CN105658313A

CN105658313A - 硫酸化纤维素水合物膜、其制备方法和该膜作为病毒纯化用吸附膜的用途

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Publication number: CN105658313A
Application number: CN201480056704.9A
Authority: CN
Inventors: L·维兰; H-H·霍勒; C·布鲁姆
Original assignee: Sartorius Stedim Biotech GmbH
Current assignee: Sartorius Stedim Biotech GmbH
Priority date: 2013-10-14
Filing date: 2014-09-11
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2034-09-11
Also published as: JP2016536114A; EP3057690B1; US20160257941A1; DE102013017014A1; WO2015055269A1; EP3057690A1; US10253299B2; DE102013017014B4; CN105658313B; JP6368781B2

Abstract

本发明涉及硫酸化纤维素水合物膜、其制备方法，以及所述膜作为病毒纯化处理用吸附膜的用途。

Description

硫酸化纤维素水合物膜、其制备方法和该膜作为病毒纯化用吸附膜的用途

技术领域

本发明涉及硫酸化纤维素水合物膜(sulfatedcellulosemembrane)、其制备方法和该膜作为病毒纯化用吸附膜的用途。

背景技术

流感(流感病毒)是由流感病毒引发的上下呼吸道的高度传染性急性感染。流感作为世界性流行病而发生，特别是在冬季的月份，然而个别的病毒也可引发大流行。当前控制流感爆发的策略是基于预防性疫苗结合例如神经氨酸酶抑制剂等抗病毒治疗。大部分季节性人类流感疫苗是失活三价裂解病毒粒体(trivalentsplitvirion)疫苗。这些由病毒抗原，三种不同流感病毒亚型的包膜糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(HA)组成。各种抗原用去污剂(例如CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)或吐温20(聚山梨醇酯20))通过膜增溶而从纯化的病毒颗粒获得。

在传统的生产方法中，流感病毒在温育的鸡蛋中生产。除了此方法的有限扩展性和与之相关联的问题以外，在鸡蛋中生产个别大流行流感病毒(例如H5N1)有系统性困难而难以满足全球市场增长的需求。最后，对鸡蛋白质的变态反应问题也使得在生物反应器中使用哺乳动物细胞的生产方法建立了若干年。在细胞培养中培养病毒之后，需要从污染物(例如宿主细胞蛋白质、DNA)中分离病毒，以便病毒可进一步以其纯化形式使用。此外，从非感染性分子或颗粒分离感染性物质是有利的。在生物药物生产过程中，脱氧核糖核酸(DNA)和从宿主细胞培养物中产生的其它蛋白质作为副产物出现。这通常当作污染物，并且必须在处理时从终产物中除去。在病毒的生产中，宿主细胞或病毒自身的DNA片段也被释放，这些必须被除去。

通过色谱纯化在固相上吸附病毒，在病毒纯化特别是在处理规模中有重要意义。其特征在于分子结合至吸附器材料(离子交换器、疏水或亲水吸附剂)，且之后可在后续步骤中以纯化形式洗脱。在此情况中，吸附过程可逆地进行是重要的，以便获得高产率。可进行简单富集或者分离成两种以上的目标物质，其中后一种情况可选择性地影响吸附或解吸或二者。用于此目标的色谱介质的主要缺点是其相对低的选择性，和溶液中存在的污染物(DNA片段和宿主细胞蛋白质)也可结合至吸附器材料，以至于需要长的处理展开时间，以便确定最优结合和洗脱条件(pH、离子强度和缓冲系统的选择)。

亲和色谱提供增加的选择性。从现有技术可知硫酸化纤维素基质对流感病毒和肝素结合蛋白的选择性增加。

EP0053473A1公开了具有肝素样效果的纤维素硫酸盐(cellulosesulfatesalt)供用作抗凝剂。为了充分的高抗凝效果，与生理条件下的所需高长期稳定性一起，纤维素的硫酸化程度(在吡喃糖单元的C2、C3和C6原子上OH基团被硫酸系基团(sulfategroup)取代的程度)在0.8至2.6之间。纤维素硫酸盐可通过三种不同方法获得：通过在胺的存在下与氯磺酸反应，通过与例如二甲基甲酰胺可用作酰胺的SO₃-酰胺复合物反应，或通过与例如吡啶可用作胺的SO₃-酰胺复合物反应。在述及的后一变型中，纤维素与SO₃-吡啶复合物在室温下反应30至35分钟，并随后以NaOH中和。

EP1698641A1公开了纤维素硫酸盐作为治疗活性成分用于例如特应性湿疹等皮肤疾病。纤维素硫酸盐的特征在于对透明质酸酶的抑制效果，并具有基于纤维素硫酸盐总重量为6.5至19.0重量％的硫酸系基(sulfate)含量。在制备中，结晶纤维素首先在例如吡啶、二甲基亚砜或二甲基甲酰胺等溶剂中预溶胀。所得的混合物添加至选自氯磺酸、哌啶-硫酸复合物、SO₃-吡啶复合物、SO₃-三甲胺复合物或硫酸酐-二甲基甲酰胺复合物的组的硫酸化试剂，其中优选较后述及的复合物。

