CN117886911A - 蛋白快速浓缩换液的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白领域，尤其涉及蛋白快速浓缩和换液的方法。本发明提供了蛋白快速浓缩和换液的方法，包括如下步骤：S1：在有机相和盐相存在的条件下，加入样品，获得混合物；S2：取S1中所述混合物分相后，离心，收集固体相，获得所述蛋白；所述有机相包括：PEG6000；所述盐相包括：硫酸铵。本发明利用双水相萃取系统，通过对双水相系统组分比例的筛选，将植物总蛋白、植物重组蛋白GFP以及植物源流感HA病毒样颗粒(HA‑VLP)富集到双水相中间相，形成固体，然后通过添加不同体积的溶液以达到对蛋白不同倍数浓缩的效果；亦可以添加不同的缓冲液，以达到对蛋白换液的效果；亦可以同时实现浓缩换液。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白领域，尤其涉及蛋白的检测及纯化方法。
背景技术
蛋白药物的开发为患者提供创新且负担得起的生物药从而加强了全球医疗保障。蛋白已经越来越多被用于科研、医药产品，在蛋白药物开发过程中，蛋白产物的纯化和生产是实现蛋白药物符合法规要求、具有所需安全性、有效性和质量的产品的关键部分。通过各种纯化技术来提纯，得到高纯度、有活性的蛋白至关重要。蛋白纯化的基本步骤包括根据蛋白产品的特性确定合适的纯化工艺。随后，涉及多项流程，并且在遵守化学、制造和控制(CMC)要求时会遇到许多挑战。蛋白质纯化工艺流程、下游工艺开发和生产的关键考虑因素、挑战并努力为最高级工艺提供有效的解决方案一直都是生产工艺的核心领域。
蛋白分离纯化成本占到蛋白药物生产工艺全部成本的60％～80％，一个蛋白纯化的典型工艺流程从收获开始，再澄清、粗纯、最后精纯。精心设计的纯化工艺可以实现高效的回收率、纯度、高病毒清除率和宿主蛋白去除率。传统工艺上使用各种不同的填料对目标蛋白执行捕获步骤，随后使用离子交换或疏水相互作用进行中间层析和精纯层析，利用目的蛋白和污染物之间的电荷和亲水/疏水差异，再进行缓冲液置换和蛋白质浓缩，然后使用超滤/洗滤技术进一步纯化，以将纯化的蛋白质配制成药物或产品。在传统工艺中，蛋白的捕获阶段一般要求一定的上样浓度和合适的缓冲液，以便于目的蛋白与对应的填料结合；在蛋白精纯阶段同样需要将蛋白的缓冲液置换成相应纯化方式所需的缓冲液以进一步精纯层析；在蛋白产品的最终检测环节和生产阶段，都需要对其浓度和缓冲液成分进行调节，即进行浓缩、脱盐、换液。蛋白的浓缩换液贯穿整个蛋白产品的研发或生产工艺，是蛋白纯化工艺中不可或缺的关键步骤。
目前蛋白浓缩使用最普遍的方法是超滤、透析、沉淀、吸附层析或者冷冻干燥。超滤是以分子大小为最基本的因素，常用于分离溶液中极其微小的颗粒和不溶分子，一般使用不同分子截留量的超滤管、中空纤维素超滤管、超滤膜包等。普通的超滤管仅需相应转子的离心机即可完成蛋白浓缩，但是随着蛋白浓度的增加，附着在超滤管上的超滤膜孔部分堵塞，超滤管的水分子透过效率降低；中空纤维素超滤管和超滤膜包都需要蠕动泵的辅助，而且根据中空纤维素超滤管和超滤膜包的空腔体积，需要一定初始量的蛋白样品，并不适合小量蛋白样品浓缩。
透析浓缩是利用透析袋浓缩蛋白质溶液，是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋，结扎，将高分子聚合物吸水剂如聚乙二醇8000、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。透析浓缩大多数都不适用于总蛋白的浓缩，且需要根据目标蛋白的分子量选择透析袋的孔径，以免造成目标蛋白的损失，对于大规模的蛋白样品的浓缩需要特殊定制的透析袋和使用大量吸水剂，且浓缩过程时间长，并不能达到经济高效的原则。
