CN110373406A - 一种固定化谷氨酰胺转氨酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固定化谷氨酰胺转氨酶的制备方法，该方法利用葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、卡拉胶、明胶等天然高分子化合物固定化酶，将固定化好的包埋体浸入保护剂含有醇类、糖类、抗氧化剂等液态混合物中，使得固定化后酶制剂的稳定性大大提升。本发明不仅大大延长谷氨酰胺转氨酶在低温、常温和高温下的保存时间，且使谷氨酰胺转胺酶的稳定性大大提高。

Description

一种固定化谷氨酰胺转氨酶的制备方法
技术领域
本发明涉及生物酶制剂的固定化技术领域，具体涉及一种固定化谷氨酰胺转氨酶的制备方法。
背景技术
谷氨酰胺转胺酶，是一种催化酰基转移反应的转移酶，它能够促使蛋白质分子内交联，蛋白质分子间交联以及蛋白质和氨基酸之间的交联，可以在很大程度上改善蛋白质的功能性质，提高蛋白质的营养价值，在食品加工业中有着广泛的应用。谷氨酰胺转胺酶最早在豚鼠肝脏中首次发现，1989年首次从茂源链霉菌中分离得到，1997年实现规模化生产，2001年正式列为我国食品添加剂。谷氨酰胺转胺酶广泛存于自然界中，按来源可以将它分成三类：动物来源的谷氨酰胺转胺酶，植物来源的谷氨酰胺转胺酶和微生物来源的谷胺酰胺转胺酶。由于动植物来源的谷氨酰胺转胺酶来源少且成本昂贵，而微生物具有繁殖速度快、产酶量高等特点，目前生产的谷氨酰胺转胺酶主要通过微生物发酵获得。
但是，目前微生物产谷氨酰胺转氨酶在高温运输、保存、应用方面仍有许多问题需要解决，尤其是谷氨酰胺转氨酶液态酶制剂只能在低温或是室温下长期保存，但在夏天或是炎热地区运输，保存过程中很难提供稳定低温环境。因此开发一种可在较高温度下(30℃或37℃)长期稳定保存的谷氨酰胺转氨酶酶制剂是非常重要的。
发明内容
本发明克服现有技术存在的以上问题，本发明创新提出将酶制剂的保护剂配方和酶的固定化相结合，解决引起酶活在常温和较高温度下容易损失的问题，使制备得到的固定化谷氨酰胺转胺酶相对初始原酶，其稳定性得到巨大提高。并且，相对目前市场已有的酶制剂，其稳定也有大幅度的提高，在低温、常温和高温下保存时间大大延长。
本发明还提出了一种固定化谷氨酰胺转氨酶的制备方法，即，利用固定化和浸入保护剂复合方法制成，包括如下步骤：
1)将含有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、卡拉胶、明胶等天然高分子化合物中的一种或多种制备成载体悬浮液，加热融化灭菌。
2)将灭好菌的载体悬浮液冷却至室温，加入pH调节剂调节pH后，与游离态谷氨酰胺转氨酶混合均匀，于2-8℃的条件下静置。
3)然后加入戊二醛溶液，固定化交联，然后，用去离子水洗涤，得到固定化体系。
4)将步骤3)得到的固定化体系浸入保护剂中，制备得到所述固定化谷氨酰胺转氨酶。
步骤1)中，所述加热融化灭菌的温度为115-121℃；优选地，为115℃。所述加热融化灭菌的时长为20分钟。
步骤2)中，所述pH调节剂为硫酸、乳酸、氢氧化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、盐酸、Tris、柠檬酸、柠檬酸三钠、纯水中的任意一种或多种；优选地，为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸、柠檬酸三钠、纯水。
步骤2)中，所述pH值为5.0-7.0；优选地，为5.8-6.2。
步骤2)中，所述游离态谷氨酰胺转氨酶的初始浓度为500-1000U/mL，优选为600-800U/mL；所述静置的时间为10-60min，优选为20-40min。
步骤2)中，所述静止的时间为10-60min；优选地，为20-40min。
步骤3)中，所述戊二醛溶液的浓度为0.05-2.00％(m/V)。
步骤3)中，所述交联的时间为10-60min；优选地，为20-40min。
步骤3)中，所述洗涤的次数为2-5次。
本发明步骤3)加入戊二醛溶液之前还包括去离子水洗涤的步骤，其中，所述洗涤的次数为2-5次。
