CN1019392B - 氯化血红素的分离和纯化 - Google Patents

Abstract

在作为结晶催化剂的阳离子、非离子或两性表面活性剂存在下，用结晶法从酸性水溶液中分离和纯化氯化血红素。

Description

本发明是关于用催化结晶法从水溶液或悬浮液中分离和纯化氯化血红素的方法。而将氯化血红素从水溶液中结晶析出通常是不可能的。

在传统的方法中，只能用数量上大到不相称的大量有机溶剂将氯化血红素从血液或血红蛋白中分离出来。这些溶剂已经成为工业生产中费用最高的因素，并且引起环境污染问题。

早在1853年，Teichmann用冰醋酸在氯化钠存在下作用于血液，得到了以他名字命名的氯化血红素结晶。后来Schalfejew将这个血液显微检测方法发展成为一种生产工艺，至今仍然是传统的制备氯化血红素的方法（UIImann，应用技术化学大全（Encyklopaedie    d.tech.Chemie），第Ⅳ版，11卷，129页）。在该工艺中，制备1公斤氯化血红素大约需要800升冰醋酸，此外重结晶还需要5升吡啶，11升氯仿和70升冰醋酸。纯氯化血红素的产量只有理论产量的70%。仅在重结晶过程中，就损失约20%。

其它已知的方法是利用甲醇（欧洲专利-B-68537）、乙醇、必要时加入乙二醇或丙三醇的混合物（丹麦专利-A2526596）、二甲基甲酰胺、甲乙酮或丙酮（生理化学进展80（1912），35）在酸化的血红蛋白中分离氯化血红素和珠蛋白。1公斤氯化血红素需要200至500升上述有机溶剂，得到的还是杂质很多的氯化血红素。

根据美国专利4，330，463，在血红蛋白中加入盐酸，将混合物喷雾干燥，得到的酸性干血用乙醇/甲醇混合物提取若干次，将氯化血红素提入溶液。用这个方法每公斤氯化血红素需要1000升以上溶剂。

本发明的目的就是提供一个分离和纯化氯化血红素的方法，该方法不用有机溶剂，并以很高的收率获得纯的氯化血红素。

我们发现，用本权利要求的方法可以达到这个目的。用本方法，在PH0.5-2.5时，借助于阳离子的、非离子的或两性的表面活性剂或这些表面活性剂的混合物，将它们作为催化剂，氯化血红素可以从含有氯化物的水溶液或悬浮液中结晶出来。

一般地说，氯化血红素得自血红蛋白，血红蛋白得自血液。加入催化剂后，由于氯化血红素的结晶析出，使血红蛋白分解成氯化血红素和珠蛋白的平衡向氯化血红素移动（因而防止了逆反应的发生）。因此，所涉及的方法主要是氯化血红素从血红蛋白和珠蛋白混合物中的结晶和分离。

如果将含有盐酸的稀血红蛋白溶液加热，立即分出粘稠的沉淀，该沉淀由变性的珠蛋白混合物组成，即已成为不溶的珠蛋白和血红蛋白。我们已经发现，在这个处理过程中，将适当的表面活性剂作为催化剂加入，血红蛋白不会沉淀。而且，出人意外地，以实际上定量的产率形成Teichmann氯化血红素结晶。一经静置，结晶就沉淀下来。无色的上层清液由含有盐酸的纯珠蛋白溶液组成。尽管更可取的是在水解前将血红蛋白溶液稀释至含有2-8%固体含量（尤其是5%左右），但这不是绝对必需的。水解以及氯化血红素的结晶在浓溶液中也能发生（如固体含量为15%时），但是反应速度较高，也就是说，如果这样做，氯化血红素的分离时间就会变得很短，以致结晶很小，沉淀很慢。但另一方面，用很稀的溶液是不经济的。

合适的催化剂是前面所述的表面活性剂，即具有疏水和亲水基团的表面作用的混合物，阴离子表面活性剂以不同的方式作用。原则上，市场上许多类型表面活性剂都能被使用，在应用非离子表面活性剂时，最好使用分子量大的表面活性剂。为了促进表面活性剂和珠蛋白分离（在氯化血红素结晶分 离后，珠蛋白很容易经中和从母液中沉淀出来），合理的做法是采用这样的表面活性剂，这些表面活性剂即使在中性PH时仍然留在溶液中。