上文述及的两篇文献EP0053473A1和EP1698641A1都没有公开任何用于纯化病毒的色谱分离材料。此类分离材料作为凝胶可商购，并用于上述分子和病毒的纯化。用于纯化病毒的这些介质的使用常常提供对病毒的低结合能力和低病毒收率。病毒的大小可达500nm，并因此孔径在30至400nm范围的微粒色谱凝胶不太合适。通常，那么病毒仅可结合至颗粒的外表面，这解释了低结合能力。

由纤维素、葡聚糖或琼脂糖组成的色谱凝胶的硫酸化以及用于纯化流感病毒的这些硫酸化凝胶的使用是现有技术中已知的。通过实例的方式，RD298025A公开了可通过在65至70℃下以氯磺酸-吡啶复合物将“CellulofineGH-25”、“SepharoseCL-6B”或“SephadexG-50”硫酸化，接着以NaOH中和，并用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤而制备的亲和色谱凝胶。此凝胶适合用于纯化例如乙肝抗原，HIV-1和HIV-3病毒，SV40-T抗原，凝血因子7、8、9和11，核酸聚合酶，干扰素或溶菌酶等蛋白质。

EP0171086A2记述了基于琼脂糖、葡聚糖或纤维素，用吡啶中的氯磺酸或无水硫酸在65至70℃下硫酸化(部分)结晶多糖凝胶的方法。多糖凝胶的硫酸化程度通常在0.1至40％之间，其中纤维素凝胶的硫酸化程度特别地在0.1至5％之间。源于鸡胚细胞培养物的流感病毒或抗原可用硫酸化纤维素凝胶纯化。

WO2008/039136A1公开了多孔多糖基质，优选来自琼脂糖，500kDa葡聚糖“延伸剂(extender)”分子与之结合，其中硫酸系基团依次结合至葡聚糖分子作为配体，用于纯化病毒。基质用于从DNA污染物分离病毒，优选流感病毒，其中病毒最初吸附在基质上，并随后以合适的缓冲液洗脱。为制备前述基质，在硫酸化“延伸剂”分子固定在多糖基质上之前，硫酸系配体首先结合至“延伸剂”分子。

EP0171771A2公开了从EP0171086A2中得知的硫酸化纤维素凝胶用于从鸡胚细胞培养物纯化狂犬病病毒的用途。

EP0173268A2公开了从EP0171086A2中得知的硫酸化纤维素凝胶用于纯化从哺乳动物细胞培养裂解物获得的、作为HSV-1和HSV-2型单纯疱疹病毒成分的糖蛋白gA和gB的用途。糖蛋白gA和gB在阴离子或非离子表面活性剂的存在下纯化。

EP0171765A2公开了纯化日本脑炎病毒用于疫苗生产的方法，其中使用了从EP0171086A2中得知的硫酸化纤维素凝胶。

所有前述文件公开了由微粒多孔凝胶颗粒构成的色谱分离介质。为此，截留分子量(molecularweightcut-off,MWCO)小于10⁷Da的多糖凝胶用作硫酸化反应用的基材。病毒，例如R.W.HRuigrok等人在J.Gen.Virol.(1984),65,799-802中记述的直径大于100nm且分子量(MW)大于10⁸Da的流感病毒，仅可有限程度地穿透记述的多孔分离材料的孔，此情况下仅可利用这些分离材料的部分结合能力。

与微粒吸附剂相反，吸附膜具有对病毒完全可接近的实质上更大的孔。此外，它们提供通过利用两种主要表面之间的液压差而以介质强行灌注的可能性，由此获得可在高流量下起效快得多的对流迁移，而不是在浓度梯度的方向上吸附剂向吸附剂内部的纯扩散迁移。由此可避免微粒吸附剂另外的固有缺点，即由下列事实构成的所谓的“扩散限制”：当吸附剂粒径增加且吸附剂的摩尔质量增加时，建立吸附平衡所需的时间显著增加，这转化为动力学的劣化。因此，在例如流感病毒的纯化中，用色谱凝胶通常仅获得低流速。

基于纤维素的硫酸化膜吸附器已通过硫酸化纤维素水合物膜成功地生产，其中硫酸化通常通过在适合反应的溶剂中纤维素膜与路易斯碱-SO₃复合物的反应而发生。与常规的硫酸化多糖凝胶相比，硫酸化膜吸附器具有下列优点：

-与微粒分离材料中的扩散“流”相对的对流流动

-可能更高的流速

-对配体更好的可接近性和对病毒更高的结合能力

-更简单的扩展性，即，从低体积膜吸附器增加规模至大体积膜吸附器。

由于能力是配体密度和可得的结合表面的函数，其通常通过减少膜孔径而增加，但这对于流动和堵塞特性有负面影响。

US5,667,684公开了用于从血浆除去HIV病毒的微孔膜，其由例如聚丙烯、聚乙烯或聚偏二氟乙烯等疏水基材构成，其上接枝了丙烯酸烷氧基烷基酯、丙烯酸缩水甘油酯或丙烯酰胺的链。硫酸化纤维素通过共价结合固定在此中间接枝层上，其中例如硫酸化纤维素的游离OH基团与例如接枝链的重复单元的环氧基等官能团反应。HIV病毒主要通过硫酸化纤维素单元除去。

