ES2332787T3 - Procedimiento para la purificacion de rivoflavina. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la producción de cristales de riboflavina con un contenido de ADN inferior a 0.2 ppb, que se puede medir por PCR, comprendiendo los pasos de: (a) precipitar una primera forma cristalina de riboflavina en el caldo de fermentación, (b) aislar la primera forma cristalina de riboflavina, (c) transformar la primera forma cristalina de riboflavina en una segunda forma cristalina de riboflavina en condiciones que descompongan el ADN diluido, y (d) aislar la segunda forma cristalina de riboflavina en el que la primera forma cristalina es el dihidrato de riboflavina, que es termodinámicamente menos estable a temperatura ambiente que la segunda forma cristalina de riboflavina, y en el que la precipitación de la primera forma cristalina se controla mediante la adición de cristales iniciadores al caldo de fermentación.
Description
Procedimiento para la purificación de
riboflavina.
La invención se refiere a un procedimiento para
la purificación de riboflavina (vitamina B_{2}) particularmente
adecuado para la eliminación de ADN asociado a cristales de
riboflavina.
Aunque la riboflavina se ha producido de manera
sintética en el pasado, por razones económicas los procesos
modernos de producción de riboflavina se basan en la tecnología de
fermentación. Los procesos de este tipo tienen en común que la
riboflavina la producen microorganismos y que el producto puro se
obtiene a través de pasos de purificación consecutivos partiendo de
la suspensión de reacción cruda (el caldo de fermentación) que
contiene la riboflavina.
Los procesos de fermentación para la producción
de riboflavina se conocen en el estado anterior de la técnica. Con
relación a estos se pueden consultar, por ejemplo, las publicaciones
Takata, Ryohei, Nagata, Toshiomi, Shimamoto, Sumio;
Solubility of riboflavin obtained from cultured Eremothecium
ashbyii (1949) 27, p. 8-10 y
50-52; Sen Gupta, S. B.; Gupta, H. N.;
Solubility of riboflavin (vitamin B2) in water; J. Proc. Inst.
Chemists (India)(1949) 21, p. 1-4; Chemical
Engineering, Abril 2002, p. 23; van Loon R.P.G.M. et al.;
Development of a Fermentation Process for the Manufature of
riboflavin; Chimia 50 (1996) N.º 9 p. 410-412;
EP-A 428 767; EP-A 464 582 y
DE-A 2 920 592.
La concentración de riboflavina en la
fermentadora aumenta continuamente según transcurre el proceso de
fermentación. Sin embargo, la solubilidad de la riboflavina en
soluciones acuosas es ciertamente pobre; se ha establecido que, en
soluciones acuosas neutras y a una temperatura entre 30ºC y 50ºC, la
solubilidad de la riboflavina es aproximadamente de 0.014% a 0.031%
en peso. Por lo tanto, cuando se alcanza un nivel particular de
sobresaturación durante el proceso de fermentación, la riboflavina
comienza a cristalizar de manera espontánea. Una vez se han formado
los primeros cristalitos durante el proceso de fermentación, la
riboflavina producida por la fermentación incesante cristaliza
continuamente hasta que el proceso de fermentación llega a su
fin.
En general, la suspensión de la reacción (el
caldo de fermentación) que contiene los cristales de riboflavina se
lleva al siguiente paso del procedimiento. Normalmente, la
suspensión de la reacción se pasteriza en un primer paso, es decir,
se matan los microorganismos en condiciones ácidas y a temperaturas
elevadas. En un segundo paso, la mayor parte de la biomasa se
elimina de la suspensión de la reacción decantándola. En un tercer
paso, la suspensión de la reacción se acidifica y se calienta a una
temperatura comprendida entre 95ºC y 115ºC a fin de descomponer y
eliminar las impurezas restantes (por ejemplo, biomasa, proteínas,
lípidos, ADN) hasta cierto punto, purificando así los cristales de
riboflavina. La pureza de los cristales de riboflavina aumenta
normalmente durante el tratamiento ácido desde aproximadamente un
85% hasta un 96% en peso. En un cuarto paso, se filtra y se lava la
suspensión acidificada de la reacción. Los pasos adicionales
posteriores incluyen pasos de purificación y/o pasos de formulación
para obtener la forma final del producto.
En el paso de purificación (el tercer paso) se
pueden apartar los lípidos, las proteínas, el ADN y otros compuestos
orgánicos e inorgánicos solamente hasta cierto punto. Se ha
publicado que se puede lograr una pureza de hasta 97% en peso
añadiendo 2% en peso de ácido sulfúrico u otros ácidos minerales y
calentando la suspensión de la reacción a una temperatura en el
rango de 95ºC a 105ºC.
Sin embargo, la calidad de la riboflavina
producida en los procesos de fermentación del estado anterior de la
técnica no es satisfactoria ya que el producto sigue conteniendo una
cantidad significativa de impurezas, ADN en particular. Por un
lado, la pureza de la riboflavina debería ser lo más alta posible,
en particular para fines farmacéuticos o nutricionales. Por otro
lado, sin embargo, el procedimiento de purificación debería ser
bastante simple, eficaz, cuantitativo y moderado (por ejemplo, la
riboflavina no debería someterse a temperaturas altas durante un
periodo de tiempo determinado para prevenir la formación de
productos deteriorados).
Un objeto de la invención es proporcionar un
procedimiento para la purificación de riboflavina mejorado con
respecto a los procedimientos del estado anterior de la técnica.
Este problema técnico fundamental lo ha
solucionado la materia de las reivindicaciones de la patente, es
decir el procedimiento para la producción de cristales de
riboflavina con un contenido de ADN inferior a 0.2 ppb, que se
puede medir por PCR, comprendiendo los pasos de:
- (a)
- precipitar una primera forma cristalina de riboflavina en el caldo de fermentación,
- (b)
- aislar la primera forma cristalina de riboflavina,
- (c)
- transformar la primera forma cristalina de riboflavina en una segunda forma cristalina de riboflavina en condiciones que descompongan el ADN diluido, y
- (d)
- aislar la segunda forma cristalina de riboflavina
\vskip1.000000\baselineskip
en el que la primera forma cristalina es el
dihidrato de riboflavina, que es termodinámicamente menos estable a
temperatura ambiente que la segunda forma cristalina de riboflavina,
y en el que la precipitación de la primera forma cristalina se
controla mediante la adición de cristales iniciadores al caldo de
fermentación.
El término "temperatura ambiente" indica
una temperatura ambiente media, preferiblemente de 23ºC.
Se ha descubierto de manera sorprendente que se
puede reducir considerablemente el contenido de ADN de los
cristales de riboflavina mediante dicho procedimiento, es decir, a
un nivel inferior al límite de detección del análisis de PCR
convencional (aproximadamente 0.2 ppb).
Este procedimiento de purificación de
riboflavina se puede llevar a cabo en condiciones (temperatura,
tiempo de residencia, concentración de ácido, etc.) mucho más
moderadas que las de los procedimientos del estado anterior de la
técnica, en los que no se transforma una primera forma cristalina de
riboflavina en una segunda forma cristalina de riboflavina.
La invención se basa en el descubrimiento
fortuito de que la cristalización de la riboflavina durante la
fermentación genera diferentes formas cristalinas (modificaciones)
dependiendo de las condiciones de la fermentadora. El análisis de
los cristales de riboflavina en el caldo de fermentación desveló que
en algunos lotes precipitaba un anhidrato (es decir anhidrato de
riboflavina I) y en otros un hidrato (es decir dihidrato de
riboflavina). En otros lotes se encontraron mezclas de ambas formas
cristalinas. Se identificó incluso una tercera forma cristalina (es
decir tetrahidrato de riboflavina) en algunos casos. Estas formas
cristalinas, es decir los hidratos y anhidratos de riboflavina, se
caracterizaron por difracción de rayos X en polvo (XRD) y sorción
dinámica de vapor (DVS). Se investigaron las solubilidades de las
diferentes formas cristalinas por espectroscopía Raman. La
combinación de la DVS con la XRD permite investigar la formación de
los hidratos.
