CN1826342B - 对核黄素进行纯化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对核黄素进行纯化的方法，所述方法包括如下步骤：(a)沉淀核黄素的第一种晶体形式，(b)分离出核黄素的第一种晶体形式，(c)在能使稀释的DNA分解的条件下，将核黄素的第一种晶体形式转化为核黄素的第二种晶体形式，以及(d)分离出核黄素的第二种晶体形式，前提条件是：在环境温度下，核黄素的第一种晶体形式在热力学上较之核黄素的第二种晶体形式较为不稳定。

Description

对核黄素进行纯化的方法
本发明涉及对核黄素(维生素B2)进行纯化的方法，所述方法特别适于去除伴随核黄素晶体存在的DNA。
虽然人们过去通过合成来生产核黄素，但出于经济上的原因，用于生产核黄素的现代技术是基于发酵技术的。此类方法具有如下共同特征：通过微生物来生产核黄素，再通过连续的纯化步骤，从含有核黄素的粗反应浆体(发酵培养液)中获得纯净的产物。
用于生产核黄素的发酵方法是现有技术中已知的。在该方面可以参考，例如，Takata，Ryohei；Nagata，Toshiomi，Shimamoto，Sumio；Solubility ofriboflavin obtained from cultured Eremothecium ashbyii(1949)27，pp.8-10 and50-52；Sen Gupta，S.B.；Gupta，H N.；Solubility of riboflavin(vitamin B2)inwater；J.Proc.Inst.Chemists(India)(1949)21，pp.1-4；Chemical Engineering，April 2002，p.23；van Loon R.P.G.M.et al.；Development of a FermentationProcess for the Manufacture of riboflavin；Chimia 50(1996)No.9 pp.410-412；EP-A 428 767；EP-A 464 582 and DE-A 2 920 592。
在发酵过程期间，发酵罐中核黄素的浓度稳定增加。但是，核黄素在水溶液中的溶解度相当低；在中性水溶液中，30℃至50℃的温度下，溶解度已被报道为大约0.014％wt.-％至0.031wt.-％。因此，发酵过程中达到一定程度的过饱和后，核黄素就自发开始结晶。在发酵过程期间一旦形成了最初的微晶，通过连续发酵产生的核黄素就会连续结晶，直到发酵过程结束。
通常，含有核黄素晶体的反应浆体(发酵培养液)被转移至该过程的下游部分。在第一步中，通常对反应浆体进行巴氏灭菌，即，在酸性条件和升高的温度下杀死微生物。在第二步中，通过倾析将大部分的生物物质从反应浆体中移出。在第三步中，对反应浆体进行酸化，将其加热至高达95℃至115℃，以使残余的杂质(例如，生物物质、蛋白质、脂类、DNA)分解，并将其去除至某一程度，因此纯化了核黄素晶体。在酸处理期间，核黄素晶体的纯度通常会从大约85wt.-％上升至96wt.-％。在第四步中，对经过酸化的反应浆体进行过滤及洗涤。可选的进一步的步骤包括纯化步骤和/或配方步骤，以获得最终的产品形式。
在纯化步骤(第三步)中，仅能将脂类、蛋白质、DNA和其它有机及无机化合物去除至某一程度。已有报道说，通过加入2wt.-％的硫酸或另外的无机酸，并将反应浆体加热至95℃至105℃范围内的温度，可获得高达97wt.-％的纯度。
但是，在现有技术的发酵方法中生产出的核黄素的质量并不令人满意，因为产物中仍含有相当数量的杂质，特别是DNA。一方面，核黄素的纯度应尽可能的高，尤其是用于制药或营养用途的。但是，另一方面，纯化方法又应该相当地简单、有效、可定量并温和(例如，核黄素不应被暴露给高温达到一定的时间，以防止形成变质的产物)。
本发明的一个目的是提供比现有技术的方法更好的用于纯化核黄素的方法。
该技术问题已被本专利权利要求的主题方案所解决，即通过对核黄素进行纯化的方法解决，所述方法包括如下步骤：
(a)沉淀核黄素的第一种晶体形式(crystalline form)，
(b)分离出核黄素的第一种晶体形式，
(c)在能使稀释的DNA分解的条件下，将核黄素的第一种晶体形式转化为核黄素的第二种晶体形式，以及
(d)分离出核黄素的第二种晶体形式，
前提条件是：在环境温度下，核黄素的第一种晶体形式在热力学上较之核黄素的第二种晶体形式较为不稳定。
术语“环境温度”指平均室温，优选地，23℃。
我们惊奇地发现，通过所述方法，核黄素晶体的DNA含量可被显著降低，即，优选地，降低至低于传统PCR分析的检测极限(大约0.2ppb)的程度。
所述对核黄素进行纯化的方法可在比不将核黄素的第一种晶体形式转化为核黄素的第二种晶体形式的现有技术方法的条件更为温和的条件(温度、驻留时间、酸浓度等)下进行。
本发明基于如下意料之外的发现：取决于发酵罐中的条件，发酵期间核黄素的结晶会导致不同的晶体形式(修饰型，modification)。对发酵培养液中核黄素晶体的分析表明，在一些批次中，沉淀出了脱水形式(即，脱水核黄素I)，而在其它批次中，则沉淀出了水合物(即，二水合核黄素)。在其它批次中，还发现了两种晶体形式的混合物。在一些情况下甚至还鉴定出了第三种晶体形式(即四水合核黄素)。这些晶体形式，即水合核黄素和脱水核黄素是通过X-射线粉末衍射(XRD)和动态蒸气吸附(DVS)分析出的。通过Raman光谱对不同晶体形式的溶解度进行了研究。DVS和XRD的组合使得可对水合物的形成加以研究。