沉淀法包括盐析法、有机溶剂沉淀法和高分子聚合物等方法。蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团的分布影响蛋白质分子在水溶液中的溶解性，这些基团与水溶液中离子基团相互作用。通过改变pH或离子强度，加入有机溶剂或多聚物，可以促进蛋白质分子凝聚，形成蛋白质沉淀。通过离心或过滤可以获得沉淀物，然后利用合适的缓冲液清洗，溶解沉淀物，再经过透析或凝胶过滤，除去残留的溶剂成分。然而用于沉淀的试剂一般需要额外的纯化步骤来去除，而且对于部分蛋白凝集沉淀之后，表面的水分子膜和电荷破坏后就再难以恢复原有的构象而失活。
吸附层析是利用蛋白质的某些性质，通过静电或疏水相互作用与固相支持物的配基结合。固相支持物通常为琼脂糖、葡聚糖和聚丙烯酰胺。使用的配基包括能结合糖蛋白的凝集素、能结合特定丝氨酸蛋白酶的赖氨酸、能结合免疫球蛋白IgG和IgA的蛋白A、能结合某些酶类的染料、用于纯化某些重组蛋白质的金属螯合琼脂糖等。重组蛋白质与配基的弱结合使得洗脱条件比较温和，具有生物活性的表达产物的回收率高。但该方法不适用于总蛋白的浓缩，且一般需要相应的纯化仪和填料，成本极高，耗时长。
蛋白纯化对蛋白所在的溶液有一定的要求，如使用离子交换(Ion excha nge)，样品需换液在低盐的环境中；有些蛋白，如细胞因子，一般需换液在PBS中才能用于细胞实验。换液操作在蛋白纯化中很常见，目前常用的蛋白缓冲液换液方法有透析、超滤、脱盐柱、分子筛、离子交换等。透析换液是选择小于目标蛋白分子截留量的透析袋作为目的蛋白容器，放入需要置换的大量的缓冲液中，通过透析袋内外不同的渗透压实现换液，换液不彻底，效率很低，且容易发生蛋白质沉淀；超滤换液是利用超滤浓缩原理将蛋白原液浓缩到一定体积后开始加入一定体积需要置换的缓冲液，浓缩到一定体积后，再加入一定体积需要置换的缓冲液，反复多次实现稀释换液，效率低下，换液不彻底；脱盐柱、分子筛、离子交换等层析换液条件温和，换液彻底，但是程序复杂，且需要蛋白纯化仪、填料或相应的层析柱，成本高，耗时长。
传统的蛋白浓缩换液方法有着许多的缺点，如耗时长，程序复杂，选择性低等。因此开发一种简单有效的方法进行蛋白的浓缩换液是非常有必要的。
双水相萃取系统(ATPS)作为一种新型的液-液萃取技术，是指把两种聚合物或一种聚合物与一种盐的水溶液混合在一起，由于聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间的不相溶性形成两相，成为分离纯化生物活性成分的一种新技术。双水相萃取具有分相时间短，易于操作，投资费用少，大多数形成双水相的高聚物可回收利用，且条件温和、容易放大、可连续操作等特点。并且相对于液液萃取，双水相系统中的含水量高很多，可达70％～90％，不仅不会造成生物活性物质的变性或失活，甚至还能起到稳定和保护生物活性的作用，因此现已被广泛用于酶、蛋白质、病毒、核酸等生物产品的分离和纯化。
目前少有双水相用于蛋白浓缩换液的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种蛋白检测及纯化的方法。本发明利用双水相萃取系统，通过对双水相系统组分比例的筛选，将植物总蛋白、植物重组蛋白GFP以及植物源流感HA病毒样颗粒(HA-VLP)富集到双水相中间相，形成固体，然后通过添加不同体积的溶液以达到对蛋白不同倍数浓缩的效果；亦可以添加不同的缓冲液，以达到对蛋白换液的效果；亦可以同时实现浓缩换液。整个过程无需昂贵的设备、时间短、操作流程简单、绿色环保、成本低，不仅适用于科研小规模实验，也可用于大规模生产。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了蛋白快速浓缩换液的方法，包括如下步骤：
S1：在有机相和盐相存在的条件下，加入样品，获得混合物；
S2：取S1中所述混合物分相后，离心，收集固体相，获得所述蛋白；
