CN113528481A - 用温度响应型无规共聚醚eo20po80沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶的方法 - Google Patents

用温度响应型无规共聚醚eo20po80沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用温度响应型环氧乙烷环氧丙烷无规共聚醚EO20PO80沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶的方法，该方法包括以下步骤：步骤(1)：将EO20PO80与谷氨酰胺转氨酶发酵液混合；步骤(2)：向混合液中加入0‑100mM的盐离子溶液，混合均匀，调节混合液pH至6.0‑9.0，静置沉淀；步骤(3)：通过离心得到谷氨酰胺转氨酶沉淀，洗涤去除残留的共聚物和杂质，干燥得到谷氨酰胺转氨酶；步骤(4)：重新溶解干燥后的谷氨酰胺转氨酶，测定产品的蛋白含量和酶活力单位，并用SDS‑PAGE检测产品的纯度；步骤(5)：回收共聚物EO20PO80。本发明提供的方法，操作简单，成本低廉，谷氨酰胺转氨酶得率高。

Description

用温度响应型无规共聚醚EO20PO80沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶 的方法
技术领域
本发明涉及分离纯化技术领域，特别涉及溶剂沉淀法分离纯化蛋白质技术领域，具体是一种用温度响应型环氧乙烷环氧丙烷共聚物EO20PO80沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶。
背景技术
谷氨酰胺转移酶(transglutaminase,TGase)在食品行业经常被用来修饰蛋白质的功能特性，其最显著的特性就是其交联性能，被广泛用于改善蛋白质的溶解度、乳化性能以及凝胶性能。另外，TGase的应用不仅仅局限于食品加工行业，在其他领域诸如生物医药、材料科学、生物医学工程、皮革加工和纺织等领域也发挥着重要的作用。
链霉菌通常被工业上用作生产TGase的主要菌株，鉴于其产量不高，通过底物优化、代谢优化以及环境控制策略(pH、溶解氧和温度)提高TGase的产量，但是仍然不足以满足生产需求。于是许多研究致力于提高TGase的产量，将基因重组技术运用于生产菌株的构建改良。另一种提高TGase产量的关键在于TGase的分离纯化。一般来说，上述菌体的发酵液首先会经过离心去除菌体，然后通过超滤对蛋白质进行浓缩得到粗品，最后再通过层析(离子交换层析、凝胶色谱层析等)对TGase进行纯化，但传统用于TGase分离纯化的方法经过纯化之后得率并不高，并且这些方法所涉及到的各种色谱法纯化过程复杂，成本比较昂贵，不利于规模放大。
环氧乙烷-环氧丙烷(ethylene oxide-propylene oxide,EOPO)共聚物是一类通过开环反应得到的热响应型聚合物，聚合方式包括无规聚合和嵌段聚合。具有高度亲水性的EO和高度疏水性的PO的比例不同，所合成的EOPO在性质方面(特别是最低临界溶液温度，LCST)会有很大的差别，通过改变EO/PO的配比，共聚物的疏水性和亲水性可以得到调节，使其广泛用作洗涤剂、破乳剂、消泡剂、分散剂和保湿剂等。EOPO被加热到其LCST以上时，可发生相分离，因此，基于EOPO的热分离两水相体系已广泛应用于多肽、药物分子等的分配研究。但是在以往研究中，EOPO几乎都是与无机盐(如K3PO4、Na2SO4、(NH4)2SO4等)或可再生聚合物(如葡聚糖和淀粉衍生物)一起构建两水相体系来分离生物大分子物质。
发明内容
本发明为了解决传统的超滤和层析(离子交换层析、凝胶色谱层析等)等纯化谷氨酰胺转氨酶方法存在的问题，提供一种操作简单，成本低廉，谷氨酰胺转氨酶得率高，作为沉淀剂的聚合物无毒且可回收利用，可大规模应用于谷氨酰胺转氨酶纯化的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种用温度响应型环氧乙烷环氧丙烷共聚物EO20PO80沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶的方法，其主要特点是：
