CN110183497A - 一种从动物血球中提纯氯化血红素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从动物血球中提纯氯化血红素的方法，属于生物化学技术领域，所述方法包括以下步骤：1)将动物血球与水混合，搅拌溶血得到预溶血液；2)将所述预溶血液与尿素溶液混合，搅拌溶解20～60min后，用盐酸溶液调节料液的pH值为2～3，并与表面活性剂混合，进行深度溶解获得血红素溶液；3)将所述血红素溶液升温至88～92℃，保持20～50min，获得氯化血红素沉淀；4)将所述氯化血红素沉淀经乙酸水溶液浸泡、乙醇水溶液洗涤和水洗后获得提纯的氯化血红素；所述方法提取获得的氯化血红素产率高、纯度高、含铁量高。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，尤其涉及一种从动物血球中提纯氯化血红素的方法。
背景技术
氯化血红素是动物血液中的天然色素，具有重要的生理功能和实用价值，在化工、食品、医药及化妆品行业中都有应用。如在制药行业中，氯化血红素可以作为半合成胆红素的原料，胆红素再制备人工牛黄；氯化血红素还可以合成血卟啉衍生物，血卟啉衍生物已证实具有抗癌功效，1998年我国正式批准以氯化血红素为原料合成的血卟啉衍生物可作为抗肿瘤药物。另外，氯化血红素在临床上已作为补铁剂，治疗由缺铁导致的贫血症。虽然目前常使用的为非氯化血红素的补铁剂，如葡萄糖酸亚铁、硫酸亚铁、富马酸铁等，但这些物质在人体内吸收率很低，并存在一定的毒副作用；而氯化血红素作为补铁剂不仅副作用小，还可以被肠粘膜上的绒毛细胞直接吸收，吸收率高达20％以上，且对胃肠道不会造成损伤，有望取代当前的常用补铁剂。
在食品行业中，氯化血红素也有广阔的发展前景。如在传统的肉制品加工中常利用亚硝酸盐发色，会存在一定的致癌风险，而人工合成色素的使用也存在一定的毒副作用。氯化血红素可替代肉制品中的损害人体健康的人工合成色素如亚硝酸盐，不仅能很好的保持肉质固有的天然色，色泽均匀，口感韧性强，同时还增加了营养价值。
一个多世纪以来，围绕氯化血红素的提取与纯化，国内外众多科研人员一直在不断地探索。到目前为止，主要有五种提取方法：冰醋酸法、乙酸钠法、蒸馏法、鞣酸法和羧甲基纤维素法。中国专利2010102572793公开的“以动物血球为原料制备血红素的方法”，用4～6mol/L的脲溶解喷雾干燥后的血球粉，再加入丙酮等蛋白沉淀剂，收集沉淀用酸性丙酮法提取。这样，只用一种脲作为变性蛋白溶解剂，血红蛋白溶解不完全，血红素并未暴露出来；而且喷雾干燥制备血球粉，能耗大，成本高；而且提取用的酸性丙酮，易燃易爆，生产安全性低。
中国专利ZL87101834公开的“用表面活性剂提取氯化血红素的方法”，用氯化苄基十二烷基二甲铵等表面活性剂，促进珠蛋白溶解而使血红素暴露出来。在实践中，血红素易与珠蛋白共沉淀，得到膏状的软沉淀，而不是晶体状的紧实沉淀，这样给后期的纯化增加难度。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从动物血球中提纯氯化血红素的方法，所述方法提取获得的氯化血红素产率高、纯度高、含铁量高。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种从动物血球中提纯氯化血红素的方法，包括以下步骤：
1)将动物血球与水混合，搅拌溶血得到预溶血液；
2)将所述预溶血液与尿素溶液混合，搅拌溶解20～60min后，用盐酸溶液调节料液的pH值为2～3，并与表面活性剂混合，进行深度溶解获得血红素溶液；
3)将所述血红素溶液升温至88～92℃，保温20～50min，获得氯化血红素沉淀；
4)将所述氯化血红素沉淀经乙酸水溶液浸泡、乙醇水溶液洗涤和水洗后获得提纯的氯化血红素。
