KR20060063908A - 리보플라빈의 정제방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 리보플라빈의 제 1 결정형을 침전시키는 단계; (b) 리보플라빈의 제 1 결정형을 단리시키는 단계; (c) 희석된 DNA를 분해하는 조건하에서 리보플라빈의 제 1 결정형을 리보플라빈의 제 2 결정형으로 전환시키는 단계; 및 (d) 리보플라빈의 제 2 결정형을 단리시키는 단계를 포함하는 리보플라빈의 정제방법으로서, 이때 리보플라빈의 제 1 결정형이 주변온도에서 리보플라빈의 제 2 결정형보다 열동력학적으로 덜 안정한 정제방법에 관한 것이다.

Description

리보플라빈의 정제방법{PROCESS FOR THE PURIFICATION OF RIBOFLAVIN}
본 발명은 리보플라빈(바이타민 B2)의 정제방법에 관한 것으로, 이러한 방법은 특히 리보플라빈 결정과 관련된 DNA의 제거에 적합하다.
리보플라빈은 이제까지 합성방법으로 제조되어 왔으나, 최근에는 경제적인 이유로 발효 기술을 근거로 하여 리보플라빈을 제조한다. 이러한 공정은 리보플라빈이 미생물에 의해 제조되고 순수한 산물이 리보플라빈을 함유하는 조질 반응 슬러리(발효배지)로부터 출발하는 연속적인 정제단계에 의해 수득되는 공정으로서, 통상적이다.
리보플라빈의 제조를 위한 발효공정은 종래기술에 공지되어 있다. 이와 관련하여, 예를 들어 문헌[Takata, Ryohei; Nagata, Toshiomi; Shimamoto, Sumio; Solubility of riboflavin obtained from cultured Eremothecium ashbyii(1949) 27, pp. 8-10 and 50-52]; 문헌[Sen Gupta, S. B.,; Gupta, H. N.; Solubility of riboflavin(vitamin B2) in water; J. Proc. Inst. Chemists(India)(1949) 21, pp. 1-4]; 문헌[Chemical Engineering, April 2002, p. 23]; 문헌[van Loon R.P.G.M. et al.; Development of a Fermentation Process for the Manufacture of riboflavin; Chimia 50(1996) No.9 pp. 410-412]; 및 유럽 특허출원 제 428 767 호, 제 464 582 호 및 독일 특허출원 제 2 920 592 호를 참조할 수 있다.
발효공정의 과정에서, 발효기에서 리보플라빈의 농도는 점점 증가한다. 그러나, 수용액에서 리보플라빈의 안정성은 오히려 불량하며, 중성 수용액에서 30 내지 50℃의 온도에서 약 0.014 내지 0.031중량%의 용해도를 갖는다는 보고가 있다. 따라서, 특정한 초포화도가 발효공정 중에 도달할 때, 리보플라빈은 자발적으로 결정화되기 시작한다. 발효공정동안 제 1 결정이 형성되면, 발효를 진행함으로써 제조된 리보플라빈은 발효공정이 종료될 때까지 계속적으로 결정화한다.
일반적으로, 리보플라빈 결정을 함유하는 반응 슬러리(발효배지)를 공정의 하부스트림 부분으로 옮긴다. 제 1 단계에서, 반응 슬러리를 대개 저온살균한다. 즉, 미생물은 산성 조건하의 승온에서 죽는다. 제 2 단계에서, 생물량의 주요부를 옮김으로써 반응 슬러리로부터 제거한다. 제 3 단계에서, 잔류 불순물(예를 들어, 생물량, 단백질, 지질, DNA)을 특정한 범위로 분해 및 제거하기 위하여 반응 슬러리를 산성화시키고 95 내지 115℃까지 가열함으로써 리보플라빈 결정을 정제한다. 산 처리 동안, 리보플라빈 결정의 순도는 대개 약 85중량%에서 약 96중량%로 증가한다. 제 4 단계에서, 산성화 반응 슬러리를 여과 및 세척한다. 선택적인 추가의 단계는 최종 산물 형태를 수득하기 위한 정제단계 및/또는 제형화 단계를 포함한다.
