于吸附剂对内毒素的吸附效能明显受到可接枝配体的最大量的影响，同时复杂的化学反应可能给血液灌流吸附剂的工业化生产带来更多难题。
壳聚糖是自然界中存在的唯一带正电荷的多糖，它具有良好的生物相容性及亲水性，已被多个研究作为基材用于血液净化材料的研发。(YI Y,LAI C,JIANG Y,etal.Preparation of amino-reserved magnetic chitosan microsphere and itsapplication in adsorbing endotoxin[M])卡拉胶则具有类似于传统抗凝剂肝素的分子结构，在Xin Song等作者的研究中被证实可显著延长血液凝血时间，可作为制备自抗凝血液灌流吸附剂的原料(Xin Song，et al.Design of Carrageenan-Based Heparin-MimeticGel Beads as Self-Anticoagulant Hemoperfusion Adsorbents[J].Biomacromolecules,2018,19:1966-1978)。
对于壳聚糖与卡拉胶联合的应用，梁西潮等(“壳聚糖/卡拉胶复合水凝胶的制备及其软骨修复潜在应用”)公开了采用壳聚糖和卡拉胶分别溶解后按一定比例混合，再加入环氧氯丙烷进行交联制得壳聚糖/卡拉胶复合水凝胶，并公开了该复合凝胶具有良好的细胞相容性，并且能够促进软骨细胞ATDC5的粘附、增殖与生长。而将壳聚糖和卡拉胶联合用于血液灌流吸附剂，却未见报道。
发明内容
本发明的目的旨在针对现有技术中存在的技术缺陷，提供一种基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂，该自抗凝血液灌流吸附剂的特点是其不仅具有优异的血液相容性、较高的毒素吸附能力、良好的机械强度，而且具有类似传统抗凝剂肝素的优异抗凝血特性。
本发明的目的之一，在于提供一种基于壳聚糖的血液灌流吸附剂，采用的技术方案为：所述吸附剂包括交联壳聚糖微球。
作为优选的技术方案：所述交联壳聚糖微球是采用京尼平作为交联剂制成。
作为优选的技术方案：所述吸附剂的平均粒径为1-2mm。合适的粒径以便于作为吸附材料装填血液灌流器的灌流柱。若吸附剂尺寸太小，在使用的过程中，不仅难以回收，而且灌流柱中堆叠成的空隙太小，从而对血液通过产生较大阻力，甚至可能阻碍血流的通过，影响血液灌流器的使用；若吸附剂尺寸太大，则灌流柱内填充的吸附材料太少，灌流柱的空间利用率会大大降低，进而影响毒素清除能力。
以往传统的思路都是需要在一种特定的基材上接枝某种功能配体实现吸附，在本申请中，壳聚糖同时具有基材及配体的作用，无需额外的化学反应将配体接枝到基材表面，所以无需要考虑到化学反应对接枝量的影响；从而解决了传统的吸附剂对内毒素的吸附效能明显受到可接枝配体的最大量的影响、并且复杂的化学反应(接枝)可能给血液灌流吸附剂的工业化生产带来更多难题的问题，另外，这样的工艺也更简化，成本更低。
如前所述，虽然已被多个研究作为基材用于血液净化材料的研发，但是，未见采用特定的交联剂进行交联的壳聚糖作为脓毒血症血液净化中的应用，为了解释原因，有必要对于血液净化的相关知识进行解释说明：
不同的需要进行血液净化的疾病，比如肝衰竭、肾衰竭、药物中毒及脓毒血症等的致病因素完全不同，患者体内的毒素也完全不同，虽然都可采用血液净化治疗，但具体接受的血液净化模式是完全不同的：血液净化只是一种笼统的概念，而不是一种具体的治疗模式，上述每种疾病选择的具体血液治疗设备(即血液透析器或血液灌流器或血浆分离器)也完全不同：
1、首先，“内毒素”和“毒素”是完全不同的概念；“内毒素”是脓毒血症患者体内特有的致病因子，其本质是脂多糖，是来源于致病细菌细胞壁的固有结构；而一般意义上的“毒素”只是一种笼统的概念，上述各种疾病中患者体内异常蓄积的物质都可能是毒素，比如胆红素，肌酐，β2微球蛋白，甲状旁腺激素，自身抗体，血钾，药物，细胞因子等等；这些完全不同的物质，需要完全不同的血液净化模式去清除它们，所涉及到的净化原理亦完全不同；
2、然后，具体来说，脓毒血症患者体内的“毒素”主要包括内毒素、血液中的致病细菌及机体免疫系统过度应答产生的炎性细胞因子；脓毒血症患者体内蓄积的“毒素”具有多样性及复杂性的特点；：用现有的血液灌流材料非特异性的吸附不能实现患者的有效治疗，所以必须要专病专用。目前的用于脓毒血症血液净化的临床产品(如多粘菌素B吸附柱及oXiris膜)都专注于内毒素的清除，而忽略了细菌本身对疾病进展的影响；目前没有临床产品能实现细菌的有效清除，而脓毒症的血液净化需要清除的毒素和其他疾病的血液净化需要清除的毒素不同，所以需要研发新的血液灌流器以解决这一问题；
