JPS62221687A - ヘミンを単離しかつ精製する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分骨 本発明は水性溶液又は懸濁液から触媒作用による結晶化
によってヘミンを単離しかつ精製する方法に関する。水
溶液からヘミンを結晶させることは一般には不可能であ
る。

従来の技術 従来公知の方法によれば、血液又はヘモグロビンからヘ
ミンを単離することは、有機溶剤を極めて多量に用いる
場合にのみ達成される。工業生産に関し前記溶剤は非常
に大きな経費要因となり、更に環境問題を伴う。

既に１８５３年にＴｅｉｃｈｍａｎｎが彼により命名さ
れたヘミンの結晶ｔ１塩基の存在下で血液に氷酢酸を作
用させることによって得た。この顕微鏡的血液検出法は
後に５ｃｈａｌｆｅｊ　ｅｗによって工業的方法゛に確
立され、かつなお今日ヘミンの通常の製法として記述さ
れている（　Ｕｌｍａｎｎ　５Ｅｎｃｙｋｌｏｐ”ａｄ
ｉｅ　ｄ。

ｔｅｃｈ、Ｃｈｅｍｉｅ　、　　ＩＶ、Ａｕｆｌ、　　
、　１９７６　、　Ｂｄ、　　１１　　Ｓ　Ｓ。

１２９］。この場合、ヘミンＩＪｃ９を製造するために
氷酢酸約８００７が必要であり、かつ再結晶するために
付加的にピリジン５１．クロロホルム１１１及１び更に
氷酢酸７０１が必要である。純ヘミン収率は理論量の約
７０％に過ぎない。約２０％が専ら再結晶時に失われる
。

他の公知の方法は、酸性化ヘモグロビンのヘミ７−　り
ｏ　ヒフ分ｇｌｔのために、メタノール（ヨーロッパ特
許出願公告第６８５３７号明細Ｍ）、エタノール、場合
によりグリフール又はグリセリンと混合して（ドイツ連
邦共和国特許出願公開第２５２６５９６号明細書］、ジ
メチルホルムアミド、メチルエチルケトン又はアセトン
（ＺｔＳｃｈｒ、　ｆ、　ｐｈｙｓｉｏｌ。

（１！ｈｅｍ、　Ｅｄ、　８０　、　１９１２、Ｓ、　
３５　）が用いられる。

上記有機溶剤における必要量はヘミン１にｇ当り２００
〜５００１になり、その上極めて不純なヘミンしか得ら
れない。

米国特許第４３３０４６３号明細書によれば、ヘモグロ
ビンに塩酸を加え、噴霧乾燥し、かつこのようにして得
られた酸性乾燥血液乞数度エタノールーメタノール混合
液で抽出し、この際ヘミ／が溶出する。このためヘミン
１にｇ当り１０００１を超える溶剤が必要とされる。

発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、有機溶剤を用いることな〈実施するこ
とができ、かつその際できるだけ純粋なヘミンンできる
だけ高い収率で得られるような、ヘミンな単離しかつ精
製する方法を提供することにある。

問題点を解決するための手段 前記課題は、本発明による方法によって解決され、該方
法は塩素イオンを含有するｐＨ０，５〜２．５゛の水性
溶液又は懸濁液から結晶化触媒として陽イオン、非イオ
ン又は両性界面活性剤又はその混合物の存在下でヘミン
を晶出させることを特徴とする。

大抵ヘミンはヘモグロビンから、かつヘモグロビンは血
液から得られる。酸性溶液中で生じるヘミンとグロビン
へのヘモグロビン分離平衡は、触媒を添加することによ
ってヘミンの方向に移動する、それというのもその際ヘ
ミ／が晶出するかもである（それにより逆反応が排除さ
れる］。従って、実質的にヘモグロビンとグロビンとの
混合物からヘミンを結晶化しかつ単離することが問題で
ある。