US8,173,021B2公开了硫酸化程度(磺酰基含量)在0.5至15％之间的硫酸化、非交联纤维素膜的制备方法，其中纤维素膜与氯磺酸-吡啶复合物在40℃以下反应。氯磺酸-吡啶复合物通过在最高0℃下将氯磺酸添加至吡啶，接着在60℃下反应并冷却至最高40℃而制备。可从非交联的再生纤维素膜(例如来自Whatman的RC-55膜)制备的硫酸化纤维素膜在亲和色谱中使用，亲和色谱用于纯化含蛋白质病毒片段或用于纯化完整病毒颗粒，其后续用于流感疫苗的生产。

L.Opitz等人，BiotechnologyandBioengineering,103(6),2009,1144-1154，公开了通过将强化、非交联的纤维素膜与氯磺酸在吡啶中的溶液在37℃下反应12小时而制备硫酸化纤维素膜。16μg硫/每g干燥膜下的硫酸化纤维素膜的硫含量，显著低于微粒吸附剂Sulfate(≥700μg硫/每g干燥膜)中的硫含量。硫化纤维素膜用于纯化三种流感株，即H1N1、H3N2和“B/Malaysia/2506/2004”病毒，其中例如双链DNA或细胞成分等不期望的污染物从生产病毒用的细胞培养液中有效地被除去。在纯化用的缓冲液中，当NaCl浓度增加时(150nM对50mM)，膜对病毒的吸附能力降低。与例如S75或C75等阳离子交换膜相比，硫化纤维素膜使得双链DNA的耗减提高，并允许比基于Sulfate色谱柱更高的病毒收率。

US2012/0171750A1研究了反应温度对从Opitz等人的上述文章中得知的硫酸化纤维素基质的制备中纤维素基质的硫酸化程度、对MVA病毒的吸附能力、和纯化MVA病毒制剂被来自细胞培养液的DNA污染的影响。硫酸化中的反应温度增加时(35、40或45℃)，纤维素基质的硫酸化程度从基于纤维素聚合物主链重量的5.3重量％增至13重量％，而纯化的病毒制剂中DNA分数从7.4％增至17％，以及纯化MVA病毒的收率从66％增至80％。通过硫酸化纤维素基质的手段纯化病毒制剂可与使用具有苯基、丁基或己基配体的色谱基质的疏水相互作用色谱的附加步骤组合。

使用从US8,173,021B2已知的方法，尽管使用相对微细的膜(来自Whatman的RC-55膜，孔径0.45μm)也不能获得大于15％的硫酸化程度。选择的孔径也不利于结合直径超过100nm的病毒，因为在病毒吸附时可发生流动损失和膜的堵塞。

发明内容

因此，本发明的目标是提供病毒纯化，例如流感病毒纯化用的膜，该膜一方面具有对欲分离的目标化合物的高选择性，另一方面使得能在高流速下将例如双链DNA或细胞成分等不期望的污染物从病毒生产用的细胞培养液中有效除去。

此目标通过权利要求中表征的主题实现。

具体地，本发明提供硫酸化纤维素水合物膜，其包含具有从膜的一个主表面向另一个主表面延伸的孔的交联纤维素水合物基质，其中纤维素水合物膜在其内外表面上具有硫酸系配体用于吸附物质(adsorptivesubstance)的分离。

根据本发明，硫酸化纤维素水合物膜为吸附膜。吸附膜是指具有从一侧穿透至另一侧的孔的片状吸附剂。吸附剂为多孔固体，其可经称作配体的表面官能团而接受与流体的特定组分的选择性结合。目标物质和/或污染物是指根据本发明的吸附物(adsorbate)，其也可采取两种或更多种不同物质的形式。吸附物可为单独分子、缔合物(associate)或颗粒，在目标物质的情况下优选病毒。

根据本发明，纤维素水合物基质的交联在后续处理步骤的硫酸化之前进行。惊讶地发现欲硫酸化的纤维素水合物膜的预先交联导致对反渗透水(RO水)的透过性增加，导致硫酸系配体密度增加，导致结合能力增长，并导致对欲分离的目标化合物(特别是对流感病毒)的结合选择性增强，其中这些有利效果不能通过使用在硫酸化之前没有交联的硫酸化纤维素膜而获得。与US8,173,021B2和US2012/0171750A1相反，通过交联的纤维素膜而非现有技术获得的膜的硫酸化，出乎意料地可获得显著更高的硫酸系配体密度。

根据本发明的硫酸系配体密度通过硫酸化程度确定，其中根据本发明的硫酸化纤维素水合物膜的优选实施方案，纤维素水合物基质的硫酸化程度为10重量％以上，更优选15重量％以上，并特别优选超过20重量％，其导致有利于病毒生产的选择性提高。根据本发明，硫酸化程度理解为表示硫酸化纤维素水合物基质上的硫酸系基团的质量比。硫酸化程度通过滴定而定量测定，其中可例如用氢氧化钠水溶液确定膜上的硫酸系基团的定量的量。