정제단계(제 3 단계)에서, 지질, 단백질, DNA, 및 기타 유기 및 무기 화합물을 단지 특정한 범위로 제거할 수 있다. 2중량%의 황산 또는 또다른 무기산을 첨가하고 반응 슬러리를 95 내지 105℃의 온도로 가열시킴으로써 97중량%까지의 순도를 달성할 수 있다는 것이 보고되었다.
그러나, 종래기술의 발효공정에서 제조된 리보플라빈 산물은 여전히 상당량의 불순물, 특히 DNA를 함유하고 있기 때문에 리보플라빈의 질은 만족스럽지 못하였다. 한편, 리보플라빈의 순도는 특히 약학적 또는 영양적 목적에 있어서 가능한 순도가 높아야 한다. 그러나, 다른 한편, 정제공정은 보다 간단하고, 효율적이고, 정량적이고 완만해야 한다(예를 들어 리보플라빈은 악화된 산물의 형성이 방지되도록 특정한 기간동안 고온에 노출되지 않아야 한다).
도 A는 리보플라빈 무수화물 I 결정형의 분말 회절그램을 나타낸 것이다.
도 B는 리보플라빈 무수화물 II 결정형의 분말 회절그램을 나타낸 것이다.
도 C는 리보플라빈 무수화물 III 결정형의 분말 회절그램을 나타낸 것이다.
도 D는 리보플라빈 일수화물 결정형의 분말 회절그램을 나타낸 것이다.
도 E는 리보플라빈 이수화물 결정형의 분말 회절그램을 나타낸 것이다.
도 F는 리보플라빈 사수화물 결정형의 분말 회절그램을 나타낸 것이다.
도 1은 리보플라빈 결정형의 용해도 곡선을 나타낸 것이다.
도 2는 리보플라빈 결정형의 초포화도 곡선을 나타낸 것이다.
도 3은 리보플라빈 무수화물 II-리보플라빈 일수화물-리보플라빈 이수화물의 DVS 측정결과를 나타낸 것이다.
도 4는 리보플라빈 무수화물 III-리보플라빈 사수화물의 DVS 측정결과를 나타낸 것이다.
도 5는 수득된 리보플라빈 결정에 함유된 rDNA의 PCR 분석결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 목적은 종래기술의 공정보다 우수한 리보플라빈의 정제방법을 제공하는 것이다.
이러한 근원적인 기술적 문제는 청구의 범위의 주제, 즉 하기 a) 내지 d) 단계를 포함하는 리보플라빈의 정제방법(이때 리보플라빈의 제 1 결정형은 주변온도에서 리보플라빈의 제 2 결정형보다 열동력학적으로 덜 안정함)에 의해 해결된다:
(a) 리보플라빈의 제 1 결정형을 침전시키는 단계;
(b) 리보플라빈의 제 1 결정형을 단리시키는 단계;
(c) 희석된 DNA를 분해하는 조건하에서 리보플라빈의 제 1 결정형을 리보플라빈의 제 2 결정형으로 전환시키는 단계; 및
(d) 리보플라빈의 제 2 결정형을 단리시키는 단계.
"주변온도"라는 용어는 평균 실온, 바람직하게 23℃를 의미한다.
놀랍게도, 상기 공정에 의해 리보플라빈 결정의 DNA 함량이 유의적으로 감소된다는 것, 바람직하게는 통상적 PCR 분석의 검출 한계치(약 0.2ppb) 미만의 범위로 감소된다는 것을 발견하였다.
이러한 리보플라빈의 정제공정은 리보플라빈의 제 1 결정형을 리보플라빈의 제 2 결정형으로 전환시키지 못하는 종래기술의 공정에서의 조건보다 매우 온화한 조건(온도, 체류 시간, 산 농도 등)하에서 수행될 수 있다.
본 발명은 발효기 조건에 따라 발효동안 리보플라빈의 결정화가 상이한 결정형(변형)을 유도한다는 예측치 못한 사실의 발견을 전제로 한다. 발효배지에서 리보플라빈 결정을 분석한 결과, 일부 배치(bacth)에서 무수화물(즉 리보플라빈 무수화물 I) 및 기타 배치에서 수화물(즉 리보플라빈 이수화물)이 침전된다는 것이 나타났다. 기타 배치에서 모든 결정형의 혼합물이 발견되었다. 심지어 제 3 결정형(즉 리보플리빈 사수화물)도 일부 경우에서 식별되었다. 이러한 결정형, 즉 리보플라빈 수화물 및 리보플라빈 무수화물은 X-선 분말 회절(XRD) 및 동력학적 증기 흡착(DVS)에 의해 특정화된다. 상이한 결정형의 용해도는 라만(Raman) 분광계에 의해 조사하였다. DVS와 XRD의 조합은 수화물의 형성을 조사할 수 있도록 한다.