步骤4)中，所述保护剂为包含10％-60％的糖类、10％-60％醇类、0-1％抗氧化剂的液态混合物；优选地，所述保护剂为包含20-40％的糖类、20-40％醇类、0.05-0.20％抗氧化剂的液态混合物。
其中，所述糖类为：海藻糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖中的任意一种或多种；优选地，为蔗糖、葡萄糖。
其中，所述醇类为：山梨糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、聚乙二醇、甘露醇、丙二醇、丙三醇中的任意一种或多种；优选地，为山梨糖醇、麦芽糖醇、丙三醇。
其中，所述抗氧化剂是：大豆蛋白水解物、小麦蛋白水解、酪蛋白水解物、竹叶抗氧物、迭迭香提取物、甘草提取物、植酸及盐、茶多酚、茶多酚棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、焦亚硫酸钾、亚硫酸氢钠、乙二胺四乙酸、L-抗坏血酸、还原型谷胱甘肽、L-半胱氨酸及盐等中的任意一种或多种；优选地，为亚硫酸钠、还原型谷胱甘肽。
本发明还提出了由上述方法制备得到的固定化谷氨酰胺转氨酶。
其中，所述固定化谷氨酰胺转氨酶的理化特性如下：pH＝5.00-7.00，水分活度＝0.7-1.0，电导率＝0-3mS/cm，氧化还原电位＝0-500mV。
其中，所述固定化谷氨酰胺转氨酶于50℃的环境下保存3天后酶活剩余率不低于90％，或于40℃的环境中保存2周后酶活剩余率不低于90％，或于室温(25℃)的环境中保存6个月后酶活剩余率不低于92％，或于室温(25℃)的环境中保存8个月后酶活剩余率不低于90％，或采用无添加剂配方使得其于室温(25℃)的环境中保存3个月后酶活剩余率不低于90％。
本发明首次实现固定化谷氨酰胺转氨酶于50℃的环境下保存3天后酶活剩余率不低于90％，或于40℃的环境中保存2周后酶活剩余率不低于90％，或于室温(25℃)的环境中保存6个月后酶活剩余率不低于92％，或于室温(25℃)的环境中保存8个月后酶活剩余率不低于90％，或采用无添加剂配方使得其于室温(25℃)的环境中保存3个月后酶活剩余率不低于90％。本发明制备方法达到市场商业化生产要求，便于高温运输和保存，无需冷藏。本发明对谷氨酰胺转氨酶市场推广具有重要意义。
本发明提出的将酶的固定化和液态保护剂相结合的方法，解决了引起酶活在常温和较高温度下容易损失的问题，使固定化谷氨酰胺转胺酶相对初始原酶，其稳定性提高近百倍，同时相对目前市场已有液态酶制剂，其稳定也有大幅度提高。
本发明所述固定化谷氨酰胺转胺酶，涉及各种添加剂均为食品级，且价格低廉。相比冻干法制备的谷氨酰胺转氨酶固态酶制剂，本发明方法的生产成本将降低，生产工艺将简化，同时酶制剂的稳定性将提高。
附图说明
图1表示本发明方法制备得到的固定化谷氨酰胺转氨酶制剂在常温保存6个月后的酶活变化。
图2表示本发明方法制备得到的固定化谷氨酰胺转氨酶制剂的常温保存酶活剩余率变化曲线。
图3a和b分别表示本发明方法制备得到的固定化谷氨酰胺转氨酶制剂在模拟商业化运输条件的情形下的酶活变化。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。本发明的具体实施方式中，如无特殊说明，所使用的原料和仪器可以直接从相应供应商购买获得。以下实施例是为了更好理解本发明，本发明的权利不限于以下实施例叙述的内容，任何根据本行业的常规知识所做的修改和改进均不影响本发明的权利。
本发明的具体实施方式中，谷氨酰胺转胺酶活性的测定方法为氧肟酸比色法。具体步骤如下：吸取发酵一定时间点的谷氨酰胺转胺酶发酵液于离心管中，在4℃、7100rpm的条件下离心10min。取已离心的谷氨酰胺转胺酶发酵液上清于离心管中，用纯水稀释至一定倍数。将一定量的A试剂在37℃水浴下预热10min后，按表1所示的步骤加入对应的试剂至各管。将分光光度计的发光波长设置为525nm，以对照管为空白对照把分光光度计的吸光度值调零，将实验管中的样液倒入比色皿中测定其吸光度值。测定谷氨酰胺转氨酶活性所用的标准底物为Nα-CBZ-Gln-Gly，定义一个酶活单位为该底物在体系pH＝6.0、37℃的条件下反应1min生成1μmol L-谷氨酸-γ-单羟氧肟酸(即消耗1μmol标准底物)所需的酶量，即U＝μmol/min。