Se ha descubierto que tres modificaciones
cristalinas anhidras diferentes (anhidratos de riboflavina I, II y
III) están en equilibrio con diferentes hidratos de riboflavina
(monohidrato, dihidrato y tetrahidrato de riboflavina).
Dependiendo de la temperatura, las siguientes
formas cristalinas están en equilibrio entre sí o se transforman de
manera irreversible unas en otras en condiciones establecidas (de
por ejemplo temperatura, humedad, etc.):
anhidrato de riboflavina I con dihidrato de
riboflavina y tetrahidrato de riboflavina; anhidrato de riboflavina
II con monohidrato de riboflavina y dihidrato de riboflavina;
anhidrato de riboflavina III con tetrahidrato de riboflavina.
A los 23ºC, el estado del anhidrato de
riboflavina I y del dihidrato de riboflavina se puede representar
de la siguiente manera:
\vskip1.000000\baselineskip
A los 23ºC, el equilibrio entre el anhidrato de
riboflavina I y el dihidrato de riboflavina está completamente
inclinado del lado del anhidrato de riboflavina I, es decir, a esta
temperatura el dihidrato de riboflavina se transforma
irreversiblemente en anhidrato de riboflavina I. Por lo tanto, a los
23ºC no se puede obtener dihidrato de riboflavina a partir de
anhidrato de riboflavina I puro. Además, a temperaturas más altas,
por ejemplo a 39ºC, el dihidrato de riboflavina es
termodinámicamente menos estable que el anhidrato de riboflavina
I.
A los 23ºC, la cinética de transformación del
dihidrato de riboflavina en anhidrato de riboflavina I es bastante
lenta. Al agitar una suspensión que contiene dihidrato de
riboflavina puro a una temperatura de 23ºC se logra una
transformación parcial en anhidrato de riboflavina I (del 80%) en 11
días (determinado por espectroscopía Raman). A los 39ºC, las
diferencias entre las solubilidades o los potenciales químicos son
pequeñas. Por lo tanto, la transformación de dihidrato de
riboflavina en anhidrato de riboflavina I a esta temperatura es
lenta.
A temperaturas más altas, la diferencia entre
los potenciales químicos del anhidrato de riboflavina I y el
dihidrato de riboflavina aumenta. Por lo tanto, la velocidad del
proceso de transformación aumenta considerablemente ya que el
dihidrato de riboflavina se transforma por completo en anhidrato de
riboflavina I en 20 segundos a 80ºC.
Sin embargo, a los 4ºC, la situación
termodinámica es diferente. En una suspensión acuosa, el anhidrato
de riboflavina I se puede transformar en dihidrato de riboflavina,
pudiéndose obtener este último a partir del tetrahidrato de
riboflavina de manera irreversible (particularmente a temperaturas
más altas):
A los 4ºC, la cinética de transformación del
anhidrato de riboflavina I en dihidrato de riboflavina es muy
lenta. Al agitar una suspensión que contiene solamente anhidrato de
riboflavina I a una temperatura de 4ºC se logra una transformación
parcial de anhidrato de riboflavina I en dihidrato de riboflavina
(del 80%) en 56 días.
La investigación de la solubilidad de las formas
cristalinas, la del anhidrato de riboflavina I, dihidrato de
riboflavina y tetrahidrato de riboflavina en concreto, reveló de
manera sorprendente que por debajo de aproximadamente 40ºC las
líneas de solubilidad están muy cerca unas de otras. A una
temperatura concreta en el rango de los 4ºC y los 23ºC, la energía
libre de Gibbs (\DeltaG) de las formas cristalinas del anhidrato
de riboflavina I y del dihidrato de riboflavina es la misma. A una
temperatura concreta dentro de dicho rango de temperatura, las
líneas de solubilidad del anhidrato de riboflavina I y del dihidrato
de riboflavina se cruzan. A temperaturas por encima del cruce, el
anhidrato de riboflavina I es la forma cristalina más estable
desde el punto de vista termodinámico (la energía libre de Gibbs es
menor); a temperaturas por debajo del cruce, el dihidrato de
riboflavina es la forma cristalina más estable desde el punto de
vista termodinámico.
A los 23ºC, existe también un equilibrio entre
el anhidrato de riboflavina II, el monohidrato de riboflavina y el
dihidrato de riboflavina, el cual depende de la humedad relativa.
Además, dependiendo de la misma manera de la humedad relativa, a
los 23ºC el anhidrato de riboflavina III se puede transformar de
manera reversible en tetrahidrato de riboflavina:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades de las formas cristalinas de la
riboflavina, en particular la solubilidad y la cristalización
espontánea, se han investigado cuidadosamente (ver Ejemplo 1). Los
resultados se resumen en las figuras 1 y 2. Se investigaron la
solubilidad del dihidrato de riboflavina en el rango de temperatura
de 44ºC a 52ºC y la cristalización espontánea de la riboflavina en
el rango de temperatura de 44ºC a 59ºC. La extrapolación de las
líneas de sobresaturación hasta los 39ºC muestra que las líneas de
sobresaturación del anhidrato de riboflavina I y del dihidrato de
riboflavina se acercan bastante una a otra. En otro experimento, la
riboflavina se disolvió a una concentración de 0.7 g l^{-1} y a
una temperatura de 69ºC. El enfriamiento continuo de la solución
hasta los 39ºC en 3 h supuso la cristalización del anhidrato de
riboflavina I. A 39ºC el dihidrato de riboflavina es
termodinámicamente menos estable que el anhidrato de riboflavina I.
Se puede estimar que la posición de la línea de sobresaturación del
anhidrato de riboflavina I a 39ºC estará por encima de 0.6 g
l^{-1}. Por lo tanto, se puede controlar la formación de la forma
cristalina de la riboflavina en la zona metaestable entre las
líneas de sobresaturación y solubilidad inyectando cristales
iniciadores de la forma cristalina que se
desee.
desee.
Los difractogramas de polvo de las formas
cristalinas del anhidrato de riboflavina I, anhidrato de riboflavina
II, anhidrato de riboflavina III, monohidrato de riboflavina,
dihidrato de riboflavina y tetrahidrato de riboflavina se exponen
en la figura A-F.
En cuanto a la terminología del campo de la
cristalografía (por ejemplo el significado de los términos "forma
cristalina", "polimorfismo", "polimorfo", etc.), esta
se puede consultar en, por ejemplo, "Solid State Chemistry of
Drugs; Stephen R. Byrn, Ralph R. Pfeiffer, Joseph G. Stowell:
SSCI Inc. West Lafayette; 1999".
Los anhidratos son formas cristalinas que no
contienen agua cristalina, sobretodo en entornos exentos de agua.
El anhidrato de riboflavina I es un polimorfo de la riboflavina que
se caracteriza por el difractograma de rayos X de la figura A. En
agua de vapor el anhidrato de riboflavina II se encuentra en
equilibrio con el monohidrato y el dihidrato de riboflavina. En
agua de vapor el anhidrato de riboflavina III se encuentra en
equilibrio con el tetrahidrato de riboflavina.
Los hidratos son formas cristalinas que
contienen agua cristalina. En agua de vapor el monohidrato de
riboflavina (ver figura D) está en equilibrio con el anhidrato de
riboflavina II y el dihidrato de riboflavina. El dihidrato de
riboflavina se caracteriza por el difractograma de rayos X de la
figura E. En agua de vapor el tetrahidrato de riboflavina (ver
figura F) está en equilibrio con el anhidrato de riboflavina
III.
Se conocen diversas modificaciones de la
riboflavina cristalina del estado anterior de la técnica. En
relación a estas se pueden consultar, por ejemplo, las
publicaciones EP-A 995 749, US 2 324 800, US 2 603
633, US 2 797 215, US 4 687 847 y la base de datos International
Centre of Diffraction Data (2002 JCPDS; PCPDFWIN v. 2.2; datos
presentados por Eli Lilly and Company, Indiana, EE. UU., 1995).
