CN111346618A - 一种用于纯化病毒的亲和层析介质的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种亲和层析介质，具体说是用于纯化病毒的亲和层析介质的制备方法。它采用大孔聚合物微球为基质，通过微球的化学改性接枝纤维素，再通过纤维素硫酸化获得亲和层析介质。采用方法制得亲和层析介质的耐压性能较好，可承受较高的流速和压力，上样量较高、生产效率较高，动态载量较高。

Description

一种用于纯化病毒的亲和层析介质的制备方法
技术领域
本发明涉及一种亲和层析介质，具体说是用于纯化病毒的亲和层析介质的制备方法。特别适用于病毒类超大分子的工业化分离纯化，如囊膜病毒。
背景技术
病毒是由核酸及外部的蛋白质外壳组成的非细胞生物。随着病毒在疫苗的研发、生产以及基因治疗等领域的应用，如何有效地纯化病毒颗粒已经成为了相关领域的重要课题。在病毒的纯化工艺中，常用超速离心法或层析分离法去除产品中的宿主细胞衍生物、污染物等杂质。超速离心法利用物质的沉降系数、密度、质量等差异可有效地分离纯化病毒，然而这种方法的病毒回收率低、耗时且成本高昂，仅适用于实验室规模，不利于大规模工业生产。层析分离法具有易规模放大、自动化程度高、可连续操作、易在位清洗等优点，可高效、低成本地进行分离纯化，是工业生产中普遍采用的病毒纯化方法。而在层析分离法所使用的众多层析介质中，亲和层析介质提供了更高的选择性，通过一步纯化便可得到高纯度产品，能减少病毒纯化的步骤与成本。
目前，病毒工业化分离所使用的层析介质大多以多糖类微球（如琼脂糖微球、纤维素微球）作为基质。然而，这类微球的耐压性能差，无法承受较高的流速与压力，且其上样量低，限制了生产效率。此外，多数病毒的直径在几十至几百纳米之间，现有层析介质的微球孔径往往小于这一数值，因此，介质的孔道内表面无法与目标病毒之间充分相互作用，导致了层析介质表现出了较低的动态载量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于纯化病毒的亲和层析介质的制备方法，采用方法制得亲和层析介质的耐压性能较好，可承受较高的流速和压力，上样量较高、生产效率较高，动态载量较高。
为解决上述问题，采用以上技术方案：
本发明的用于纯化病毒的亲和层析介质的制备方法的特点是包括如下步骤：
第一步，制备纤维素溶液
a.取氢氧化钠和硫脲与去离子水按照质量比（9~10氢氧化钠+4~5硫脲）∶100去离子水水混合得到混合溶液，并存储在-6~-4℃的环境中备用。
b.在-6~-4℃的冰浴环境中，将纤维素与冷却至-6~-4℃的混合溶液按照质量比0.5~3∶100混合，并搅拌30 min以上，得到纤维素溶液。
c.采用过滤器对纤维素溶液进行过滤，得到澄清透明的纤维素溶液。
第二步，接枝纤维素
a.在50~70℃的油浴环境中，将大孔聚合物微球、碘化钾和纤维素溶液按照质量比1~20∶0.5~2∶100混合，并在接入氮气的情况下搅拌4~5小时，得到第一混合物。
b.采用过滤器将第一混合物中的微球过滤出来，并依次使用-6~-4℃的混合溶液、去离子水和甲醇对微球进行洗涤。
c.将洗涤后的微球置于50~80℃烘箱中烘干，得到接枝了纤维素的聚合物微球。
第三步，纤维素的硫酸化
a.按照0.5~4∶7~8的质量比、将氯磺酸逐滴加入溶剂中混合，滴加时不断搅拌得到混合液备用，溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺或吡啶。
b.将接枝了纤维素的聚合物微球和溶剂按照1~5∶10~50的质量比混合，得到第二混合物。
c.并在不断搅拌的情况下，按照质量比2~12∶10~50将混合液逐滴加入到第二混合物中混合，并在60℃以下反应1~12小时，得到反应液。
d. 将反应液倒入含4%醋酸钠（w/v）的乙醇溶液中静置8小时以上后，采用过滤器将溶液中的微球过滤出来，并以去离子水洗涤微球至中性。
e.将洗至中性后的微球用甲醇洗涤并抽干后，置于50~80℃烘箱中烘干，得到修饰了硫酸纤维素的聚合物微球，即为用于纯化囊膜病毒的亲和层析介质。
其中，所述过滤器为砂芯漏斗。