标准曲线的绘制方法：称取32.4mg的标准品L-Glutamic acid-γ-monohydroxamate(Mw＝162.1)于15mL离心管中，加5mL 0.2mol/L纯水充分溶解，并用0.2mol/L纯水一步稀释成1.5倍、2倍、3倍、4倍、8倍于2.0mL离心管中。将装有对应标准品溶液的各标准管和一定量的A试剂在37℃水浴下分别预热1min和10min后，加入对应的试剂(200μL标准品溶液+2.0mLA试剂)至各管。在37℃水浴下保温10min后向各管加入2.0mL B试剂，15min内在525nm下测定各管的吸光度值(以空白管调零)。以各管OD为横坐标，对应的氧肟酸含量为纵坐标瞄点，拟合直线即为标准曲线，按酶活的定义换算得到酶活公式。
表1谷氨酰胺转胺酶活性的测定方法
进一步地，上述谷氨酰胺转胺酶活性的测定方法中，A试剂由以下重量配比的成分组成：三羟甲基氨基甲烷2422份、底物1012份、盐酸羟胺695份、还原型谷胱甘肽307份，用纯水定容至1L后用盐酸调节pH至6.0。B试剂由以下体积配比的成分组成：3mol/L盐酸1份、12％(m/V)三氯乙酸1份、5％(m/V)三氯化铁1份。
实施例1
1)称取一定量的谷氨酰胺转胺酶原酶，加入适量纯水溶解，制成酶活为600U/mL的酶液，测得pH＝6.26，水活度为0.97，除菌备用。
2)将葡聚糖凝胶等天然高分子化合物制备成悬浮液，加热融化灭菌。
3)将灭好菌的载体悬浮液冷却至室温后，与100U/mL游离谷氨酰转氨酶按一定比例混合均匀，于4℃冰箱静止30min。
4)用去离子水洗涤2次，加入1％戊二醛溶液中加强固定化交联1h，去除戊二醛，用去离子水洗涤2遍。
5)将固定化体系按以下表2添加对应的配方，制备成固定化谷氨酰胺转氨酶。
表2固定化谷氨酰胺转氨酶配方
取表2中已各组分除菌，混合均匀制成固定化谷氨酰胺转氨酶制剂，测定相关参数、酶活和生物量，装入50ml离心管，于30℃培养箱放置一段时间，观察外观、检测生物量、相关参数和酶活。结果显示，如图1所示，37℃下放置6个月后，酶活剩余率达到90％以上，微生物指标符合要求，即获得了一种稳定的固定化谷氨酰胺转氨酶酶制剂。
实施例2
1)称取一定量的谷氨酰胺转胺酶原酶，加入适量纯水溶解，制成酶活为600U/mL的酶液，测得pH＝6.26，水活度为0.97，除菌备用。
2)将琼脂糖凝胶等天然高分子化合物制备成悬浮液，加热融化灭菌。
3)将灭好菌的载体悬浮液冷却至室温后，与100U/mL游离谷氨酰转氨酶按一定比例混合均匀，于4℃冰箱静止30min。
4)用去离子水洗涤2次，加入1％戊二醛溶液中加强固定化交联1h，去除戊二醛，用去离子水洗涤2遍。
5)将固定化体系按表3添加对应的配方，制备成固定化谷氨酰胺转氨酶。
表3固定化谷氨酰胺转氨酶配方
取表3中已各组分除菌，混合均匀制成谷氨酰胺转氨酶制剂，测定相关参数、酶活和生物量，装入50ml离心管，于30℃培养箱放置一段时间，观察外观、检测生物量、相关参数和酶活。结果显示，如图2所示，37℃下放置6个月后，酶活剩余率达到90％以上，微生物指标符合要求，即获得了一种稳定的固定化谷氨酰胺转氨酶酶制剂。
实施例3
1)称取一定量的谷氨酰胺转胺酶原酶，加入适量纯水溶解，制成酶活为600U/mL的酶液，测得pH＝6.26，水活度为0.97，除菌备用。
2)将琼脂糖凝胶等天然高分子化合物制备成悬浮液，加热融化灭菌。
3)将灭好菌的载体悬浮液冷却至室温后，与100U/mL游离谷氨酰转氨酶按一定比例混合均匀，于4℃冰箱静止30min。
4)用去离子水洗涤2次，加入1％戊二醛溶液中加强固定化交联1h，去除戊二醛，用去离子水洗涤2遍。
5)将固定化体系按表4添加对应的配方，制备成固定化谷氨酰胺转氨酶。
表4固定化谷氨酰胺转氨酶配方
取表4中已各组分除菌，混合均匀制成谷氨酰胺转氨酶制剂，测定相关参数、酶活和生物量，装入50ml离心管，模拟市售产品的运输过程。将制备好的酶制剂置于37℃培养箱放置5天后测定酶活，然后分别放置于25℃和30℃培养箱继续保存至一个月，测定酶活；转移至50℃培养箱中保存一天，取出测定酶活；分别直接在25℃保存(图3a)和在4℃(图3b)放置一天后继续在25℃下保存，继续观察每个月的外观、检测生物量、相关参数和酶活。结果显示，如图3所示，一些配方的酶活剩余率达到85％以上，微生物指标符合要求，即获得了一种稳定的谷氨酰胺转氨酶酶制剂。