希釈した塩酸性ヘモグロビン溶液を沸騰させると、直ち
に濃稠な沈殿物が析出し、該沈殿物は変性した、即ち不
溶になったグロビン及びヘモグロビンの混合物から成る
。ところで、この処理に際して触媒として適当な界面活
性剤の添加によりヘモグロビン析出が行われるのではな
く、意外にもタイツヒマン（Ｔｅｉｃｈｍａｎｎ、）の
ヘミン結晶カ実質的に定量的収率で生ずることが判明し
た。ヘミン結晶は放置すると沈殿する。無色の上澄みは
純粋な塩酸性グロビン溶液から成っている。加水分解前
にヘモグロビン溶液乞乾質含量２〜８特に約５％に希釈
するのが有利であるが、しかし強制的ではない。加水分
解及びヘミン結晶化は濃縮溶液中でも、例えば乾質含量
１５％でも進行するが、ただ反応速度がより大きい、即
ちヘミンは短時間で析出するので、結晶は小すく、かつ
沈殿しないか又は極めてゆっくり沈殿する。他方では著
しく希釈された溶液を用いて操作することはあまり経済
的でない。

触媒としては、上述の界面活性剤（つまり親木及び疎水
基を有する界面活性化合物Ｊが適しているが、一方陰イ
オン界面活性剤は他の形式で反応する。沢山の市販の種
類のうち原則として丁べてを用いることができるが、非
イオン性の場合には比較的高い分子量を存するものが有
利である。界面活性剤とグロビンの分離（グロビンは最
も簡単に（工、中和によって母液からヘミン結晶を分離
した後に沈殿させる）ｙａ’容易にするためには、中性
ｐＨ範囲内でも溶液中に存在する界面活性剤を用いるの
が好ましい。

例えば適当な陽イオン界面活性剤として次のものか挙げ
られる二分子内に１又は２個の長鎖状アルキル基を有す
る第四アンモニウム塩。符に重要な代表的９Ｊ質は例え
ばジメチル−０８〜０１Ｂ−７Ａ／キルベンジルアンモ
ニウムクロリド、例エバベンジルドデシルジメチルアン
モニウムクロリド、次いでステアリルトリメチルアンモ
ニウムクロリド、ベンジルトリメチルア／モーウムクロ
リド、ベンジルミリスチルジメチルアンモニウムクロリ
ド。

セチルピリジニウムクロリド及びジヒドロオキシエチル
メチルオイルアンモニウムクロリド。更ニ次のものが挙
げられるニオキシ基又はオキシポリエーテル基を■する
脂肪族アミン例えばオクタデシルジェタノールアミン又
はラウリルシボリグリコールアミン。更に脂肪族アミン
の塩に対するエチレンイミンの添加体；２−脂肪アルキ
ルイミダゾリン及び２−脂肪アルキルベンズイミダゾー
ル：トリエタノールアミンー脂肪酸モノエステル。

適当な非イオン界面活性剤としては、例えば次のものが
挙げられる＝９個以上の炭素原子を持つ天然又は合成脂
肪族アルコールのオキシエチル化生成物。特にこの場合
９〜５０個のオキシエチル基又はオキシプロピル基で置
換されたオキソアルコール・とりわけＣ９−〜Ｃ１１−
ｓＯ璽２−〜Ｃｌ１１及びＣ１０−〜Ｏ，。”−７ラク
シヨ／が非イオン界面活性剤として好ましい。同様にア
ルキルフェノール特に、８〜５０個のオキシエチル基及
び／又はオキシプロピル基で置換された誘導体の形のオ
クチル−、ノニル−又はドデシルフェノールが適当であ
る。８〜５０個のオキシエチル基で置換された形のアル
コールアミンと脂肪酸の縮合物も同様に界面活性剤とし
て適している。適当な非イオン界面活性剤は、５００〜
２５０００分子量′ｆ！：有する、酸化エチレンと？［
１，プロピレンの公知の重合体、並びに５００〜８５０
００分子量を有する、酸化エチル及び酸化プロビレ／か
も成るブロック共重合体である。

両性イオン界面活性剤としては、長鎖状の疎水基を有す
る限り、種々のベタイン、例えばミリスチルベタイン又
はスルホタウリン群カ適している。

種々の界面活性剤及び界面活性剤型は混合して使用する
こともできる。使用可能な界面活性剤濃度は広い範囲内
で、使用される溶剤又は懸濁液に対して０．００５〜２
０、有利には０．０１〜５重量％、主として０．０２５
％にある。塩素イオン濃度は少なくとも、ヘミンを形成
するのに充分でなければならない；該濃度は比較的（著
しく）高いのが有利である。上限に関しては制限は全く
ない。