所述的方法包括以下步骤：
(1)：将EO20PO80与谷氨酰胺转氨酶发酵液混合；
(2)：向混合液中加入盐离子溶液，混合均匀，调节混合液pH至6.0-9.0，静置沉淀；
(3)：通过离心得到谷氨酰胺转氨酶沉淀，经洗涤去除残留的共聚物和一些杂质，干燥得到谷氨酰胺转氨酶；
(4)：重新溶解干燥后的谷氨酰胺转氨酶，测定产品的蛋白含量和酶活力单位，并用电泳法定性检测产品的纯度；
(5)：回收共聚物EO20PO80。
较佳地，所述的步骤(1)中EO20PO80溶液的比例为5-50％。
较佳地，所述的步骤(2)中所述的盐离子溶液为氯化钠、氯化镁或氯化钙溶液，其浓度为0-50mM。
较佳地，所述的步骤(2)中所述的调节混合液pH值使用氢氧化钠和盐酸溶液。
较佳地，所述的步骤(3)中以4000rpm离心10min，对上清液取样检测酶活力单位。
较佳地，所述的步骤(3)中用沉淀湿重2-3倍体积的20％-50％的乙醇对沉淀进行洗涤，次数为0-2次，用冷冻干燥机对沉淀进行干燥，得到谷氨酰胺转氨酶产品。
较佳地，所述的步骤(4)中测定干燥后的产品中蛋白含量的方法为考马斯亮蓝法，测定产品酶活力单位的方法为氧肟酸比色法，采用SDS-PAGE法定性鉴定谷氨酰胺转氨酶产品的纯度。
较佳地，所述的步骤(5)中使用步骤(3)中离心得到的上清液，于40-80℃的恒温水浴锅内静置成相，弃掉成相后的上相(发酵液)，向下相(共聚物EO20PO80)中加入0-3倍体积的去离子水对共聚物EO20PO80进行洗涤，重复上述步骤即可回收温度响应型环氧乙烷环氧丙烷共聚物EO20PO80。
本发明提供的用温度响应型环氧乙烷环氧丙烷共聚物EO20PO80沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶的方法的有益效果在于：采用温度响应型环氧乙烷环氧丙烷共聚物EO20PO80沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶，首先对比传统的超滤和层析(离子交换层析、凝胶色谱层析等)等纯化谷氨酰胺转氨酶方法，操作简便，通过简单的一步沉淀基本可将发酵液中的谷氨酰胺转氨酶全部沉淀。其次使用其他温度响应型聚合物分离酶会造成部分酶失活，酶活力回收率通常不高；且普通的温度响应型聚合物选择性低，造成沉淀的纯度低，通过对比发现EO20PO80毒性低，提供温和的环境，大大减少了酶活力的损失。另外EOPO聚合物用来分离纯化发酵液时，通常是通过构建两水相体系实现的，从来没有用作沉淀剂使用，EO20PO80作为温度响应型共聚物，可以通过简单的调节温度对其进行回收，重复利用，降低了生产成本。通过本发明提供的用温度响应型环氧乙烷环氧丙烷共聚物EO20PO80沉淀法分离的谷氨酰胺转氨酶，酶活力回收率最高可达120％，对比发酵液中TGase的比活提高了40倍；此外，EO20PO80可通过简单的调节温度得到回收，回收率达到98％以上。
附图说明
图1为本发明实施例3、4的SDS-PAGE电泳结果，其中，Lane 1为实施例3得到的谷氨酰胺转氨酶(1mg/mL)；Lane 2为实施例4得到的谷氨酰胺转氨酶(1mg/mL)；Lane3为商品谷氨酰胺转氨酶1(4mg/mL)；Lane 4为商品谷氨酰胺转氨酶2(2.5mg/mL)；Lane5为发酵液。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方法作进一步说明。这些实施例仅是对本发明的典型描述，但本发明不限于此。下述实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的原料和试剂等如无特殊说明，均为可从常规商业途径得到的原料和试剂。
实施例1