3개의 상이한 무수 결정성 변형(리보플라빈 무수화물 I, II 및 III)은 상이한 리보플라빈 수화물(리보플라빈 일수화물, 이수화물 및 사수화물)과 평형이다.
온도에 따라, 하기 결정형은 서로 평형이거나 또는 정의된 조건(예를 들어 온도, 습도 등)하에서 서로 역으로 전환된다.
리보플라빈 무수화물 I과 리보플라빈 이수화물 및 리보플라빈 사수화물; 리보플라빈 무수화물 II와 리보플라빈 일수화물 및 리보플라빈 이수화물; 리보플라빈 무수화물 III과 리보플라빈 사수화물.
23℃에서 리보플라빈 무수화물 I 및 리보플라빈 이수화물에 관련하는 상태는 하기 반응식 1과 같이 예시될 수 있다:
Figure 112006004604712-PCT00001
23℃에서 리보플라빈 무수화물 I과 리보플라빈 이수화물 사이의 평형은 리보플라빈 무수화물 I의 측으로 완전히 이동된다. 즉, 이러한 온도에서, 리보플라빈 이수화물은 리보플라빈 무수화물 I로 역으로 전환된다. 따라서, 23℃에서 리보플라빈 이수화물은 순수한 리보플라빈 무수화물 I로부터 수득될 수 없다. 또한, 보다 높은 온도, 예를 들어 39℃에서 리보플라빈 이수화물은 리보플라빈 무수화물 I보다 열역동학적으로 덜 안정적이다.
23℃에서 리보플라빈 이수화물의 리보플라빈 무수화물 I로의 동력학적인 전환은 보다 느리다. 23℃에서 리보플라빈 이수화물을 함유하는 슬러리를 교반함으로써 11일내에 리보플리빈 무수화물 I로의 부분적인 전환(80%)을 수득한다(라만 분광계에 의해 측정됨). 39℃에서 용해도 또는 화학적 전위 차는 작다. 따라서, 이러한 온도에서, 리보플라빈 이수화물의 리보플라빈 무수화물 I로의 전환은 느리다.
보다 높은 온도에서 리보플라빈 무수화물 I과 리보플라빈 이수화물의 화학적 전위차는 증가한다. 따라서, 리보플라빈 이수화물이 80℃에서 20초내에 리보플라빈 무수화물 I로 완전히 전환됨에 따라 전환공정의 속도가 유의적으로 증가한다.
그러나, 4℃에서 열동력학적 상태는 상이하다. 수성 슬러리에서 리보플라빈 무수화물 I은 이후에 리보플라빈 사수화물로부터 역으로 수득될 수 있는(특히 보다 높은 온도에서) 리보플라빈 이수화물로 전환될 수 있다:
Figure 112006004604712-PCT00002
4℃에서 리보플라빈 무수화물 I의 리보플라빈 이수화물로의 동력학적 전환은 매우 느리다. 4℃에서 단지 리보플라빈 무수화물 I을 함유하는 슬러리를 교반함으로써 56일내에 리보플리빈 무수화물 I의 리보플라빈 이수화물로의 부분적인 전환(80%)을 수득한다.
결정형의 용해도 조사에서, 놀랍게도, 특히 리보플라빈 무수화물 I, 리보플라빈 이수화물 및 리보플라빈 사수화물은 약 40℃ 미만에서 용해도 곡선이 서로 매우 밀접하게 나타난다는 것을 발견하였다. 4 내지 23℃ 범위의 특정한 온도에서 리보플라빈 무수화물 I과 리보플라빈 이수화물의 결정형의 유리 기브스(Gibbs) 에너지(△G)는 동일하다. 상기 온도 범위내의 특정한 온도에서 리보플라빈 무수화물 I 및 리보플라빈 이수화물의 용해도 곡선은 교차한다. 상기 교차 온도 초과에서 리보플라빈 무수화물 I은 열동력학적으로 보다 안정한 결정형(보다 낮은 유리 기브스 에너지)이고; 상기 교차 온도 미만에서 리보플라빈 이수화물은 열동력학적으로 보다 안정한 결정형이다.