反応混合物ヶヘミンの結晶化に必要とするよりも長く加
熱すると、界面活性剤の存在下でも変性したグロビンの
析出が生ずる。この過程は望しくない。何故ならば、そ
の際にはグロビンと不溶ヘミンの混合物が形成されるか
らである。従って、装入物の加熱及び冷却に比較的長い
時間がかかる比較的多いバッチに関しては、短時間加熱
するため連続したバッチ案内が有利である。このために
は、触媒として界面活性剤を加えた反応混合物を熱交換
器を通して圧送し、その際該反応混合’＊？：迅速に加
熱し、場合によっては適合した容積の容器乞貫流させる
ことにより、なおしばらく達成された反応温度に保ち、
次いで迅速な冷却のため第２の熱交換器内に供給する。

加熱剤としてすべての媒体例えば熱い水、グリセリン、
油及びそれに類似するものを使用することができるが、
しかし標準圧において凝縮液として排出される蒸気が有
利であり、これによって水性反応混合物の沸騰が回避さ
れ、しかもその沸点以下にある温度が達成される。勿論
比較的大きな設備において、相応する温度調整装置が設
けられている場合には、蒸気を加圧して用いることもで
きる。９０〜９９℃において最も好ましい結果が得られ
、これに対して明らかにそれよりも低い温度ではグロビ
ン変性が競合する。反応速度に適したポンプ吸い上げ速
度により、実施例２及び３に記述のように、最適の経過
を簡単に制御することができる。

添加されたヘミン接種結晶を用いて、単に時間的に正確
な反応経過を保証するばかりではなく、界面活性剤触媒
のかなりの（９９％までの）ｍ約が可能である。接種結
晶懸濁液は原則として界面活性剤触媒なしにもヘミン結
晶化Ｚ惹起することかできる。このため結晶速度は、競
合するグロビン変性前にもう終了している程上昇されて
いなければならず、即ち相応して大ぎな接種結晶表面が
必要であると見なされる。例えば多量の接種結晶ヘミン
ン用いることができ、つまりヘミンにおけるよりも約１
０〜１００倍であるか、特に平均直径１μｍ未満の細砕
された接種結晶を用いることができ、この場合生ずるヘ
ミンも相応して細かくなり、従って遠心分離が困難にな
る。この問題性に基づき、ヘミン又はグロビン乞不純化
することのある異物が全く入らないという利点を有して
いるが、この方法（この方法は特許請求に包括されない
］は実際上殆ど重要ではない。本発明により用いられる
べき界面活性剤触媒は成程そのような異物ではあるが、
自発的に即ち遠心分離を必要とせずに沈殿する程大きな
ヘミン結晶を生じない、かつ界面活性剤はグロビン塩化
水素酸塩溶液の中和に際してグロビンとは異なり溶解し
たままであるので、界面活性剤は良好に再び除去可能で
ある。ヘミン結晶から界面活性剤残留物は水での洗浄？
することにより分離することができる。

更に、界面活性剤触媒の使用は、粗製アミンを最少物質
損失で再結晶化するのに適している。粗製ヘミンとして
は単に実施例２〜４において得られる反応生成物だけで
なく、例えば酵素によるヘモグロビン分解の際に生ずる
（実施例８参照］他のすべてのヘミン含有残留物又は単
に不純なヘミンも理解されるべきである。この場合、界
面活性剤濃度は比較的高くて、例えば溶液に対して０．
１〜２０重量％の範囲内、主として５％に選択するのが
有利である。無定形で沈殿する又は溶解するヘミンは直
接結晶化され得るが、これに対して結晶ヘミンはまず第
一にアンモニア水に溶かす必要がある。アンモニアの代
りに任意の他の塩基を用いることもできるが、ただ溶液
がしばしば不安定になる。粗製ヘミンを有機溶剤例えば
ジメチルホルムアミド又はジメチルスルホキシド中に溶
かし、次いで混合液が溶剤よりも専ら水を含むまで多く
の界面活性剤含有水を加え、それからヘミンな結晶化さ
せることができる。

実施例５〜８に記載する精製結晶化は目的の大きさのタ
イツヒマン（Ｔｅｉｃｈｍａｎｎ　）結晶を生成する。

結晶の大きさは、結晶形成中に攪拌しない場合（実施例
７）に（工、多くの界面活性剤を用いることによって特
に大きくなり、わずかな非イオン界面活性剤を攪拌（実
施例６）及び迅速な塩酸添加のもとに加熱する場合には
特に小さくなる。接種結晶は、この場合必要ない。