将1mL温度响应型环氧乙烷环氧丙烷共聚物EO20PO80与3mL 5mg/mL谷氨酰胺转氨酶粗酶液混合(EO20PO80的终浓度为25％)，加入1mM Mg2+溶液，混合均匀，调节混合液的pH至8.9，在室温下静置沉淀0.5h。接下来以4000rpm的转速将混合液离心10min，收集上清液。用1.2mL(沉淀湿重的3倍体积)的乙醇溶液(50％，v/v)对沉淀进行洗涤，以4000rpm的转速离心10min，弃掉上清液。将离心得到的沉淀用冷冻干燥机干燥，称量得到的谷氨酰胺转氨酶产品的质量。取研磨成粉末状的谷氨酰胺转氨酶产品配置成1mg/mL的酶溶液，用考马斯亮蓝法在595nm下测定产品中的蛋白含量，用氧肟酸比色法在525nm下测定产品的酶活力单位，并用SDS-PAGE电泳法鉴定产品的纯度。经检验，纯化后的谷氨酰胺转氨酶酶活力为35.6U/mL，酶活力回收率为93.7％，比活为12.41U/mg，对比商品酶的比活(2.15U/mg)提高了5.77倍。将上清液置于60℃的恒温水浴锅中，待其形成两相后弃掉上相，加入下相2倍体积的去离子水，混合均匀后置于60℃的恒温水浴锅中，重新成相后的下相即是回收的共聚物EO20PO80。
实施例2
将0.75mL温度响应型环氧乙烷环氧丙烷共聚物EO20PO80与2.25mL发酵液混合(EO20PO80的终浓度为25％)，加入1mM Mg2+溶液，混合均匀，调节混合液的pH至8.9，在室温下静置沉淀0.5h。接下来以4000rpm的转速将混合液离心10min，收集上清液。用1.2mL(沉淀湿重的3倍体积)的乙醇溶液(50％，v/v)对沉淀进行洗涤，以4000rpm的转速离心10min，弃掉上清液。将离心得到的沉淀用冷冻干燥机干燥，称量得到的谷氨酰胺转氨酶产品的质量。取研磨成粉末状的谷氨酰胺转氨酶产品配置成1mg/mL的酶溶液，用考马斯亮蓝法在595nm下测定产品中的蛋白含量，用氧肟酸比色法在525nm下测定产品的酶活力单位，并用SDS-PAGE电泳法鉴定产品的纯度。经检验，得到谷氨酰胺转氨酶产品30.5mg，酶活力为51.20U/mL，酶活力回收率为109.8％，比活为18.78U/mg，对比商品酶的比活(2.15U/mg)提高了8.73倍。将上清液置于60℃的恒温水浴锅中，待其形成两相后弃掉上相，加入下相2倍体积的去离子水，混合均匀后置于60℃的恒温水浴锅中，重新成相后的下相即是回收的共聚物EO20PO80。
实施例3
将0.75mL温度响应型环氧乙烷环氧丙烷共聚物EO20PO80与2.25mL发酵液混合(EO20PO80的终浓度为25％)，加入1mM Mg2+溶液，混合均匀，调节混合液的pH至8.9，在室温下静置沉淀0.5h。接下来以4000rpm的转速将混合液离心10min，收集上清液。用沉淀湿重的3倍体积的乙醇溶液(20％，v/v)对沉淀进行洗涤，以4000rpm的转速离心10min，弃掉上清液，重复洗涤2次。将离心得到的沉淀用冷冻干燥机干燥，称量得到的谷氨酰胺转氨酶产品的质量。取研磨成粉末状的谷氨酰胺转氨酶产品配置成1mg/mL的酶溶液，用考马斯亮蓝法在595nm下测定产品中的蛋白含量，用氧肟酸比色法在525nm下测定产品的酶活力单位，并用SDS-PAGE电泳法鉴定产品的纯度。经检验，得到谷氨酰胺转氨酶产品27.4mg，酶活力为48.14U/mL，酶活力回收率为103.3％，比活为24.07U/mg，对比商品酶的比活(2.15U/mg)提高了12.74倍。将上清液置于60℃的恒温水浴锅中，待其形成两相后弃掉上相，加入下相2倍体积的去离子水，混合均匀后置于60℃的恒温水浴锅中，重新成相后的下相即是回收的共聚物EO20PO80。
实施例4