23℃에서 또한 리보플라빈 무수화물 II와 리보플라빈 일수화물 및 리보플라 빈 이수화물 사이에 평형이 존재하며, 이러한 평형은 상대습도에 의해 좌우된다. 또한, 23℃에서 상대습도에 따라 리보플라빈 무수화물 III은 리보플라빈 사수화물로 역으로 전환될 수 있다:
Figure 112006004604712-PCT00003
Figure 112006004604712-PCT00004
리보플라빈의 결정형의 성질, 특히 용해도 및 자발적 결정화를 상세하게 조사하였다(실시예 1 참조). 이의 결과는 도 1 및 2에 요약하였다. 44 내지 52℃의 온도 범위내에서 리보플라빈 이수화물의 용해도 및 44 내지 59℃의 온도 범위내에서 리보플라빈의 자발적 결정화를 조사하였다. 39℃까지의 초포화도 곡선의 외삽법은 리보플라빈 무수화물 I 및 리보플라빈 이수화물의 초포화도 곡선이 서로 보다 밀접하게 접근한다는 것을 지시한다. 또다른 실험에서, 리보플라빈을 0.7g/ℓ의 농도로 69℃에서 용해시켰다.
3시간내에 용액을 39℃로 연속적으로 냉각시킴으로써 리보플라빈 무수화물 I의 결정화를 수득하였다. 39℃에서 리보플라빈 이수화물은 리보플라빈 무수화물 I 보다 열동력학적으로 덜 안정적이다. 39℃에서 리보플라빈 무수화물의 초포화도 곡선의 위치는 0.6g/ℓ 초과로 평가될 수 있다. 따라서, 초포화도 곡선 및 용해도 곡선 사이의 준안정성 대역에서 목적 결정형의 종자결정을 사용하여 접종함으로써 리보플라빈의 결정형의 형성을 조절할 수 있다.
리보플라빈 무수화물 I, 리보플라빈 무수화물 II, 리보플라빈 무수화물 III, 리보플라빈 일수화물, 리보플라빈 이수화물 및 리보플라빈 사수화물의 결정형의 분말 회절그램을 도 A 내지 F에 나타내었다.
결정학 분야에서 용어(예를 들어 "결정형", "다형성", "다형체" 등)에 관하여는 예를 들어 문헌[Solid State Chemistry of Drugs; Stephen R. Byrn, Ralph R. Pfeiffer, Joseph G. Stowell; SSCI Inc. West Lafayette; 1999]을 참조할 수 있다.
무수화물은 특히 물 부재 분위기하에서 결정성 물을 함유하지 않는 결정형이다. 리보플라빈 무수화물 I은 도 A에서 X-선 회절그램에 의해 특정화되는 리보플라빈 다형체이다. 수증기하에서 리보플라빈 무수화물 II는 리보플라빈 일수화물 및 리보플라빈 이수화물과 평형이다. 수증기하에서, 리보플라빈 무수화물 III은 리보플라빈 사수화물과 평형이다.
수화물은 결정성 물을 함유하는 결정형이다. 수증기하에서 리보플라빈 일수화물(도 D 참조)은 리보플라빈 무수화물 II 및 리보플라빈 이수화물과 평형이다. 리보플라빈 이수화물은 도 E에서 X-선 회절그램에 의해 특정화된다. 수증기하에서 리보플라빈 사수화물(도 F 참조)은 리보플라빈 무수화물 III과 평형이다.
결정성 리보플라빈의 다양한 변형은 종래기술에 공지되어 있다. 이와 관련하여 예를 들어 유럽 특허출원 제 995 749 호, 미국 특허 제 2,324,800 호, 제 2,603,633 호, 제 2,797,215 호, 제 4,687,847 호 및 국제 센타의 회절데이터(2002 JCPDS; PCPDFWIN v.2.2; 엘리 릴리 엔 캄파니(Eli Lilly and Company), 미국 인디아나주 소재)에 의해 제출된 데이터, 1955)를 참조할 수 있다.
종래기술에서 결정성 리보플라빈 형태(변형)의 명명법이 단일화되지 않아서 상이한 용어들을 사용하여 하기 표 1에 요약하였다.