采取以上方案，具有以下优点：
由于本发明的用于纯化病毒的亲和层析介质的制备方法采用大孔聚合物微球为基质，通过微球的化学改性接枝纤维素，再通过纤维素硫酸化获得亲和层析介质。这种亲和层析介质对病毒的特异性强，提高了病毒样品的纯化效果。相比现有层析介质有更高的耐压性能，可承受较高的流速与压力，从而大大提高了上样量和生产效率。而且，大孔聚合物微球的孔径大于400 nm，远高于病毒的直径，使得介质孔道内表面与目标病毒之间可充分相互作用，从而大大提高了层析介质的动态载量。
具体实施方式
以下对本发明做进一步详细说明。
实施例1
本发明的用于纯化病毒的亲和层析介质的制备方法包括如下步骤：
第一步，制备纤维素溶液
a.取9质量份的氢氧化钠、4质量份的硫脲和100质量份的去离子水混合得到混合溶液，并将混合溶液存储在-6℃的环境中备用。
b.在-6℃的冰浴环境中，取0.5质量份的纤维素、加入到100质量份的混合溶液中混合，并搅拌30 min，得到纤维素溶液。
c.采用砂芯漏斗对纤维素溶液进行过滤，得到澄清透明的纤维素溶液。
第二步，接枝纤维素
a.在50℃的油浴环境中，取1质量份的大孔聚合物微球、0.5质量份的碘化钾和100质量份的纤维素溶液混合，并在接入氮气的情况下搅拌4小时，得到第一混合物。
b.采用砂芯漏斗将第一混合物中的微球过滤出来，并依次使用-6℃的混合溶液、去离子水和甲醇对微球进行洗涤。
c.将洗涤后的微球置于50℃烘箱中烘干，得到接枝了纤维素的聚合物微球。
第三步，纤维素的硫酸化
a.将0.5质量份的氯磺酸逐滴加入7质量份的N，N-二甲基甲酰胺中，滴加时不断搅拌得到混合液备用。
b.将1质量份的接枝了纤维素的聚合物微球与10质量份的N，N-二甲基甲酰胺混合，得到第二混合物。
c.并在不断搅拌的情况下，将2质量份的混合液逐滴加入10质量份的第二混合物中，并在60℃的环境中反应1小时，得到反应液。
d. 将反应液倒入含4%醋酸钠（w/v）的乙醇溶液中静置8小时后，采用砂芯漏斗将溶液中的微球过滤出来，并以去离子水洗涤微球至中性。
e.将洗至中性后的微球用甲醇洗涤并抽干后，置于50℃烘箱中烘干，得到修饰了硫酸纤维素的聚合物微球，即为用于纯化囊膜病毒的亲和层析介质。
实施例2
本发明的用于纯化病毒的亲和层析介质的制备方法包括如下步骤：
第一步，制备纤维素溶液
a.取10质量份的氢氧化钠、5质量份的硫脲和100质量份的去离子水混合得到混合溶液，并将混合溶液存储在-4℃的环境中备用。
b. 在-4℃的冰浴环境中，取3质量份的纤维素、加入到100质量份的混合溶液中混合，并搅拌40 min，得到纤维素溶液。
c.采用砂芯漏斗对纤维素溶液进行过滤，得到澄清透明的纤维素溶液。
第二步，接枝纤维素
a.在70℃的油浴环境中，取20质量份的大孔聚合物微球、2质量份的碘化钾和100质量份的纤维素溶液混合，并在接入氮气的情况下搅拌5小时，得到第一混合物。
b.采用砂芯漏斗将第一混合物中的微球过滤出来，并依次使用-4℃的混合溶液、去离子水和甲醇对微球进行洗涤。
c.将洗涤后的微球置于80℃烘箱中烘干，得到接枝了纤维素的聚合物微球。
第三步，纤维素的硫酸化
a.将4质量份的氯磺酸逐滴加入8质量份的N，N-二甲基乙酰胺中，滴加时不断搅拌得到混合液备用。
b.将5质量份的接枝了纤维素的聚合物微球与50质量份的N，N-二甲基乙酰胺混合，得到第二混合物。
c.并在不断搅拌的情况下，将12质量份的混合液逐滴加入50质量份的第二混合物中，并在50℃的环境中反应12小时，得到反应液。
d.将反应液倒入含4%醋酸钠（w/v）的乙醇溶液中静置10小时后，采用砂芯漏斗将溶液中的微球过滤出来，并以去离子水洗涤微球至中性。
e.将洗至中性后的微球用甲醇洗涤并抽干后，置于80℃烘箱中烘干，得到修饰了硫酸纤维素的聚合物微球，即为用于纯化囊膜病毒的亲和层析介质。
实施例3
本发明的用于纯化病毒的亲和层析介质的制备方法的特点是包括如下步骤：
第一步，制备纤维素溶液
a.取9.5质量份的氢氧化钠、4.5质量份的硫脲和100质量份的去离子水混合得到混合溶液，并将混合溶液存储在-5℃的环境中备用。