根据本发明，硫酸化程度用下式确定：

以重量％计的硫酸化程度＝(n_硫酸系基×M(SO₃)/(m_纤维素+(n_硫酸系基×M(SO₃)))×100％

其中

m_纤维素＝每cm²膜中以μg计的纤维素的质量

和通过下式的方式确定的硫酸系基团密度n_硫酸系基：

硫酸系基团密度：n_硫酸系基(μmol/cm²)＝c(NaOH)×t(NaOH)×V(NaOH)×1000/A

其中

c(NaOH)以mol/l计的氢氧化钠滴定水溶液的定量浓度

V(NaOH)以ml计的在等当点(pH7)下消耗的滴定液体积

t(NaOH)滴定液的校正系数

1000从mol/l向μmol/l的转换系数

A以cm²计的活性滤器表面

和其中

M(SO₃)以μg/μmol计的SO₃摩尔质量。

与非交联纤维素膜的硫酸化相比，硫酸系配体密度可出乎意料地增加，通过根据本发明的纤维素膜的交联的上至30的系数，相比于来自现有技术的比较例(表2中的样品1和3)。这甚至用平均孔径超过0.45μm的纤维素膜也是可能的。

纤维素水合物膜预先交联的另外的出乎意料的结果是与之相连的透过性的增加，和对于例如宿主细胞蛋白质等小蛋白质或污染物的结合能力的降低，尽管硫酸系配体密度增加，这导致有利于病毒生产的增强的选择性。

如下文所述，根据本发明的膜的制备方法可按两步进行：将膜交联和将膜硫酸化。

交联程度、孔径、和作为结果的膜的透过性、和用于进一步硫酸化反应的羟基的可接近性可通过交联剂的类型、交联剂的浓度、任选使用的交联催化剂的浓度、如果适当的交联持续时间、惰性有机溶剂的类型和浓度、和/或交联温度来控制。

根据本发明的硫酸化纤维素水合物膜的优选实施方案，交联的程度在0.05至0.5之间，其中选择通过与双官能交联剂反应的纤维素的葡糖酐单元的平均取代程度作为交联程度(DC)的量度。在此情况下，根据本发明的交联程度，如WO95/32793A1中记载的，定义为：

DC＝3.24×ΔM/M_v

其中

DC：根据本发明的膜的交联程度

ΔM：通过起始膜的初始质量的以％计的交联，根据本发明的膜的质量增加

M_v：交联剂的摩尔质量。

从双官能交联剂开始，并假设它们各自结合至两个纤维素单体单元，则至多三个交联剂分子可与两个纤维素单体单元反应。这具有324g/mol的组合摩尔质量。DC的理论最大可能值为至多3，归因于纤维素单体单元的三个可交联羟基。

根据本发明，硫酸化纤维素水合物膜适合用于吸附物质的分离，特别是用于病毒的有效纯化。特别地，以下是可能的：如果选择根据本发明的硫酸化纤维素水合物膜的截留分子量，使得目标物质不阻塞膜表面，由此可维持高流速。取决于所需的目标物质，可设定截留分子量，使得目标物质吸附在硫酸化纤维素水合物膜中，并且随后可从其洗脱。根据本发明的膜的平均孔径优选在0.5至5.0μm之间，特别优选1.0至3.0μm之间。

起始膜：

平均孔径为0.1至20μm，优选0.5至15μm，更优选1至10μm，在根据本发明的方法中用作起始膜的纤维素水合物膜，通过从例如在L.J.Zeman等人，“Microfiltrationandultrafiltrationprinciplesandapplications”,MarcelDekker1996,“PartI”,“Chapter3.1”、DE10326741A1和DE3447625A1中记载的技术领域中获知的通常制备方法来制备。为了确定平均孔径，进行“毛细管流气孔测量法(capillaryflowporometry)试验”。详细信息可见于“CapillaryFlowPorometer6.0”,CAPWINSoftwareSystem,PorousMaterialsInc.的操作指南。

优选根据本发明，已任选地受到下文记载的预处理的纤维素酯膜以合适的皂化介质皂化，在此情况下形成纤维素水合物膜。取决于预处理介质的类型，在皂化步骤中纤维素酯膜可按干燥或湿润使用。

纤维素酯膜可基于单醋酸纤维素、二醋酸纤维素、三醋酸纤维素、丙酸纤维素、丁酸纤维素和乙酰丁酸纤维素，或其它合适的纤维素酯或硝酸纤维素、甲基纤维素或乙基纤维素或其混合物，其中醋酸纤维素系为优选的，特别是二醋酸纤维素。在此情况下纤维素酯膜在皂化步骤前可在合适的介质中预处理，其中预处理介质包含对纤维素酯有溶解或软化效果的一种或多种添加剂。合适的添加剂尤其是酸，特别是羧酸，例如醋酸，和用于纤维素酯的水溶性软化剂，例如甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯和环丁砜。

皂化介质优选包含碱性化合物，优选碱金属氢氧化物。特别优选使用氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化锂的水溶液。也可使用碱金属氢氧化物和其它碱性化合物例如碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯等碱金属碳酸盐，碳酸氢钠和/或三聚磷酸钠(sodiumtriphosphate)、三聚磷酸钾、硅酸钠和硅酸钾等的混合物。

所得的纤维素水合物膜可具有任意合适的厚度。膜厚度优选在50至500μm之间的范围，更优选在100至300μm之间的范围。获得的纤维素水合物膜可成形为片状膜或圆筒。圆筒膜是指中空纤维膜、毛细管膜或管状膜。