已经发现，三种不同的脱水晶体修饰型(脱水核黄素I、II和III)与不同的水合核黄素(单水合核黄素、二水合核黄素和四水合核黄素)达成平衡。
取决于温度，下述晶体形式与另一种之间互相达成平衡，或者在给定的条件(例如，温度、湿度等)下互相不可逆转化：
脱水核黄素I与二水合核黄素及四水合核黄素；脱水核黄素II与单水合核黄素及二水合核黄素；脱水核黄素III与四水合核黄素。
在23℃，关于脱水核黄素I和二水合核黄素的状况可由下述方程式阐述：
在23℃，脱水核黄素I和二水合核黄素之间的平衡完全转移至脱水核黄素I这边，即，在此温度下，二水合核黄素不可逆地转化为脱水核黄素I。因此，在23℃，不能从纯的脱水核黄素I中获得二水合核黄素。此外，在较高的温度，例如39℃下，二水合核黄素在热力学上也比脱水核黄素I更为不稳定。
在23℃，二水合核黄素向脱水核黄素I转化的反应相当缓慢。在23℃的温度下，对含有纯二水合核黄素的浆体进行搅拌在11天内能得到向脱水核黄素I的部分转化(80％)(由Raman光谱测定)。在39℃，溶解度或化学势的差异很小。因此，在该温度下，二水合核黄素向脱水核黄素I的转化缓慢。
在更高的温度下，脱水核黄素I和二水合核黄素化学势之间的差异就增加了。因此，转化过程的速率显著提高，80℃下二水合核黄素在20秒之内即完全转化为脱水核黄素I。
但是，在4℃，热力学状况有所不同。在水性浆体中，脱水核黄素I可被转化为二水合核黄素，后者可不可逆地获得自四水合核黄素(尤其是在较高的温度下)：
在4℃，脱水核黄素I向二水合核黄素的转化非常缓慢。在4℃的温度下，对仅含有脱水核黄素I的浆体进行搅拌在56天内才能得到脱水核黄素I向二水合核黄素的部分转化(80％)。
对各晶体形式(特别是脱水核黄素I、二水合核黄素和四水合核黄素)的溶解度的研究，令人惊奇地揭示：在低于约40℃时，溶解度曲线互相接近。在4℃至23℃之间的范围内的某一温度处，脱水核黄素I和二水合核黄素的晶体形式的Gibbs自由能(ΔG)相等。在所述温度范围内的某一温度处，脱水核黄素I和二水合核黄素的溶解度曲线相交。在高于交点的温度下，脱水核黄素I是热力学上更稳定的晶体形式(较低的Gibbs自由能)；在低于该交点的温度下，二水合核黄素是热力学上更稳定的晶体形式。
在23℃，在脱水核黄素II和单水合核黄素及二水合核黄素之间还有一种平衡，该平衡取决于相对湿度。此外，同样取决于相对湿度，在23℃，脱水核黄素III可以可逆转化为四水合核黄素：
核黄素的各晶体形式的性质，尤其是溶解度和自发结晶情况，都已被仔细地研究过了(见实施例1)。结果被概括于图1和图2中。对二水合核黄素在44℃至52℃范围内的温度下的溶解度，和核黄素在44℃至59℃范围内的温度下的自发结晶情况进行了研究。将过饱和曲线外推至39℃显示，脱水核黄素I和二水合核黄素的过饱和曲线彼此相当接近。在另一项实验中，在69℃的温度下，将核黄素以0.7g l-1的浓度溶解。在3小时内将溶液持续冷却至39℃，得到脱水核黄素I晶体。在39℃，二水合核黄素在热力学上比脱水核黄素I更不稳定。39℃时脱水核黄素I的过饱和曲线的位置可被估计为高于0.6g l-1。因此，在过饱和曲线和溶解曲线之间的亚稳定区，通过用目标晶体形式的晶种进行接种，有可能对核黄素晶体形式的形成加以控制。
图A-F中展示了脱水核黄素I、脱水核黄素II、脱水核黄素III、单水合核黄素、二水合核黄素和四水合核黄素的晶体形式的粉末衍射图。
关于晶体学领域的术语(例如，“晶体形式(crystalline form)”、“多态性(polymorphism)”、“多晶型体(polymorph)”等)，可参见，例如，Solid State Chemistry of Drugs；Stephen R.Byrn，Ralph R.Pfeiffer，Joseph G.Stowell：SSCI Inc.West Lafayette；1999。
脱水形式是不含结晶水的晶体形式，尤其是在不含水的大气环境下。脱水核黄素I是图A中由X射线衍射图所表征的核黄素多晶型体。在水蒸气下，脱水核黄素II与单水合核黄素和二水合核黄素达到平衡。在水蒸气下，脱水核黄素II与四水合核黄素达到平衡。
水合物是含有结晶水的晶体形式。在水蒸气下，单水合核黄素(参见图D)与脱水核黄素II和二水合核黄素达到平衡。二水合核黄素由图E中的X射线衍射图所表征。在水蒸气下，四水合核黄素(参见图F)与脱水核黄素III达到平衡。
结晶核黄素的多种修饰型都是本领域现有技术中已知的。在此方面可以参见，例如EP-A 995 749、US 2,324,800、US 2,603,633、US2,797,215、US 4,687,847和International Center of Diffraction Data(2002JCPDS；PCPDFWIN v.2.2；Data submitted by Eli Lilly and Company，Indiana，USA，1995)。
在现有技术中，对结晶核黄素的各种晶体形式(修饰型)命名并不统一，下表中对不同的术语进行了概括：
Figure G2004800211488D00061
