CN113600148B - 基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的血液灌流吸附剂、其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的血液灌流吸附剂，属于生物材料技术领域，所述血液灌流吸附剂包括交联壳聚糖/纤维素微球，所述交联壳聚糖/纤维素微球外接枝有肝素涂层，还公开了其制备方法以及应用；本发明的吸附剂具有较好的力学强度和稳定性，从而更好地满足血液灌流对血液灌流吸附剂机械强度的需要，所含壳聚糖分子中所带丰富的氨基使得吸附剂带有丰富的正电荷，可高效清除带负电荷的内毒素；吸附剂外层中的肝素涂层则可与组蛋白形成复合物，从而快速清除血液中的组蛋白；本发明的的血液灌流吸附剂可通过多吸附靶点清除脓毒症患者血液中多种致病因子，从而增强血液净化治疗对脓毒症患者的治疗效果。

Description

基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的血液灌流吸附剂、其制备 方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物材料/血液接触材料技术领域，尤其涉及一种基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的血液灌流吸附剂、其制备方法及其应用。
背景技术
脓毒症是机体由于细菌、病毒或真菌感染导致的免疫系统失调从而导致危及生命的器官功能障碍的一系列临床综合征。脓毒症在危重患者中发病率高，是危重患者最主要死因，我国每年约有250万人被确诊为脓毒症，约70万人死于脓毒症。目前，脓毒症的治疗主要包括广谱抗生素抗感染治疗、液体复苏及必要时血管升压药治疗等；但这些传统治疗的治疗效果较差，脓毒症患者的死亡率仍高达20％，重症脓毒症和脓毒性休克患者的死亡率则更高。
血液净化治疗(如血液灌流、血浆置换及血液透析率过等)是重症脓毒症和脓毒性休克患者的重要辅助治疗。血液净化可清除脓毒症患者血液中异常蓄积的多种致病因子(如内毒素、炎症因子、致病细菌等)从而改善脓毒症患者预后。
在脓毒症中，血液循环中较高的内毒素及组蛋白浓度均与患者多器官功能衰竭严重程度及病死率均密切相关。
其中，内毒素是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分，是在脓毒症中研究最多的病原相关分子模式。内毒素可特异性激活免疫细胞表面的多种辅助因子(内毒素结合肽及Toll样受体等)，从而激活免疫细胞内下游的多个信号通路，诱发机体在脓毒症发生时产生过度激活的免疫应答，促进促炎性细胞因子及抑炎性细胞因子在血液循环中的释放，导致宿主免疫失衡。内毒素是公认的诱发脓毒症患者体内异常免疫应答的扳机点。然而，在临床试验中，多种中和脓毒症患者血液中内毒素的药物并不能改善脓毒症患者预后，降低脓毒症患者死亡率。鉴于此，血液净化逐步成为脓毒症患者内毒素清除的主要治疗方法，目前商业化的用于内毒素吸附的血液净化吸附材料主要包括oXiris膜及多粘菌素B吸附柱两种，但其内毒素吸附效果不佳(最大内毒素吸附量低)，不适用于血液中内毒素浓度超过10ng/mL的重症脓毒症患者。例如，最新的EUPHRATES随机对照临床试验发现多粘菌素B吸附柱用于脓毒血症患者治疗时无法显著地改善患者28天生存率，具体原因可能是：1)多钻菌素B吸附柱内毒素吸附效果不佳，在治疗过程中无法实现对内毒素的有效清除；2)多钻菌素B吸附柱不能吸附脓毒症患者血液中细菌及组蛋白等其他致病因子，治疗原理单一，而单一的内毒素吸附治疗模式可能严重影响其对脓毒血症的治疗效果(Dellinger RP,Bagshaw SM,Antonelli M,et al.Effect of Targeted Polymyxin B Hemoperfusion on 28-DayMortality in Patients With Septic Shock and Elevated Endotoxin Level:TheEUPHRATES Randomized Clinical Trial[J].JAMA.2018:320(14):1455-1463)。
另外，组蛋白是脓毒症发生、进展过程中另一个重要的致病因子。脓毒症患者在入侵病原体的刺激下出现免疫细胞激活、大量中性粒细胞细胞外陷阱形成及细胞凋亡/坏死，从而导致细胞内组蛋白释放到血液中，引起血液循环中组蛋白异浓度常增高，进而引起血管内皮细胞损害、炎性细胞因子风暴、弥漫性血管内凝血及多器官功能衰竭。组蛋白是近年来研究最火热的脓毒症治疗靶点之一。