Figure 112006004604712-PCT00005
본 발명에 따른 공정의 단계 (a)에서 리보플라빈의 제 1 결정형이 침전, 즉 결정화된다. 바람직하게 단계 (a)는 발효기(발효배지)에서 미생물에 의해 제조된 조질 반응 슬러리로부터 개시된다. 적합한 미생물은 비-유전자 조작 유기체(비-GMO) 및 유전자 조작 유기체(GMO)를 포함한다. 발효공정은 연속적으로 또는 배치공정으로서 수행될 수 있으며, 배치공정이 바람직하다. 대개 발효기에 함유된 물의 양은 용해된 리보플라빈 산물의 전체 양을 유지하기에 불충분하다. 따라서, 발효공정의 초기에서 수득된 리보플라빈의 양은 단지 용액 중에 존재하지만, 발효공정중 특정한 초포화도에 도달될 때 리보플라빈은 자발적으로 결정화를 개시한다. 일반적으로, 결정화는 발효공정의 말기 전에 적절히 개시된다. 따라서, 공정의 말기에서 주요한 산물은 결정성 리보플라빈의 형태로 침전되며(리보플라빈의 제 1 결정형), 단지 비교적 소량의 리보플라빈이 용액 중에 남게된다.
본 발명의 공정은 주변온도(바람직하게 23℃ 보다 높은 온도)에서 리보플라빈의 제 1 결정형이 단계 (c)에서 제조된 리보플라빈의 제 2 결정형보다 열동력학적으로 덜 안정할 것이 요구된다. 이는 단계 (a) 자체가 주변온도에서 실행되어야 한다는 것을 의미하는 것이 아니고, 온도는 단지 리보플라빈의 각 결정형의 열동력학적 안정성이 비교되는 조건을 정의한다. 바람직하게 단계 (a)는 40℃ 보다 낮은 온도에서 수행된다.
한편, 단계 (a)에서 침전된 리보플라빈의 결정형은, 주변온도에서 열동력학적으로 보다 안정한 임의의 제 2 결정형으로의 전환이 가능하지 않는 경우에서와 같이 주변온도에서 결정성 리보플라빈의 열동력학적으로 가장 안정한 형태로 되는 것이 방지되어야 한다. 다른 한편, 리보플라빈의 제 1 결정형은 조절된 침전시 수득가능하여야 하며, 발효조건 및 선택적인 이후의 저온살균 단계에서 유지되어야 한다. 이러한 성질을 나타내는 임의의 결정형은 리보플라빈의 효과적인 정제, 특히 단계 (c)에서 리보플라빈 결정에 함유된 DNA 농도의 유의적인 감소를 가능하게 한다.
본 발명에 따른 공정의 바람직한 실시양태에서, 단계 (a)에서 침전된 리보플라빈의 제 1 결정형은 리보플라빈 수화물, 바람직하게 리보플라빈 일수화물, 리보플라빈 이수화물 또는 리보플라빈 사수화물을 포함한다. 가장 바람직하게 단계 (a)에서 침전된 제 1 결정형은 리보플라빈 이수화물이다.
단계 (a)에서 반응조건에 따라, 발효배지로부터 자발적으로 침전하는 리보플라빈의 제 1 결정형은 목적하는 리보플라빈의 제 1 결정형에 필수적이지 않다. 따라서, 단계 (a)에서 침전된, 즉 바람직하게 발효공정중 제조된 결정성 리보플라빈의 침전 형태를 조절하는데 필수적일 수 있다.
놀랍게도, 단계 (a)에서 발효기에서 목적하는 리보플라빈의 제 1 결정형의 형성은 특정한 결정 구조를 갖는 종자결정에 의해 결정화를 개시함으로써 조절될 수 있다. 발효배지에 적합한 종자결정의 첨가는 리보플라빈의 뚜렷한 제 1 결정형의 침전을 유발한다. 따라서, 바람직한 리보플라빈의 제 1 결정형(예를 들어 리보플라빈 일수화물, 리보플라빈 이수화물 또는 리보플라빈 사수화물), 바람직하게 리보플라빈 이수화물의 침전은 선택된 적합한 종자결정에 의해 수행될 수 있다.