在根据本发明的方法的步骤(a)中，沉淀出了(即，结晶出了)核黄素的第一种晶体形式。优选地，步骤(a)从发酵罐中微生物产生的粗反应浆体(发酵培养液)开始进行。合适的微生物包括未经过遗传修饰的生物(非GMO)和经过遗传修饰的生物(GMO)。发酵过程可以连续进行或作为分批过程进行，后者是优选的。通常，发酵罐中含有的水的量不足以令全部量的核黄素产物溶解。因此，仅有在发酵过程最开始时获得的核黄素的量保留于溶液中，但是在后续发酵期间，达到一定程度的过饱和时，核黄素就自发开始结晶。通常，结晶在发酵过程终止之前就能很好地初始化。因此，在该过程的终点，产物中的大部分都已以结晶核黄素的形式(核黄素的第一种晶体形式)沉淀，仅有相当少量的核黄素保留于溶液中。
本发明的方法要求：在环境温度(优选为23℃或更高)下，核黄素的第一种晶体形式在热力学上比步骤(c)中产生的核黄素的第二种晶体形式更不稳定。这并不意味着步骤(a)本身必须在环境温度下进行，此处的温度仅定义了在何种条件下对核黄素的不同晶体形式的热力学稳定性进行比较。优选地，步骤(a)在低于40℃的温度下进行。
一方面，必须防止步骤(a)中沉淀出的核黄素的晶体形式是环境温度下结晶核黄素在热力学上最为稳定的形式，因为在那种情况下，就不可能有向环境温度下热力学上更为稳定的任何第二种晶体形式的转化。另一方面，核黄素的第一种晶体形式应是在受控沉淀条件下可获得的，并且应可经受发酵以及可选的后续巴氏灭菌步骤。展示出这些性质的任何晶体形式都能令核黄素被有效纯化，尤其是令在步骤(c)中，核黄素晶体含有的DNA的浓度显著降低。
在根据本发明的方法的一种优选的实施方式中，步骤(a)中沉淀出的核黄素的第一种晶体形式包含水合核黄素，优选是单水合核黄素、二水合核黄素或四水合核黄素。最优选地，步骤(a)中沉淀出的核黄素的第一种晶体形式是二水合核黄素。
取决于步骤(a)中的反应条件，从发酵培养液中自发沉淀出的核黄素的第一种晶体形式并不一定是人们想要的核黄素的第一种晶体形式。因此，可能必须要对步骤(a)沉淀出的(即，发酵过程中优先产生的)结晶核黄素的沉淀形式加以控制。
已令人惊奇地发现，在步骤(a)中，可通过具有某种晶体结构的晶种来初始化结晶过程，对人们想要的发酵罐中核黄素的第一种晶体形式的形成加以控制。向发酵培养液中加入合适的晶种能使得核黄素的特定的第一种晶体形式沉淀出来。因此，可以通过择出的合适晶种，来沉淀出优选的核黄素的第一种晶体形式(例如，单水合核黄素、二水合核黄素或四水合核黄素)，优选地，二水合核黄素。
通过晶种(接种)来初始化结晶过程是已知技术，由此可对结晶形成的产物的形式加以影响。在此方面，可以参见，例如CrystallizationTechnology Handbook；A.Mersmann；Marcel Decker，Inc.；1995。
在根据本发明方法的一种优选的实施方式中，步骤(a)中核黄素的第一种晶体形式的沉淀是由晶种来初始化的，优选是由核黄素的晶种来初始化的。优选地，晶种包含水合核黄素的晶种，更优选地，单水合核黄素、二水合核黄素或四水合核黄素的晶种。最优选地，核黄素的晶种包含单水合核黄素。
优选地，步骤(a)中沉淀出的核黄素的第一种晶体形式是由合适的晶种获得的二水合核黄素或四水合核黄素。优选地，核黄素的第一种晶体形式是二水合核黄素，其沉淀过程优选由单水合核黄素的晶种所控制。
已令人惊奇地发现，单水合核黄素的晶种适于沉淀二水合核黄素。当将单水合核黄素的晶种引入，令其与水接触时，溶解于过饱和水溶液(发酵培养液)中的核黄素就立即以二水合核黄素的晶体形式沉淀。对晶体形式的本质的研究揭示，在水性分散体系中，结晶的单水合核黄素会迅速转化为结晶的二水合核黄素。
在本发明的一种优选的实施方式中，在2-10小时后，优选地，4-7小时后，将晶种加入到发酵培养液中。优选地，用接种针将晶种从灭菌瓶转移到发酵罐中。
用于制备结晶单水合核黄素的方法是现有技术中已知的(参见EP-A995749-修饰型B/C)。
可通过将单水合核黄素的晶种加入到核黄素的过饱和水溶液中来制备结晶的二水合核黄素，优选地，在5-8的pH值之间，更优选地，在6.5-7的pH之间。本发明的一个方面涉及二水合核黄素。本发明的另一方面涉及制备结晶的二水合核黄素的方法，其中，将结晶的单水合核黄素加入到核黄素的饱和水溶液中。
可通过在真空下、大约40℃下将核黄素水溶液中的水蒸发出去来制备四水合核黄素。为获得起始材料，即，核黄素的水溶液，优选地，将脱水核黄素I以大约0.07g l-1的浓度悬浮于去离子水中(参见实施例6)。然后通过过滤器系统(包括带有玻璃纤维的预过滤器和5μm Teflon过滤器的组合)将饱和溶液与未溶解的晶体分开。将核黄素的饱和水溶液连续加入到旋转式蒸发器中含有的核黄素溶液中。同时，令水蒸发，优选地，在30至60℃之间的温度下进行，尤其是35至45℃之间，并且在10至100mbar的真空下，优选在20至25mbar的真空下。优选地，水浴温度不应超过40℃。将核黄素的溶液连续转移至蒸发器的烧瓶中，而通过蒸发使烧瓶中的溶液体积保持恒定。结晶过程在某个点初始化。蒸发终止之后，对浆体进行过滤。可通过XRD来对四水合核黄素的湿晶体进行分析。本发明的一个方面涉及四水合核黄素。本发明的另一方面涉及制备四水合核黄素的方法，其中，在真空下、大约40℃的温度下，从核黄素的溶液中蒸发出水，并同时将核黄素的饱和溶液加入到旋转式蒸发器中。
下面描述了获得用于步骤(a)中的结晶单水合、二水合和四水合核黄素或其它合适的核黄素晶体形式的适用晶种的进一步的方法。
在根据本发明的方法的步骤(a)中，成功沉淀出人们想要的核黄素的第一种晶体形式需要晶种是人们想要的晶体形式，优选地，单水合核黄素、二水合核黄素或四水合核黄素，更优选地，单水合核黄素或二水合核黄素。此外，晶种应当是经过灭菌的，不会导致外来生物对发酵过程的污染。