Al igual que en el estado anterior de la
técnica, la nomenclatura de las formas (modificaciones) cristalinas
de la riboflavina no es unitaria y se plasman los diferentes
términos empleados en la tabla a continuación:
En el paso (a) del procedimiento según la
invención precipita, es decir cristaliza, una primera forma
cristalina de riboflavina. Preferiblemente se lleva a cabo el paso
(a) partiendo de la suspensión de reacción cruda producida por los
microorganismos en una fermentadora (el caldo de fermentación). Los
microorganismos adecuados incluyen organismos que no han sido
modificados genéticamente (O-no-MG)
y organismos modificados genéticamente (OMG). El proceso de
fermentación puede realizarse de manera continua o como un proceso
por lotes, prefiriéndose este último. Normalmente, la cantidad de
agua en la fermentadora no es suficiente para mantener disuelto todo
el producto de riboflavina. Por lo tanto, solo se mantiene en
solución la cantidad de riboflavina que se obtiene al principio del
todo del proceso de fermentación, pero según avanza la fermentación,
cuando se alcanza un nivel particular de sobresaturación, la
riboflavina comienza a cristalizar de manera espontánea. Por lo
general, la cristalización comienza bastante antes de que termine
el proceso de fermentación. De este modo, al final del proceso ha
precipitado la mayoría del producto en forma de riboflavina
cristalina (primera forma cristalina de riboflavina) y solo se
queda en solución una cantidad relativamente pequeña de
riboflavina.
El procedimiento de la invención requiere que, a
temperatura ambiente (preferiblemente a 23ºC o más alta), la
primera forma cristalina de riboflavina sea termodinámicamente menos
estable que la segunda forma cristalina de riboflavina, que se
genera en el paso (c). Esto no quiere decir que el mismo paso (a)
tenga que llevarse a cabo a temperatura ambiente, simplemente
indica en qué condiciones se debe comparar la estabilidad
termodinámica de las respec-
tivas formas cristalinas de riboflavina. Preferiblemente, el paso (a) se realiza a una temperatura por debajo de 40ºC.
tivas formas cristalinas de riboflavina. Preferiblemente, el paso (a) se realiza a una temperatura por debajo de 40ºC.
Por un lado, se debe prevenir que la forma
cristalina de riboflavina que precipita en el paso (a) sea la forma
termodinámicamente más estable de riboflavina cristalina a
temperatura ambiente, ya que si esto ocurriese no sería posible
transformarla en una segunda forma cristalina que fuese
termodinámicamente más estable a temperatura ambiente. Por otro
lado, la primera forma cristalina de riboflavina debería poder
obtenerse con la precipitación controlada y debería poder tolerar
las condiciones de la fermentación y un paso opcional de
pasterización consecutivo. Cualquier forma cristalina que muestre
estas propiedades permite una purificación eficaz de la
riboflavina, en particular una reducción significativa de la
concentración de ADN en los cristales de riboflavina del paso
(c).
En el procedimiento según la invención, la
primera forma cristalina de riboflavina, que precipita en el paso
(a), comprende un dihidrato de riboflavina.
Dependiendo de las condiciones de reacción en el
paso (a), la primera forma cristalina de riboflavina que precipita
espontáneamente en el caldo de fermentación puede o no ser la
primera forma cristalina de riboflavina deseada. Por lo tanto, es
necesario controlar la forma del precipitado de riboflavina
cristalina que precipita en el paso (a), es decir producirla
preferiblemente en el transcurso del proceso de fermentación.
Se ha descubierto de manera sorprendente que en
el paso(a) la formación en la fermentadora de la primera
forma cristalina de riboflavina deseada se puede controlar
iniciando la cristalización por medio de cristales iniciadores con
una estructura cristalina concreta. La adición de cristales
iniciadores adecuados al caldo de fermentación causa la
precipitación de una primera forma cristalina de riboflavina
definida. Por lo tanto, la precipitación de la primera forma
cristalina de riboflavina se realiza por medio de cristales
iniciadores adecuados y seleccionados.
La iniciación de la cristalización por medio de
cristales iniciadores (inyección) es una técnica conocida con la
cual se puede influenciar la forma del producto a cristalizar. En
relación a esto se puede consultar, por ejemplo, la publicación
Crystallization Technology Handbook; A. Mersmann; Marcel
Decker, Inc.; 1995.
En el procedimiento según la invención, se
inicia la precipitación de la primera forma cristalina de
riboflavina en el paso (a) por medio de cristales iniciadores,
preferiblemente por medio de cristales iniciadores de riboflavina.
Preferiblemente los cristales iniciadores comprenden cristales
iniciadores de un hidrato de riboflavina, de manera aun más
preferible de monohidrato de riboflavina, dihidrato de riboflavina o
tetrahidrato de riboflavina. Más preferiblemente los cristales
iniciadores de riboflavina comprenden monohidrato de
riboflavina.
La primera forma cristalina de riboflavina que
precipita en el paso (a) es el dihidrato de riboflavina, que se
obtiene por medio de cristales iniciadores adecuados. La primera
forma cristalina de riboflavina es el dihidrato de riboflavina,
cuya precipitación se controla preferiblemente por medio de
cristales iniciadores de monohidrato de riboflavina.
Se ha descubierto de manera sorprendente que los
cristales iniciadores de monohidrato de riboflavina son adecuados
para la precipitación de dihidrato de riboflavina. Cuando se ponen
en contacto cristales de monohidrato de riboflavina con agua, la
riboflavina disuelta en una solución acuosa sobresaturada (caldo de
fermentación) precipita inmediatamente en la forma cristalina de
dihidrato de riboflavina. La investigación de la naturaleza de las
formas cristalinas desveló que el monohidrato de riboflavina
cristalina se transforma rápidamente en dihidrato de riboflavina
cristalina en dispersiones acuosas.
En una realización preferida de la invención,
los cristales iniciadores se añaden al caldo de fermentación
pasadas de 2 a 10 h, preferiblemente pasadas de 4 a 7 h.
Preferiblemente, los cristales iniciadores se transfieren a la
fermentadora desde un frasco estéril por medio de una jeringa.
Se conoce un procedimiento para la preparación
de monohidrato de riboflavina cristalina a través del estado
anterior de la técnica (ver EP-A 995 749 -
modificación B/C).
El dihidrato de riboflavina cristalina se puede
producir añadiendo cristales iniciadores de monohidrato de
riboflavina a una solución acuosa sobresaturada de riboflavina,
preferiblemente a un valor de pH de 5-8, aun más
preferiblemente a un valor de pH de 6.5-7. Un
aspecto de la invención se refiere al dihidrato de riboflavina.
Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la
preparación de dihidrato de riboflavina cristalina, en el cual se
añade monohidrato de riboflavina cristalina a una solución acuosa
saturada de riboflavina.
El procesamiento posterior para obtener
cristales iniciadores adecuados de monohidrato, dihidrato y
tetrahidrato de riboflavina cristalina se describe aquí debajo.
Para lograr una precipitación correcta de la
primera forma cristalina de riboflavina deseada en el paso (a) del
procedimiento según la invención se requiere que los cristales
iniciadores sean de la forma cristalina deseada, preferiblemente de
monohidrato, dihidrato o tetrahidrato de riboflavina, de manera aun
más preferible de monohidrato o dihidrato de riboflavina. Además,
los cristales iniciadores deberían ser estériles para no contaminar
el proceso de fermentación con organismos externos.
Los cristales iniciadores de riboflavina se
pueden preparar en fermentadoras de iniciadores o en otro reactor
adecuado. La riboflavina que se introduce como material de partida
en las fermentadoras de iniciadores se debe diluir por completo.
Cualquier impureza, es decir cualquier cristal de una forma
cristalina indeseada sin disolver, normalmente supondrá después una
precipitación de esta misma forma cristalina indeseada en el paso
(a) del procedimiento, dando lugar así a un intermedio indeseado (es
decir, la primera forma cristalina de la riboflavina). En concreto,
cualquier impureza de anhidrato de riboflavina I en los cristales
iniciadores dará lugar, de manera inevitable, a la precipitación de
anhidrato de riboflavina I durante el proceso de fermentación y,
por lo tanto, estas deben evitarse.