所述有机相包括：PEG6000；所述盐相包括：硫酸铵。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述有机相的浓度为14.0wt％～20.0wt％；所述盐相的浓度为16.0wt％～22.0wt％。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述有机相的浓度为18.0wt％；所述盐相的浓度为22.0wt％。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中，S2中所述离心的转速为4000rpm，时间为5min。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述收集固体相后还包括浓缩和/或换液的步骤；所述浓缩采用PBS缓冲液，所述浓缩的倍数为2～100倍。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述换液采用平衡液和洗脱液；
所述平衡液和所述洗脱液包括：咪唑或Tris，和NaCl。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述NaCl的终浓度为150～300mM；所述咪唑的终浓度为10～500mM；所述Tris的终浓度为20mM。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述平衡液包括：镍柱平衡液和/或分子筛平衡液；
所述镍柱平衡液包括：终浓度为300mM的NaCl和终浓度为10mM的咪唑；
所述分子筛平衡液包括：终浓度为150mM的NaCl和终浓度为20mM的Tris。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述洗脱液包括：镍柱洗脱液和/或分子筛洗脱液；
所述镍柱洗脱液包括：终浓度为300mM的NaCl和终浓度为500mM的咪唑；
所述分子筛洗脱液包括：终浓度为100mM的NaCl和终浓度为20mM的Tris。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述换液还包括离心的步骤；所述离心的转速为8000～12000rpm，时间为15min。
在本发明的一些实施方案中，上述方法中，所述样品包括：植物蛋白、植物重组蛋白和植物源病毒样颗粒中的一种或多种。
本发明提供了蛋白快速浓缩换液的方法，包括如下步骤：
S1：在有机相和盐相存在的条件下，加入样品，获得混合物；
S2：取S1中所述混合物分相后，离心，收集固体相，获得所述蛋白；
所述有机相包括：PEG6000；所述盐相包括：硫酸铵。
本发明利用双水相萃取系统，通过对双水相系统组分比例的筛选，将植物总蛋白、植物重组蛋白GFP以及植物源流感HA病毒样颗粒(HA-VLP)富集到双水相中间相，形成固体，然后通过添加不同体积的溶液以达到对蛋白不同倍数浓缩的效果；亦可以添加不同的缓冲液，以达到对蛋白换液的效果；亦可以同时实现浓缩换液。整个过程无需昂贵的设备、时间短、操作流程简单、绿色环保、成本低，不仅适用于科研小规模实验，也可用于大规模生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示PEG6000/硫酸铵双水相对植物总蛋白回收最佳条件筛选；其中：C:植物总蛋白对照；1-8:对应表1中各体系中间层样品；
图2示PEG6000/硫酸铵双水相对低浓度植物总蛋白的浓缩；其中：C:植物总蛋白对照；1、2、3分别对应植物总蛋白浓缩2倍、5倍、10倍；
图3示PEG6000/硫酸铵双水相对重组GFP植物总蛋白回收最佳条件筛选；其中：C:重组GFP总蛋白；1-8:对应表2中各体系中间层样品；
图4示PEG6000/硫酸铵双水相对重组GFP植物总蛋白的浓缩；其中：C:重组GFP总蛋白；1、2、3分别对应重组GFP植物总蛋白浓缩2倍、5倍、10倍；