可在种子发酵罐或其它合适的反应器中来制备核黄素的晶种。作为起始材料被引入到种子发酵罐中的核黄素必须被完全稀释。任何杂质，即任何不想要的晶体形式的未溶晶体，在本方法的步骤(a)中通常稍后将导致同样的不想要的晶体形式沉淀，因此产生不想要的中间产物(即，核黄素的第一种晶体形式)。具体而言，晶种中脱水核黄素I的任何杂质都会不可避免地导致发酵过程中脱水核黄素I的沉淀，因此应加以避免。
在本发明的一种优选的实施方式中，核黄素的晶种以单水合核黄素的形式存在。制备方法优选从单水合核黄素开始(参见EP-A 995 749)。然后，在2℃至40℃之间的温度下，优选在10℃至20℃之间，在单水合核黄素会转化为二水合核黄素的条件下，将单水合核黄素的晶体悬浮于水中。将晶体滤出，并进行干燥，以去除表面的水。将晶体碾碎增加比表面积，稍后在步骤(a)中其被引入到发酵培养液中之后，能使晶核形成速率更高。然后用纯乙醇或乙醇与水的混合物来洗碾细的晶体。
优选地，在将其用于根据本发明的方法的步骤(a)之前，先对核黄素的晶种进行灭菌。优选地，通过蒸汽灭菌或通过溶剂(优选地，乙醇与水的混合物，最优选地，＞70％的乙醇与水的混合物)来对晶种进行灭菌。
在通过蒸汽对晶种进行灭菌的情况下，将单水合核黄素或二水合核黄素的干燥晶体转移至封闭系统中。在该系统中，将晶体加热至110℃至150℃之间的温度，优选在120℃至140℃之间，优选进行大约30分钟。在根据本发明的方法的一种优选的实施方式中，通过蒸汽和温度(优选为120-140℃)来对水合核黄素晶种，更优选地，单水合核黄素或二水合核黄素晶种进行灭菌。已经令人惊奇地发现，在这些条件下，晶种的晶体形式并未改变。
另一种可能性是通过溶剂进行灭菌。第二种灭菌过程可通过加入溶剂，例如醇或酮来进行，其中，加入乙醇或甲醇是优选的。因为核黄素晶种实际上是不溶于溶剂的，从而会形成浆体，然后再将溶剂从中过滤去除。用灭菌水来洗涤湿的晶体，以去除残留的溶剂。在根据本发明的方法的一种优选的实施方式中，通过乙醇和水的混合物，优选地，含有70vol.-％至90vol.-％乙醇的混合物来对水合核黄素晶种，更优选地，单水合核黄素或二水合核黄素的晶种进行灭菌。已经吃惊地发现，在上述条件下，晶种的晶体形式不会改变。
此时，新鲜制备好的核黄素的晶种即可用于根据本发明的方法的步骤(a)中。XRD显示，灭菌之后晶体形式并未改变。已经出人意料地发现，灭菌晶种在室温下于含有80％醇和20％水的溶液中是稳定的。但是，更高的醇浓度会导致晶体形式的变化。
在根据本发明的一种优选的实施方式中，将蒸汽灭菌和通过溶剂灭菌组合起来。优选地，通过温度高于100℃的蒸汽，优选大约140℃的蒸汽在烘箱中持续大约50分钟来对晶种进行灭菌。然后，将晶种悬浮于0-1000重量当量、优选为5-100重量当量的乙醇中，进行10至200分钟，优选为20至40分钟。在用于步骤(a)之前，优选地，将0-100体积当量的灭菌H2O加入，以能更好地对液体进行操作。
在根据本发明的方法的一种优选的实施方式中，晶种包含水合核黄素，尤其是单水合核黄素或二水合核黄素。优选地，当稀释的核黄素的浓度超过了较好的可溶晶体形式(其可能是二水合核黄素(取决于温度))的溶解度极限时，在步骤(a)将晶种加入到发酵培养液中。在二水合核黄素和脱水核黄素I的溶解度极限之上，存在脱水核黄素I的亚稳态区域。
脱水核黄素I的自发结晶并不发生。优选地，接种进行于36℃和43℃之间的温度、发酵培养液中核黄素浓度为0.16g l-1至0.23g l-1的条件下。
在根据本发明的方法的步骤(b)中，分离出核黄素的第一种晶体形式。这意味着，当步骤(a)已经从发酵罐中含有的粗反应浆体开始进行时，优选地，生物物质中的大部分都被从反应浆体中移出。优选地，通过清洗来分离核黄素的第一种晶体形式，即，通过将上层物质与沉淀物分离(生物物质分离)。根据本发明的方法的步骤(b)通常不会导致纯核黄素的分离。通常，经过分离的核黄素的第一种晶体形式仍含有杂质，其必须在后续纯化步骤中被分离。本发明特别涉及对这些杂质的去除。
在根据本发明的方法的一种优选的实施方式中，对在步骤(a)中沉淀出的和在步骤(b)中分离出的第一种晶体形式进行巴氏灭菌，优选地，在步骤(b)之后，但是优选在步骤(c)之前进行。优选地，通过加热核黄素的第一种晶体形式来进行巴氏灭菌，所述第一种晶体形式是在步骤(b)中较早时候与反应物中含有的生物物质的量中的大部分分离的。在一种优选的实施方式中，在40℃至80℃范围内的温度、优选从60至75℃范围内的温度下来进行巴氏灭菌。优选地，巴氏灭菌进行于酸性条件下。优选地，巴氏灭菌进行于低于6的pH值下，更优选地，低于4的pH下。可加入到核黄素的第一种晶体形式的水性悬浮液中的优选的酸是无机酸，优选地，硫酸或硝酸；或有机酸，优选地，羧酸，最优选地，蚁酸或草酸。
在根据本发明的方法的步骤(c)中，在能使稀释的DNA分解的条件下，将核黄素的第一种晶体形式转化为核黄素的第二种晶体形式。在环境温度(优选为23℃)下，核黄素的第一种晶体形式在热力学上不如核黄素的第二种晶体形式稳定，这是根据本发明的方法的必要特征。优选地，在高于环境温度的温度下，核黄素的第一种晶体形式在热力学上也不如核黄素的第二种晶体形式稳定。
通过在发酵罐中使用经过遗传修饰的微生物，发酵培养液中可存在有重组DNA(rDNA)。取决于最终产物所需要的规格，重组DNA需在下游期间，以及，尤其是纯化步骤期间，被完全去除或分解。在本说明书中，术语“DNA”包括：被包括于核黄素晶体中的、被吸附于核黄素晶体表面的以及与核黄素晶体接触被稳定的任何类型的DNA(例如，天然的或重组DNA)。