交联：

交联剂分子中有至少两个官能团，其与纤维素膜的羟基反应，并由此实现纤维素膜的交联。例如，纤维素膜的交联通过可对纤维素聚合物链的羟基反应的具有至少两个官能团的前述交联剂，经两条纤维素聚合物链的(分子间)连接或经纤维素聚合链的重复单元的(分子内)连接而实现。可用的交联剂原理上不受任何特别限制，且本领域技术人员可根据后续硫酸化的反应条件来选择交联剂。然而，在交联步骤中，优选使用双环氧化合物(diepoxidecompounds)或其它具有可与纤维素的羟基反应的至少两个反应性官能团的化合物，例如二异氰酸酯、表氯醇、表溴醇、二甲基脲、二甲基乙基脲、二甲基氯硅烷、双(2-羟乙基砜)、二乙烯基砜、亚烷基二卤化物、羟亚烷基二卤化物和二环氧甘油醚。特别优选在交联步骤中使用双环氧化合物。

从二环氧甘油醚的组中，优选1,4-丁二醇二环氧甘油醚、乙二醇二环氧甘油醚、丙三醇二环氧甘油醚和聚乙二醇二环氧甘油醚。

特别优选使用1,4-丁二醇二环氧甘油醚或乙二醇二环氧甘油醚作为交联剂。

任选地，可使用不同交联剂的混合物。

交联可在水性介质中、有机溶剂中或者在水和有机溶剂的混合物中进行。交联优选在水性介质中进行。

优选使用交联催化剂，例如氢氧化钠或氢氧化钾，以加速纤维素与交联剂的交联。

交联步骤中使用的介质的温度可从约4℃直至交联介质的沸点，其中优选从5℃至约85℃范围内的温度。特别优选20℃至40℃的温度。

交联持续时间通常为几分钟至几天，其中优选在15至30℃下12小时至7天的交联持续时间。特别优选1至3天的交联持续时间。在用于制备根据本发明膜的根据本发明方法的优选实施方案中，交联溶液中交联剂的浓度在10至30重量％之间。

如上所述，根据本发明的硫酸化纤维素水合物膜的交联程度为0.05以上，优选0.07以上，并特别优选0.1以上。交联程度的上限优选0.5，更优选0.4，并特别优选0.3。

更有利地，根据本发明的膜由于交联而具有更高的化学稳定性，并因此在后续的硫酸化过程中耐受更高的反应温度(上至90℃)。

硫酸化：

硫酸化通过将交联的纤维素水合物膜与路易斯碱-SO₃复合物反应而进行。反应可如下进行：在胺的存在下以氯磺酸进行，或通过与SO₃-酰胺复合物反应(其中二甲基甲酰胺可优选用作酰胺)来进行，或通过与SO₃-胺复合物反应(其中吡啶或三甲胺可优选用作胺)来进行。SO₃-吡啶复合物特别优选用于反应。

硫酸化溶液中SO₃-吡啶复合物的浓度通常为1至40重量％，特别优选在10至30重量％之间的浓度。

通常，质子惰性的极性溶剂，例如二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基-2-吡咯烷酮或2-吡咯烷酮等可用作与SO₃-胺复合物反应用的溶剂。特别优选2-吡咯烷酮。

反应持续时间在30min至24小时之间，特别优选1至4小时之间的反应持续时间。

反应温度在20至90℃之间，特别优选70至90℃的反应温度。

附图说明

本发明通过下列实施例和图1至3的方式详细说明。示出

图1交联程度对于根据本发明的膜的硫酸化程度、对于RO水的透过性和对于溶菌酶的结合能力的影响。

图2对流感病毒和溶菌酶的动态结合能力，和

图3来自现有技术的硫酸化多糖凝胶和本发明硫酸化纤维素膜用HCP溶液(“宿主细胞蛋白”溶液)加载的穿透曲线。

具体实施方式

工作例

将5种不同的膜功能化，以便说明交联的影响。将两种不同的硫酸化方法施于孔径相同的交联和非交联(比较例)纤维素水合物膜(样品1至4)。

进一步制备根据实施例1交联并根据实施例2硫酸化的样品(样品5)。此样品与样品1至4的不同之处在于平均孔径为1.2μm的更窄的起始膜用于硫酸化。所有膜样品根据实施例5至8表征。结果总结于表2。S样品为具有磺酸配体的纤维素水合物膜。

图1示出交联程度的增加导致硫酸化程度的增加，但也导致RO水的流速的增加。此外，根据本发明交联的硫酸化膜具有相比于污染物更高的对流感病毒的选择性，因为其实验性地示出对例如溶菌酶等小的带负电蛋白质显著更低的动态结合能力。图1中的硫酸化程度以重量％示出。表1包含制备图1的膜用的交联溶液的组成的详细信息。

图2示出，由于根据本发明的样品2、4和5的膜具有对流感病毒更高的动态结合能力，其结合性质明显比选作比较例的样品1和3的膜更好。样品5的膜对流感病毒的动态结合能力更高，是样品1和3的10倍以上。此外，在样品2、4和5的膜中，对例如溶菌酶等小的带正电的蛋白质污染物的结合能力，仅仅是非交联样品1和3以及具有阳离子交换磺酸基作为配体的“S”膜的1/3。根据本发明的样品5的膜因此在所有研究的样品中具有对流感病毒结合的最高的选择性。