3、本专利涉及的壳聚糖吸附剂的治疗机理是：壳聚糖微球所制成的血液灌流器，在接触脓毒血症患者血液后可直接清除血液中的内毒素及致病细菌，其主要原理是吸附，这同多粘菌素B吸附柱的治疗模式相同，可以实现内毒素及致病细菌的同时清除。oXiris膜的治疗机理是：oXiris膜本身即是血液透析滤过膜，可通过“弥散+对流”的治疗机理清除脓毒血症患者血液中的中、小分子毒素(包括细胞因子)；oXiris膜上预接枝的聚乙烯亚胺可通过吸附内毒素；oXiris膜不能实现致病细菌的清除
其他疾病的血液净化原理简述：
1)药物中毒：临床上选择树脂类的血液灌流吸附剂，将血液中异常蓄积的亲水性药物通过树脂的非特异性“吸附”作用清除，主要是物理吸附，类似于活性炭的作用；现有的研究结果表明树脂类的血液灌流吸附剂对脓毒血症患者的血液净化治疗无法改善患者预后，治疗无效。
2)肝衰竭：肝脏是人体内重要的代谢解毒器官，肝衰竭时患者体内胆红素、血氨等毒素浓度升高，体内凝血因子合成不足，患者出血风险增加，故临床上人工肝系统多选用“血浆置换”的血液净化模式对此类患者进行治疗，即将患者血液中的血浆全数分离出，然后输入健康人正常血浆实现治疗，是一种非特异性的血液净化治疗。
3)肾衰竭：慢性肾衰竭患者多接受血液透析治疗，即通过血液透析膜在“弥散”这一治疗机理下实现小分子毒素(肌酐、尿素氮、胍类等数千种毒素)的非特异性清除，。如果需要实现中分子毒素的清除，则需要采用血液透析滤过模式，利用“对流”的治疗机理清除中分子毒素(如β2微球蛋白及甲状旁腺激素等)。
总的来说，对于脓毒血症血液净化与其他非脓毒血症(比如肝衰竭、肾衰竭、药物中毒等)血液净化的治疗机理及需要清除的“毒素”完全不同；必须设计专门的血液净化装置治疗脓毒血症。
而本发明中，通过试验证实，采用经过交联的壳聚糖微球，就可以实现脓毒血症患者血液中内毒素和细菌的有效清除。
本发明的目的之二，在于提供一种上述的基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂的制备方法，采用的技术方案为：
包括以下步骤：
(1)将质量百分数1-3％的壳聚糖溶液滴入氢氧化钠溶液中，浸泡4-6小时后将壳聚糖微球从氢氧化钠溶液中捞出，经清洗即得到未交联的壳聚糖微球，将所得未交联的壳聚糖微球置于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中储存；将壳聚糖微球在氢氧化钠溶液中浸泡有利于壳聚糖微球硬化，增强其机械强度；
发明人通过大量实验证明，滴入的氢氧化钠溶液物质的量浓度可以为0.1-0.5mol/L，氢氧化钠浓度对于成球效果影响不大，只要在碱性条件下均可成球，氢氧化钠浓度的高低完全不会引起微球中壳聚糖的含量变化，微球中壳聚糖的含量是由壳聚糖初始浓度决定的；
(2)将步骤(1)所得未交联的壳聚糖微球浸入质量分数0.5-1％的京尼平溶液中，在弱碱性(pH＝8-9)及恒温水浴(T＝50-70℃)条件下壳聚糖与京尼平发生交联，反应时间12-24小时，从而制备出京尼平交联后的壳聚糖微球，反应结束后将交联后的壳聚糖微球捞出，经去离子水反复清洗后置于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中储存，所述交联反应中壳聚糖微球的湿重与京尼平溶液的体积比值为1g/5mL至2g/5mL；所述反复清洗方式为将反应所得产物放置于去离子水中浸泡振荡至少12h，总计3次以上；
将步骤(2)中所得的京尼平交联后的壳聚糖微球持续浸泡在质量分数1-2％的卡拉胶溶液中，浸泡时间0.5-2小时，浸泡时通过水浴维持卡拉胶溶液温度在50-70℃，得到已均匀涂覆卡拉胶溶液的交联后的壳聚糖微球；所述浸泡过程中交联后壳聚糖微球的湿重与卡拉胶溶液的体积比值为1g/5mL至2g/5mL；
(4)将步骤(3)所得的已均匀涂覆卡拉胶溶液的交联后的壳聚糖微球置入氯化钾溶液中形成壳聚糖-卡拉胶杂合微球，使卡拉胶在壳聚糖表面形成均匀的凝胶薄膜层；浸泡4-6小时后将壳聚糖-卡拉胶杂合微球捞出，经去离子水反复清洗后置于pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中储存。
氯化钾溶液有助于提高卡拉胶形成凝胶的速率，且可使形成的卡拉胶微球硬化，增强卡拉胶微球的机械强度；为了确保壳聚糖-卡拉胶杂合微球具有一定的机械强度，本发明中将壳聚糖-卡拉胶杂合微球在氯化钾溶液中浸泡4-6h后再使用。
为了达到需要的性能，本发明的制备方法有别于现有的方法，先形成壳聚糖的微球，然后交联，然后再在表面形成卡拉胶的凝胶。
作为优选的技术方案，所述壳聚糖溶液的制备方法为：将壳聚糖粉末溶解到质量百分数为2％的醋酸溶液中得到壳聚糖溶液；所述壳聚糖粉末与2％醋酸溶液的重量比为2:98。