可通过标准PCR(聚合酶链式反应)来监测核黄素产物中DNA的含量。现有技术中基于PCR的分析工具可被用于检测给定的rDNA的序列(例如，含有200个碱基对的生产株(production strain)的DNA的特定序列)与色谱分析方法(例如，气相或液相色谱)相比，PCR的灵敏度高若干数量级。检测极限取决于多种参数，例如，循环的数量、引物的类型、聚合酶的种类等。关于伴随结晶核黄素的给定序列的rDNA而言，PCR的特异性检测极限是大约0.2ppb。在根据本发明的方法的一种优选的实施方式中，核黄素晶体中，具有给定长度的碱基对(bp)(优选地，50至10000bp，更优选地，100至1000bp，最优选地，大约200bp)的DNA的含量被降低到大约0.2ppb的检测极限之下。
能使稀释的DNA分解的条件是本领域内已知的。在高于10-4至10-3mol l-1的浓度的酸存在的情况下，在升高的温度下，稀释的DNA可被迅速地完全分解(参见，DNA的分解对pH值的依赖性展示于Lindahl T.andNyberg B.；Rate of Depurination of Native Deoxiribonucleic Acid；Biochemistry，11，19(1972)3610-3618中)。已有报道，60℃时，浓度为大约10-3mol l-1的柠檬酸能使DNA在一小时内分解(参见，Schriftenreihe des Fonds derChemischen Industrie zu Forderung der Chemie und Biologischen Chemie imVerband der Chemischen Industrie e.V.；60329 Frankfurt；Karlstrasse 21；Heft32，Informationsband″Sicherheitsforschung in der Biotechnologie″)。
在根据本发明的方法的一种优选的实施方式中，步骤(c)中能分解DNA的条件是酸性条件。优选地，通过将酸加入到含有0.5-50wt.-％，优选2-10wt.-％核黄素的水性浆体中悬浮的核黄素的第一种晶体形式中来获得酸性条件。在一种优选的实施方式中，酸是选自由硫酸、硝酸、磷酸、氢氯酸、氢溴酸所组成的组的无机酸或选自由乙酸、蚁酸和草酸所组成的组的有机酸。优选地，水性浆体中的酸浓度应高于10-4mol-1，优选在10-4至10-1mol l-1之间，最优选为大约5x10-4mol l-1。优选地，水性浆体的pH值应低于6，更优选地，低于5，最优选地，低于4。
在根据本发明的方法的另一种优选的实施方式中，步骤(c)中能分解DNA的条件是碱性条件。优选地，通过将碱加入到含有0.5-50wt.-％，优选2-10wt.-％核黄素的水性浆体中悬浮的核黄素的第一种晶体形式中来获得碱性条件。在一种优选的实施方式中，碱是选自由NaOH、KOH和Ca(OH)2所组成的组的无机碱。优选地，水性浆体中的碱浓度应高于10-4mol-1，优选在10-4至10-1mol l-1之间，最优选为大约5x10-4mol l-1。优选地，水性浆体的pH值应高于8，更优选地，高于9，最优选地，高于10。
理论上，当含有DNA分子的水溶液被暴露给能分解DNA的条件时，DNA链能被迅速分解。但是，如果DNA没有完全溶解的话，例如，如果DNA被吸附到表面上或被包括于晶格(包藏，occlusion)中时，DNA的分解会受到抑制。
已有报道，DNA可被表面吸附或被稳定于表面上。已进行了研究，以对能吸附DNA的不同载体加以评估。需要有足够强的吸附以抵抗原子力显微镜尖端(tip)的引力。吸附的性质和强度还取决于存在的离子。具体而言，二价阳离子，例如Mg2+和Ca2+会影响到稳定性(参见，Bezanilla etal.；Adsorption of DNA to Mica，Silylated Mica，and Minerals：Characterizationby Atomic Force Microscopy；Langmuir 11(1995)655-659)。其它研究揭示，被吸附于表面上的来自bacillus subtilis的DNA可被稳定至甚至能抵抗核酸酶攻击的程度。稳定作用的程度受周围环境组分的影响，例如，受一价或二价离子浓度的影响。低pH值看上去具有更强的稳定作用(参见，Khanna M.；Yoder M.；Calamay L.and Stotzky G.；X-ray diffractometry andelectron microscopy of DNA from Bacillus subtilis bound on clay minerals；Sciences of soils(1998)3：1)。
已令人惊奇地发现，对DNA杂质(尤其是伴随核黄素晶体的rDNA)的分解很大程度上依赖于核黄素的晶体形式的性质。发酵期间沉淀出脱水核黄素I的情况下对rDNA的分解是特别困难的，但是如果发酵期间形成二水合核黄素的话，在下游过程中分解rDNA就相当迅速了。不希望受限于任何理论，假设从获得的细胞中释放出的rDNA与核黄素晶体在很大程度上相关。