图2中的描述符号“E+12”表示“×10¹²”。

图3展示的以HCP溶液(宿主细胞蛋白质溶液)的穿透曲线示出，与常规的硫酸化多糖凝胶不同，样品4的硫酸化膜实际上不结合例如宿主细胞蛋白质(HCP)等污染物。在此情况下，来自JNCCorporation的Sulfate和来自GEHealthcare的DeVirS用于比较。在根据本发明的样品4的膜中，发生宿主细胞蛋白(HCP)的立即穿透，这证明此膜不结合任何HCP。在作为比较例的硫酸化凝胶中，原始使用的HCP溶液的UV信号仅在100ml柱体积(columnvolume，CV[ml]＝以ml计的柱体积)后再次获得，这证明硫酸化凝胶结合这些污染物至可观的程度。上文记载的根据本发明的膜的性质对病毒的纯化有重要的优点，因为例如HCP等污染物不能结合至膜材料，并因此病毒洗脱后在洗脱液中没有发现污染物。为此，可省略进一步的污染物除去步骤，并且显著降低纯化过程的总成本。同样显然的是，根据本发明的膜中更高的硫酸系配体密度以期望的方式在污染物结合上没有负面作用，仅选择性地提高对流感病毒的结合能力。

实施例1：纤维素微量过滤器膜的交联

交联反应在20至25℃下进行。将10％氢氧化钠水溶液添加至预充填量(以g计)的反渗透水并搅拌。然后添加1,4-丁二醇二环氧甘油醚(Sigma-Aldrich,Cat.No.:220892)并搅拌至形成均匀溶液。交联程度可通过交联溶液中1,4-丁二醇二环氧甘油醚的浓度控制。此处制备的交联溶液中反渗透水、氢氧化钠水溶液和1,4-丁二醇二环氧甘油醚(BUDGE)各自的量和根据本发明的膜所得的交联程度总结于表1。

表1：交联溶液的组分和所得的交联程度

将来自SartoriusStedimBiotechGmbH的干燥纤维素微量过滤器膜(型号10142V)的DINA4片用交联溶液完全湿润，然后在气密性聚乙烯袋中存储7天。交联反应结束后，微量过滤器膜用流动的反渗透水漂洗10min，然后在对流烘箱中在80℃下干燥10至12分钟。

为确定如上文定义的交联程度，进行下列工序：型号10142V的非交联纤维素膜在Sartorius水分分析仪天平(型号MA100)中于110℃下干燥5min，并测定其重量m_A。然后，膜用交联溶液湿润。将没有用交联剂处理的另外的空白样品称重，以确定归结于可浸出组分的重量损失。7天的交联时间后，用流动的RO水漂洗膜10分钟，然后在对流烘箱中在80℃下预干燥10min，并最后-作为起始膜-在水分分析仪天平中干燥5min，并确定m_V。通过未经交联剂处理的空白样品的方式，确定可浸出组分的质量m_B。定义的值所需的质量的百分增长ΔM如下文产生：

ΔM＝100％*((m_V-m_A-m_B)/m_A-m_B))，

其中

m_V交联膜的质量

m_A非交联膜的质量

m_B空白样品可浸出组分的质量。

实施例2：用2-吡咯烷酮和吡啶-三氧化硫复合物来硫酸化

将2g吡啶-三氧化硫复合物(Sigma-Aldrich,Cat.No.84737-500g)在搅拌下添加至8g2-吡咯烷酮。反应容器密封。然后混合物控温在70℃下，于是吡啶-三氧化硫复合物溶解，并形成赭色硫酸化溶液。

向加热至70℃、具有研磨玻璃盖的80ml称重瓶的基座中，用移液管加入3.8g加热至70℃的新制备的硫酸化溶液。将非交联膜(比较例，型号10142V的实施例1的起始膜)和根据实施例1交联的膜的圆形干燥纤维素微量过滤器膜盘(直径70mm)依次置于硫酸化溶液中；在此情况下它们自发湿润。然后立即密封反应容器。

然后在对流干燥橱中70℃下将反应容器存储4小时。随后用流动的反渗透水漂洗硫酸化纤维素微量过滤器膜10min，在1MNaCl溶液中以100g震摇5min，然后在流动的反渗透水下漂洗5min。然后在30重量％甘油和70重量％水的100g溶液中将膜震摇5min，并随后在80℃下干燥10min。

实施例3：用吡啶和氯磺酸来硫酸化

吡啶(Sigma-Aldrich,Cat.No.270970-1L)和氯磺酸(Sigma-Aldrich,Cat.No.571024-100G)在使用前冷却至-18℃。伴随剧烈搅拌，经压力平衡滴加漏斗和干燥管将60ml氯磺酸在15min内逐滴添加至1000ml吡啶中，其中温度一定不能超过5℃；此处析出白色固体。

然后密封混合物，并在水浴中搅拌下加热至65℃，直至固体完全溶解。然后将由此获得的硫酸化溶液在1小时内冷却至40℃。

宽度为3.3cm、长度为21cm的非交联的膜条(来自实施例1的比较例)和来自实施例2的膜条共计18条，以粗糙PP织物缠绕并转移至500ml聚丙烯旋盖罐。控温至40℃的硫酸化溶液转移至该旋盖罐。密封旋盖罐。