因而，解决脓毒症血液净化治疗难题的突破点在于研发可从血液中同时高效清除内毒素及组蛋白等多种致病因子的新型血液灌流吸附剂。这种多吸附靶点的血液净化治疗模式可以最大程度地减少脓毒血症发病及进展中的两个关键致病因子：内毒素及组蛋白，从而避免机体发生免疫失衡及多器官功能衰竭，在现有治疗基础上进一步降低重症脓毒症及脓毒性休克患者的死亡率，减轻脓毒症引起的卫生经济负担，对脓毒症防治具有重要临床意义。
同时，脓毒症患者普遍存在着弥散性血管内凝血、血小板降低等凝血功能障碍问题，患者自身出血风险高。而传统血液灌流治疗过程中，患者需要接受系统性肝素抗凝来防止体外循环管路及血液灌流吸附剂中血液凝结，这不仅增加了血液净化治疗成本，而且增加了脓毒症患者在血液灌流后发生严重大出血的风险。申请人前期的研究表明，具有自抗凝特性的血液灌流吸附剂相较于传统治疗模式能更小程度地影响患者凝血系统功能，更好地防止血液净化过程中(后)严重大出血的发生(Song X,Ji HF,Li YP,et al.Transientblood thinning during extracorporeal blood purification via the inactivationof coagulation factors by hydrogel microspheres[J].Nature BiomedicalEngineering.2021.DOI:10.1038/s41551-020-00673-x)。
壳聚糖是自然界中存在的唯一带正电荷的多糖,它具有良好的生物相容性及亲水性,已被多个研究作为基材用于血液净化材料的研发。申请人前期公开了一种基于京尼平交联壳聚糖微球的血液灌流吸附剂可有效地清除血液中内毒素及细菌，但尚不能吸附组蛋白(基于壳聚糖的血液灌流吸附剂及其在制备用于脓毒血症血液净化的血液灌流器中的应用，专利号：ZL 2020 1 0095433.5)。
肝素是从动物小肠黏膜中提取的一种抗凝物质，它是由D-葡糖胺，L-艾杜糖醛酸以及D-葡糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸酯，负电荷密度高，可通过静电作用与组蛋白形成复合物从而中和组蛋白病理生理作用，发挥免疫调节作用，但无法直接从脓毒症患者血浆中清除组蛋白(Alhamdi Y,Abrams ST,Lane S,et al.Histone-associatedthrombocytopenia in patients who are critically ill[J].JAMA,2016,315(8):817-819.)。
发明内容
本发明的目的之一就在于提供一种基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的血液灌流吸附剂，以解决上述问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的血液灌流吸附剂所述血液灌流吸附剂包括交联壳聚糖/纤维素微球，所述交联壳聚糖/纤维素微球外接枝有肝素涂层。
作为优选的技术方案：所述交联壳聚糖/纤维素微球采用相转化法制成。
本发明的微球优选使用壳聚糖和纤维素的混合溶液通过相转化法一步制备出壳聚糖/纤维素微球，在微球中引入纤维素分子使之与壳聚糖分子通过物理交联增加微球的机械强度和稳定性，从而使得微球制备过程中无需再添加其他具有细胞毒性作用的化学交联剂(如戊二醛、京尼平等)。
作为优选的技术方案：所述吸附剂的平均粒径为0.5-2mm。
合适的粒径以便于将其作为吸附材料装填成一次性血液灌流器。若吸附剂尺寸太小，在使用的过程中，不仅难以回收，而且灌流柱中堆叠成的空隙太小，对血液通过产生较大阻力，甚至可能阻碍血流的通过，影响血液灌流器的使用；若吸附剂尺寸太大，则灌流柱内填充的吸附材料太少，灌流柱的空间利用率会大大降低，进而影响毒素清除能力。
作为优选的技术方案：所述肝素涂层是由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐接枝到壳聚糖/纤维素微球表面。
本发明的目的之二，在于提供一种上述的基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的血液灌流吸附剂的制备方法，采用的技术方案为，包括以下步骤：
1)配制壳聚糖/纤维素的溶剂，溶剂组成为下述重量份的组分：
氢氧化锂 4.5份
氢氧化钾 7份
尿素 8份
去离子水 80.5份
称取上述重量份的组分，加入容器中，室温搅拌溶解完全，得到纤维素和壳聚糖的溶剂；
2)取步骤1)所得溶剂，配置壳聚糖溶液,溶液组成为下述重量份的组分：
壳聚糖 2-4份
步骤1)所得溶剂 96-98份