核黄素的晶体形式的性质对下游纯化方法的效率有着巨大的影响，尤其是影响将重组DNA分解至低于分析方法(例如PCR)的检测极限的过程。具体而言，在对核黄素的纯化期间，当在纯化条件下由于核黄素的第一种晶体形式的转化破坏了晶格时，伴随核黄素晶体的重组DNA可被迅速分解。令人吃惊地发现了核黄素的新的晶体形式，即二水合核黄素。二水合核黄素优选形成于发酵过程期间，在纯化期间其可转化为环境温度下热力学上更加稳定的核黄素的第二种晶体形式。建立起必要的数据，以控制想要的晶体形式的形成。在现有技术中的方法中，晶体形式不会改变。基于这些发现，发现了用于纯化核黄素的更为有效的新方法，尤其是关于从晶体中去除重组DNA的方面。
在根据本发明的方法的一种优选的实施方式中，步骤(a)中沉淀出的核黄素的第一种晶体形式是二水合核黄素。在步骤(b)中，分离出沉淀的二水合核黄素，优选地，通过倾析出生物物质中的大部分，以及，可选地，巴氏灭菌。现在已观察到，当将分离出的结晶二水合核黄素悬浮于水中，并将浆体加热至高于70℃的温度，粘度就会显著增加。高速搅拌数分钟后，高粘度可被降低。
通过X射线粉末衍射可对下述问题加以验证：通过所述处理，结晶二水合核黄素转化为脱水核黄素I。此外，晶体修饰型从短针(10至20μm)变为长针(50至200μm)。长针的形成导致粘度显著增加。悬浮液中二水合核黄素的转化的结果是晶格的完全破坏，其后立即发生核黄素分子重结晶为结晶脱水核黄素I的过程。杂质，尤其是DNA获得释放，并被完全释出，被稀释至周围培养基中。存在有小量酸的情况下(优选地，pH低于4)，DNA在相当低的温度下迅速分解，至低于传统PCR的检测极限；在50至70℃和低于4的pH下，10至30分钟内，核黄素晶体中就检测不到DNA，尤其是rDNA了。
在根据本发明的方法的一种优选的实施方式中，步骤(c)中核黄素的第一种晶体形式向核黄素的第二种晶体形式的转化在升高的温度下进行，优选在60℃至75℃之间的温度，最优选在大约70℃。优选地，转化进行于酸性条件下，最优选进行于低于4的pH下。
在根据本发明的方法的一种优选的实施方式中，步骤(c)进行于60℃至75℃之间的温度下，其中使用
(i)无机酸，优选为H2SO4、HNO3、HCl、HBr或H3PO4；或
(ii)碱，优选为NaOH、KOH或Ca(OH)2；或
(iii)有机酸，优选为蚁酸、乙酸、草酸或柠檬酸。
在根据本发明的方法的一种优选的实施方式中，步骤(c)中，含有核黄素的第一种晶体形式的水性浆体被转移至装备有叶轮搅拌器的反应器中。然后，优选地，加入足够量的无机酸或有机酸。升高温度，优选通过夹套设备(jacket)进行，优选将温度升高至60℃至75℃之间，最优选为大约70℃。叶轮搅拌器的搅拌速度设定为大约500rpm。一旦粘度增加，搅拌速度也增加，优选至多达大约2000rpm，以使浆体重新液化。经过约20分钟的处理之后，对浆体进行过滤，通过XRD来分析获得的晶体，通过PCR来分析rDNA的含量。
或者，生物物质分离和巴氏灭菌之后，可对含有核黄素的第一种晶体形式的浆体进行酸化，并将其不断泵入搅拌多级提取器(stirred multistageextractor)中。在搅拌多级提取器中的驻留时间(其优选为5至20分钟)可被泵入速率所确定。优选地，提取器可被夹套设备加热至大约70℃的理想温度。
在根据本发明的方法的一种优选的实施方式中，步骤(c)中，在进入搅拌多级提取器之前，先通过热交换器将含有核黄素的第一种晶体形式的浆体预热至大约70℃。热交换器能在数秒内加热浆体。优选地，核黄素的第一种晶体形式被连续泵过热交换器，以迅速获得需要的温度，并且，优选地，进一步被泵过装备有夹套加热的管和多级搅拌系统，以施加足够高的剪切力。装备有静态混合器的反应器管也可代替搅拌多级提取器使用。
转化期间，核黄素晶体溶解，由此释放出晶体包括的或伴随晶体的DNA分子。但是，溶解的核黄素立即重新结晶为核黄素的第二种晶体形式，环境温度下(优选地，23℃或更高)其在热力学上比核黄素的第一种晶体形式更为稳定。
相反，当对含有脱水核黄素I的浆体的相应发酵液体进行加热时，没有观察到粘度上的变化。由X射线衍射所确定的结晶结构没有改变。因此，没有诱导出晶体形式的转化，也没有伴随核黄素的DNA被释放到溶液中。对脱水核黄素I而言，只有通过将浆体完全稀释于溶剂或酸化的水中才能释放出DNA。但是，在这些条件下，只有通过在高于95℃的温度下对核黄素浆体进行超过12小时的处理(或分别地，高于100℃，超过6小时；或高于120℃，超过2小时)才能使DNA分解至低于PCR检测极限的程度。
在根据本发明的方法的一种优选的实施方式中，核黄素的第一种晶体形式是水合核黄素，优选地，二水合核黄素，核黄素的第二种晶体形式是脱水核黄素I。优选地，步骤(a)中核黄素的第一种晶体形式的沉淀是通过加入晶种来控制的，更优选地，通过水合核黄素的晶种，最优选地，通过单水合核黄素的晶种或二水合核黄素的晶种。
在根据本发明的方法的一种优选的实施方式中，在步骤(a)中沉淀出二水合核黄素(核黄素的第一种晶体形式)，其再在步骤(c)中转化为脱水核黄素I(核黄素的第二种晶体形式)。在转化期间，伴随核黄素晶体的其它化合物和rDNA被释放到周围介质中。在溶液中，溶解的rDNA可被任何合适的条件或组分(例如，被能使溶解的DNA分解的无机酸或有机酸)容易地分解。
在根据本发明的方法的步骤(d)中，分离出核黄素的第二种晶体形式。优选地，通过过滤、离心和倾析分离出核黄素的第二种晶体形式。优选地，用冷的乙醇或乙醇与水的混合物来洗从步骤(d)获得的晶体，然后进行干燥。