作为优选的技术方案，采用微球制备装置制备步骤(1)所述壳聚糖微球，所述微球制备装置包括气体控制阀、储液罐、液体控制阀、针头和加热带；所述储液罐为由罐体和顶盖组合形成的密闭容器，所述气体控制阀安装在与储液罐顶盖连接的进气管上，所述针头安装在与储液罐底部连接的出液管端部的出液口处，所述液体控制阀安装在与储液罐连接的出液管上；针头的针孔孔径为0.3-0.5mm。这样可以使得到的壳聚糖微球平均粒径在1-2mm。
使用时，取下顶盖，将壳聚糖溶液装入储液罐罐体中，再盖上顶盖，然后操作气体控制阀向储液罐中的液面施加恒定气压，并开启液体控制阀使壳聚糖溶液从针头中流出滴入0.1-0.3mol/L的氢氧化钠溶液中凝固成壳聚糖微球。
作为优选的技术方案，步骤(2)中，所述京尼平溶液的质量分数0.5％，其制备方法为：将京尼平溶解到乙醇/去离子水混合溶液中得到的，京尼平与乙醇/去离子水混合溶液的重量比为1:199；所述乙醇/去离子水混合溶液是无水乙醇溶解到去离子水中得到的，无水乙醇与去离子水的重量比为1：99至5:95。
作为优选的技术方案，步骤(4)中，所述氯化钾溶液的浓度为0.3-1mol/L。
本发明提供的这种基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂，包括经京尼平交联后的网络结构的壳聚糖微球及经卡拉胶凝胶表面改性后的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(即自抗凝血液灌流吸附剂)。壳聚糖是自然界中存在的唯一带正电荷的多糖，它具有良好的生物相容性及亲水性，可作为吸附内毒素及致病细菌的基材(同时也是配体)，其经京尼平交联后形成网络结构的壳聚糖微球力学强度较未交联前明显提升，其机械强度相较于单纯的壳聚糖微球提升了50％以上，满足血液灌流对以体外循环中血液灌流器机械强度的需要。卡拉胶是一种从天然红藻中提取出来的多糖，其具有增稠、独特的热可逆凝胶化、抗蛋白凝结、亲水无毒、可生物降解等多种特点；此外，卡拉胶具有与传统抗凝剂肝素相似的分子结构，具有一定的抗凝特性。将卡拉胶引入上述经京尼平交联的壳聚糖微球表面，制备出的壳聚糖-卡拉胶杂合微球，同时具有吸附毒素(内毒素、致病细菌)及抗凝血特性；将其作为吸附剂填充如血液灌流器，在应用时可很大程度地减少血治疗过程中传统抗凝剂肝素的使用，极大地降低治疗成本和肝素带来的出血风险。
上述基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂实质是凝胶微球。凝胶微球本身的疏松多孔的网状结构，可以与内毒素及致病细菌有更充分的接触，其中丰富的氨基(来自壳聚糖)使得吸附剂具有丰富的正电荷，因此对于内毒素及细菌具有良好的清除能力。
本发明的目的之三，在于提供上述的基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂在制备专用于血液净化治疗的血液灌流器中的应用。
作为优选的技术方案：所述血液净化治疗为脓毒血症患者血液净化治疗。本发明的壳聚糖-卡拉胶杂合微球可以通过多靶点独特地应用于脓毒血症患者的血液净化(灌流)治疗，原理如下：
1、在壳聚糖-卡拉胶杂合微球中，壳聚糖可同时作用于内毒素和不同的致病细菌；
2、卡拉胶凝胶的表面改性可赋予壳聚糖-卡拉胶杂合微球独特的抗凝血性能，这种性能在血液净化过程中是有好处的，可减少抗凝剂使用和由抗凝剂使用带来的出血风险。
3、因此，壳聚糖-卡拉胶杂合微球可以更好的保护脓毒血症患者，从更多的靶点实现血液净化。
目前，尚未有将采用本发明的方法制备的杂合微球用于血液灌流；况且，本发明的杂合微球，尤其适用于脓毒血症患者血液净化治疗，相对于传统的血液灌流应用领域，包括急性药物和毒物中毒、急慢性肾衰竭以及肝性脑病等等，脓毒血症患者血液净化有其特殊的治疗要求，现有的普通血液灌流材料是不能满足的。专病专用，这个也是目前和今后血液净化治疗的趋势。
与现有技术相比，尤其是与现有的用于脓毒血症血液灌流的材料相比，本发明的优点在于：
1、本发明提供的基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂是经京尼平交联后的网络结构的壳聚糖微球及经卡拉胶凝胶表面改性后的壳聚糖-卡拉胶杂合微球；该吸附剂基于天然多糖卡拉胶及壳聚糖制备而成，具有优良的血液相容性，且具有与肝素分子类似的结构和功能基团，表现出优异的抗凝血性能；