称取上述重量份的组分，加入容器中，室温搅拌均匀，得到壳聚糖的悬浊液。密封放置于-40～-20℃的恒温冰箱中2～6小时，冰冻结束后，在室温充分融化后开始搅拌使壳聚糖溶解均匀，再放入-40～-20℃的冰箱2～6小时，取出后在室温再次充分融化后，搅拌均匀，得到壳聚糖溶液；
3)取步骤1)所得溶剂，配置纤维素溶液,溶液组成为下述重量份的组分：
纤维素 2-4份
步骤1)所得溶剂 96-98份
称取上述重量份的组分，加入容器中，室温搅拌均匀，得到纤维素的悬浊液。密封放置于-40～-20℃的恒温冰箱中2～6小时，冰冻结束后，在室温充分融化后开始搅拌使壳聚糖溶解均匀，再放入-40～-20℃的冰箱2～6小时，取出后在室温再次充分融化后，搅拌均匀，得到纤维素溶液；
4)将步骤2)所得壳聚糖溶液与将步骤3)所得纤维素溶液以体积比1:1、1:2或2:1混合，得到壳聚糖/纤维素混合溶液；
5)将步骤4)所得的聚合物溶液加入到注射器中，通过选择直径24-28G的注射针头，得到均匀的球形液滴，滴入5-20％体积分数的稀硫酸或稀盐酸溶液中，滴加速度为30～40滴/分钟，温度维持在25-30℃，在稀硫酸或稀盐酸溶液中静置1-3小时后得到固化的凝胶微球：凝胶微球通过滤网过滤并用去离子水洗涤至洗涤液pH处于7-8之间，得到壳聚糖/纤维素微球；
6)取步骤(5)所得的壳聚糖/纤维素微球，制备肝素改性壳聚糖/纤维素微球，反应组成为下述重量份的组分：
Figure BDA0003204831300000061
Figure BDA0003204831300000071
称取上述重量份的组分在常温下搅拌反应12-24小时，将使用滤网将微球过滤并用去离子水洗涤，得到肝素改性的壳聚糖/纤维素微球。
为了达到需要的性能，本发明的制备方法有别于现有的方法，先形成交联的壳聚糖/纤维素微球，然后再在复合微球表面形成肝素涂层。
上述的制备方法中，微球制备过程中选择的稀硫酸或稀盐酸作为凝固浴，可使壳聚糖分子中的氨基充分质子化，增加微球内层所带正电荷，从而增强微球对内毒素的吸附效果。
步骤(6)中，通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化基团，并通过酰胺反应接枝肝素。
本发明提供的这种基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂，包括纤维素与壳聚糖物理交联后形成的的壳聚糖/纤维素微球及经肝素表面改性后的肝素改性壳聚糖/纤维素微球(即自抗凝血液灌流吸附剂)。
其中，壳聚糖是自然界中存在的唯一带正电荷的多糖，它具有良好的生物相容性及亲水性，可作为吸附内毒素的基材(同时也是配体)，其经纤维素交联后形成的壳聚糖/纤维素微球力学强度较未交联前明显提升，其机械强度相较于原始的壳聚糖微球提升50％以上，满足血液灌流对以体外循环中血液灌流器机械强度的需要。
肝素是一种从动物内脏中提取的抗凝药物，除具有抗凝血功能外，肝素还具有特异性吸附组蛋白的功能。将肝素引入上述交联形成的壳聚糖/纤维素微球表面，制备出的肝素改性壳聚糖/纤维素微球，同时具有吸附毒素(内毒素、组蛋白)及抗凝血特性；将其作为吸附剂填充入血液灌流器，在应用时，可很大程度地减少血液灌流治疗过程中传统外源性抗凝剂肝素的体内注射，极大地降低治疗成本和外源性肝素带来的出血风险。
虽然现有技术中报道了肝素可以中和血液中的组蛋白等毒素，但是，“中和”与本申请的“吸附”不一样，“中和”了以后，组蛋白和肝素形成的复合物还存在血液中，组蛋白浓度仍然没有变化，还可能会损害机体；而本申请把肝素接枝在吸附剂后，吸附剂就可以直接吸附组蛋白了，这样血液中组蛋白的浓度才能有效地实质性地下降；也就是说，肝素这个分子本身是不能“吸附”组蛋白，它在血液中是无形的，只能中和组蛋白，其本申请不能把组蛋白从血液中清除掉，其必须依赖于本申请的壳聚糖微球吸附剂才能产生这样的效果，即本申请的肝素是吸附组蛋白的配体(提供功能基团)。另外，从抗凝的角度，本申请与申请人之前的采用卡拉胶抗凝相比，在本申请中，吸附剂就是自抗凝式的，因为肝素是接枝在吸附剂表面的，只能在体外循环中与其直接接触的血液相互作用，即局部抗凝策略，这一点显著区别于临床现有的血液灌流(净化)治疗：临床上的肝素是直接注射到静脉中，属于系统抗凝策略，出血风险更高(亦有临床数据证实)。
上述基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂中所含壳聚糖分子中所带丰富的氨基在稀盐酸或稀硫酸溶液中充分质子化使得吸附剂内层壳聚糖基材带有丰富的正电荷，可高效清除带负电荷的内毒素；吸附剂外层中的肝素涂层则可与组蛋白形成复合物，从而快速清除血液中的组蛋白。因此肝素改性壳聚糖/纤维素微球对于内毒素及组蛋白具有较高的吸附能力。