b.在-5℃的冰浴环境中，取2质量份的纤维素、加入到100质量份的混合溶液中混合，并搅拌35 min，得到纤维素溶液。
c.采用砂芯漏斗对纤维素溶液进行过滤，得到澄清透明的纤维素溶液。
第二步，接枝纤维素
a.在60℃的油浴环境中，取5质量份的大孔聚合物微球、1质量份的碘化钾和100质量份的纤维素溶液混合，并在接入氮气的情况下搅拌4.5小时，得到第一混合物。
b.采用砂芯漏斗将第一混合物中的微球过滤出来，并依次使用-5℃的混合溶液、去离子水和甲醇对微球进行洗涤。
c.将洗涤后的微球置于75℃烘箱中烘干，得到接枝了纤维素的聚合物微球。
第三步，纤维素的硫酸化
a.将3.2质量份的氯磺酸逐滴加入7.5质量份的吡啶中，滴加时不断搅拌得到混合液备用。
b.将4质量份的接枝了纤维素的聚合物微球与38质量份的吡啶混合，得到第二混合物。
c.并在不断搅拌的情况下，使用恒压滴液漏斗将10质量份的混合液逐滴加入42质量份的第二混合物中，并在20℃的环境中反应3小时，得到反应液。
d.将反应液倒入含4%醋酸钠（w/v）的乙醇溶液中静置12小时后，采用砂芯漏斗将溶液中的微球过滤出来，并以去离子水洗涤微球至中性。
e.将洗至中性后的微球用甲醇洗涤并抽干后，置于75℃烘箱中烘干，得到修饰了硫酸纤维素的聚合物微球，即为用于纯化囊膜病毒的亲和层析介质。
采用本发明以具有超大孔的刚性聚合物微球为基质，通过微球的化学改性接枝纤维素，再通过纤维素的硫酸化，获得接枝了硫酸纤维素配基的亲和层析介质。该亲和层析介质具有极佳的机械稳定性，在层析分离应用中能耐受较大的流速和压力；同时，硫酸纤维素配基对病毒具有杰出的亲和能力，不需要复杂的样品前处理即可快速、高选择性地结合目标病毒，极大地降低了分离的时间、提高目标病毒的纯度；此外，聚合物微球的超大孔结构使层析介质上样量达到了传统病毒凝胶层析介质的数百倍，且大孔能容纳病毒颗粒进入，增加了能与病毒作用的有效位点数量，提高了该亲和层析介质的病毒载量。

Claims (2)

1.如权利要求1所述的用于纯化病毒的亲和层析介质的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
第一步，制备纤维素溶液
a.取氢氧化钠和硫脲与去离子水按照质量比（9~10氢氧化钠+4~5硫脲）∶100去离子水水混合得到混合溶液，并存储在-6~-4℃的环境中备用；
b.在-6~-4℃的冰浴环境中，将纤维素与冷却至-6~-4℃的混合溶液按照质量比0.5~3∶100混合，并搅拌30 min以上，得到纤维素溶液；
c.采用过滤器对纤维素溶液进行过滤，得到澄清透明的纤维素溶液；
第二步，接枝纤维素
a.在50~70℃的油浴环境中，将大孔聚合物微球、碘化钾和纤维素溶液按照质量比1~20∶0.5~2∶100混合，并在接入氮气的情况下搅拌4~5小时，得到第一混合物；
b.采用过滤器将第一混合物中的微球过滤出来，并依次使用-6~-4℃的混合溶液、去离子水和甲醇对微球进行洗涤；
c.将洗涤后的微球置于50~80℃烘箱中烘干，得到接枝了纤维素的聚合物微球；
第三步，纤维素的硫酸化
a.按照0.5~4∶7~8的质量比、将氯磺酸逐滴加入溶剂中混合，滴加时不断搅拌得到混合液备用，溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺或吡啶；
b.将接枝了纤维素的聚合物微球和溶剂按照1~5∶10~50的质量比混合，得到第二混合物；
c.并在不断搅拌的情况下，按照质量比2~12∶10~50将混合液逐滴加入到第二混合物中混合，并在60℃以下反应1~12小时，得到反应液；
d. 将反应液倒入含4%醋酸钠（w/v）的乙醇溶液中静置8小时以上后，采用过滤器将溶液中的微球过滤出来，并以去离子水洗涤微球至中性；
e.将洗至中性后的微球用甲醇洗涤并抽干后，置于50~80℃烘箱中烘干，得到修饰了硫酸纤维素的聚合物微球，即为用于纯化囊膜病毒的亲和层析介质。
2.如权利要求1所述的用于纯化病毒的亲和层析介质的制备方法，其特征在于所述过滤器为砂芯漏斗。
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