优选的，步骤1)中所述的水为二级反渗透水，所述二级反渗透水的电导率≤5.0μS/cm，所述二级反渗透水的体积为动物血球体积的1～2倍。
优选的，步骤1)中所述搅拌溶血的转速为35～40rpm，所述搅拌溶血的时间为20～60min。
优选的，步骤2)中所述尿素溶液的浓度为4～6mol/L，所述尿素溶液的体积为动物血球体积的2～3倍。
优选的，步骤2)中所述表面活性剂为吐温80，所述吐温80的体积为动物血球体积的2％～8％。
优选的，步骤2)中所述深度溶解的时间为20～60min。
优选的，步骤2)中所述深度溶解后进行固液分离，收集液相组分为血红素溶液。
优选的，所述固液分离的方式为管式离心，所述管式离心的转速为15000～17000rpm。
优选的，步骤4)中所述乙酸水溶液的体积浓度为10％～20％，所述乙酸水溶液浸泡的时间为3～5h。
优选的，步骤4)中所述乙醇水溶液的体积浓度为20％～50％。
本发明的有益效果：本发明提供的从动物血球中提纯氯化血红素的方法，经过尿素溶液溶解、调节pH使血红素与珠蛋白结合松散、吐温助溶三重作用，使血红素从血红蛋白内部暴露出来，然后通过热力作用完成血红素与珠蛋白的拆分，获得氯化血红素沉淀，最后通过乙酸水溶液浸泡、乙醇水溶液洗涤和水洗，去除残留的珠蛋白、有机物等杂质获得氯化血红素：高纯度、高含铁量。根据本发明实施例的记载，利用本发明所述方法获得的氯化血红素含铁8.42％以上，纯度98.0％以上，产率(以动物血球体积计)0.7％以上。另外，本发明提供的方法，仅少量使用乙酸、乙醇做洗涤剂用，避免了大量使用乙酸、丙酮等有机溶剂做提取剂；同时尿素溶液和表面活性剂可实现回收，循环使用。
具体实施方式
本发明提供了一种从动物血球中提纯氯化血红素的方法，包括以下步骤：1)将动物血球与水混合，搅拌溶血得到预溶血液；2)将所述预溶血液与尿素溶液混合，搅拌溶解20～60min后，用盐酸溶液调节料液的pH值为2～3，并与表面活性剂混合，进行深度溶解获得血红素溶液；3)将所述血红素溶液升温至88～92℃，保持20～50min，获得氯化血红素沉淀；4)将所述氯化血红素沉淀经乙酸水溶液浸泡、乙醇水溶液洗涤和水洗后获得提纯的氯化血红素。
本发明将动物血球与水混合，搅拌溶血得到预溶血液。本发明对所述动物血球的来源和制备方法没有特殊限定，采用市售或本领域常规方法制备获得的动物血球即可。在本发明中，所述的水优选为二级反渗透水，所述二级反渗透水的电导率优选为≤5.0μS/cm，所述二级反渗透水的体积优选为动物血球体积的1～2倍。在本发明中，所述搅拌溶血的转速优选为35～40rpm，更优选为36～37rpm，所述搅拌溶血的时间优选为20～60min，更优选为30～50min。
本发明在获得所述预溶血液后，将所述预溶血液与尿素溶液混合，搅拌溶解20～60min。在本发明中，所述尿素溶液的浓度优选为4～6mol/L，更优选为5mol/L，所述尿素溶液的体积优选为动物血球体积的2～3倍；所述搅拌溶解的时间优选为30～50min，更优选为40min。在本发明中，所述搅拌溶解的转速优选为35～40rpm，更优选为36～37rpm。在本发明所述搅拌溶解过程中，血红蛋白变性导致空间构象破坏，伸展的珠蛋白的部分肽链溶解到尿素溶液中，但溶解不完全，血红素未暴露出来。本发明在所述搅拌溶解后，用盐酸溶液调节料液的pH值为2～3；当所述料液的pH值为2～3时，血红素与珠蛋白结合最松散，促进血红素的暴露。本发明将调节pH值后的料液与表面活性剂混合，进行深度溶解获得血红素溶液。在本发明中，所述表面活性剂优选为吐温80，所述吐温80的体积优选为动物血球体积的2％～8％，更优选为3％～7％，最优选为4％～6％。在本发明中，所述深度溶解的时间优选为20～60min，更优选为30～50min；在本发明中，所述深度溶解过程中，伴随搅拌，所述搅拌的转速优选为35～40rpm，更优选为36～37rpm。在所述深度溶解过程中，所述吐温80与珠蛋白充分结合，进一步促进珠蛋白溶解，此时血红素充分暴露出来，溶液呈紫色。本发明在所述深度溶解后优选的进行固液分离，收集液相组分为血红素溶液。在本发明中，所述固液分离的方式优选为管式离心，所述管式离心的转速优选为15000～17000rpm，更优选为16000rpm。