将6.7mL温度响应型环氧乙烷环氧丙烷共聚物EO20PO80与20mL发酵液混合(EO20PO80的终浓度为25％)，加入1mM Mg2+溶液，混合均匀，调节混合液的pH至8.9，在室温下静置沉淀0.5h。接下来以4000rpm的转速将混合液离心10min，收集上清液。用1.2mL(沉淀湿重的3倍体积)的乙醇溶液(20％，v/v)对沉淀进行洗涤，以4000rpm的转速离心10min，弃掉上清液，重复洗涤2次。将离心得到的沉淀用冷冻干燥机干燥，称量得到的谷氨酰胺转氨酶产品的质量。取研磨成粉末状的谷氨酰胺转氨酶产品配置成1mg/mL的酶溶液，用考马斯亮蓝法在595nm下测定产品中的蛋白含量，用氧肟酸比色法在525nm下测定产品的酶活力单位，并用SDS-PAGE电泳法鉴定产品的纯度。经检验，得到谷氨酰胺转氨酶产品221mg，酶活力为45.72U/mL，酶活力回收率为100.7％，比活为21.11U/mg，对比商品酶的比活(2.15U/mg)提高了9.82倍。将上清液置于60℃的恒温水浴锅中，待其形成两相后弃掉上相，加入下相2倍体积的去离子水，混合均匀后置于60℃的恒温水浴锅中，重新成相后的下相即是回收的共聚物EO20PO80。如图1所示为实施例3和实施例4的SDS-PAGE电泳图，从图中可以看出经过纯化后得到的产品与发酵液相比只有一条带，没有杂条带。
综上，本发明提供的用温度响应型环氧乙烷环氧丙烷共聚物EO20PO80沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶的方法，采用温度响应型共聚物EO20PO80沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶，首先对比传统的超滤和层析(离子交换层析、凝胶色谱层析等)等纯化谷氨酰胺转氨酶方法，简化了操作，大大提高了TGase的得率；其次EO20PO80作为温度响应型共聚物，可以通过调节温度对其进行回收，重复利用，降低了生产成本。通过本发明提供的用温度响应型环氧乙烷环氧丙烷共聚物EO20PO80沉淀法分离的谷氨酰胺转氨酶，酶活力回收率可达100％以上，在最优条件下对比商品酶中TGase的比活提高了12倍；此外，EO20PO80可通过简单的调节温度得到回收，回收率达到98％以上。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然，仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (6)

1.一种用温度响应型无规共聚醚EO20PO80沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)：将EO20PO80与谷氨酰胺转氨酶发酵液混合；
(2)：向混合液中加入盐离子溶液，混合均匀，调节混合液pH至6.0-9.0，静置沉淀；
(3)：通过离心得到谷氨酰胺转氨酶沉淀，经洗涤去除残留的共聚物和杂质，干燥得到谷氨酰胺转氨酶。
2.根据权利要求1所述的用温度响应型无规共聚醚EO20PO80沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中EO20PO80溶液的比例为5～50％。
3.根据权利要求1所述的用温度响应型无规共聚醚EO20PO80沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中所述的盐离子溶液为氯化钠、氯化镁或氯化钙溶液，其浓度为0～50mM。
4.根据权利要求1所述的用温度响应型无规共聚醚EO20PO80沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中所述的调节混合液pH值使用氢氧化钠和盐酸溶液。
5.根据权利要求1所述的用温度响应型无规共聚醚EO20PO80沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中以4000rpm离心10min。
6.根据权利要求1所述的用温度响应型无规共聚醚EO20PO80沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中用沉淀湿重2-3倍体积的20％-50％的乙醇对沉淀进行洗涤，次数为0～2次，用冷冻干燥机对沉淀进行干燥，得到谷氨酰胺转氨酶。
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