上述基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂实质是凝胶微球。凝胶微球本身的疏松多孔的网状结构，可以与内毒素及组蛋白有更充分的接触，因此对于内毒素及组蛋白具有良好的清除能力。
本发明的目的之三，在于提供上述的基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的血液灌流吸附剂在制备用于血液净化的血液灌流器中的应用。
作为优选的技术方案，所述血液净化为脓毒症患者血液净化。
本发明的肝素改性壳聚糖/纤维素微球可以通过独特的多靶点吸附方式，应用于脓毒血症患者的血液净化(灌流)治疗，原理如下：
1、肝素改性壳聚糖/纤维素微球中，壳聚糖分子中质子化的氨基可作用于内毒素，实现内毒素高效吸附；
2、肝素改性壳聚糖/纤维素微球中，外层肝素分子可与组蛋白形成复合物，从而清除血液中的组蛋白；
3、肝素的表面改性可赋予壳聚糖/纤维素微球独特的抗凝血性能，这种自抗凝性能在血液净化过程中可避免额外注射抗凝剂和由外源性抗凝剂使用带来的出血风险；
4、因此，肝素改性壳聚糖/纤维素微球可以更好的保护脓毒血症患者，从更多的靶点实现血液净化。
目前，尚未有将采用本发明的方法制备的肝素改性壳聚糖/纤维素微球用于血液灌流治疗；此外，本发明的肝素改性壳聚糖/纤维素微球，尤其适用于脓毒血症患者血液净化治疗，相较于传统的血液灌流应用领域，如急性药物和毒物中毒、急慢性肾衰竭以及肝性脑病等等，脓毒血症患者血液净化有其特殊的治疗要求，现有的普通血液灌流材料并不能满足。研发专病专用的血液灌流器是目前和今后血液净化(灌流)治疗的趋势
本申请公开了一种基于壳聚糖/纤维素微球的血液灌流吸附剂的制备方法，它具有较好的力学强度和稳定性，从而更好地满足血液灌流对血液灌流吸附剂机械强度的需要。本申请将肝素通过化学反应接枝在所得的壳聚糖/纤维素微球表面，制备出肝素改性的壳聚糖/纤维素微球，用于同时吸附脓毒症患者血液中内毒素及组蛋白，通过多吸附靶点清除脓毒症患者血液中多种致病因子，从而增加血液净化治疗对脓毒症患者的治疗效果。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明提供的基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂是经纤维素物理交联后的网状结构的壳聚糖微球再经肝素表面改性后的微球吸附剂；该吸附剂基于天然多糖壳聚糖、纤维素及肝素制备而成，具有优良的血液相容性，且自身具有肝素的抗凝基团，表现出优异的抗凝血性能；
2、本发明提供的基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂，其中丰富的氨基(来自壳聚糖)使得吸附剂具有丰富的正电荷，因此对于内毒素具有良好的清除能力；本发明创新性地将传统血液灌流吸附剂设计中吸附内毒素的配体及相应的基材(在本发明中均为壳聚糖)有机结合在一起，无需额外的化学反应将吸附内毒素的配体接枝到基材表面，简化了制备工艺；
3、本发明提供的基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂，其中肝素改性可使肝素在壳聚糖/纤维素微球表面涂覆，进而实现肝素涂层对组蛋白的特异性吸附，因此吸附剂对于组蛋白具有良好的清除能力；
4、本发明提供的基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂，本身的疏松多孔的网状结构，可以与内毒素及组蛋白有更充分的接触，因此对于内毒素和组蛋白具有高效的吸附功能；
5、本发明提供的基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂，壳聚糖经纤维素交联后提升了微球的机械性能，可以有效避免微球在使用过程中破裂，满足临床血液灌流治疗的需求，且可在使用中保持微球尺寸的稳定性；
6、本发明提供的基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂，通过肝素分子中的羧基与壳聚糖分子中的氨基发生酰胺反应将肝素接枝在壳聚糖微球表面，实现肝素在壳聚糖/纤维素微球表面的涂覆，在使吸附剂获得组蛋白吸附功能的同时，实现了壳聚糖/纤维素微球血液相容性的提升，赋予壳聚糖/纤维素微球自抗凝特性，其制备工艺简单、条件温和，并且全程反应在溶液中进行，不需要有机溶剂作为反应介质，不仅绿色环保，而且避免了有机溶剂对于环境和人体的危害，同时也减少了因回收有机溶剂而带来的繁琐处理流程；
7、本发明提供的基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂的制备方法，由相转化法制备壳聚糖/纤维素微球，操作简便。