En una realización preferida de la invención,
los cristales iniciadores de riboflavina se encuentran en forma de
monohidrato de riboflavina. La preparación se inicia preferiblemente
a partir del monohidrato de riboflavina (ver EP-A
995 749). Después, se suspenden los cristales de monohidrato de
riboflavina en agua a una temperatura entre 2ºC y 40ºC,
preferiblemente entre 10ºC y 20ºC, y el monohidrato de riboflavina
se transforma en dihidrato de riboflavina en estas condiciones. Se
filtran los cristales y se secan para eliminar el agua de la
superficie. El triturado de los cristales incrementa la superficie
específica, que conllevará una tasa de nucleación más alta en el
paso (a) tras su introducción en el caldo de fermentación. Los
cristales triturados se lavan después con etanol puro o con una
mezcla de agua y etanol.
Preferiblemente, los cristales iniciadores de
riboflavina se esterilizan antes de usarse en el paso (a) del
procedimiento según la invención. Preferiblemente los cristales
iniciadores se esterilizan mediante esterilización por vapor o por
disolvente, preferiblemente una mezcla de etanol y agua, de la
manera más preferible una mezcla de etanol
al >70% y agua.
al >70% y agua.
Si los cristales inciadores se esterilizan por
vapor, los cristales de monohidrato o dihidrato de riboflavina
secos se transfieren a un sistema cerrado. Se calientan los
cristales en este sistema a temperaturas comprendidas entre 110ºC y
150ºC, preferiblemente entre 120ºC y 140ºC y preferiblemente durante
aproximadamente 30 min. En una realización preferida del
procedimiento según la invención, se esterilizan por vapor los
cristales de un hidrato de riboflavina, de manera más preferible de
monohidrato o dihidrato de riboflavina, a una temperatura de
preferiblemente 120-140ºC. Se ha descubierto de
manera sorprendente que la forma cristalina de los cristales
iniciadores no cambia en estas condiciones.
Otra posibilidad es la esterilización por
disolvente. Se puede realizar un segundo procedimiento de
esterilización añadiendo un disolvente, por ejemplo un alcohol o
una cetona, prefiriéndose la adición de etanol o metanol. Ya que
los cristales iniciadores de riboflavina son prácticamente
insolubles en el disolvente, se forma una suspensión que se filtra
para eliminar el disolvente. Se lavan los cristales húmedos con agua
esterilizada para eliminar lo que quede de disolvente. En una
realización preferida del procedimiento según la invención, se
esterilizan los cristales iniciadores de un hidrato de riboflavina,
de manera más preferible de monohidrato o dihidrato de riboflavina,
con una mezcla de etanol y agua, preferiblemente de etanol al 70
hasta 90% en volumen. Se ha descubierto de manera sorprendente que
la forma cristalina de los cristales iniciadores no cambia en estas
condiciones.
A estas alturas, los cristales iniciadores de
riboflavina recién preparados están listos para usarse en el paso
(a) del procedimiento según la invención. La XRD muestra que la
forma cristalina no cambia tras la esterilización. Se ha
descubierto de manera sorprendente que los cristales iniciadores
esterilizados son estables en una solución que contiene 80% de
alcohol y 20% de agua a temperatura ambiente. Sin embargo, una
concentración mayor de alcohol conlleva un cambio de la forma
cristalina.
En una realización preferida del procedimiento
según la invención, se combinan la esterilización por vapor y por
disolvente. Preferiblemente, se esterilizan los cristales
iniciadores por vapor a una temperatura por encima de 100ºC,
preferiblemente a aproximadamente 140ºC durante aproximadamente 50
min en un horno. Después, se suspenden los cristales iniciadores en
0-1000 equivalentes en peso, preferiblemente en
5-100 equivalentes en peso de etanol a lo largo de
10 a 200 min, preferiblemente de 20 a 40 min. Se añaden
preferiblemente 0-100 equivalentes en volumen de
H_{2}O estéril que facilitan el manejo del líquido antes de usarse
en el paso (a).
En una realización preferida del procedimiento
según la invención, los cristales iniciadores comprenden un hidrato
de riboflavina, en concreto monohidrato o dihidrato de riboflavina.
Preferiblemente, los cristales iniciadores se añaden al caldo de
fermentación en el paso (a) cuando la concentración de la
riboflavina diluida sobrepasa el límite de solubilidad de la forma
cristalina más soluble, que (dependiendo de la temperatura) es el
dihidrato de riboflavina. Aparece, por encima del límite de
solubilidad del dihidrato de riboflavina y el anhidrato de
riboflavina I, una zona metaestable correspondiente al anhidrato de
riboflavina I.
No tiene lugar la cristalización espontánea del
anhidrato de riboflavina I. Preferiblemente, la inyección se
realiza a temperaturas entre 36ºC y 43ºC y a una concentración de
riboflavina de 0.16 g l^{-1} a 0.23 g l^{-1} en el caldo de
fermentación.
En el paso (b) del procedimiento según la
invención, se aísla la primera forma cristalina de la riboflavina.
Esto quiere decir que, cuando se ha realizado el paso (a) partiendo
de la suspensión de reacción cruda contenida en la fermentadora, se
elimina preferiblemente la mayor parte de la biomasa de la
suspensión de reacción. Preferiblemente, la primera forma
cristalina de riboflavina se aísla decantando, es decir separando la
fase superior del precipitado (separación de biomasa). El paso (b)
del procedimiento según la invención no suele conducir a un
aislamiento de riboflavina pura. Normalmente, la primera forma
cristalina de riboflavina aislada sigue conteniendo impurezas que
deben separarse en pasos de purificación posteriores. La invención
se centra particularmente en la eliminación de estas impurezas.
En una realización preferida del procedimiento
según la invención, la primera forma cristalina de riboflavina, que
precipita en el paso (a) y se aísla en el paso (b), se pasteriza,
preferiblemente después del paso (b), pero preferiblemente con
anterioridad al paso (c). La pasterización se lleva a cabo
preferiblemente calentando la primera forma cristalina de
riboflavina que se apartó del grueso de la biomasa en la suspensión
de reacción anteriormente en el paso (b). En una realización
preferida, la pasterización se lleva a cabo a una temperatura
comprendida entre 40 y 80ºC, preferiblemente entre 60 y 75ºC. La
pasterización se realiza preferiblemente en condiciones ácidas. La
pasterización tiene lugar preferiblemente a un valor de pH inferior
a 6, de manera aun más preferible a un valor de pH inferior a 4.
Los ácidos preferidos que se pueden añadir a una suspensión acuosa
de la primera forma cristalina de riboflavina son los ácidos
minerales, preferiblemente los ácidos sulfúrico o nítrico, o los
ácidos orgánicos, preferiblemente los ácidos carboxílicos y de la
manera más preferible los ácidos fórmico u oxálico.
En el paso (c) del procedimiento según la
invención, se transforma la primera forma cristalina de riboflavina
en una segunda forma cristalina de riboflavina en condiciones que
descompongan ADN diluido. Una característica indispensable del
procedimiento según la invención es que la primera forma cristalina
de riboflavina sea termodinámicamente menos estable que la segunda
forma cristalina de riboflavina a temperatura ambiente
(preferiblemente a 23ºC). Preferiblemente, la primera forma
cristalina de riboflavina es termodinámicamente menos estable que la
segunda forma cristalina de riboflavina también a temperaturas
superiores a la temperatura ambiente.
Se puede hallar ADN recombinante (ADNr) en el
caldo de fermentación cuando se usan microorganismos modificados
genéticamente en la fermentadora. Dependiendo de la especificación
que se requiera para el producto final, el ADN recombinante se debe
eliminar por completo o descomponer durante los pasos posteriores y
en particular durante los pasos de purificación. En la presente
descripción, el término "ADN" incluye cualquier tipo de ADN
(por ejemplo, ADN natural o recombinante) que esté presente en los
cristales de riboflavina, adsorbido a la superficie de los
cristales de riboflavina y estabilizado en contacto con los
cristales de riboflavina.