图5示双水相换液后对重组GFP镍柱纯化样品的检测；其中：C:重组GFP总蛋白；1-5：重组GFP镍柱纯化洗脱样品；
图6示PEG6000/硫酸铵双水相对HA-VLP植物总蛋白的浓缩；其中：1、2、3分别对应HA-VLP植物总蛋白浓缩2倍、5倍、10倍；
图7示双水相换液后对HA-VLP分子筛纯化样品的检测；其中：C:HA-VLP植物总蛋白；1-5:HA-VLP通过分子筛分离纯化的样品；
图8示双水相对极低浓度HA-VLP的高倍浓缩；其中：C:低浓度HA-VLP原液；1-5:分别对应HA-VLP浓缩10倍、20倍、30倍、50倍、100倍样品。
具体实施方式
本发明公开了一种蛋白检测及纯化的方法。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明实施例1～实施例9和对比例1～对比例2中，所用原料及试剂均可由市场购得。
本发明所采用的材料：本氏烟(植物房)；
氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾：上海麦克林生化科技有限公司；
Tris：上海麦克林生化科技有限公司；
硫酸铵、PEG6000：国药集团化学试剂有限公司；
氢氧化钠：上海麦克林生化科技有限公司；
咪唑：上海麦克林生化科技有限公司；
植物密码子优化后的绿色荧光蛋白GFP(GenBank:BBG75461.1)和甲型流感病毒样颗粒HA-VLP[InfluenzaA virus(A/California/165/2019(H1N1))]序列均由擎科生物合成；
一抗：Anti-GFP Mouse mAb，TRAN；
二抗：Goat anti-Mouse IgG HRP antibody，华安生物；
一抗：Anti-HA RabbitmAb，TRAN；
二抗：Goat anti-RabbitIgG HRP antibody，华安生物；
显色液：DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒，碧云天；
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、溶液制备
(1)、PBS提取液的配制
称取8g NaCl，0.2g KCl，0.19g KH2PO4，1.39g K2HPO4置于烧杯中，加入约900mL纯水，充分溶解后用HCl调节pH至8.0，定容至1L，使得各成分终浓度为137mM NaCl，2.7mMKCl，1.4mM KH2PO4，8mM K2HPO4并经0.22μm滤膜过滤备用。
(2)、双水相各体系溶液的配制
称取40g硫酸铵，加入60g纯水充分溶解配置成40.0wt％硫酸铵溶液并经0.22μm滤膜过滤备用，
称取50g PEG6000，加入50g纯水充分混匀配置成50.0wt％PEG6000溶液备用。
(3)、镍柱平衡液
称取17.5g NaCl，0.68g咪唑置于烧杯中，加入约900mL PBS，充分溶解后用2MNaOH调节pH至8.0，定容至1L，使得各成分终浓度为300mM NaCl，10mM咪唑并经0.22μm滤膜过滤备用。
(4)、镍柱洗脱液
称取17.5g NaCl，34g咪唑置于烧杯中，加入约900mL PBS，充分溶解后用2M NaOH调节pH至8.0，定容至1L，使得各成分终浓度为300mM Na Cl，500mM咪唑并经0.22μm滤膜过滤备用。
(5)、分子筛平衡液
称取2.4gTris，8.76g NaCl置于烧杯中，加入约900mL纯水，充分溶解后用HCl调节pH至7.0，定容至1L，使得各成分终浓度为20mM Tris、150mM NaCl并经0.22μm滤膜过滤备用。
(6)、分子筛洗脱液