8、本发明提供的基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂的制备方法，壳聚糖和纤维素是天然多糖，为常用化工原料，肝素广泛存在于动物内脏中，资源丰富、成本低廉，有利于工业化生产，因此易于在生物医药领域内推广应用；
9、本发明提供的基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂，不仅具有优异的吸附性能、良好的生物相容性和机械性能，而且具有优异的抗凝血性能，是一种具有应用前景的尤其专用于脓毒血症患者血液净化治疗的生物材料(血液接触材料)。
附图说明
图1为本发明所述方法制备基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂时接枝肝素化学反应的示意图；
图2为本发明实施例1步骤(5)制备的壳聚糖/纤维素微球(CSCE)和实施例1步骤(6)以及实施例2步骤(6)得到的肝素改性壳聚糖/纤维素微球(分别为CSCEHEP150和CSCEHEP75)的傅里叶红外光谱图；
图3为本发明实施例1步骤(5)制备的壳聚糖/纤维素微球(CSCE)、实施例1步骤(6)以及实施例2步骤(6)得到的肝素改性壳聚糖/纤维素微球(分别为CSCEHEP150和CSCEHEP75)及实施例5步骤(3)得到的壳聚糖微球(CS)在66.7kPa应力下形变量；
图4为本发明实例1步骤(5)制备的壳聚糖/纤维素微球(CSCE)、实施例1步骤(6)以及实施例2步骤(6)得到的肝素改性壳聚糖/纤维素微球(分别为CSCEHEP150和CSCEHEP75)、实施例3步骤(5)得到的壳聚糖/纤维素微球(CSCE(HCl))及实施例4步骤(5)得到的壳聚糖/纤维素微球(CSCE(HAc))在血液中吸附内毒素时的内毒素吸附容量(结果以柱状图表示)；
图5为本发明实例1步骤(5)制备的壳聚糖/纤维素微球(CSCE)和实施例1步骤(6)以及实施例2步骤(6)得到的肝素改性壳聚糖/纤维素微球(分别为CSCEHEP150和CSCEHEP75)在血液中吸附组蛋白时的吸附容量图(包括实验组组蛋白的吸附容量及对照组牛血清白蛋白的吸附容量，结果分别以黑色及灰色柱状图表示)；
图6为本发明实施例1步骤(5)制备的壳聚糖/纤维素微球(CSCE)和实施例1步骤(6)以及实施例2步骤(6)得到的肝素改性壳聚糖/纤维素微球(分别为CSCEHEP150和CSCEHEP75)的凝血时间图(包括部分凝血酶原时间、凝血酶时间及凝血酶原时间，结果分别以灰色、黑色及白色柱状图表示)。
具体实施方式：
以下将通过实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例制备基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂的制备过程如下：
(1)原料按重量份计，定量称取4.5份氢氧化锂、7份氢氧化钾、8份尿素、80.5份去离子水，加入容器中，室温搅拌溶解完全，得到纤维素和壳聚糖的溶剂；
(2)原料按重量份计，定量称取4份纤维素、96份步骤1所得纤维素溶剂，加入容器中室温搅拌均匀，得到纤维素的悬浊液；密封放置于-30℃的恒温冰箱中4小时，冰冻结束后，在室温充分融化后开始搅拌使纤维素溶解均匀，再放入-30℃的冰箱4小时，取出后在室温再次充分融化后，搅拌均匀，得到纤维素溶液；
(3)原料按重量份计，定量称取4份壳聚糖、96份步骤1所得壳聚糖溶剂，加入容器中室温搅拌均匀，得到壳聚糖的悬浊液。密封放置于-30℃的恒温冰箱中4小时，冰冻结束后，在室温充分融化后开始搅拌使壳聚糖溶解均匀，再放入-30℃的冰箱4小时，取出后在室温再次充分融化后，搅拌均匀，得到壳聚糖溶液；
(4)将壳聚糖溶液与纤维素溶液等体积混合，得到壳聚糖/纤维素溶液；
(5)将壳聚糖/纤维素溶液加入到注射器中，通过28G注射针头，得到均匀的球形液滴，依次滴入10％体积分数的稀硫酸中，滴加速度为30～40滴/分钟，温度维持在25-30℃即可，得到固化的凝胶微球；凝胶微球通过滤网过滤并用去离子水洗涤至洗涤液pH处于7-8之间，得到CSCE微球；
(6)定量称取6g壳聚糖/纤维素微球、150mg肝素钠、0.96g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、2.13g 2-(N-吗啉)乙磺酸、100g去离子水，在常温下搅拌反应24小时，将微球过滤并用去离子水洗涤3-4次，得到CSCEHEP150微球，其接枝反应原理如图1所示。
实施例2
本实施例制备基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂的制备过程如下：