2、本发明提供的基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂，本身的疏松多孔的网状结构，可以与内毒素及致病细菌有更充分的接触，其中丰富的氨基(来自壳聚糖)使得吸附剂具有丰富的正电荷，因此对于内毒素及细菌具有良好的清除能力；本发明创新性地将传统血液灌流吸附剂设计中配体及相应的基材(均为壳聚糖)有机结合在一起无需额外的化学反应将配体接枝到基材表面，简化了制备工艺；
3、本发明提供的基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂，经京尼平交联后提升了吸附剂的机械性能，可以有效避免微球在使用过程中破裂，满足临床血液灌流治疗的需求，且可在使用中保持微球尺寸的稳定性；
4、本发明提供的基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂，通过将壳聚糖微球浸泡入卡拉胶溶液后实现卡拉胶在壳聚糖微球表面的均匀涂覆，最终实现壳聚糖微球血液相容性的提升，赋予壳聚糖微球自抗凝特性，其制备工艺简单、条件温和，并且全程反应在溶液中进行，不需要有机溶剂作为反应介质，不仅绿色环保，而且避免了有机溶剂对于环境和人体的危害，同时也减少了因回收有机溶剂而带来的繁琐处理流程；
5、本发明提供的基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂的制备方法，由于液-液相转化法制备可壳聚糖微球，不仅操作简便，而且通过控制制备过程中液滴的大小来调节微球尺寸的大小，实现微球尺寸可控；
6、本发明提供的基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂的制备方法，卡拉胶和壳聚糖均是天然多糖，为常用化工原料，资源丰富、成本低廉，有利于工业化生产，因此易于在生物医药领域内推广应用；
7、本发明提供的基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂，不仅具有优异的吸附性能、良好的生物相容性和机械性能，而且具有优异的抗凝血性能，是一种具有应用前景的尤其专用于脓毒血症患者血液净化治疗的生物材料(血液接触材料)。
附图说明
图1为本发明所述方法制备基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂的流程示意图；
图2为本发明所述方法中使用的微球制备装置示意图；其中，1-气体控制阀、2-储液罐、21-顶盖、22-罐体、3-液体控制阀、4-针头；
图3为本发明实施例1步骤(4)制备的京尼平交联的壳聚糖微球(C2)和实施例1步骤(7)以及实施例2步骤(7)得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(分别为C2-K1和C2-K2)的红外光谱图；
图4为本发明实施例1步骤(2)制备的未交联壳聚糖微球(CS)及步骤(4)制备的京尼平交联的壳聚糖微球(C2)的形变率随压强的变化示意图；
图5为本发明实例1步骤(7)制备的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(C2-K1)在血液中吸附内毒素时内毒素浓度的变化图及实时内毒素吸附量变化图；
图6为本发明实施例1步骤(4)制备的京尼平交联的壳聚糖微球(C2)和实例1步骤(7)以及实施例2步骤(7)得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(分别为C2-K1和C2-K2)在血液中吸附金黄色葡萄球菌时金黄色葡萄球菌浓度变化图(黑色柱状图)及经计算得出的细菌清除率(灰色柱状图)。
图7为本发明实施例1步骤(4)制备的京尼平交联的壳聚糖微球(C2)和实例1步骤(7)以及实施例2步骤(7)得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(分别为C2-K1和C2-K2)在血液中吸附大肠埃希氏菌时大肠埃希氏菌浓度变化图(黑色柱状图)及经计算得出的细菌清除率(灰色柱状图)。
图8为本发明实施例1步骤(4)制备的京尼平交联的壳聚糖微球(C2)和实例1步骤(7)以及实施例2步骤(7)得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(分别为C2-K1和C2-K2)的凝血时间图(包括活化的部分凝血酶原时间及凝血酶时间，结果分别以黑色及灰色柱状图表示)。
具体实施方式
以下将通过实施例并结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。