称取2.4gTris，58.44g NaCl置于烧杯中，加入约900mL纯水，充分溶解后用HCl调节pH至7.0，定容至1L，使得各成分终浓度为20mM Tris、1000mM NaCl并经0.22μm滤膜过滤备用。
2、蛋白表达和提取
(1)、烟草总蛋白的提取
收集生长4周左右的，未经任何处理的本氏烟烟叶，按照料液比1:3加入提取液，在破壁机中破碎2min，冰浴30min后，再在4℃、12000rpm条件下离心15min，收集上清并调节pH为7.0，经0.22μm滤膜过滤放入4℃备用。
(2)、重组GFP蛋白和HA病毒样颗粒(HA-VLP)的植物表达
将携带GFP(GenBank:BBG75461.1)基因序列或HA-VLP[Influenza A virus(A/California/165/2019(H1N1))]基因序列的质粒转入农杆菌中，菌液在含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平的平板上进行划线，28℃培养36h后，挑取单克隆在5mL YEP液体培养基(含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平)中进行220rpm小摇待菌液混浊，转至500mL培养基中扩培20h，收集菌体并用MES溶液重悬稀释至OD600为0.8～1.2即可。将烟草叶片浸没在菌液中，真空抽2～4min，使得菌体完全进入叶片中。在日光灯下继续恒温培养四天后，收集叶片放入-80℃冰箱备用。
(3)、重组GFP蛋白和HA病毒样颗粒(HA-VLP)的粗提液制备
将收集好表达有重组GFP蛋白和HA病毒样颗粒的烟草叶片，分别加入破壁机中，按照料液比1:3加入PBS提取液，在破壁机中破碎2min，冰浴30min后，再在4℃、8000rpm条件下离心30min，收集上清并调节pH为7.0，经0.22μm滤膜过滤放入4℃备用。
实施例2PEG6000/硫酸铵质量分数对植物总蛋白回收率的影响
取四支5mL离心管编号，在各个离心管中称取18wt％PEG6000作为有机相，再分别加入16.0wt％、18.0wt％、20.0wt％、22.0wt％的硫酸铵，组成4个不同的双水相体系，再加入实施例1制备的0.69g本氏烟总蛋白粗提液充分混匀，组成3g体系，进行硫酸铵对植物总蛋白回收率最佳条件的筛选；然后根据最佳硫酸铵条件，在各个离心管中称取22wt％硫酸铵作为盐相，再分别加入14.0wt％、16.0wt％、18.0wt％、20.0wt％的PEG6000，组成4个不同的双水相体系，再加入0.69g本氏烟总蛋白粗提液充分混匀，组成3g体系，进行PE G6000对植物总蛋白回收率最佳条件的筛选。具体体系各重量见表1。
表1PEG6000/硫酸铵质量分数植物总蛋白回收率的影响
| 体系 | 样品/g | 硫酸铵wt％ | PEG6000wt％ | 回收率％ |
| 1 | 0.69 | 16％ | 18％ | 44.26％ |
| 2 | 0.69 | 18％ | 18％ | 66.37％ |
| 3 | 0.69 | 20％ | 18％ | 90.82％ |
| 4 | 0.69 | 22％ | 18％ | 98.33％ |
| 5 | 0.69 | 22％ | 14％ | 53.26％ |
| 6 | 0.69 | 22％ | 16％ | 56.50％ |
| 7 | 0.69 | 22％ | 18％ | 98.62％ |
| 8 | 0.69 | 22％ | 20％ | 40.01％ |
称好各组分后混匀，静置1～2min分相后，在室温下，4000rpm，离心5min，然后取双水相的中间固体相，并溶解中间固体相，然后通过蛋白电泳来检测蛋白回收结果，根据SDS-PAGE胶图结果计算出体系回收率，结果如表1所示。
从图1可以看出，植物总蛋白的回收率在硫酸铵22wt％和PEG600018wt％时回收率最高，且高达98％以上，PEG6000/硫酸铵双水相体系可以有效的实现植物总蛋白的回收。