El contenido de ADN en el producto de
riboflavina se puede observar mediante la PCR (reacción en cadena de
la polimerasa) estándar. Se emplean herramientas analíticas de
tecnología de punta que se basan en la PCR para detectar secuencias
específicas de ADNr (por ejemplo, una secuencia específica de ADN de
la cepa de producción que contenga 200 pares de bases). En
comparación con métodos cromatográficos como las cromatografías de
gases o líquida, la PCR es más sensible con diferencias de órdenes
de magnitud. El límite de detección depende de varios parámetros,
por ejemplo, del número de ciclos, tipo de cebador, tipo de
polimerasa, etc. En cuanto al ADNr de una secuencia definida que se
asocia con la riboflavina cristalina, el límite de detección
característico de la PCR es aproximadamente 0.2 ppb. En el
procedimiento según la invención, se reduce el contenido de ADN de
una largura de pares de bases (pb) específica, preferiblemente de 50
a 10 000 pb, de manera aun más preferible de 100 a 1000 pb, de la
manera más preferible de aproxi-
madamente 200 pb en los cristales de riboflavina por debajo del límite de detección de aproximadamente 0.2 ppb.
madamente 200 pb en los cristales de riboflavina por debajo del límite de detección de aproximadamente 0.2 ppb.
Las condiciones que descomponen ADN diluido se
conocen en el estado anterior de la técnica. En presencia de un
ácido a una concentración por encima de 10^{-4} a 10^{-3} mol
l^{-1}, el ADN diluido se descompone lo suficientemente rápido a
una temperatura elevada (véase la dependencia de la descomposición
de ADN respecto al valor de pH que se muestra en la publicación
Lindahl T. and Nyberg B.; Rate of Depurination of Native
Deoxiribonucleic Acid; Biochemistry, 11, 19 (1972)
3610-3618). Se ha publicado que el ácido cítrico a
una concentración de aproximadamente 10^{-3} mol l^{-1}
descompone ADN a 60ºC en 1 hora (remítase a Schriftenreihe des
Fonds der Chemischen Industrie zu Förderung der Chemie und
Biologischen Chemie im Verband der Chemischen Industrie e.V.; 60329
Frankfurt; Karlstrasse 21; Heft 32, Informationsband
"Sicherheitsforschung in der Biotechnologie").
En una realización preferida del procedimiento
según la invención, las condiciones del paso (c) que descomponen
ADN son las condiciones ácidas. Las condiciones ácidas se logran
preferiblemente añadiendo un ácido a la primera forma cristalina de
riboflavina suspendida en una suspensión acuosa que contenga
riboflavina al 0.5-50% en peso, preferiblemente al
2-10% en peso. En una realización preferida, el
ácido es un ácido mineral que se selecciona del grupo conformado
por los ácidos sulfúrico, nítrico, fosfórico, clorhídrico,
bromhídrico, o un ácido orgánico que se selecciona del grupo
conformado por los ácidos acético, fórmico y oxálico. La
concentración del ácido en la suspensión acuosa debería ser
preferiblemente mayor que 10^{-4} mol l^{-1}, estar
preferiblemente comprendida entre 10^{-4} y 10^{-1} mol
l^{-1} y de la manera más preferible ser aproximadamente de 5
10^{-4} mol l^{-1}. El valor de pH de la suspensión acuosa
debería
ser preferiblemente inferior a 6, de manera más preferible inferior a 5 y de la manera más preferible inferior a 4.
ser preferiblemente inferior a 6, de manera más preferible inferior a 5 y de la manera más preferible inferior a 4.
En otra realización preferida del procedimiento
según la invención, las condiciones del paso (c) que descomponen
ADN son las condiciones básicas. Las condiciones básicas se logran
preferiblemente añadiendo una base a la primera forma cristalina de
riboflavina suspendida en una suspensión acuosa que contenga
riboflavina al 0.5-50% en peso, preferiblemente al
2-10% en peso. En una realización preferida la base
es una base mineral que se selecciona del grupo conformado por
NaOH, KOH y Ca(OH)_{2}. La concentración de la base
en la suspensión acuosa debería ser preferiblemente mayor que
10^{-4} mol l^{-1}, estar preferiblemente comprendida entre
10^{-4} y 10^{-1} mol l^{-1} y de la manera más preferible ser
aproximadamente de 5 10^{-4} mol l^{-1}. El valor de pH de la
suspensión acuosa debería ser preferiblemente superior a 8, de
manera más preferible superior a 9 y de la manera más preferible
superior a 10.
En principio, cuando se expone una solución
acuosa que contiene moléculas de ADN a condiciones que descomponen
ADN, las cadenas de ADN se descomponen rápidamente. Sin embargo, si
el ADN no se encuentra disuelto por completo, por ejemplo, si el
ADN está adsorbido a la superficie o contenido en la red estructural
del cristal (oclusión), la descomposición del ADN se inhibe.
Se ha publicado que al ADN lo pueden adsorber
las superficies y que este se estabiliza sobre aquellas. Se
realizaron estudios para evaluar diferentes vehículos que absorben
ADN. Es necesaria una adsorción lo suficientemente fuerte como para
resistir las fuerzas de atracción provenientes de la punta de un
microscopio de fuerza atómica. La naturaleza y la fuerza de la
adsorción dependen también de la presencia de iones. Los iones
divalentes como Mg^{2+} y Ca^{2+} en particular influencian la
estabilidad (remítase a Benzanilla et al.; Adsorption of DNA
to Mica, Silylated Mica, and Minerals: Characterization by Atomic
Force Microscopy; Langmuir
11(1995)655-659). Otros estudios
desvelaron que el ADN de bacillus subtilis adsorbido a
superficies se puede estabilizar hasta tal punto que incluso
resista el ataque de nucleasas. Al grado de estabilidad lo
influencia la composición de la solución circundante, por ejemplo,
a través de la concentración de iones mono o divalentes. Un valor
bajo de pH parece ejercer un efecto estabilizador mayor (remítase a
Khanna M.; Yoder M.; Calamay L. and Stotzky G.;
X-ray diffractometry and electron microscopy of DNA
from Bacillus subtilis bound on clay minerals; Sciences of
soils (1998) 3:1).
Se ha descubierto de manera sorprendente que la
descomposición de las impurezas de ADN, en particular de ADNr
asociado a cristales de riboflavina, depende estrechamente de la
naturaleza de la forma cristalina de riboflavina. Mientras que la
descomposición de ADNr es particularmente difícil cuando precipita
durante la fermentación el anhidrato de riboflavina I, la
descomposición de ADNr en pasos posteriores es relativamente rápida
si durante la fermentación se forma el dihidrato de riboflavina. Se
supone, sin la intención de ceñirse a ninguna teoría, que el ADNr
liberado de las células cosechadas está estrechamente asociado a los
cristales de riboflavina.
La naturaleza de la forma cristalina de
riboflavina afecta de manera drástica a la eficacia del
procedimiento de purificación posterior, en particular a la
descomposición del ADN recombinante (ADNr) por debajo del límite
de detección de los métodos analíticos como la PCR. Durante la
purificación de la riboflavina, se puede descomponer rápidamente en
particular el ADN recombinante asociado a los cristales de
riboflavina cuando la red cristalina se deshace por transformación
de la primera forma cristalina de riboflavina en las condiciones de
la purificación. Se descubrió de manera sorprendente una nueva
forma cristalina de riboflavina, es decir el dihidrato de
riboflavina. El dihidrato de riboflavina se forma preferiblemente
durante el proceso de fermentación y se puede transformar durante
la purificación en una segunda forma cristalina de riboflavina que
es termodinámicamente más estable a temperatura ambiente. Se
determinaron los datos necesarios para controlar la formación de la
forma cristalina deseada. En el procedimiento del estado anterior
de la técnica no cambia la forma cristalina. Basándose en estos
descubrimientos, se desarrolló un procedimiento nuevo y más eficaz
para la purificación de riboflavina, en particular con relación a
la eliminación de ADN recombinante de los cristales.