종자결정(접종)에 의한 초기 결정화는 결정화될 산물 형태에 영향을 주는 것으로서, 공지된 기술이다. 이와 관련하여 예를 들어 문헌[Crystallization Technology Handbook; A. Mersmann; Marcel Decker, Inc.; 1995]을 참조할 수 있다.
본 발명에 따른 공정의 바람직한 실시양태에서, 단계 (a)에서 리보플라빈의 제 1 결정형의 침전은 종자결정, 바람직하게 리보플라빈의 종자결정에 의해 개시된다. 바람직하게 종자결정은 리보플라빈 수화물, 보다 바람직하게 리보플라빈 일수화물, 리보플라빈 이수화물 또는 리보플라빈 사수화물의 종자결정을 포함한다. 가장 바람직하게 리보플라빈의 종자결정은 리보플라빈 일수화물을 포함한다.
바람직하게 단계 (a)에서 침전된 리보플라빈의 제 1 결정형은 적합한 종자결정에 의해 수득되는 리보플라빈 이수화물 또는 리보플라빈 사수화물이다. 바람직하게 리보플라빈의 제 1 결정형은 리보플라빈 이수화물이며, 침전은 바람직하게 리보플라빈 일수화물의 종자결정에 의해 조절된다.
놀랍게도, 리보플라빈 일수화물의 종자결정은 리보플라빈 이수화물의 침전에 적합하다는 것을 발견하였다. 리보플라빈 일수화물의 결정이 물과 접촉될 때, 초포화 수용액(발효배지)에 용해된 리보플라빈은 리보플라빈 이수화물의 결정형으로 즉시 침전된다. 결정형 성질을 조사한 결과, 수분산액에서 결정성 리보플라빈 일수화물이 결정형 리보플라빈 이수화물로 빠르게 전환된다는 것을 발견하였다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 종자결정은 2 내지 10시간, 바람직하게는 4 내지 7시간 후 발효배지에 첨가된다. 바람직하게 종자결정은 바늘에 의해 멸균 병으로부터 발효기로 옮겨진다.
결정성 리보플라빈 일수화물의 제조방법은 종래기술에 공지되어 있다(유럽 특허출원 제 995 749 호-변형 B/C 참조)
결정성 리보플라빈 이수화물은 바람직하게 pH 5 내지 8, 보다 바람직하게 pH 6.5 내지 7에서 리보플라빈의 초포화 수용액에 리보플라빈 일수화물의 종자결정을 첨가시킴으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 하나의 양태는 리보플라빈 이수화물에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 양태는 결정성 리보플라빈 일수화물이 리보플라빈의 포화 수용액에 첨가되는 결정성 리보플라빈 이수화물의 제조방법에 관한 것이다.
결정성 리보플라빈 사수화물은 진공하의 약 40℃에서 리보플라빈의 수용액으로부터 물을 증발시킴으로써 제조될 수 있다. 출발 물질, 즉 리보플라빈의 수용액을 수득하기 위해, 바람직하게 리보플라빈 무수화물 I을 약 0.07g/ℓ의 농도로 탈이온수에 현탁시켰다(실시예 6 참조). 이어서, 포화수를 섬유유리를 갖는 예비 여과기 및 5㎛ 테플론 여과기의 조합을 포함하는 여과기 시스템에 의해 비용해된 결정으로부터 분리할 수 있다. 리보플라빈의 포화 수용액을 회전식 증발기에 함유된 리보플라빈의 용액에 연속적으로 첨가한다. 동시에, 물을 바람직하게 30 내지 60℃, 특히 35 내지 45℃의 온도에서 10 내지 100mbar, 바람직하게 20 내지 25mbar의 진공하에서 증발시킨다. 바람직하게 욕온도는 40℃를 초과하면 안된다. 리보플라빈 용액이 증발기의 플라스크로 연속적으로 이동는 반면, 플라스크에서 용액의 부피는 증발에 의해 일정하게 유지된다. 결정화는 특정한 지점에서 개시된다. 증발이 종료된 후, 슬러리를 여과시킨다. 리보플라빈 사수화물의 습윤 결정은 XRD에 의해 특정화될 수 있다. 본 발명의 하나의 양태는 리보플라빈 사수화물에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 양태는, 물을 진공하의 약 40℃에서 리보플라빈 용액으로부터 증발시키고, 동시에 리보플라빈의 포화수를 회전 증발기에 첨가하는, 리보플로빈 사염화수소의 제조방법에 관한 것이다,
단계 (a)에서 유용한 결정성 리보플라빈 일수화물, 이수화물 및 사수화물 또는 기타 적합한 리보플라빈의 결정형의 종자결정을 수득하기 위한 추가의 공정을 하기에서 설명한다.