实施例3PEG6000/硫酸铵双水相对低浓度植物总蛋白的浓缩
在硫酸铵22wt％和PEG600018wt％的条件下，可以将低浓度的植物总蛋白富集到双水相的中间固体相，收集中间固体相后，通过添加不同体积的PB S缓冲液来溶解中间相，以实现对低浓度植物总蛋白不同倍数的浓缩，从而达到进一步实验需求的目的。取体系中间相分别加入350μL、140μL、70μL PB S重悬，即达到2倍、5倍、10倍蛋白浓缩效果，并通过蛋白电泳来检测蛋白浓缩结果，如图2所示。
从图2可以看出，通过添加不同的体积的PBS缓冲液来溶解中间相，低浓度植物总蛋白确实有不同倍数的浓缩。因此PEG6000/硫酸铵双水相体系可以有效的实现低浓度植物总蛋白的浓缩。
实施例4PEG6000/硫酸铵质量分数对重组GFP的植物总蛋白回收率的影响
取四支5mL离心管编号，在各个离心管中称取18wt％PEG6000作为有机相，再分别加入16.0wt％、18.0wt％、20.0wt％、22.0wt％的硫酸铵，组成4个不同的双水相体系，再加入0.69g重组GFP植物总蛋白提取液充分混匀，组成3g体系，进行硫酸铵对重组GFP植物总蛋白回收率最佳条件的筛选；然后根据最佳硫酸铵条件，在各个离心管中称取22wt％硫酸铵作为盐相，再分别加入14.0wt％、16.0wt％、18.0wt％、20.0wt％的PEG6000，组成4个不同的双水相体系，再加入0.69g重组GFP植物总蛋白提取液充分混匀，组成3g体系，进行PEG6000对重组GFP植物总蛋白回收率最佳条件的筛选。具体体系各重量见表2。
表2PEG6000/硫酸铵质量分数对重组GFP的植物总蛋白回收率的影响
称好各组分后混匀，静置1～2min分相后，在室温下，4000rpm，离心5min，然后取双水相的中间固体相，并溶解中间固体相，然后通过蛋白电泳来检测蛋白回收结果，根据SDS-PAGE胶图结果计算出体系回收率，结果如表2所示。
从图3可以看出，重组GFP植物总蛋白的回收率也是在硫酸铵22wt％和PEG600018wt％时回收率最高，且高达97％以上，PEG6000/硫酸铵双水相体系可以有效的实现重组GFP植物总蛋白的回收。
实施例5PEG6000/硫酸铵双水相对重组GFP植物总蛋白的浓缩
在硫酸铵22wt％和PEG600018wt％的条件下，可以将重组GFP植物总蛋白富集到双水相的中间固体相，收集中间固体相后，通过添加不同的体积的PBS缓冲液来溶解中间相，以实现对重组GFP植物总蛋白不同倍数的浓缩，从而实现进一步实验需求的目的。取体系中间相分别加入350μL、140μL、70μL PBS重悬，即达到2倍、5倍、10倍蛋白浓缩效果，并通过蛋白电泳和We stern Blotting(一抗：Anti-GFP Mouse mAb，二抗：Goat anti-Mouse IgGHRP antibody)来检测蛋白浓缩结果，如图4所示。
从图4的蛋白SDS-PAGE电泳胶图和对应的Western blotting可以看出，通过添加不同的体积的缓冲液来溶解中间相，重组GFP植物总蛋白确实有不同倍数的浓缩。因此PEG6000/硫酸铵双水相体系可以有效的实现重组GFP植物总蛋白的浓缩。
实施例6PEG6000/硫酸铵双水相对重组GFP植物总蛋白的换液
通过镍柱进一步将重组GFP植物总蛋白纯化时，需要将蛋白提取液转换为镍柱平衡液，本发明将重组GFP植物总蛋白快速富集到双水相的中间固体相后，通过添加镍柱平衡液来溶解中间相，以实现短时间快速换液，且可以根据加液体积调整重组GFP植物总蛋白到合适的浓度，从而实现进一步纯化的目的。本发明在硫酸铵22wt％和PEG600018wt％的条件下，将300g(300ml)重组GFP植物总蛋白富集到双水相的中间固体相，添加30mL镍柱平衡液来溶解中间相后，在4℃条件下12000rpm离心15min，再取上清上样到镍柱，然后通过镍柱洗脱液逐步梯度洗脱将重组GFP洗脱下来，通过对相应洗脱样品的蛋白电泳和荧光拍照检测，结果如图5所示。