合适的阳离子表面活性剂的例子是分子中带有一个或二个长链烷基的季铵盐。特别重要的典型化合物的例子是氯化二甲基-C₈-C₁₈-烷基-苄基铵，例如氯化苄基十二烷基二甲铵、氯化十八烷基三甲铵、氯化苄基三甲铵、氯化苄基十四烷基二甲铵、氯化十六烷基吡啶鎓以及氯化二羟乙基甲基油酰铵。其它例子是具有羟聚醚基团的羟基脂肪胺，例如十八烷基二乙醇胺或十二烷基二聚乙二醇胺，还有氮杂环丙烷和脂肪胺盐的加成物，2-（脂肪烷基）咪唑啉、2-（脂肪烷基）苯并咪唑和三乙醇胺的脂肪酸单酯。

合适的非离子表面活性剂的例子是天然的和合成的9个碳或更多碳原子脂肪醇的乙氧化物。在这种情况下，非离子表面活性剂最好是具有9到50个乙氧基或丙氧基、尤其是按C₉到C₁₁、C₁₂到C₁₅和C₁₆到C₂₀部分的氧己醇。烷基酚也是有用的，尤其是具有8到50个乙氧基和/或丙氧基的辛基、壬基或十二烷基酚的衍生物。具有8到50个乙氧基的脂肪酸和烷醇胺缩合物的衍生物也是有用的表面活性剂。其它合适的非离子表面活性剂有已知的分子量为500到2，500的环氧乙烷和1，2-环氧丙烷的聚合物，分子量为500到8，500的环氧乙烷和1，2-环氧丙烷的嵌段共聚物。

合适的两性表面活性剂是种类繁多的内铵盐，要求它们有长链的疏水基团，如十四烷基内铵盐或磺基牛磺酸基的化合物。

不同的表面活性剂或表面活性剂类型也可混合使用。表面活性剂可在变化很大的浓度范围使用，根据所用的溶液或悬浮液，以重量计其浓度范围从0.005至20%，最好是0.01至5%，最常用的是0.025%。氯离子浓度至少必须足以生成氯化血红素，实际上（更有利地）高于这个限度。这里没有明确地规定上限。

如果加热反应混合物时间长于氯化血红素结晶所需要的时间，即使混合物中有表面活性剂，也会离析出变性的珠蛋白。由于这样做会生成不溶的氯化血红素和珠蛋白的混合物，所以，这种情况是不希望发生的。对于更大的规模，加热和冷却都需要更长的时间，因此，最好采用连续的方法，这样，加热的时间较短。为了这个目的，将表面活性剂作为催化剂加入反应混合物，用泵输入到热交换器，并在此将反应物迅速加热。如果必要，将反应物送至体积合适的容器，在已达到的反应温度上在反应更长周期，然后送至另一个热交换器迅速冷却。任何介质如热水、甘油，油等都可作为加热介质，但是，最好利用蒸汽，蒸汽在大气压下冷凝成水，以避免使反应的水混合物沸腾，并且使温度正好略低于沸点。在大工厂中，如果采用适当的温度控制，当然也可以利用高于大气压的蒸汽。在90℃-99℃可得到最有利的结果，这是因为珠蛋白变性的竞争性沉淀远低于这个温度，用泵的速度和反应速度配合的方法可以得到最佳控制，这将在实施例2和3中叙述。

加入氯化血红素晶种，不仅可以保证恰当的反应速度，实际上还大量节省了表面活性催化剂（最高达99%）原则上，没有表面活性催化剂，晶种混悬液也能促使氯化血红素结晶。但是，为了这个目的，必须将结晶速度增加到一定程度，使结晶在珠蛋白变性前完成，也就是需要较大的晶种表面积。例如，这个方法可能要用大量的氯化血红素晶种，即为所得氯化血红素结晶的10-100倍，也可能需要磨得特别细的、平均直径小于1微米的晶种，在这种情况下，得到的所生成的氯化血红素也相应地很细，以致离心分离很困难。由于这个问题，这个方法（没有在这里提出权利要求）实际上是不重要的，尽管它的优点在于不引入可能污染氯化血红素或珠蛋白的外来物质。虽然本发明所使用的表面活性催化剂是这样一种外来的物质，但是，它能得到很大的氯化血红素结晶，这种结晶能自动地沉淀，不需要离心。并且，由于表面活性剂和珠蛋白不同，在中和珠蛋白盐酸溶液时，表面活性剂仍留在溶液中，它们可以很容易地被除去。用水洗涤，可以除去氯化血红素结晶中的表面活性剂。