界面活性剤触媒を含有するアンモニア性ヘミン溶液ビ塩
酸で迅速に酸性化すると、結晶欠陥、例えば湾曲した針
列又は塊を有するヘミン−沈殿物が生ずる。しかし、例
えばジメチルホルムアミド中の中性溶液から出発すると
、正常な結晶が形成される。また、まず第一に２〜５の
ｐＨ−値において加熱し、その後初めて塩酸ｔ１最初の
結晶が形成されるまでゆっくり加えると、アンモニア性
溶液からも正常な結晶形状が得られることが判明した。

迅速にＨＯｌ”ｇ添加すると、結晶は小さくかつ鋭角に
なり、これは円滑な単離の意味から大抵好ましくない。

各々の界面活性剤は、細いものから繊維状のものまで又
は幅広いものから柔らかいものまで、極めて交差したも
のから星形のものまで等であり得る結晶形状に特に影響
を与えることが明白である。

グロビンタンパク質を不純化された粗製アミンの場合に
は、再結晶化及びアミン分離を簡単にするため、場合に
より例えばペプシンを用いた酵素による加水分解を行な
うことができる。水を用いた微塵の懸濁及び引続く沈降
によってヘミンはしばしば９０％の純度で得られるので
、例えば実施例５に記載したように、なお５０〜７０％
の硫酸中で処理することができ、この場合純度は９８％
以上に上昇する。

実施例　１ 牛の血液をクエン酸三ナトリウムの添加後遠心分離し、
かつ残留血球濃縮物を水による希釈によって５％の転質
含量にした。次いで、ｐＨ値が１．５になるまで２０％
の塩酸を加えた。

前記出発溶液５００ｄＹベンジルドデシルジメチルアン
モニウムクロリド１０１と一緒に攪拌し、かつ磁気攪拌
機上で、１０分以内に加熱し沸騰させた。

約３分後に、赤茶色溶液は黒紫色ヘミン結晶を析出しつ
つ脱色した。水で冷却し、かつ沈殿させた。

上澄みの殆ど無色の、塩酸性グロビンの溶液を簡。

単にデカンテーションすることができた。結晶ヘミンの
沈殿物が吸引濾過、洗浄及び乾燥後に°９６．５％の純
度で収量０．７６　ｆ　＝理論量の１００％で得られた
。

実施例　２ 実施例１に記載の、ｐＨ１，５の出発溶液１０１をコカ
ミドプロピル−ベタイン（Ｏｖ〜Ｃ１，１−アルコイル
アミド−３−ジメチルアンモニオ−プロパン−３−カル
ボキシメチルベタイン）２４ｆと及　’び４％の接種結
晶懸濁液０．：１Ｍと一緒に攪拌した。

この接種結晶懸濁液は水性ヘミン結晶懸濁液を攪拌式ボ
ールミル（回転数約４００　ｒｐｍ　Ｊ内で６時間微粉
砕することによって得た（平均粒子直径１　ｐｍ　）。

前記バッチ溶液を連続した作業形式で下方力）ら、１長
ｇ　１．４０　ｍ及び直径２０ａｌ１１の直立した、ジ
ャケラトン備えた蒸気加熱されるガラス管を通して圧送
し、かつ次いで実験室冷却器によって最大５５°Ｃに冷
却した。搬送速度は流出する反応溶液がもはや茶色にな
らないように調節した。これは上述の条件下で分当り約
８０ｍ１であった。小型流過遠心分離機（約３０００　
Ｘ　ｆ　）によって分離し、かつこのようにしてやや黄
色のグロビン塩化水素酸塩溶液１０１及び幾分グロビン
ン含有する湿潤粗製ヘミン１７０１を得た。更なる精製
は実施例５に記載の通り行なった。

実施例　３ 実施例１に記載の出発溶液６００！をノニルフェノール
ポリグリコールエーテル（重合度３０　）　１５０２及
び実施例２の４％のヘミン−接種結晶懸濁液２０　ｆと
一緒に攪拌した。

前記バッチ溶液を連続した操作形式で下方から、長さ１
ｍの直立した蒸気加熱される管型熱交換器及び直径が各
１２簡の特殊鋼管４６本を貫流させ、かつ更に後反応器
として６１収容する管片及び冷却面積約０．１　ｍ”の
冷却器を経てドラム容量３１及び遠心分離器内約５００
０　Ｘ　ｆを有する連続して搬出する分離器内に導いた
。ポンプの吐出速度は時間当り約２５０１であり、溶液
が遠心分離器内に流入する際もはや褐色を有しないよう
に関節した。