从图5的蛋白SDS-PAGE电泳胶图和对应的荧光检测可以看出，通过双水相体系换液后的重组GFP植物总蛋白可以有效的被镍柱吸附并洗脱纯化，PEG6000/硫酸铵双水相体系可以实现对重组GFP植物总蛋白的快速换液。
实施例7PEG6000/硫酸铵双水相对HA-VLP植物总蛋白的浓缩
根据实施例2和实施例4的最优筛选条件，在硫酸铵22wt％和PEG600018wt％的条件下，可以将表达的HA-VLP植物总蛋白富集到双水相的中间固体相，收集中间固体相后，通过添加不同的体积的PBS缓冲液来溶解中间相，以实现对HA-VLP植物总蛋白不同倍数的浓缩，从而实现进一步实验需求的目的。取体系中间相分别加入350μL、140μL、70μL PBS重悬，即达到2倍、5倍、10倍蛋白浓缩效果，并通过蛋白电泳和Western Blotting(一抗：Anti-HARabbit mAb，二抗：Goat anti-Rabbit IgG HRP antibody)来检测蛋白浓缩结果，如图6所示。
从图6的蛋白SDS-PAGE电泳胶图和对应的Western blotting可以看出，通过添加不同的体积的缓冲液来溶解中间相，HA-VLP植物总蛋白确实有不同倍数的浓缩。因此PEG6000/硫酸铵双水相体系可以有效的实现HA-VLP植物总蛋白的浓缩。
实施例8PEG6000/硫酸铵双水相对HA-VLP植物总蛋白的换液
通过分子筛HiScreen Capto Core700进一步分离纯化HA-VLP时，需要将HA-VLP植物总蛋白提取液转换为分子筛平衡液，本发明将HA-VLP植物总蛋白快速富集到双水相的中间固体相后，通过添加分子筛平衡液来溶解中间相，以实现短时间快速换液，且可以根据加液体积调整HA-VLP植物总蛋白到合适的浓度，从而实现进一步纯化的目的。本发明在硫酸铵22wt％和PE G600018wt％的条件下，将100g(100mL)HA-VLP植物总蛋白富集到双水相的中间固体相，添加20mL分子筛平衡液来溶解中间相后，在4℃条件下8000rpm离心15min，再取上清上样到分子筛，然后通过分子筛洗脱液逐步梯度洗脱将HA-VLP洗脱下来，通过对相应洗脱样品的蛋白电泳和Western blo tting(一抗：Anti-HA Rabbit mAb，二抗：Goatanti-Rabbit IgG HRP antibo dy)检测，结果如图7所示。
从图7的蛋白SDS-PAGE电泳胶图和对应的Western Blotting检测可以看出，通过双水相体系换液后的HA-VLP植物总蛋白可以有效的通过分子筛的洗脱纯化，PEG6000/硫酸铵双水相体系可以实现对HA-VLP植物总蛋白的快速换液。
实施例9PEG6000/硫酸铵双水相对极低浓度HA-VLP的高倍浓缩
PEG6000/硫酸铵双水相可以将极低浓度的HA-VLP富集到双水相的中间固体相，收集中间固体相后，通过添加不同的体积的PBS缓冲液来溶解中间相，以实现对极低浓HA-VLP不同倍数的浓缩，以达到进一步实验需求的目的。取15g(约15ml)极低浓度的HA-VLP溶液，在硫酸铵22wt％和PEG600018wt％的条件下富集到中间相，进行分别用1.5mL，0.75mL，0.5mL，0.3mL，0.15mL的PBS缓冲液溶解，即达到10倍、20倍、30倍、50倍、100倍的浓缩效果，并通过蛋白电泳以及Western blotting来检测蛋白浓缩结果，如图8所示。
从图8的蛋白SDS-PAGE电泳胶图和对应的Western blotting可以看出，通过添加不同的体积的缓冲液来溶解中间相，以实现对极低浓HA-VLP不同倍数的浓缩，直到达到可以进行下一步实验的目的，PEG6000/硫酸铵双水相体系可以有效的实现极低浓度HA-VLP的高倍浓缩。
对比例1