本发明提供的基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂的制备流程如图1所示，首先利用液-液相转化技术将壳聚糖溶液转变为壳聚糖微球，然后将壳聚糖微球浸泡入京尼平溶液中，在弱碱性(pH＝8-9)及恒温水浴(T＝50-70℃)条件下壳聚糖与京尼平发生交联，从而制备出力学强度更高的壳聚糖微球。最后依靠卡拉胶自身独特的热可逆凝胶化特性，将上述已交联后的壳聚糖微球浸入卡拉胶溶液中，经静电作用及氢键作用使卡拉胶在壳聚糖微球表面均匀涂覆后，再将微球从溶液中捞出，滴入冰浴的氯化钾溶液中，使卡拉胶在壳聚糖表面形成均匀的凝胶薄膜层，最终制备出壳聚糖-卡拉胶杂合微球(即自抗凝血液灌流吸附剂)。
下述实施例中，制备壳聚糖微球制备装置如图2所示，包括气体控制阀1、储液罐2、液体控制阀3和针头4；所述储液罐2为由罐体22和顶盖21组合形成的密闭容器，气体控制阀1为手动阀，安装在与储液罐顶盖21连接的进气管上，用于控制储液罐内的气压；液体控制阀3为手动阀，安装在与储液罐连接的出液管上；针头4安装在与储液罐底部连接的出液管端部的出液口处，并位于针头4之上。
实施例1
本实施例所采用的原料均按重量份计，本实施例制备基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂的制备过程如下：
(1)将2份醋酸加入到98份的去离子水中，得到质量分数为2％的醋酸溶液；将2份壳聚糖加入到98份质量分数为2％的醋酸溶液磁力搅拌4小时得到质量分数为2％的壳聚糖溶液；
(2)将2％的壳聚糖溶液加入微球制备装置的储液罐中，然后操作气体控制阀通过空气压缩机向储液罐中的液面施加气压，并开启液体控制阀使2％的壳聚糖溶液滴入物质的量浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液中形成壳聚糖微球，浸泡4小时后将壳聚糖微球从氢氧化钠溶液中使其硬化，稍后捞出，经清洗即得到壳聚糖微球，将所得壳聚糖微球置于磷酸盐缓冲液(pH7.2-7.4)中储存；
(3)将5份无水乙醇加入到95份的去离子水中，得到质量分数5％的乙醇/去离子水溶液；将1份京尼平加入到199份的乙醇/去离子水溶液中，得到质量分数0.5％的京尼平溶液；
(4)将未交联的壳聚糖微球浸入质量分数0.5％的京尼平溶液中，在弱碱性(pH＝8)及恒温水浴(T＝50℃)条件下壳聚糖与京尼平发生交联，反应时间12小时，制备出京尼平交联后的壳聚糖微球，反应结束后将交联后的壳聚糖微球捞出，经去离子反复清洗后(即图3中的“C2”)置于磷酸盐缓冲液(pH7.2-7.4)中储存，所述交联反应中壳聚糖微球的湿重与京尼平溶液的体积比值为2g：5mL。
(5)于50-70℃、搅拌条件下，将1份卡拉胶溶解于99份去离子水中得到质量分数1％的卡拉胶水溶液；
(6)将京尼平交联后的壳聚糖微球持续浸泡在上述质量分数1％的卡拉胶溶液中，浸泡时间0.5小时，浸泡时通过水浴维持卡拉胶溶液温度在50-70℃；所述浸泡过程中交联后壳聚糖微球的湿重与卡拉胶溶液的体积比值为2g：5mL；
(7)将已均匀涂覆卡拉胶溶液的交联后的壳聚糖微球置入浓度0.3mol/L氯化钾溶液中形成壳聚糖-卡拉胶杂合微球，使卡拉胶在壳聚糖表面形成均匀的凝胶薄膜层；浸泡4-6小时后使微球进一步硬化，稍后将壳聚糖-卡拉胶杂合微球捞出，经去离子反复清洗后(即图3中的“C2-K1”)置于磷酸盐缓冲液(pH7.2-7.4)中储存。
实施例2
本实施例所采用的原料均按重量份计，本实施例制备基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂的制备过程如下：
(1)将2份醋酸加入到98份的去离子水中，得到质量分数为2％的醋酸溶液；将2份壳聚糖加入到98份质量分数为2％的醋酸溶液磁力搅拌4小时得到质量分数为2％的壳聚糖溶液；
(2)将2％的壳聚糖溶液加入微球制备装置的储液罐中，然后操作气体控制阀通过空气压缩机向储液罐中的液面施加气压，并开启液体控制阀使2％的壳聚糖溶液滴入物质的量浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液中形成壳聚糖微球，浸泡4小时后将壳聚糖微球从氢氧化钠溶液中使其硬化，稍后捞出，经清洗即得到壳聚糖微球，将所得壳聚糖微球置于磷酸盐缓冲液(pH7.2～7.4)中储存；
(3)将5份无水乙醇加入到95份的去离子水中，得到质量分数5％的乙醇/去离子水溶液；将1份京尼平加入到199份的乙醇/去离子水溶液中，得到质量分数0.5％的京尼平溶液；