En el procedimiento según la invención la
primera forma cristalina de la riboflavina que precipita en el paso
(a) es el dihidrato de riboflavina. En el paso (b) se aísla el
dihidrato de riboflavina cristalino que precipitó, preferiblemente
decantando la mayor parte de la biomasa y, opcionalmente,
pasterizándola. Se ha observado ahora que la viscosidad aumenta
considerablemente cuando se suspende el dihidrato de riboflavina
cristalino que se aisló en agua y la suspensión se calienta a una
temperatura por encima de los 70ºC. La alta viscosidad se puede
rebajar agitando a gran velocidad durante unos minutos.
Se puede verificar por difracción de rayos X en
polvo que con el tratamiento mencionado el dihidrato de riboflavina
cristalino se transforma en el anhidrato de riboflavina cristalino
I. Además, la modificación del cristal cambia de agujas cortas (10
a 20 \mum) a agujas largas (50 a 200 \mum). La formación de las
agujas largas conlleva un incremento considerable de la viscosidad.
Una consecuencia de la transformación del dihidrato de riboflavina
cristalino en la suspensión es la disrupción total de la red
cristalina, seguida inmediatamente de una recristalización en forma
de anhidrato de riboflavina cristalino I de las moléculas de
riboflavina. Las impurezas, en particular el ADN, se liberan y se
expulsan en su totalidad y se diluyen en el medio que las rodea. En
presencia de una cantidad reducida de ácidos (preferiblemente a un
valor de pH inferior a 4), el ADN se descompone rápidamente a
temperaturas relativamente bajas hasta un punto que está por debajo
del límite de detección de la PCR estándar; no se puede detectar
ADN y en particular ADNr en los cristales de riboflavina de 10 a 30
minutos, a 50 a 70ºC y a un valor de pH inferior a 4.
En una realización preferida del procedimiento
según la invención, la transformación de la primera forma cristalina
de riboflavina en la segunda forma cristalina de riboflavina en el
paso (c) se lleva a cabo a temperatura aumentada, preferiblemente a
una temperatura de entre 60 y 75ºC, de la manera más preferible a
aproximadamente 70ºC. Preferiblemente, la transformación se lleva a
cabo en condiciones ácidas, de la manera más preferible a un valor
de pH inferior a 4.
En una realización preferida del procedimiento
según la invención, el paso (c) se lleva a cabo a una temperatura
de entre 60 y 75ºC usando
- (i)
- un ácido mineral, preferiblemente H_{2}SO_{4}, HNO_{3}, HCl, HBr o H_{3}PO_{4}; o
- (ii)
- una base, preferiblemente NaOH, KOH o Ca(OH)_{2}; o
- (iii)
- un ácido orgánico, preferiblemente los ácidos fórmico, acético, oxálico o cítrico.
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En una realización preferida del procedimiento
según la invención, en el paso (c) se transfiere una suspensión
acuosa que contiene la primera forma cristalina de riboflavina a un
reactor equipado con un agitador de turbina. Después, se añade
preferiblemente una cantidad suficiente de ácido mineral o ácido
orgánico. Se sube la temperatura, preferiblemente empleando una
camisa y preferiblemente a una temperatura comprendida entre 60 y
75ºC, de la manera más preferible a aproximadamente 70ºC. Se fija
la velocidad de agitación del agitador de turbina a aproximadamente
500 rpm. En cuanto aumenta la viscosidad, se incrementa la velocidad
de agitación, preferiblemente hasta aproximadamente 2000 rpm, para
licuar nuevamente la suspensión. Tras unos 20 min de tratamiento se
filtra la suspensión. Los cristales que se obtienen se pueden
caracterizar por XRD y el contenido de ADNr se puede analizar por
PCR.
Como alternativa, tras la separación de la
biomasa y la pasterización se puede acidificar la suspensión que
contiene la primera forma cristalina de riboflavina y bombearla
constantemente en un extractor multietapa en agitación. El tiempo
de residencia dentro del extractor multietapa en agitación, que
preferiblemente es de 5 a 20 min, se puede establecer mediante la
velocidad de bombeo. Preferiblemente, se puede calentar el
extractor hasta la temperatura deseada de aproximadamente 70ºC con
una camisa.
En una realización preferida del procedimiento
según la invención, en el paso (c) se calienta con anterioridad la
suspensión que contiene la primera forma cristalina de riboflavina a
aproximadamente 70ºC con un intercambiador de calor antes de pasar
a un extractor multietapa en agitación. El intercambiador de calor
permite calentar la suspensión en cuestión de segundos. Se bombea
preferiblemente la primera forma cristalina de riboflavina
continuamente a través del intercambiador de calor para alcanzar la
temperatura deseada rápidamente, y preferiblemente se sigue
bombeando hasta atravesar un tubo equipado con calentamiento por
camisa y un sistema de agitación multietapa para ejercer tensiones
cortantes lo suficientemente altas. Se puede usar también un tubo de
reactor equipado con mezcladores estáticos en vez de un extractor
multietapa en agitación.
Durante la transformación se disuelven los
cristales de riboflavina, liberando de esta manera moléculas de ADN
dentro de o asociadas a los cristales. Sin embargo, la riboflavina
disuelta recristaliza inmediatamente a la segunda forma cristalina
de riboflavina, que es termodinámicamente más estable que la primera
forma cristalina de riboflavina a temperatura ambiente
(preferiblemente a 23ºC o superior).
Por otro lado, cuando se calienta el líquido de
fermentación correspondiente que contiene una suspensión de
anhidrato de riboflavina I, no se observa ningún incremento en la
viscosidad. La estructura cristalina, que se determina por
difracción de rayos X, no cambia. Por lo tanto, no se induce ninguna
transformación de la forma cristalina y no se expulsa la
riboflavina asociada al ADN a la solución. Respecto al anhidrato de
riboflavina I, solo se puede liberar el ADN diluyendo por completo
la suspensión en un disolvente o agua acidificada. En estas
condiciones, sin embargo, el ADN se puede descomponer por debajo del
límite de detección de la PCR tan solo tratando la suspensión de
riboflavina a una temperatura superior a 95ºC durante más de 12
horas, o superior a 100ºC durante más de 6 horas, o superior a
120ºC durante más de 2 horas, respectivamente.
En el procedimiento según la invención la
primera forma cristalina de riboflavina es el dihdrato de
riboflavina, y la segunda forma cristalina de riboflavina es
preferiblemente el anhidrato de riboflavina I. La precipitación de
la primera forma cristalina de riboflavina en el paso (a) se
controla mediante la adición de cristales iniciadores,
preferiblemente por cristales iniciadores de un hidrato de
riboflavina, de manera aun más preferible por cristales iniciadores
de monohidrato de riboflavina o cristales iniciadores de dihidrato
de riboflavina.
En una realización preferida del procedimiento
según la invención el dihidrato de riboflavina precipita en el paso
(a) (primera forma cristalina de riboflavina) y luego se transforma
en anhidrato de riboflavina I (segunda forma cristalina de
riboflavina) en el paso (c). En el transcurso de la transformación
se expulsan el ADNr y otros compuestos que están asociados a los
cristales de riboflavina al medio que los rodea. En la solución, el
ADN disuelto se puede descomponer fácilmente con cualquier condición
o ingrediente adecuado, por ejemplo, con un ácido mineral o un
ácido orgánico que descompone el ADN disuelto.
En el paso (d) del procedimiento según la
invención se aísla la segunda forma cristalina de riboflavina.
Preferiblemente, la segunda forma cristalina de riboflavina se
aísla por filtración, centrifugación o decantación. Preferiblemente,
los cristales que se obtienen del paso (d) se lavan con etanol frío
o una mezcla de etanol y agua y después se secan.