(1)原料按重量份计，定量称取4.5份氢氧化锂、7份氢氧化钾、8份尿素、80.5份去离子水，加入容器中，室温搅拌溶解完全，得到纤维素和壳聚糖的溶剂；
(2)原料按重量份计，定量称取4份纤维素、96份步骤1所得纤维素溶剂，加入容器中室温搅拌均匀，得到纤维素的悬浊液；密封放置于-30℃的恒温冰箱中4小时，冰冻结束后，在室温充分融化后开始搅拌使纤维素溶解均匀，再放入-30℃的冰箱4小时，取出后在室温再次充分融化后，搅拌均匀，得到纤维素溶液；
(3)原料按重量份计，定量称取4份壳聚糖、96份步骤1所得壳聚糖溶剂，加入容器中室温搅拌均匀，得到壳聚糖的悬浊液；密封放置于-30℃的恒温冰箱中4小时，冰冻结束后，在室温充分融化后开始搅拌使壳聚糖溶解均匀，再放入-30℃的冰箱4小时，取出后在室温再次充分融化后，搅拌均匀，得到壳聚糖溶液；
(4)将壳聚糖溶液与纤维素溶液等体积混合，得到壳聚糖/纤维素溶液；
(5)将壳聚糖/纤维素溶液加入到注射器中，通过28G注射针头，得到均匀的球形液滴，依次滴入10％体积分数的稀硫酸中，滴加速度为30～40滴/分钟，温度维持在25-30℃即可，得到固化的凝胶微球；凝胶微球通过滤网过滤并用去离子水洗涤至洗涤液pH处于7-8之间，得到壳聚糖/纤维素微球。
(6)定量称取6g壳聚糖/纤维素微球、75mg肝素钠(92.5USP)、0.96g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、2.13g 2-(N-吗啉)乙磺酸、100g去离子水，在常温下搅拌反应24小时，将微球过滤并用去离子水洗涤3-4次，得到CSCEHEP75微球。
实施例3
本实施例制备基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂的制备过程如下：
(1)原料按重量份计，定量称取4.5份氢氧化锂、7份氢氧化钾、8份尿素、80.5份去离子水，加入容器中，室温搅拌溶解完全，得到纤维素和壳聚糖的溶剂；
(2)原料按重量份计，定量称取4份纤维素、96份步骤1所得纤维素溶剂，加入容器中室温搅拌均匀，得到纤维素的悬浊液。密封放置于-30℃的恒温冰箱中4小时，冰冻结束后，在室温充分融化后开始搅拌使纤维素溶解均匀，再放入-30℃的冰箱4小时，取出后在室温再次充分融化后，搅拌均匀，得到纤维素溶液；
(3)原料按重量份计，定量称取4份壳聚糖、96份步骤1所得壳聚糖溶剂，加入容器中室温搅拌均匀，得到壳聚糖的悬浊液。密封放置于-30℃的恒温冰箱中4小时，冰冻结束后，在室温充分融化后开始搅拌使壳聚糖溶解均匀，再放入-30℃的冰箱4小时，取出后在室温再次充分融化后，搅拌均匀，得到壳聚糖溶液；
(4)将壳聚糖溶液与纤维素溶液等体积混合，得到壳聚糖/纤维素溶液。
(5)将壳聚糖/纤维素溶液加入到注射器中，通过28G注射针头，得到均匀的球形液滴，依次滴入10％体积分数的稀盐酸中，滴加速度为30～40滴/分钟，温度维持在25-30℃即可，得到固化的凝胶微球；凝胶微球通过滤网过滤并用去离子水洗涤至洗涤液pH处于7-8之间，得到CSCE(HCl)微球。
实施例4
本实施例制备壳聚糖/纤维素微球血液灌流吸附剂的制备过程如下：
(1)原料按重量份计，定量称取4.5份氢氧化锂、7份氢氧化钾、8份尿素、80.5份去离子水，加入容器中，室温搅拌溶解完全，得到纤维素和壳聚糖的溶剂；
(2)原料按重量份计，定量称取4份纤维素、96份步骤1所得纤维素溶剂，加入容器中室温搅拌均匀，得到纤维素的悬浊液；密封放置于-30℃的恒温冰箱中4小时，冰冻结束后，在室温充分融化后开始搅拌使纤维素溶解均匀，再放入-30℃的冰箱4小时，取出后在室温再次充分融化后，搅拌均匀，得到纤维素溶液；
(3)原料按重量份计，定量称取4份壳聚糖、96份步骤1所得壳聚糖溶剂，加入容器中室温搅拌均匀，得到壳聚糖的悬浊液；密封放置于-30℃的恒温冰箱中4小时，冰冻结束后，在室温充分融化后开始搅拌使壳聚糖溶解均匀，再放入-30℃的冰箱4小时，取出后在室温再次充分融化后，搅拌均匀，得到壳聚糖溶液；
(4)将壳聚糖溶液与纤维素溶液等体积混合，得到壳聚糖/纤维素溶液；
(5)将壳聚糖/纤维素溶液加入到注射器中，通过28G注射针头，得到均匀的球形液滴，依次滴入10％体积分数的稀醋酸中，滴加速度为30～40滴/分钟，温度维持在25-30℃即可，得到固化的凝胶微球；凝胶微球通过滤网过滤并用去离子水洗涤至洗涤液pH处于7-8之间，得到CSCE(HAc)微球。
实施例5
本实施例制备壳聚糖微球血液灌流吸附剂的制备过程如下：
(1)原料按重量份计，定量称取4.5份氢氧化锂、7份氢氧化钾、8份尿素、80.5份去离子水，加入容器中，室温搅拌溶解完全，得到壳聚糖的溶剂；