(4)将未交联的壳聚糖微球浸入质量分数0.5％的京尼平溶液中，在弱碱性(pH＝8)及恒温水浴(T＝50℃)条件下壳聚糖与京尼平发生交联，反应时间12小时，制备出京尼平交联后的壳聚糖微球，反应结束后将交联后的壳聚糖微球捞出，经去离子反复清洗后置于磷酸盐缓冲液(pH7.2～7.4)中储存，所述交联反应中壳聚糖微球的湿重与京尼平溶液的体积比值为2g：5mL。
(5)于50-70℃、搅拌条件下，将2份卡拉胶溶解于98份去离子水中得到质量分数2％的卡拉胶水溶液；
(6)将京尼平交联后的壳聚糖微球持续浸泡在上述质量分数2％的卡拉胶溶液中，浸泡时间0.5小时，浸泡时通过水浴维持卡拉胶溶液温度在50-70℃；所述浸泡过程中交联后壳聚糖微球的湿重与卡拉胶溶液的体积比值为2g：5mL；
(7)将已均匀涂覆卡拉胶溶液的交联后的壳聚糖微球置入浓度0.3mol/L氯化钾溶液中形成壳聚糖-卡拉胶杂合微球，使卡拉胶在壳聚糖表面形成均匀的凝胶薄膜层；浸泡4-6小时后使微球进一步硬化，稍后将壳聚糖-卡拉胶杂合微球捞出，经去离子反复清洗后(即图3中的“C2-K2”)置于磷酸盐缓冲液(pH7.2-7.4)中储存。
实施例3
实施例1和2所制备的基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂的成分、结构、机械强度、吸附性能和抗血凝性能检测：
1、成分及结构检测
分别对实施例1步骤(4)得到的京尼平交联后的壳聚糖微球和步骤(7)以及实施例2步骤(7)得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(分别为C2-K1和C2-K2)进行傅里叶变换红外光谱检测，结果如图3所示；从图3中可以发现，C2-K1和C2-K2的红外图谱中在波长929cm-1和846cm-1处分别出现3,6-脱水-D-半乳糖和D-半乳糖-4-硫酸酯基团的吸收峰，证实卡拉胶已成功引入交联后的壳聚糖微球表面，即成功制备出基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂。
2、机械强度检测
使用万能材料试验机对实施例1步骤(2)制备的未交联壳聚糖微球(CS)及步骤(4)制备的京尼平交联的壳聚糖微球(C2)进行压缩测试，得到其形变率随压强变化示意图，如图4所示，从图4中可以发现，经京尼平交联后微球的力学强度提升50％以上，从而满足血液灌流治疗时对吸附剂力学强度的需求。
3、吸附性能检测
分别利用实施例1步骤(4)得到的京尼平交联后的壳聚糖微球和步骤(7)以及实施例2步骤(7)得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球对血液中内毒素及细菌进行清除。
吸附量的计算公式如下：
Figure BDA0002385159110000181
其中公式中q(EU/g)代表微球的吸附量，C0和Ct分别代表内毒素在起始时和吸附了t小时的浓度(Eu/mL)，V(mL)代表内毒素的体积，m(g)代表所采用的自抗凝类肝素微球的干态质量。
吸附清除率的计算公式如下：
Figure BDA0002385159110000182
其中公式中Clearance(％)代表微球对内毒素或致病细菌的吸附清除率，C0和Ct分别代表内毒素或致病细菌在起始时和吸附了t小时的浓度。
3.1取实施例1步骤(4)得到的京尼平交联后的壳聚糖微球(C2)和步骤(7)以及实施例2步骤(7)得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球1g(湿重)放入到2mL初始浓度为120EU/mL内毒素磷酸盐缓冲溶液中，于37℃恒温振荡吸附3小时，利用
Figure BDA0002385159110000191
Portable TestSystem(PTSTM)仪器(来自Charles River Laboratories International,Inc.US)在鲎试剂试剂盒(敏感度0.05-5.0EU/mL)下检测吸附前后磷酸盐缓冲液中内毒素的变化，计算基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂对内毒素的吸附量(EU/g)及吸附清除率，结果：
实施例1步骤(4)得到的京尼平交联后的壳聚糖微球(C2)在磷酸盐缓冲液中对内毒素的吸附量为219.8EU/g，吸附清除率为90.8％；
实施例1步骤(7)所得到的所得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(C2-K1)在磷酸盐缓冲液中对内毒素的吸附量为202.8EU/g，吸附清除率为83.8％；
实施例2步骤(7)所得到的所得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(C2-K2)在磷酸盐缓冲液中对内毒素的吸附量为137.6EU/g，吸附清除率为53.9％。