在40℃下震摇反应容器20小时。然后将膜过滤器条漂洗并如下文浸渍：

-流动的反渗透水10min，

-用1000ml的1MNaCl震摇10min，

-流动的反渗透水10min，

-在30重量％甘油和70重量％水的溶液中10min。

然后将其在80℃下干燥12小时以上。

实施例4：微量过滤器膜的渗透性测定

从根据实施例3的硫酸化纤维素微量过滤器膜中打孔出47mm盘。用反渗透水将之湿润，并在流动的反渗透水下漂洗5min。打孔空白包含在Sartorius型号16249压力过滤器保持件中。测定在20至25℃和0.1bar正压下进行。测定100g介质流经膜过滤器所消耗的时间。由此确定的流动单位表示为ml/(cm²·min·bar)。反渗透水和pH7的10mM磷酸钾缓冲液都用作介质。

流动测定后，盘可用于进一步的研究。

实施例5：通过滴定定量测定硫酸化程度

用圆形打孔器从硫酸化纤维素微量过滤器膜打孔出30mm盘。30mm打孔空白包含在死体积优化的过滤器保持件中。活性过滤器表面(activefiltersurface)为5.7cm²。过滤器保持件用反渗透水填充并排除气泡。过滤器保持件连接至来自WatsonMarlow的多通道盒式泵(型号205U)，其管线没有气泡。盒式泵输出为每分钟约5ml。然后经过膜过滤器系列地泵入下列介质，每种4分钟时间：1MNaCl，1MHCl，1mMHCl，反渗透水。

然后将具有磁力搅拌棒的40ml玻璃烧杯放在过滤器保持件的输出侧下。然后进一步提供1MNaCl4min。收集的洗脱液然后通过电位指示的方式滴定。滴定液为5.0mM氢氧化钠水溶液。为此，直到pH7.0的等当量点，确定5mM氢氧化钠水溶液的消耗量。消耗的氢氧化钠水溶液的定量的量直接与膜上的硫酸系基团的定量的量成比例。从可得的膜的活性表面和氢氧化钠水溶液的消耗量以及每cm²的纤维素质量，可计算硫酸化程度，其与硫酸化纤维素上的硫酸系基团的质量成比例。

式：

硫酸系基团密度：

n_硫酸系基(μmol/cm²)＝c(NaOH)×t(NaOH)×c(NaOH)×1000/A

其中

c(NaOH)以mol/l计的氢氧化钠滴定水溶液的定量的浓度

V(NaOH)以ml计的在等当量点(pH7)下消耗的滴定液体积

t(NaOH)滴定液的校正因子

1000从mol/l向μmol/ml的转化因子

A以cm²计的活性过滤器表面

并且其中

M(SO₃)以μg/μmol计的SO₃的摩尔质量。

式：

以重量％计的硫酸化程度＝(n_硫酸系基×M(SO₃)/m_纤维素+(n_硫酸系基×M(SO₃)))×100％

其中

m_纤维素打孔空白的纤维素以μg每cm²计的纤维素质量

样品1至5的硫酸化程度的结果总结于表2。

实施例6：对溶菌酶的结合能力的测定

将活性膜表面为17.6cm²的各膜样品在35ml的10mM磷酸钾缓冲液(KPi)中，在pH7.0下约80转每分钟(rpm)下震摇3次5分钟，然后置于溶菌酶在10mMKpi、pH7.6中的2mg/ml溶液35ml中在20至25℃下放置12至18小时。然后将膜样品每次在35ml的10mMKPi缓冲液(pH7.0)中漂洗2×15分钟。然后将膜样品在20ml的10mMKPi缓冲液(pH7.0)和1MNaCl水溶液中震摇。洗脱的蛋白质的量通过测定280nm下的光密度(OD)而确定。

样品1至5和S对溶菌酶的结合能力的结果总结于表2。

实施例7：宿主细胞蛋白质(HCP)的结合

为了确定宿主细胞蛋白质的结合，用没有抗体的10倍浓缩的HCP在PBS缓冲液(磷酸盐缓冲的盐水溶液，pH7.4)中的溶液，在感染产生剂(contractproducer)的情况中，在中国仓鼠卵巢细胞系的“假”运行(培养细胞系而没有抗体产生)中制备。HCP溶液在20mMTRIS/HCl缓冲液(pH7.4)中1:10稀释，并通过添加NaCl将电导率调节至10mS/cm。1000ml稀释的HCP溶液用于加载膜。HCP浓度通过ELISA(“酶联免疫吸附试验ELISACygnusCM105”)的方法根据方法说明测定。宿主细胞蛋白质(HCP)的浓度为7μg/ml。

3层膜层(样品4)固定在膜保持件中。膜保持件中的膜层叠的膜表面积为15cm²，流入表面为5cm²，床高度(膜层叠的厚度)为750μm。膜保持件中的膜用20mMTRIS/HCl缓冲液(pH7.4)漂洗以取代空气，然后连接至来自GEHealthcare的“Explorer100”色谱系统。