表面活性催化剂也适用于氯化血红素粗品的重结晶，并且产物的损耗很小。氯化血红素粗品不仅指实施例2至4的反应产物，而且包括任何其它含有氯化血红素的残留物，例如，在血红蛋白酶法降解（参看实施例8）中的生成物，甚至包括纯氯化血红素。在这种情况下，表面活性剂的浓度选择高一些是有利的。例如，根据溶液的情况，以重量计从0.1至20%，最常用的是5%。溶液中的氯化血 红素或沉淀中无定形的氯经血红素可以直接结晶，而结晶氯化血红素必须先溶于氨水中。也可以用任何别的碱来代替氨，尽管这样溶液常常更不稳定。也可以将氯化血红素粗品溶于有机溶剂，如二甲基甲酰胺或二甲亚砜，然后加入含有表面活性剂的水，直至混合物主要以水为溶剂，然后使氯化血红素在混合物中结晶。

在实施例5至8所述的结晶法进行纯化时，产生特定大小的Teichmann结晶。如果使用大量的表面活性剂且在结晶生长期停止搅拌，可得到特别大的结晶（实施例7），如果在搅拌下，用少量非离子表面活性剂并加热（实施例6），再迅速加入盐酸，可得特别小的结晶。此处不必加入晶种。

如果将含有表面活性催化剂的氯化血红素的氨溶液迅速用盐酸酸化，则生成含有结晶不好的氯化血红素沉淀，如呈针状或粒状的弯曲排列。但是，如果使用中性溶液，如二甲基甲酰胺溶液，则生成正常的结晶。我们已发现，如果先在pH2至5加热，再慢慢地加入盐酸，直至形成初步的结晶，那么也可以从氨溶液中得到正常晶形。

当HCI加入比较快时，结晶变得比较小和比较尖，从分离过程应温和的观点看，一般是不希望这样做的。特定的表面活性剂对结晶形状有着可清楚地观察到的、特定的影响，这些晶形可以比较薄或比较细或比较宽以致开裂，也可呈比较坚实的十字形直至星形等。

为了使氯化血红素更容易结晶和分离，如果必要，可以将混有珠蛋白的氯化血红素粗品酶解。虽然在水中反复悬浮和沉淀，所得的氯化血红素纯度只有90%，可以进一步用浓度为50-70%的硫酸处，如实施例5所述，其纯度可增加到98%以上。

实施例1

在牛血中加入柠檬酸三钠后，将牛血离心，用水稀释，使血球浓度保持在固体含量为5%。然后加入浓度为20%的盐酸，至pH为1.5。

在磁搅拌器上将500毫升该起始液和10克氯化苄基十二烷基二甲铵一起搅拌，在10分钟内加热至沸。约3分钟后，红棕色溶液变为无色，产生小的黑紫色氯化血红素结晶沉淀。用水冷却该混合物，使结晶沉淀下来。无色的珠蛋白盐酸上层液可以很容易地倾出。抽滤沉淀的结晶氯化血红素，洗涤和干燥，得0.76g（100%理论值）的96.5%纯产物。

实施例2

实施例1所述起始液10L，pH为1.5，和古柯酰氨基（Cocamido-）-丙基内铵盐（1-C₇-C₁₇-烷基酰氨基-3-二甲胺-丙烷-3-羧甲基内铵盐）24g、浓度为4%的晶种悬浮液0.2g一起搅拌，晶种悬浮液按下法制备，在转速为每分400转的碾磨机中，将氯化血红素结晶的水悬浮液仔细碾磨6小时（平均颗粒直径1微米）。

该溶液连续地用泵输入，从下方通过一垂直的，有夹套的蒸汽加热的玻璃管（管长1.40米，直径20毫米），然后用实验室冷凝器冷却至最高温度为55℃。调节输送速度，以便输出的反应液不因加热而成为棕色，这个速度相当于在所述条件下每分钟约80毫升。利用小的连续离心机（约3，000×g）进行分离，得到10升淡黄色珠蛋白盐酸溶液和170克含有少量珠蛋白的湿的氯化血红素粗品。按实施例5所述方法进一步处理。