本发明在获得所述血红素溶液后，将所述血红素溶液升温至88～92℃，保温20～50min，获得氯化血红素沉淀。在本发明中，所述升温优选在带夹套的反应釜中进行，所述升温优选的采用向夹套中通入蒸汽实现。本发明在所述升温、保温过程中，血红素与珠蛋白在热力作用下完成拆分，血红素凝集到一起，形成晶体状的紧实沉淀。本发明在所述升温、保温程序结束后，优选的进行冷却、离心获得氯化血红素沉淀。在本发明中，所述冷却优选的通过板式换热器实现；所述冷却后的温度优选的≤30℃；所述离心优选为管式离心，所述管式离心的转速优选为15000～17000rpm，更优选为16000rpm。
本发明在获得所述氯化血红素沉淀后，将所述氯化血红素沉淀经乙酸水溶液浸泡、乙醇水溶液洗涤和水洗后获得提纯的氯化血红素。在本发明中，所述乙酸水溶液的体积浓度优选为10％～20％，更优选为12％～18％，所述乙酸水溶液浸泡的时间优选为3～5h，更优选为3.5～4.5h；所述乙酸浸泡的作用为溶解氯化血红素沉淀中少量残留的珠蛋白。在本发明中，所述乙醇水溶液的体积浓度优选为20％～50％，更优选为30％～40％；所述乙醇水溶液洗涤的作用为进一步洗去氯化血红素沉淀中残留的珠蛋白、有机物等杂质。本发明在所述乙醇水溶液洗涤后，进行水洗至中性，以去除残留的乙酸、乙醇等。本发明在获得所述提纯的氯化血红素后优选的还包括干燥和粉碎步骤；所述干燥优选为烘干，所述烘干的温度优选为100～110℃，更优选为105℃；所述烘干的时间优选为10～18h，更优选为12～16h；本发明在所述干燥后进行粉碎，所述粉碎优选的采用球磨粉碎，本发明优选的将粉碎后的物料过100目筛，收集筛下组分获得提纯的氯化血红素。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
黄牛在屠宰时，预先在接血池中加入0.5wt％的柠檬酸钠抗凝剂(用少量二级反渗透水溶解后倒入池中)，当血液流入池中时不断搅拌；经105型管式离心机分离，制备黄牛血球400L。
加入600L二级反渗透水(电导率≤5.0μS/cm)，搅拌溶血20min；加入1000L的5mol/L的尿素溶液，搅拌溶解30min；加入盐酸调pH值至2.8，再加入20公斤吐温-80，搅拌60min后，管式离心机16000rpm离心，收集液体；
将离心液体泵入带夹套的反应釜中，通入蒸汽并搅拌，快速升温至90℃，保温40min后，通过板式换热器快速冷却至30℃以下，管式离心机16000rpm离心，收集氯化血红素沉淀；
沉淀用20％的乙酸浸泡4h后，离心洗涤；得到的沉淀再用50％的乙醇洗涤，最后水洗、105℃烘干18h、球磨粉碎过100目筛，制得氯化血红素3.3公斤。氯化血红素的铁含量8.42％，纯度98％，产率0.825％(相对于血球体积而言)。
实施例2
猪在屠宰时，预先在接血池中加入0.4wt％的柠檬酸钠抗凝剂(用少量二级反渗透水溶解后倒入池中)，当血液流入池中时不断搅拌；经管式离心机分离，制备猪血球400L。
加入520L二级反渗透水(电导率≤5.0μS/cm)，搅拌溶血30min；加入920L的4mol/L的尿素溶液，搅拌溶解40min；加入盐酸调pH值至2.5，再加入8公斤吐温-80，搅拌50min后，管式离心机16000rpm离心，收集液体；
将离心液体泵入带夹套的反应釜中，通入蒸汽并搅拌，快速升温至88℃，保温50min后，通过板式换热器快速冷却至30℃以下，管式离心机16000rpm离心，收集氯化血红素沉淀；