La invención se refiere a un procedimiento
eficaz para la purificación y cristalización de riboflavina en la
cual se descompone el ADN (recombinante) por debajo del límite de
detección de la PCR estándar. El proceso comprende la formación y,
preferiblemente, la esterilización de cristales iniciadores
adecuados, preferiblemente cristales iniciadores de monohidrato de
riboflavina o dihidrato de riboflavina. La precipitación de una
primera forma cristalina de riboflavina, el dihidrato de
riboflavina, se inicia por medio de dichos cristales iniciadores en
la fermentadora. Además, el procedimiento comprende la eliminación
de moléculas de ADN asociadas a la primera forma cristalina de
riboflavina transformando la primera forma cristalina de
riboflavina, el dihidrato de riboflavina, en una segunda forma
cristalina de riboflavina, preferiblemente el anhidrato de
riboflavina I, en condiciones que descompongan ADN diluido.
Preferiblemente, la transformación de la primera forma cristalina
de riboflavina en la segunda forma cristalina de riboflavina se
lleva a cabo calentando la primera forma cristalina de riboflavina
suspendida en presencia de un ácido. La concentración del ácido es
preferiblemente superior a 10^{-4} mol l^{-1}, el valor de pH
de la solución está preferiblemente por debajo de 6, de manera aun
más preferible por debajo de 5 y de la manera más preferible por
debajo de 4.
Las formas cristalinas de riboflavina
particulares, en particular el anhidrato de riboflavina II,
anhidrato de riboflavina III, el dihidrato de riboflavina y el
tetrahidrato de riboflavina se pueden usar en el campo de la
nutrición humana y animal y la salud animal y la salud humana.
Los siguientes ejemplos representan
adicionalmente el procedimiento según la invención.
Se investigó una muestra de la modificación B/C
(según se describe en EP-A 995 749; correspondiente
al monohidrato de riboflavina) por DVS y gravimetría combinadas y
DVS y difracción de rayos X combinadas, figura 3. Se fijó la
muestra a temperatura ambiente y a una humedad relativa del 52%
(vapor de agua). En ambos métodos combinados se incrementó
constantemente la humedad relativa (HR) hasta alcanzar una humedad
relativa de aproximadamente el 96%. Después, se redujo
constantemente la humedad relativa al 0%. Después, se volvió a
incrementar la humedad hasta un 52% para alcanzar el valor de
partida. Se repitió el ciclo una segunda vez.
La absorción y liberación del agua asociada al
cristal en el ciclo que depende del incremento o la reducción del
vapor de agua vienen acompañadas de una histéresis. La histéresis se
puede explicar mediante la absorción dictada por la cinética
durante el aumento de la humedad relativa y la liberación retardada
de agua de cristal durante la reducción de la humedad relativa.
La cantidad de agua teorética que se incorpora
en las formas cristalinas de riboflavina que conduce a los
diferentes hidratos se enumera debajo:
De anhidrato de riboflavina a monohidrato de
riboflavina: 4.97% en peso
De anhidrato de riboflavina a dihidrato de
riboflavina: 9.57% en peso
De anhidrato de riboflavina a trihidrato de
riboflavina: 14.36% en peso
De anhidrato de riboflavina a tetrahidrato de
riboflavina: 19.15% en peso.
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La difracción de rayos X escaneada en paralelo
mostró al menos tres espectros claramente distinguibles para las
formas cristalinas que se mostraron a diferentes intervalos de
humedad relativa:
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El anhidrato de riboflavina II presenta un
difractograma de rayos X que difiere del difractograma del anhidrato
de riboflavina I. Por lo tanto, se le puede calificar de verdadero
polimorfo del anhidrato de riboflavina I. Al aumentar la humedad
relativa, la estructura cristalina cambia a la forma de monohidrato
de riboflavina. A una humedad relativa cercana al 20%, se sigue
estableciendo la estructura del monohidrato de riboflavina. De la
manera que ocurre en una esponja casi seca, solamente algunas
posiciones en la red cristalina del cristal de riboflavina las
ocupan moléculas de agua. Las posiciones se llenan incrementando la
humedad relativa. Por encima de aproximadamente un 75% de humedad
relativa, la estructura de cristal vuelve a cambiar de repente a la
estructura del dihidrato de riboflavina, antes de que se absorba la
cantidad de agua teorética del monohidrato de riboflavina. Por
encima de una humedad relativa del 75%, el agua se incorpora
rápidamente en la estructura del dihidrato de riboflavina. A una
humedad relativa de aproximadamente el 92%, la absorción de agua
alcanza un valor teorético de 9.57% en peso el cual corresponde al
dihidrato de riboflavina.
Se libera agua constantemente reduciendo la
humedad relativa. La estructura del dihidrato de riboflavina se
mantiene intacta hasta que se alcanza una humedad relativa del 20%.
A una humedad relativa del 20%, la estructura del dihidrato
contiene aun 1.3 mol de agua por mol de riboflavina. Después, la
estructura cambia directamente al anhidrato de riboflavina II.
Se pueden diferenciar claramente tres formas
diferentes por espectroscopía Raman.
Se analizó una segunda muestra de una forma
cristalina de riboflavina por DVS, figura 4, de la misma manera que
se analizó la muestra "B/C". La muestra manifestó una
estructura cristalina que se podía identificar como de tipo C,
según la publicación US 2 603 633.
\newpage
Se pudieron identificar dos formas diferentes
cristalinas en los intervalos de:
\vskip1.000000\baselineskip
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La estructura del tetrahidrato de riboflavina se
conoce como (modificación) de tipo C. El anhidrato de riboflavina
III es una forma cristalina nueva y se trata de la tercera
modificación anhidra además del anhidrato de riboflavina I y del
anhidrato de riboflavina II. Su difractograma de rayos X difiere del
resto de los difractogramas de las formas cristalinas de
riboflavina.
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Los experimentos se llevaron a cabo en un
calorímetro de flujo de calor. El proceso de dilución por
calentamiento y de cristalización por enfriamiento se observó
mediante un sensor de turbidez. Se suspendieron, respectivamente,
36 mg de cristales de anhidrato de riboflavina I o 60 mg de la forma
cristalina del monohidrato de riboflavina o 120 mg de cristales de
dihidrato de riboflavina en la solución de fermentación y se
calentaron a 80ºC a una velocidad de 0.1ºC/min. La temperatura se
mantuvo durante 60 min. Después se volvió a enfriar el sistema a
20ºC a una velocidad de 0.1ºC/min.
A 39ºC, la dependencia de la línea de
sobresaturación en función a la temperatura es débil. Por lo tanto,
se aplicó otro método (MethB) para determinar la sobresaturación a
39ºC: se suspendieron 420 mg de cristales de tetrahidrato de
riboflavina y se disolvieron por completo calentando a 69ºC. La
concentración de riboflavina fue de 0.6 mg ml^{-1}. Tras volver a
enfriar a 39ºC, la temperatura se mantuvo constante. Tras 3 horas,
se inició la cristalización lentamente (ver figura 2).
El mismo experimento llevado a cabo con 360 mg
de cristales de tetrahidrato de riboflavina (lo que corresponde a
0.7 mg ml^{-1}) condujo a una cristalización espontánea aun a
46ºC.
Se puede establecer que la línea de
sobresaturación se encuentra por debajo de 0.6 mg ml^{-1} a
39ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se esterilizaron 500 mg de cristales de
monohidrato de riboflavina a 140ºC durante 50 min en un horno, se
suspendieron en 5 mL de etanol durante 10-200 min,
preferiblemente 20-40 min y se añadieron, antes de
la inducción, 10 mL de H_{2}O estéril para manejar mejor el
líquido. Se añadió la suspensión al bioreactor tras 6 h por medio
de un recipiente estéril con jeringa. Se formaron cristales de
dihidrato de riboflavina y se mantuvieron en entorno estéril. A
partir de estos experimentos se puede decir que es posible dirigir
la modificación del cristal hacia el dihidrato de
riboflavina.
riboflavina.