(2)原料按重量份计，定量称取4份壳聚糖、96份步骤1所得壳聚糖溶剂，加入容器中室温搅拌均匀，得到壳聚糖的悬浊液；密封放置于-30℃的恒温冰箱中4小时，冰冻结束后，在室温充分融化后开始搅拌使壳聚糖溶解均匀，再放入-30℃的冰箱4小时，取出后在室温再次充分融化后，，搅拌均匀，得到壳聚糖溶液；
(3)将壳聚糖溶液加入到注射器中，通过28G注射针头，得到均匀的球形液滴，依次滴入10％体积分数的稀硫酸中，滴加速度为30～40滴/分钟，温度维持在25-30℃即可，得到固化的凝胶微球；凝胶微球通过滤网过滤并用去离子水洗涤至洗涤液pH处于7-8之间，得到CS微球。
实施例6
实施例1和2所制备的基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂、实施例3和4所制备的壳聚糖/纤维素微球血液灌流吸附剂和实施例5所制备的壳聚糖微球血液灌流吸附剂的成分、结构、机械强度、吸附性能和抗血凝性能检测：
1、成分及结构检测
分别对实施例1步骤(5)制备的壳聚糖/纤维素微球(CSCE)和实施例1步骤(6)以及实施例2步骤(6)得到的肝素改性壳聚糖/纤维素微球(分别为CSCEHEP150和CSCEHEP75)进行傅里叶变换红外光谱检测，结果如图2所示；从图2中可以发现，相对于CSCE，CSCEHEP150和CSCEHEP75的傅里叶红外图谱中在波长1217cm-1和941cm-1处分别出现磺酸基的特征性吸收峰，证实肝素已成功引入交联后的壳聚糖微球表面，即成功制备出基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂。
2、机械强度检测
使用万能材料试验机对实施例1步骤(5)制备的壳聚糖/纤维素微球(CSCE)、实施例1步骤(6)以及实施例2步骤(6)得到的肝素改性壳聚糖/纤维素微球(分别为CSCEHEP150和CSCEHEP75)、实施例5步骤(3)得到的壳聚糖微球(CS)进行压缩测试，得到其形变率随压强变化图。如图3所示，在血液灌流吸附剂最大理论承受压力条件下(66.7kPa)，加入纤维素的CSCE微球形变较未加入纤维的CS微球形变明显更低，机械强度更好，即本发明中血液灌流吸附剂的机械强度是壳聚糖与纤维素物理交联带来的；经肝素改性后，肝素改性壳聚糖/纤维素微球(CSCEHEP150和CSCEHEP75)形变较CSCE微球形变稍微增加，这与改性过程中肝素分子中羧基与壳聚糖分子中氨基发生酰胺化反应部分牺牲壳聚糖/纤维素微球骨架有关，但其力学强度仍满足血液灌流治疗时对吸附剂力学强度的需求。
3、吸附性能检测
分别利用实施例1步骤(5)制备的壳聚糖/纤维素微球(CSCE)和实施例1步骤(6)以及实施例2步骤(6)得到的肝素改性壳聚糖/纤维素微球(分别为CSCEHEP150和CSCEHEP75)对血液中内毒素及组蛋白进行清除。
吸附量的计算公式如下：
q＝(C0-Ct)*V/m
其中公式中q代表微球的吸附量，C0和Ct分别代表内毒素或组蛋白在起始时和吸附了t小时的浓度，V(mL)代表内毒素的体积，m(g)代表所采用的壳聚糖/纤维素微球或肝素改性壳聚糖/纤维素微球的干态质量。
3.1取实施例1步骤(5)制备的壳聚糖/纤维素微球(CSCE)、实施例1步骤(6)以及实施例2步骤(6)得到的肝素改性壳聚糖/纤维素微球(分别为CSCEHEP150和CSCEHEP75)、实施例3步骤(5)得到的壳聚糖/纤维素微球(CSCE(HCl))及实施例4步骤(5)得到的壳聚糖/纤维素微球(CSCE(HAc))各1g(湿重)放入到2mL初始浓度为84.5EU/mL内毒素磷酸盐缓冲溶液中，于37℃恒温振荡吸附3小时，利用Endosafe Portable Test System(PTSTM)仪器(来自Charles River Laboratories International,Inc.US)在鲎试剂测试盒(敏感度0.05-5.0EU/mL)下检测吸附前后磷酸盐缓冲液中内毒素的变化，计算肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂、其他壳聚糖/纤维素微球及对内毒素的吸附量(EU/g)，结果如图4所示：
实施例1步骤(5)制备的壳聚糖/纤维素微球(CSCE)在磷酸盐缓冲液中对内毒素的吸附量为577.7EU/g；
实施例1步骤(6)所得到的肝素改性壳聚糖/纤维素微球(CSCEHEP150)在磷酸盐缓冲液中对内毒素的吸附量为250.8EU/g；
实施例2步骤(6)所得到肝素改性壳聚糖/纤维素微球(CSCEHEP75)在磷酸盐缓冲液中对内毒素的吸附量为475.9EU/g。
实施例3步骤(5)所得到壳聚糖/纤维素微球(CSCE(HCl))在磷酸盐缓冲液中对内毒素的吸附量为498.3EU/g。
实施例4步骤(5)所得到壳聚糖/纤维素微球(CSCE(HAc))在磷酸盐缓冲液中对内毒素的吸附量为205.4EU/g。