本发明方法能使得固定化后酶制剂的稳定性大大提升。
同时，本发明制备方法在谷氨酰胺转氨酶上的应用不仅大大延长谷氨酰胺转氨酶在常温和高温下保存时间，同时使得谷氨酰胺转胺酶的稳定性大大提高。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (10)

1.一种固定化谷氨酰胺转氨酶的制备方法，其特征在于，所述方法为，利用固定化和浸入保护剂复合方法制备得到所述固定化谷氨酰胺转氨酶，包括如下步骤：
1)将含有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、卡拉胶、明胶的天然高分子化合物中的一种或多种制备成载体悬浮液，加热融化灭菌；
2)将灭好菌的所述载体悬浮液冷却至室温，加入pH调节剂调节pH后，与游离态谷氨酰胺转氨酶混合均匀，于2-8℃的条件下静置；
3)然后加入戊二醛溶液，固定化交联，然后去离子水洗涤，得到固定化体系；
4)将所述步骤3)得到的固定化体系浸入保护剂中，制备得到所述固定化谷氨酰胺转氨酶。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述pH调节剂为硫酸、乳酸、氢氧化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、盐酸、Tris、柠檬酸、柠檬酸三钠、纯水中的任意一种或多种；所述pH值为5.0-7.0。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述游离态谷氨酰胺转氨酶的初始浓度为500-1000U/mL；所述静置的时间为10-60min。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述交联的时间为10-60min；所述洗涤的次数为2-5次；所述戊二醛溶液的浓度m/V为0.05-2.00％。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，所述保护剂为包含10％-60％糖类、10％-60％醇类、以及0-1％抗氧化剂的液态混合物；所制备得到的固定化谷氨酰胺转氨酶的终浓度为100-200U/mL。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述糖类为海藻糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖中的任意一种或多种；醇类为山梨糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、聚乙二醇、甘露醇、丙二醇、丙三醇中的任意一种或多种。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述抗氧化剂为大豆蛋白水解物、小麦蛋白水解、酪蛋白水解物、竹叶抗氧物、迭迭香提取物、甘草提取物、植酸及盐、茶多酚、茶多酚棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、焦亚硫酸钾、亚硫酸氢钠、乙二胺四乙酸、L-抗坏血酸、还原型谷胱甘肽、L-半胱氨酸及盐中的任意一种或多种。
8.如权利要求1-7之任一项所述方法制备得到的固定化谷氨酰胺转氨酶。
9.如权利要求8所述的固定化谷氨酰胺转氨酶，其特征在于，所述固定化谷氨酰胺转氨酶的理化特性如下：pH＝5.00-7.00，水分活度＝0.7-1.0，电导率＝0-3mS/cm，氧化还原电位＝0-500mV。
10.如权利要求8所述的固定化谷氨酰胺转氨酶，其特征在于，所述固定化谷氨酰胺转氨酶于50℃的环境下保存3天后酶活剩余率不低于90％，或于40℃的环境中保存2周后酶活剩余率不低于90％，或于室温25℃的环境中保存6个月后酶活剩余率不低于92％，或于室温25℃的环境中保存8个月后酶活剩余率不低于90％。
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