La medición de la fracción de riboflavina
soluble en cultivos inducidos y no inducidos mostró diferencias
importantes: en el cultivo sin inducir se obtuvo una solución
sobresaturada tras 6-9 h. La solubilidad se reduce
considerablemente después en 1 hora. No se observa este fenómeno con
los cultivos inducidos. No se supera la solubilidad de la
riboflavina (aproximadamente 0.4 gl^{-1}). Se controla por
difracción de rayos X si la forma cristalina de los cristales
cambia durante el procedimiento de esterilización.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la esterilización y la decantación de la
mayor parte de la biomasa, la suspensión de riboflavina restante
que contiene 6% en peso de cristales de riboflavina se trata
añadiendo un ácido mineral, preferiblemente ácido sulfúrico,
nítrico o fosfórico y/o ácido orgánico, preferiblemente ácido
acético, fórmico, oxálico. Tras añadir el ácido la concentración
del ácido en la suspensión era de 5 10^{-4} mol l^{-1}. Se
agitó la suspensión acidificada con intensidad.
La suspensión se pasó a un reactor de 1.5 litros
con un agitador de turbina. Se acidificó la suspensión y se subió
la temperatura mediante una camisa a una temperatura de 70ºC. Se
fijó la velocidad de agitación a 500 rpm. En cuanto aumentó la
viscosidad, se aumentó la velocidad de agitación a 2000 rpm para
volver a licuar la suspensión. Tras el tratamiento de 20 min la
suspensión se filtro. Los cristales que se obtuvieron se
caracterizaron por XRD. El contenido de ADNr se analizó por PCR (ver
figura 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la separación y pasterización de la biomasa
según el ejemplo 4 se acidificó la suspensión y se bombeó
continuamente en un extractor multietapa en agitación. El tiempo de
residencia en el extractor multietapa en agitación de entre 5 a 20
min lo dictó la velocidad de bombeo. Se pudo calentar el extractor a
la temperatura deseada de 70ºC mediante una camisa.
En un experimento distinto, se precalentó la
suspensión a 70ºC mediante un intercambiador de calor antes de
pasarse al extractor multietapa en agitación. Mediante el
intercambiador de calor se pudo calentar la suspensión en cuestión
de segundos. En vez de un extractor multietapa en agitación, se usó
un tubo de reactor equipado con mezcladores estáticos.
\vskip1.000000\baselineskip
(Ejemplo
comparativo)
Se describe un procedimiento para la preparación
de tetrahidrato de riboflavina en la publicación US 2 603 633. El
procedimiento emplea fundamentalmente un disolvente para precipitar
la riboflavina rápidamente a fin de obtener el tetrahidrato
(modificación) "tipo C" deseado. Las muestras que se preparan
con este método se transforman en dihidrato de riboflavina a una
humedad relativa de 95% en aproximadamente 100 min.
Otro procedimiento para la producción de
tetrahidrato de riboflavina en pequeñas cantidades se basa en la
evaporación de una solución acuosa. Se describe un procedimiento
aquí debajo:
Se disolvieron 500 mg de riboflavina (ensayo
> 98% en peso de la producción química) en 7 litros de agua
desionizada. Se filtró la solución después sobre un sistema de
filtrado Sartorious que comprende un filtro de fibra de cristal y
un filtro de Teflon de 5 \mu. La solución filtrada se evaporó
después en un sistema evaporador de matraz rotatorio Büchi. La
solución se aspiró continuamente al matraz de evaporación a una
temperatura del baño de 40ºC como máximo y a un vacío de 20 - 25
mbar.
Se evaporó el agua de manera simultánea. El
volumen del matraz se mantuvo a 200 mL como máximo. La
cristalización comenzó al final del procedimiento.
Por último, se aspiraron los 7 litros en su
totalidad al matraz de evaporación y se evaporaron. Se redujo por
evaporación el volumen en el matraz de evaporación hasta
aproximadamente 100 mL. Se filtró después la suspensión sin un
lavado adicional y se secó al alto vacío, p < 0.05 mbar a 35ºC
como máximo. Se caracterizó la muestra después por difracción de
rayos X para confirmar la estructura de tetrahidrato. La muestra se
empleó después para experimentos posteriores.
\vskip1.000000\baselineskip
Se empleó el genoma entero de la cepa de
producción como control positivo de la amplificación por PCR. Se
usó la concentración del genoma de hasta 100 ng \mul^{-1}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron dos cebadores. Si una muestra contenía
ADN de una cepa de producción a una concentración superior a 0.2
partes por billón (ppb), se amplificaba un fragmento de 200 pares de
bases (pb) con los cebadores.
\newpage
-primero, desnaturalización
- -45 ciclos de:
- 40 segundos a 94ºC
- \quad
- 60 segundos a 55ºC
- \quad
- 60 segundos a 72ºC
-Por último, se mantuvo la muestra a 72ºC
durante 600 segundos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 0.5 mL de tampón TE (pH 8) con
desoxicolato al 1% a 50 mg de riboflavina. Tras 10 minutos de
agitación, se añadieron 0.7 mL de fenol (saturado con TE) y se agitó
de nuevo durante 15 min. Tras la separación de las fases, se
purificaron 50 \muL de la fase acuosa por cromatografía (MicroSpin
S200, Amersham Pharmacia Biotech) para eliminar los restos de
fenol, desoxicolato y riboflavina.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos amplificados se identificaron por
electroforesis en gel de agarosa empleando una cepa de ácido
nucléico UV-activa para marcar el ADN.
Claims (7)
1. Procedimiento para la producción de cristales
de riboflavina con un contenido de ADN inferior a 0.2 ppb, que se
puede medir por PCR, comprendiendo los pasos de:
(a) precipitar una primera forma cristalina de
riboflavina en el caldo de fermentación,
(b) aislar la primera forma cristalina de
riboflavina,
(c) transformar la primera forma cristalina de
riboflavina en una segunda forma cristalina de riboflavina en
condiciones que descompongan el ADN diluido, y
(d) aislar la segunda forma cristalina de
riboflavina
en el que la primera forma cristalina es el
dihidrato de riboflavina, que es termodinámicamente menos estable a
temperatura ambiente que la segunda forma cristalina de riboflavina,
y en el que la precipitación de la primera forma cristalina se
controla mediante la adición de cristales iniciadores al caldo de
fermentación.
2. Procedimiento para la reducción del contenido
de ADN por debajo de 0.2 ppb, que se puede medir por PCR, en
relación con los cristales de riboflavina que se producen por
fermentación, que comprende los pasos de:
(a) precipitar una primera forma cristalina de
riboflavina en el caldo de fermentación,
(b) aislar la primera forma cristalina de
riboflavina,
(c) transformar la primera forma cristalina de
riboflavina en una segunda forma cristalina de riboflavina en
condiciones que descompongan el ADN diluido, y
(d) aislar la segunda forma de riboflavina que
posee dicho contenido de ADN,
en el que la primera forma cristalina es el
dihidrato de riboflavina, que es termodinámicamente menos estable a
temperatura ambiente que la segunda forma cristalina de riboflavina,
y en el que la precipitación de la primera forma cristalina se
controla mediante la adición de cristales iniciadores al caldo de
fermentación.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que la segunda forma cristalina de riboflavina es el anhidrato
de riboflavina I.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que se seleccionan los cristales
iniciadores entre el monohidrato de riboflavina o el dihidrato de
riboflavina.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el paso (c) se lleva a cabo a una
temperatura comprendida entre 60ºC y 75ºC empleando un disolvente
que se selecciona del grupo conformado por un ácido mineral, una
base y un ácido orgánico.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la primera forma cristalina de
riboflavina del paso (b) se pasteriza antes de su transformación en
el paso (c).
7. Uso de la transformación cristalina para la
eliminación de ADN asociado de los cristales de riboflavina, en el
que el dihidrato de riboflavina que precipitó en el caldo de
fermentación se aísla y se transforma en condiciones que
descompongan ADN diluido en una segunda forma cristalina, que es
termodinámicamente más estable a temperatura ambiente que el
dihidrato de riboflavina, y en el que el contenido de ADN por debajo
de 0.2 ppb de los cristales de riboflavina según la segunda forma
cristalina se puede medir por PCR, y en el que la precipitación del
dihidrato de riboflavina se controla mediante la adición de
cristales iniciadores al caldo de fermentación.
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