遠心分離物は淡黄色のグロビン塩化水素酸塩溶液約６０
０７から成り、残渣は湿潤したグロビン含有粗製ヘミン
かも成っていた。その後処理は実施例５に基づいて行な
った。

実施例３のバッチを同じ界面活性剤の５倍量＝０．７５
ｋＩｉ、及びこれに対して接種結晶量の１／１０＝２ｆ
の懸濁液で繰り返した。反応速度は実施例３におけるの
と同じであった。塩酸グロビン溶液６００１及び湿潤粗
製ヘミン４．４　ｋｇを得た。

実施例　５ 実施例２〜４において得られた粗製ヘミンな水添加によ
って攪拌可能にし、３０〜４０℃の温度で懸濁液２１当
りペプシン１２と２時間攪拌した。次いで氷で＋５”Ｃ
まで冷却し、かつヘミンなアンモニアの添加によって全
く完全に溶かした。この際、予測されるヘミン収量に対
して、同じ重量部のノニルフェノールポリグリコールエ
ーテル（重合度３０）及び同じ責のクエン酸を加え、約
９５℃に１゜分間加熱した。次いで攪拌下で、用いたア
ンモニアと当量の塩酸を加え、かつ更にヘミン結晶化が
始まる（顕微鏡ンまで、９５′Ｃでゆっくり塩酸ビ加え
た。１〜２時間後に無定形の茶褐色の小塊が完全に消滅
し、これに対して相応する数の、陵長３　約０　、　Ｑ
２　ｎｍの非常に均一な大きさのタイツヒマンのヘミン
結晶を得た。

沈殿及びデカンテーション処理し、かつ硫酸において６
０％の濃度が達成されるまで、残留物に攪拌下で８５％
の硫酸を加えた。１０分後２倍容量の水で希釈し、沈殿
させ、かつ吸引濾過器上で水で酸不含になるまで洗浄し
た。収量は定量的であった。１００％ヘミンに関し３８
８　ｎｍ　（１％、１　ｃｍ　）＝９５６ＯＮａＯＨに
おいて比吸光として測定して、純度は９８％であった。

Ｆｅ計算値：　８．５７％　測定値二８．４％Ｃ１計算
値：　５．４４％　測定値：５．３％実施例　６ 実施例５の再結晶化を触媒量の１／１０で繰り返した。

きわめて小さなヘミン結晶を得た。

実施例　７ 実施例５に記載の再結晶化を、実施例１〜５の界面活性
剤の同じ部から成る触媒混合物の同じ総量で繰り返し、
結晶化中は攪拌しなかった。陵長さ約０．１朋のぎわめ
て大ぎなヘミン結晶を得た。

実施例１に記載の出発溶液４０１をペプシン１０　Ｆと
一緒に３７”Ｃで１６時間攪拌し、次いで遠心分離力約
５０００　Ｘ　ｆ及びドラム容量３１の流過遠心分離機
に供給した。

ヘミン含有する残留物は２に９であり、かつ１２％の乾
質含ｆ＆ＷＬ、ていた。これを水２１で希釈し、実施例
３の触媒６０　Ｆを加え、かつ９５°Ｃに加熱した。２
０％の塩酸ｔまず第一に１５０ｒｎｔ、次いで少しづつ
各１０−加えることによって、結晶化を生ぜしぬ、かつ
更に実施例５〜７に記載のように処理した。

収量：結晶ヘミン６０２ 純度＝９８％

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヘミンを単離しかつ精製する方法において、塩素
   イオンを含有するｐＨ０．５〜２．５の水性溶液又は懸
   濁液から結晶化触媒として陽イオン、非イオン又は両性
   界面活性剤又はその混合物の存在下でヘミンを晶出させ
   ることを特徴とする、ヘミンを単離しかつ精製する方法
   。
2. （２）ヘミン結晶化を連続して行う、特許請求の範囲第
   １項記載の方法。
3. （３）触媒結晶化を微晶質の接種結晶の添加によつて促
   進する、特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
4. （４）使用溶液又は懸濁液に対して０．００５〜２０重
   量％の範囲内の界面活性剤濃度を適用する、特許請求の
   範囲第１項から第３項までのいずれか１項に記載の方法
   。