实施例3

将实施例1所述起始液600升，和壬基酚聚乙二醇醚（聚合度30）150克，实施例2的浓度为4%的氯化血红素晶种20克一起搅拌。

该溶液连续地用泵输入，从下方通过一垂直的、蒸汽加热的管式热交换器（长度为1米，有46根不锈钢管，每根管直径为12毫米），再通过6升管形后反应器以及冷却面积约为0.1米²的冷却器，然后进入连续卸料分离器（有3升转鼓，离心力约5，000×g）。泵的输送速度约为250升/小时，控制输入速度以使溶液在进入离心机时不会变成棕色。离心液由600升淡黄色珠蛋白盐酸溶液组成，残余物为4.2公斤含有珠蛋白的湿的氯化血红素粗品。该氯化血红素粗品按实施例5所述方法处理。

实施例4

以五倍量的相同表面活性剂（0.75公斤）和1/10量的晶种（2克悬浮液）重复实施例3的实验。反应速度与实施例3相同。得到600升含有盐酸的珠蛋白溶液和4.4公斤湿的氯化血红素粗品。

实施例5

在实施例2至4得到的氯化血红素粗品中加入 水，使之变得可以搅拌，每2升悬浮液加1克胃蛋白酶，在30至40℃搅拌2小时。用冰冷却混合物至+5℃，加入氨至恰好使其全部溶解。加入壬基酚聚乙二醇醚（聚合度30）和柠檬酸，每种物质的量等于预计的氯化血红素产量，将混合物在约95℃加热10分钟。与所加氨等当量的盐酸加入到搅拌的混合物中，在95℃再慢慢地加入盐酸，直到氯化血红素开始结晶（显微镜）。一到两小时后，无定形的棕黑色快状物已经全部消失，在那些地方生成相应数量的Teichmann氯化血红素结晶，这些结晶大小一致，棱长约0.02毫米。

待结晶沉淀后，倾出溶液，将浓度为85%的硫酸加入搅拌的残余物，直至硫酸浓度达到60%。十分钟后，混合物用两倍体积的水稀释，待结晶沉下后，在抽滤漏斗上用水洗去酸。产量是定量的。纯度为98%，在388血红素毫微米NaOH中测定比消光（1%，1cm），对于纯度为100%的氯化，其值为956。

Fe    计算值：8.57%，实测值：8.4%

Cl    计算值：5.44%，实测值：5.3%

利用1/10催化剂量重复实施例5的重结晶，生成小得多的氯化结晶。

实施例6

利用1/10催化剂量重复实施例5的重结晶，生成小得多的氯化血红素结晶。

实施例7

混合催化剂由等量实施例1和5的表面活性剂组成，用总量相等的混合催化剂重复实施例5所述的重结晶，在结晶期间停止搅拌。生成大得多的棱长约为0.1毫米的氯化血红素结晶。

实施例8

实施例1所述起始液40升和10克胃蛋白酶在37℃搅拌16小时，然后将混合物通过转鼓容量为3升的连续离心机，在离心力为约5，000×g下离心。

得到2公斤含有氯化血红素的残余物，该残余物的固体含量为12%。用2L水稀释，加入实施例3的催化剂60克，将混合物加热到95%。加入浓度为20%的盐酸150ml，开始出结晶，然后间歇地多次加入盐酸，每次10ml。后面的步骤与实施例5至7所述相同。

产量：60克结晶氯化血红素

纯度：98%

Claims (3)

1、一种分离和纯化氯化血红素的方法，其中在PH为0.5-2.5及作为结晶催化剂的阳离子、非离子或两性表面活性剂或它们的混合物按所用溶液或悬浮液的重量计以0.005-20%的量存在的情况下，氯化血红素在约90℃至沸点的温度范围内从含有氯化物的水溶液或悬浮液中开始结晶，并在冷却至55℃或55℃以下后折出，然后洗涤结晶。

2、根据权利要求1所述的方法，其中氯化血红素的结晶是连续进行的，即用泵将已加入了作为催化剂的表面活性剂的溶液或悬浮液输至热交换器，它在此迅速加热，并通过将其送至体积合适的容器而将所达到的反应温度保持更长时间，直至开始结晶为止，然后将其送至另一热交换器冷却。

3、根据权利要求1所述的方法，其中用加入微晶晶种促进催化结晶。