沉淀用10％的乙酸浸泡3h后，离心洗涤；得到的沉淀再用30％的乙醇洗涤，最后水洗、105℃烘干10h、球磨粉碎过100目筛，制得氯化血红素2.8公斤。氯化血红素的铁含量8.43％，纯度98％，产率0.7％(相对于血球体积而言)。
实施例3
牦牛在屠宰时，预先在接血池中加入0.6wt％的柠檬酸钠抗凝剂(用少量二级反渗透水溶解后倒入池中)，当血液流入池中时不断搅拌；经105型管式离心机分离，制备牦牛血球400L。
加入800L二级反渗透水(电导率≤5.0μS/cm)，搅拌溶血40min；加入1200L的6mol/L的尿素溶液，搅拌溶解40min；加入盐酸调pH值至2.0，再加入32公斤吐温-80，搅拌40min后，管式离心机16000rpm离心，收集液体；
将离心液体泵入带夹套的反应釜中，通入蒸汽并搅拌，快速升温至92℃，保温30min后，通过板式换热器快速冷却至30℃以下，管式离心机16000rpm离心，收集氯化血红素沉淀；
沉淀用15％的乙酸浸泡5h后，离心洗涤；得到的沉淀再用40％的乙醇洗涤，最后水洗、108℃烘干16h、球磨粉碎过100目筛，制得氯化血红素3.6公斤。氯化血红素的铁含量8.45％，纯度98.4％，产率0.9％(相对于血球体积而言)。
由上述实施例可知，本发明提供的方法提取获得的氯化血红素产率高、纯度高、含铁量高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种从动物血球中提纯氯化血红素的方法，包括以下步骤：
1)将动物血球与水混合，搅拌溶血得到预溶血液；
2)将所述预溶血液与尿素溶液混合，搅拌溶解20～60min后，用盐酸溶液调节料液的pH值为2～3，并与表面活性剂混合，进行深度溶解获得血红素溶液；
3)将所述血红素溶液升温至88～92℃，保温20～50min，获得氯化血红素沉淀；
4)将所述氯化血红素沉淀经乙酸水溶液浸泡、乙醇水溶液洗涤和水洗后获得提纯的氯化血红素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的水为二级反渗透水，所述二级反渗透水的电导率≤5.0μS/cm，所述二级反渗透水的体积为动物血球体积的1～2倍。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述搅拌溶血的转速为35～40rpm，所述搅拌溶血的时间为20～60min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述尿素溶液的浓度为4～6mol/L，所述尿素溶液的体积为动物血球体积的2～3倍。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述表面活性剂为吐温80，所述吐温80的体积为动物血球体积的2％～8％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的深度溶解的时间为20～60min。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述深度溶解后进行固液分离，收集液相组分为血红素溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述固液分离的方式为管式离心，所述管式离心的转速为15000～17000rpm。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述乙酸水溶液的体积浓度为10％～20％，所述乙酸水溶液浸泡的时间为3～5h。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述乙醇水溶液的体积浓度为20％～50％。
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