然后用包含4个步骤的试验程序检查膜或膜层叠的HCP结合。试验程序的4个步骤说明如下：

1.用10ml电导率为10mS/cm的20mMTRIS/HCl缓冲液(pH7.4)平衡膜，

2.用100mlHCP溶液加载膜，

3.用10ml的20mMTRIS/HCl缓冲液(pH7.4，电导率10mS/cm)洗涤，和

4.用10ml的20mMTRIS/HCl缓冲液(pH7.4)中的1MNaCl洗脱。

所有步骤在10ml/min的流速下进行。在所有步骤中，吸收在紧接在膜单元后的检测器在280nm下测定。穿透曲线示于图3。

实施例8对小型失活流感病毒的结合能力的测定

甲型流感PuertoRico/8/34，H1N1在贴壁MDCK细胞(GMEM培养基)中产生(参考Y.Genzel等人，Vaccine22(2004),2202-2208)。培养之后，培养基经连续的两步过滤步骤过滤(孔径5μm和0.65μm过滤器深度，GEWater&ProcessTechnologies)，并接着用3mMβ-丙内酯在37℃下化学灭活24小时。灭活后，再次使溶液澄清(0.45μm膜过滤器，GEWater&ProcessTechnologies)，并接着经交叉流过滤器(750kDaMWCO,GEHealthcare)浓缩20倍(参见B.Kalbfuss等人，Biotechnol.Bioeng.97(1),2007,73-85)。浓缩的样品在-80℃下存储直至需要使用。

冷冻的病毒分装品(3×2ml)在水浴中解冻，混合并在9000g下离心10min。接着用结合缓冲液(10mMTris,pH7.4和50mMNaCl)1:3稀释上清。

由此制备的溶液用于测定动态结合能力。所有实验在来自GEHealthcare的“Explorer100”色谱系统上进行。实验所试验的单元由流入表面0.36cm²和床体积0.14ml的15层膜层组成。平衡用10mMTris，50mMNaCl，pH7.4进行。平衡后，26ml病毒溶液加样在单元上，并连续收集2ml部分。加样时的流速为1ml/min。血凝素(HA)活性在不同部分中定量。加样后，膜单元用平衡缓冲液漂洗直至到达基线，并随后用10mMTris，2.0MNaClpH7.4洗脱。也收集洗脱液和漂洗部分，并且也分析其HA活性。

病毒浓度在连续流部分中测定，并经血凝素试验定量(参见Kalbfuss等人，Biologicals36(2008),145-161)。针对所有样品测定对流感病毒的结合能力，并且能力在10％、25％和50％穿透处计算，即每体积分离材料的结合的病毒量达至起始溶液的病毒浓度的10％或25％或50％。动态结合能力计算如下：

C₀：起始溶液中的病毒浓度(病毒颗粒/ml＝颗粒/ml)

V_x：达至x％穿透的加样体积(ml)

A_x：达至x％穿透的连续流中病毒颗粒的数目

V_B：试验单元的床体积

达至x％穿透的动态结合能力(颗粒/ml)＝(V_x×C₀-A_x)/V_B

样品1至5和的结合能力的结果总结在表2中。

表2：结果总结

*在样品5中，由于此膜对流感病毒非常高的结合能力，25％和50％穿透都不能由实施例8中述及的26ml的病毒溶液加样体积达到。

Claims

1.一种硫酸化纤维素水合物膜，其包括具有从膜的一个主表面向另一个主表面延伸的孔的交联纤维素水合物基质，其中所述纤维素水合物膜在其内外表面上具有硫酸系配体用于吸附物质的分离。

2.根据权利要求1所述的硫酸化纤维素水合物膜，其中所述纤维素水合物基质的硫酸化程度为10重量％以上。

3.根据权利要求1或2所述的硫酸化纤维素水合物膜，其中所述膜的平均孔径为0.5至5.0μm之间。

4.根据权利要求1至3任一项所述的硫酸化纤维素水合物膜，其中所述纤维素水合物基质的交联程度为0.05至0.5。

5.一种用于制备根据权利要求1所述的硫酸化纤维素水合物膜的方法，其包括以下步骤：

-提供孔径为0.1至20μm的纤维素水合物膜；

-用分子中具有与所述纤维素水合物基质的羟基反应的至少两个官能团的交联剂将所述纤维素水合物基质交联；和

-将交联纤维素水合物基质硫酸化。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述交联剂选自由双环氧化合物、二异氰酸酯、表氯醇、表溴醇、二甲基脲、二甲基乙基脲、二甲基氯硅烷、双(2-羟乙基砜)、二乙烯基砜、亚烷基二卤化物、羟亚烷基二卤化物和二环氧甘油醚或其混合物组成的组。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中1,4-丁二醇二环氧甘油醚或乙二醇二环氧甘油醚用作所述交联剂。

8.根据权利要求5至7任一项所述的方法，其中所述交联剂在交联溶液中的浓度为10至30重量％。

9.根据权利要求5至8任一项所述的方法，其中所述硫酸化通过将所述交联纤维素水合物基质与路易斯碱-SO₃复合物反应而进行。

10.根据权利要求5至9任一项所述的方法，其中所述硫酸化通过与SO₃-吡啶复合物的反应进行。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述SO₃-吡啶复合物在硫酸化溶液中的浓度为1至40重量％。

12.根据权利要求5至11任一项所述的方法，其中所述硫酸化在20至90℃的温度下进行。

13.根据权利要求1至4任一项所述的硫酸化纤维素水合物膜作为用于纯化病毒或病毒片段的吸附膜的用途。

14.根据权利要求13所述的用途，其用于纯化分子量大于10⁷Da的病毒。

15.根据权利要求13或14所述的用途，其用于纯化流感病毒。