从上述结果可以看出，表面有了卡拉胶以后内毒素吸附会下降，这是合情合理的，卡拉胶的负电荷降低了内毒素的吸附。在本发明中，卡拉胶主要是用来改善生物相容性，存在卡拉胶含量和壳聚糖含量的一个权衡，壳聚糖越多吸附性能越好，但生物相容性差。所以，本发明关注的点在如何权衡和取舍卡拉胶的量，最后选用于在血液中吸附内毒素的也是取了一个折中值，既保留了一定的吸附性能，又有不错的抗凝血性能。
3.2取实施例1步骤步骤(7)得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(C2-K1)2g(湿重)放入到10mL内毒素初始浓度为60EU/mL的全血中，于37℃恒温振荡吸附3小时，利用
Figure BDA0002385159110000201
Portable Test System(PTSTM)仪器(来自Charles River Laboratories International,Inc.US)在鲎试剂试剂盒(敏感度0.05-5.0EU/mL)下检测吸附前后血液中内毒素的变化，计算基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂对内毒素的吸附量(EU/g)及吸附清除率，最后结果：
实施例1步骤(7)所得到的所得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(C2-K1)在血液中对内毒素的吸附量为114.0EU/g，吸附清除率为38.6％；
3.3取实施例1步骤步骤(7)得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(C2-K1)2g(湿重)放入到10mL内毒素初始浓度为30EU/mL的全血中，于37℃恒温振荡吸附3小时，利用
Figure BDA0002385159110000202
Portable Test System(PTSTM)仪器(来自Charles River Laboratories International,Inc.US)在鲎试剂试剂盒(敏感度0.05-5.0EU/mL)下检测吸附前后血液中内毒素的变化，计算基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂对内毒素的吸附量(EU/g)及吸附清除率，最后得到实施例1步骤(7)所得到的所得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(C2-K1)在血液中对内毒素的吸附量为95.0EU/g，吸附清除率为63.3％，如图5所示；
从上述分析可以看出，本发明提供基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂在血液及磷酸盐缓冲液溶液中均可高效地清除内毒素，其清除效果具有临床意义，可用于脓毒血症患者的血液净化治疗。
3.4取实施例1步骤(4)得到的京尼平交联后的壳聚糖微球(C2)和步骤(7)以及实施例2步骤(7)得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球1g(湿重)放入金黄色葡萄球菌(S.aureus,ATCC 25922)初始浓度为81200CFU mL-1的全血中，于37℃恒温振荡吸附0.5小时，将吸附前后全血取出于琼脂平板上培养12小时，稍后通过平板上的菌落计数确定吸附前后血液中金黄色葡萄球菌的浓度变化，计算基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂对金黄色葡萄球菌的吸附清除率，最后结果如图6所示：吸附前血液中金黄色葡萄球菌的初始浓度约81200CFU mL-1,经0.5小时吸附后细菌清除率约70％。
实施例1步骤(4)得到的京尼平交联后的壳聚糖微球(C2)在血液中对金黄色葡萄球菌的吸附清除率为67.5％；
实施例1步骤(7)所得到的所得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(C2-K1)在血液中对金黄色葡萄球菌的吸附清除率为68.7％；
实施例2步骤(7)所得到的所得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(C2-K2)在血液中对金黄色葡萄球菌的吸附清除率为70.0％。