本发明涉及用于对核黄素进行纯化和结晶的有效方法，其中，(重组)DNA被分解至低于传统PCR的检测极限。在一种优选的实施方式中，本方法包括合适晶种的形成和灭菌，优选地，单水合核黄素或二水合核黄素晶种。在一种优选的实施方式中，核黄素的第一种晶体形式，优选地，二水合核黄素的沉淀，在发酵罐中由所述晶种初始化。此外，本方法包括：通过在能使稀释的DNA分解的条件下，将核黄素的第一种晶体形式(优选地，二水合核黄素)转化为核黄素的第二种晶体形式(优选地，脱水核黄素I)来除去伴随核黄素的第一种晶体形式的DNA分子。优选地，核黄素的第一种晶体形式向核黄素的第二种晶体形式的转化是通过在存在酸的情况下对悬浮的核黄素的第一种晶体形式加热来进行的。酸的浓度优选大于10-4mol l-1，溶液的pH值优选低于6，更优选低于5，最优选低于4。
核黄素的不同晶体形式，特别是脱水核黄素II、脱水核黄素III、二水合核黄素和四水合核黄素可被用于人和动物营养以及动物健康和人类健康的领域。
下述实施例对根据本发明的方法进行了进一步的阐述。
实施例1 通过DVS和X射线衍射进行分析
通过组合的DVS-重量分析和组合的DVS-x射线衍射，来对修饰型B/C(如EP-A 995 749所述；相应于单水合核黄素)的样品进行研究，如图3所示。将样品置于环境温度和52％的相对湿度(水蒸气)下。在两种组合方法中，相对湿度(RH)不断增长，直到达到大约96％的相对湿度。然后，相对湿度持续降低至0％。然后，湿度重新增加至52％，以达到起始点。循环第二次重复。
取决于水蒸气的增加或减少的晶体结合水的吸收及释放存在滞后。滞后可被解释为：在增加相对湿度期间动力学确定的吸收和降低相对湿度期间结晶水的延迟释放。
下面列出了核黄素的晶体形式中包含的导致不同水合物产生的水的理论量：
从脱水核黄素到单水合核黄素：4.79wt.-％
从脱水核黄素到二水合核黄素：9.57wt.-％
从脱水核黄素到三水合核黄素：14.36wt.-％
从脱水核黄素到四水合核黄素：19.15wt.-％
平行扫描X射线衍射显示，至少存在三种明显不同的关于晶体形式的谱，其存在于不同的相对湿度范围下：
范围               晶体形式
0％RH              脱水核黄素II
20＜RH＜75％       单水合核黄素
90-20％            二水合核黄素
脱水核黄素II显示出不同于脱水核黄素I的X射线衍射图。因此，其可被鉴定为脱水核黄素I的真实的多晶型体。通过增加相对湿度，结晶结构变为单水合核黄素。在相对湿度接近20％时，单水合核黄素的结构仍能被建立起来。如在几乎全干的海绵中一样，核黄素晶体晶格中仅有一些位置被水分子所占据。通过增加相对湿度来填充这些位置。超过大约75％的相对湿度时，晶体结构突然再次改变，变为二水合核黄素的结构，这发生于针对单水合核黄素的理论量的水被吸收之前。超过75％的相对湿度时，水被迅速包括进二水合核黄素的结构中。在大约92％的相对湿度下，水吸收达到9.57wt.-％的吸收值，其对应于二水合核黄素。
通过降低相对湿度使水不断释放。二水合核黄素的结构保持完整，直至达到20％的相对湿度。在20％的相对湿度处，二水合结构仍含有1.3mol水/mol核黄素。然后，结构直接变化为脱水核黄素II。
通过Raman光谱可以清楚地区分开三种不同的晶体形式。
按照与分析样品“B/C”相同的方法，通过DVS，图4来分析核黄素的晶体形式的第二份样品。根据US 2603633，该样品显示出的晶体形式可被命名为C型。
在下列范围中可以鉴定出两种不同的晶体形式：
范围               晶体形式
0％＜RH            脱水核黄素III
50％＜RH＜90％     四水合核黄素
四水合核黄素的结构已知为C型(修饰型)。脱水核黄素III是新的晶体形式，其是除了脱水核黄素I和脱水核黄素II之外的第三种脱水修饰型。其X射线衍射图不同于其它所有核黄素的晶体形式的衍射图。
实施例2 测定溶解度和过饱和的方法
实验在热流热量器中进行。用浊度传感器(turbidity sensor)来监测通过加热进行稀释和通过冷却进行结晶的过程。将36mg脱水核黄素I的晶体或60mg单水合核黄素的晶体形式或120mg二水合核黄素的晶体分别悬浮于发酵溶液中，并以0.1℃/分钟的速率加热至80℃。温度被保持60分钟。然后将系统再冷却至20℃，冷却速率为0.1℃/分钟。
在39℃，过饱和度的函数关系曲线仅是温度的较弱的函数。因此，用另一种方法(方法B)来测定39℃时的过饱和：通过加热至69℃，令420mg四水合核黄素的晶体悬浮并完全溶解。核黄素的浓度为0.6mg ml- 1。再次冷却至39℃之后，温度保持恒定。3小时后，结晶缓慢开始(参见图2)。
用360mg四水合核黄素的晶体(相应于0.7mg ml-1)来进行同样的实验，仍在46℃时获得了自发结晶。
由此可以推断出，在39℃时，过饱和曲线低于0.6mg ml-1。
实施例3 制备晶种、灭菌及接种
在烘箱中于140℃对500mg单水合核黄素的晶体进行50分钟的灭菌，将晶体悬浮于5ml乙醇中，10-200分钟，优选为20-40分钟，在诱导(induction)之前加入10ml灭菌水，用于更好地对液体进行操作。6小时后通过带针的灭菌瓶将悬浮液加入到生物反应器中。二水合核黄素的晶体形成，在培养物中留下单水合的(monoseptic)。从上述实验中可以推断出，将晶体修饰型引导为二水合核黄素是可能的。
在经过诱导和未经过诱导的培养物中对核黄素的可溶部分进行的测量显示了很大的区别：在未经过诱导的培养物中，6-9小时后获得过饱和的溶液。然后溶解度在1小时内显著降低。在经过诱导的培养物的情况下未观察到该现象。核黄素的溶解度(大约0.4gl-1)未过量。通过x射线衍射可对灭菌过程期间晶体晶体形式是否发生变化加以控制。