取六支5mL离心管编号，在各离心管中分别按照表3比例进行体系的称取。
表3PEG6000/硫酸铵质量分数植物总蛋白回收率的影响
| 体系 | 样品/g | 硫酸铵wt％ | PEG6000wt％ | 回收率％ |
| 1 | 0.69 | 10％ | 12％ | 3.42％ |
| 2 | 0.69 | 12％ | 12％ | 5.26％ |
| 3 | 0.69 | 14％ | 12％ | 5.82％ |
| 4 | 0.69 | 12％ | 12％ | 5.34％ |
| 5 | 0.69 | 12％ | 14％ | 7.26％ |
| 6 | 0.69 | 12％ | 16％ | 9.47％ |
从1～3号体系可以看出，在低浓度的PEG6000中，虽然随着硫酸铵的浓度升高，回收率有所上升，但均在10％以下，蛋白没有完全集中在中间相；从4～6号体系可以看出，在低浓度的硫酸铵中，回收率较低浓度PEG6000整体有上升，但仍不高。
对比例2
取四支5mL离心管编号，在各个离心管中称取18wt％PEG6000作为有机相，再分别加入16.0wt％、18.0wt％、20.0wt％、22.0wt％的磷酸盐，组成4个不同的双水相体系，再加入0.69g本氏烟总蛋白粗提液充分混匀，组成3g体系，进行磷酸盐对植物总蛋白回收率最佳条件的筛选；然后根据最佳磷酸盐条件，在各个离心管中称取20wt％磷酸盐作为盐相，再分别加入14.0wt％、16.0wt％、18.0wt％、20.0wt％的PEG6000，组成4个不同的双水相体系，再加入0.69g本氏烟总蛋白粗提液充分混匀，组成3g体系，进行PEG6000对植物总蛋白回收率最佳条件的筛选。具体体系各重量见表4。
表4PEG6000/磷酸盐质量分数植物总蛋白回收率的影响
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.蛋白快速浓缩换液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：在有机相和盐相存在的条件下，加入样品，获得混合物；
S2：取S1中所述混合物分相后，离心，收集固体相，获得所述蛋白；
所述有机相包括：PEG6000；所述盐相包括：硫酸铵。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机相的浓度为14.0wt％～20.0wt％；所述盐相的浓度为16.0wt％～22.0wt％。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，S2中所述离心的转速为4000rpm，时间为5min。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述收集固体相后还包括浓缩和/或换液的步骤；
所述浓缩采用PBS缓冲液，所述浓缩的倍数为2～100倍。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述换液采用平衡液和洗脱液；
所述平衡液和所述洗脱液包括：咪唑或Tris，和NaCl。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述NaCl的终浓度为150～300mM；所述咪唑的终浓度为10～500mM；所述Tris的终浓度为20mM。
7.如权利要求4至6任一项所述的方法，其特征在于，所述换液还包括离心的步骤；所述离心的转速为8000～12000rpm，时间为15min。
8.如权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于，所述样品包括：植物蛋白、植物重组蛋白和植物源病毒样颗粒中的一种或多种。
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