从上述结果可以看出，将壳聚糖/纤维素溶液滴入到不同类型的稀酸溶液中所形成的不同类型的壳聚糖/纤维素微球其内毒素吸附性能不同：由稀硫酸溶液制备的壳聚糖/纤维素微球(CSCE)内毒素吸附容量最高，由稀盐酸溶液制备的壳聚糖/纤维素微球(CSCE(HCl))内毒素吸附容量次之；而由稀醋酸溶液制备的壳聚糖/纤维素微球(CSCE(HAc))内毒素吸附容量最低。上述差异是由于微球形成过程中，较盐酸及醋酸作为凝固浴，壳聚糖/纤维素微球可更多地接收硫酸中的质子导致微球带更多的正电荷引起的；因而，本发明后续的肝素改性壳聚糖/纤维素微球均是在CSCE基础上制备得到的。此外，上述结果还表面接枝肝素涂层以后内毒素吸附性能会下降，符合理论：肝素所带的负电荷会降低内毒素的吸附性能。在本发明中，肝素主要用于吸附组蛋白，同时可带来自抗凝性能并改善生物相容性，存在微球中肝素含量和壳聚糖含量的一个权衡，壳聚糖越多内毒素吸附性能越好，但抗凝血性能差，组蛋白吸附能力越低。
所以，本发明关注的点在于如何权衡和取舍肝素的量，最后选用于在血液中吸附内毒素的肝素量采取了最优值，既保留了一定的内毒素吸附性能，又有不错的组蛋白吸附性能、抗凝血性能和生物相容性。
3.2取实施例1步骤(5)制备的壳聚糖/纤维素微球(CSCE)、实施例1步骤(6)以及实施例2步骤(6)得到的肝素改性壳聚糖/纤维素微球(分别为CSCEHEP150和CSCEHEP75)1g(湿重)放入到2mL初始浓度为100μg/mL组蛋白或牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于37℃恒温振荡吸附3小时，检测吸附前后磷酸盐缓冲液中组蛋白或牛血清白蛋白浓度的变化，计算基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂对组蛋白或牛血清白蛋白的吸附量(μg/g)，结果如图5所示：
实施例1步骤(5)所得到的壳聚糖/纤维素微球(CSCE)在磷酸盐缓冲液中对组蛋白的吸附量为39.9μg/g，对牛血清白蛋白的吸附量为105.7μg/g；
实施例1步骤(6)所得到的肝素改性壳聚糖/纤维素微球(CSCEHEP150)在磷酸盐缓冲液中对组蛋白的吸附量为314.3μg/g；对牛血清白蛋白的吸附量为38.9μg/g；
实施例2步骤(6)所得到的所得到的肝素改性壳聚糖/纤维素微球(CSCEHEP75)在磷酸盐缓冲液中对组蛋白的吸附量为222.9μg/g；对牛血清白蛋白的吸附量为55.3μg/g；
从上述分析可以看出，本发明提供基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂在在磷酸盐缓冲液溶液中可高效地清除组蛋白，且组蛋白吸附量随着微球表面肝素含量的增加而增加，牛血清白蛋白吸附量则随着微球表面肝素含量的增加而降低，这是因为带负电荷的肝素涂层可通过静电排斥作用减少微球对带负电荷牛血清白蛋白的吸附，即肝素改性壳聚糖/纤维素微球对组蛋白的吸附具有选择性，不会影响患者体内正常白蛋白浓度，可安全有效地用于脓毒血症患者的血液净化治疗。
4、抗凝血性能检测
取实施例1步骤(5)制备的壳聚糖/纤维素微球(CSCE)和实施例1步骤(6)以及实施例2步骤(6)得到的肝素改性壳聚糖/纤维素微球(分别为CSCEHEP150和CSCEHEP75)1g(湿重)分别与贫血小板血浆5mL共孵化30min，此后使用自动化凝血分析仪测定血浆凝血时间，结果如图6所示：
肝素改性壳聚糖/纤维素微球可以将部分凝血活酶时间、凝血酶时间延长，但不影响凝血酶原时间，展现出优异的抗凝血能力，特别是随着肝素含量的增加，其抗凝血能力有显著的提高，可以将活化部分凝血活酶时间从32.8秒延长到100.5秒。由此可以看出，本发明提供的肝素改性壳聚糖/纤维素微球的自抗凝血液灌流吸附剂具有优异的抗凝血性能，在血液净化时可以直接防止血液凝结，从而减少外源性肝素在血液净化中的应用；这不仅降低了治疗成本，也可使患者避免发生因外源性肝素注射产生的系统性抗凝导致的严重大出血等副作用的风险。

Claims (2)

1.一种基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的血液灌流吸附剂在制备用于血液净化的血液灌流器中的应用，其特征在于，所述血液灌流吸附剂包括交联壳聚糖/纤维素微球，所述交联壳聚糖/纤维素微球外接枝有肝素涂层。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述血液净化为脓毒症患者血液净化。
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