实施例4 通过分批操作从二水合核黄素的核黄素晶体中去除DNA
灭菌和将生物物质中的大部分倾析之后，通过加入无机酸(优选地，硫酸、硝酸、磷酸)和/或有机酸(优选地，乙酸、蚁酸、草酸)来处理剩下的核黄素浆体，其中含有6wt.-％的核黄素晶体。加入酸后，浆体中酸的浓度为5x10-4mol l-1。对经酸化的浆体进行剧烈搅拌。
将浆体加入到带有叶轮搅拌器的1.5升反应器中。对浆体进行酸化，通过夹套设备将温度升高至高达70℃。搅拌速度设置为500rpm。粘度一上升，就将搅拌速度增至高达2000rpm，以使浆体重新液化。处理20分钟后，将浆体滤出。通过XRD对获得的晶体进行分析。通过PCR来分析rDNA的含量(参见图5)。
实施例5 通过连续操作从二水合核黄素的核黄素晶体中去除DNA
对按照实施例4进行生物物质分离和巴氏灭菌之后的浆体进行酸化，并将其持续泵入搅拌多级提取器中。通过泵入速率来确定在搅拌多级提取器中的驻留时间(5至20分钟)。可通过夹套设备将提取器加热至70℃的想要的温度。
在另外的实验中，在浆体进入到搅拌多级提取器中之前，通过热交换器将其预加热至70℃。用热交换器可在数秒内加热浆体。装备有静态混合器的反应器管可以用来代替搅拌多级提取器。
实施例6
在US 2,603,633中描述了用于制备四水合核黄素的方法。基本上，所述方法用溶剂来迅速沉淀核黄素，以获得想要的四水合物“C型”(修饰型)。通过此方法制备出的样品在95％的相对湿度下于大约10分钟内转化为二水合核黄素。
另一种制造小量四水合核黄素的方法基于对水溶液进行蒸发。下面对该过程进行了描述：
将500mg核黄素(化验＞98wt.-％，通过化学方法制造的)溶于7升去离子水中。然后在Sartorius过滤器系统(由玻璃纤维过滤器和5μTeflon过滤器组成)上对溶液进行过滤。然后在Büchi旋转瓶蒸发系统中令滤出液蒸发。在20-25mbar的真空和最高40℃的水浴温度下，将溶液持续吸入到蒸发瓶中。同时，蒸发水分。瓶中体积保持为最大200ml。在该过程的末尾开始结晶。
最后，将所有7升都吸入蒸发瓶进行蒸发。蒸发瓶中的体积通过蒸发降低至大约100ml。然后对悬浮液进行过滤，不进行额外的洗涤，在高真空下(p＜0.05mbar)，于最高35℃进行干燥。然后通过x射线衍射来分析样品，证实了四水合物的结构。然后将样品用于进一步的实验。
实施例7
对照DNA
用生产菌株的全基因组作为PCR扩增的阳性对照。使用的基因组的浓度为达到100ngμl-1。
PCR扩增
使用两种引物。如果样品含有的生产菌株的DNA的浓度高于每十亿0.2份(ppb)的话，用引物能扩增出200个碱基对(bp)的片段。
PCR程序
-初始变性
-45个如下循环：94℃，40秒
55℃，60秒
72℃，60秒
-最后，将样品置于72℃，600秒。
提取
向50mg核黄素中加入含有1％去氧胆酸盐(desoxycholate)的50mlTE-缓冲液(pH 8)。10分钟振荡之后，加入0.7ml苯酚(用TE饱和过)，再进行15分钟的振荡。相分离之后，通过色谱(MicroSpin S200，Amersham Pharmacia Biotech)对50μl水相进行纯化，以除去剩余的苯酚、去氧胆酸盐和核黄素。
鉴定
用UV活性核酸系来标记DNA，通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定扩增出的产物。

Claims (8)

1.对从DNA发酵生产的核黄素进行纯化的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)沉淀核黄素的第一种晶体形式，
(b)分离出核黄素的第一种晶体形式，
(c)在能使稀释的DNA分解的条件下，将核黄素的第一种晶体形式转化为核黄素的第二种晶体形式，以及
(d)分离出核黄素的第二种晶体形式，
其中，所述核黄素的第一种晶体形式是水合核黄素。
2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(d)的核黄素晶体中DNA的含量低于0.2ppb。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水合核黄素是二水合核黄素。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)中的核黄素的晶体形式选自脱水核黄素I。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一种晶体形式的沉淀是通过向发酵培养液中加入晶种诱导的。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述晶种选自
二水合核黄素或单水合核黄素。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)的转化之前对步骤(b)的第一种晶体形式进行巴氏灭菌。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)在60℃至75℃之间的温度下进行，其中使用选自无机酸，碱，或有机酸构成的组的溶剂来进行。
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