3.5取实施例1步骤(4)得到的京尼平交联后的壳聚糖微球(C2)和步骤(7)以及实施例2步骤(7)得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球1g(湿重)放入大肠埃希氏菌(E.coli,ATCC6538)初始浓度为153200CFU mL-1的全血中，于37℃恒温振荡吸附0.5小时，将吸附前后全血取出于琼脂平板上培养12小时，稍后通过平板上的菌落计数确定吸附前后血液中大肠埃希氏菌的浓度变化，计算基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂对大肠埃希氏菌的吸附清除率，最后结果如图7所示：吸附前血液中大肠埃希氏菌的初始浓度约153200CFU mL-1,经0.5小时吸附后细菌清除率约45％。
实施例1步骤(4)得到的京尼平交联后的壳聚糖微球(C2)在血液中对大肠埃希氏菌的吸附清除率为52.4％；
实施例1步骤(7)所得到的所得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(C2-K1)在血液中对大肠埃希氏菌的吸附清除率为46.0％；
实施例2步骤(7)所得到的所得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(C2-K2)在血液中对大肠埃希氏菌的吸附清除率为42.6％。
从上述分析可以看出，本发明提供基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂在血液中可高效地清除致病细菌，可用于脓毒血症患者的血液净化治疗。
4、抗凝血性能检测
取实施例1步骤(4)得到的京尼平交联后的壳聚糖微球(C2)和步骤(7)以及实施例2步骤(7)得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球1g(湿重)分别与贫血小板血浆5mL共孵化30min，此后使用自动化凝血分析仪测定血浆凝血时间，结果如图8所示。从图8中可以看出，自抗凝类肝素微球可以将活化部分凝血活酶时间及凝血酶时间延长，展现出优异的抗凝血能力，特别是随着卡拉胶含量的增加，其抗凝血能力有显著的提高，可以将活化部分凝血活酶时间从39.6秒延长到445.3秒，这说明基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂同传统抗凝剂相同，可预防血液凝固。
应用例1
取实施例1步骤步骤(7)得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(C2-K1)2g(湿重)放入到10mL内毒素初始浓度为30EU/mL的全血中，于37℃恒温振荡吸附3小时，利用
Figure BDA0002385159110000221
Portable Test System(PTSTM)仪器(来自Charles River Laboratories International,Inc.US)在鲎试剂试剂盒(敏感度0.05～5.0EU/mL)下检测吸附前后血液中内毒素的变化，计算基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂对内毒素的吸附量(EU/g)及吸附清除率，最后得到实施例1步骤(7)所得到的所得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(C2-K1)在血液中对内毒素的吸附量为95.0EU/g，吸附清除率为63.3％；
本发明提供的基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂对血液中的致病细菌(如金黄色葡萄球菌及大肠埃希氏菌)也有很好的清除效果。
应用例2
取实施例1步骤步骤(7)得到的壳聚糖-卡拉胶杂合微球(C2-K1)与贫血小板血浆5mL共孵化30min，之后使用自动化凝血仪测定凝血时间，结果如图7所示。从图7中可以看出，当壳聚糖-卡拉胶杂合微球(C2-K1)与贫血小板血浆孵化30分钟后，活化部分凝血活酶时间延长至110.5s，凝血酶时间延长至37.4秒；由此可以看出，本发明提供的基于壳聚糖及卡拉胶的自抗凝血液灌流吸附剂具有优异的抗凝血性能，在血液净化时可以直接防止血液凝结，从而减少传统抗凝剂肝素在血液净化中的应用；这不仅降低了治疗成本，也可使患者避免发生因肝素产生的系统性抗凝导致的严重大出血等副作用的风险。

Claims (1)

1.交联壳聚糖微球在制备用于脓毒血症血液净化的血液灌流器吸附剂中的应用，其特征在于，所述交联壳聚糖微球是采用京尼平作为交联剂制成。
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