본 발명에 따른 공정의 단계 (a)에서, 목적하는 리보플라빈의 제 1 결정형의 성공적인 침전은, 목적하는 결정형, 바람직하게 리보플라빈 일수화물, 리보플라빈 이수화물, 리보플라빈 사수화물, 보다 바람직하게 리보플라빈 일수화물 또는 리보플라빈 이수화물 중에 종자결정이 존재할 것이 요구된다. 또한, 종자결정은 외부로부터 유기체에 의해 발효공정이 오염되지 않도록 멸균시켜야 한다.
리보플라빈의 종자결정은 종자 발효기 또는 또다른 적합한 반응기에서 제조될 수 있다. 출발 물질로서 종자 발효기에 도입되는 리보플라빈은 완전히 희석되어야 한다. 임의의 불순물, 즉 공정의 단계 (a) 이후 목적하지 않은 결정형의 임의의 비용해된 결정은 대개 동일한 목적하지 않은 결정형의 침전을 유발하여 목적하지 않은 중간물질(즉, 리보플라빈의 제 1 결정형)을 수득하도록 유발한다. 특히, 종자결정에서 리보플라빈 무수화물 I의 임의의 불순물은 발효공정동안 리보플라빈 무수화물 I의 침전을 불가피하게 유발하므로, 이를 피해야 한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 리보플라빈의 종자결정은 리보플라빈 일수화물의 형태이다. 제조는 바람직하게 리보플라빈 일수화물로부터 시작된다(유럽 특허출원 제 995 749 호 참조). 이어서, 리보플라빈 일수화물의 결정을, 리보플라빈 일수화물이 리보플라빈 이수화물로 전환되는 조건하의 2 내지 40℃, 바람직하게 10 내지 20℃의 온도에서 물에 현탁시킨다. 결정을 표면수로부터 제거하기 위하여 여과 제거하고 건조시킨다. 결정의 그라인딩(grinding)은 단계 (b) 이후 발효배지에 도입 후 보다 높은 응집률을 유도하는 특이적 표면을 증가시킨다. 이어서, 가공된 결정을 순수한 에탄올 또는 에탄올 및 물의 혼합물로 세척한다.
바람직하게 리보플라빈의 종자결정을 이들이 본 발명에 따른 공정의 단계 (a)에 사용되기 전에 멸균시킨다. 바람직하게 종자결정을 증기 멸균시 멸균시키거나 또는 용매, 바람직하게는 에탄올과 물의 혼합물, 가장 바람직하게는 70% 초과의 에탄올과 물의 혼합물에 의해 멸균시킨다.
종자결정을 증기에 의해 멸균시키는 경우, 리보플라빈 일수화물 또는 리보플라빈 이수화물의 건조 결정을 폐쇄된 시스템에 이동시킨다. 이러한 시스템에서, 결정은 110 내지 150℃, 바람직하게 120 내지 140℃의 온도로 바람직하게 약 30분동안 가열시킨다. 본 발명의 공정에 따른 바람직한 양태에서, 리보플라빈 수화물, 보다 바람직하게 리보플라빈 일수화물 또는 리보플라빈 이수화물의 종자결정을 증기에 의해 바람직하게 120 내지 140℃의 온도에서 멸균시킨다. 놀랍게도, 이러한 조건하에서 종자결정의 결정형은 변화되지 않는다는 것을 발견하였다.
또다른 가능성은 용매에 의해 멸균시키는 것이다. 제 2 멸균 절차는 용매, 예를 들어 알콜, 또는 케톤의 첨가에 의해 수행될 수 있으며, 에탄올 또는 메탄올의 첨가가 바람직하다. 리보플라빈의 종자결정이 실질적으로 용매에 불용성임에 따라, 이후에 용매로부터 여과 제거되는 슬러리가 형성된다. 습윤 결정을 멸균수로 세척하여 잔류 용매를 제거한다. 본 발명에 따른 공정의 바람직한 실시양태에서, 리보플라빈 수화물, 보다 바람직하게는 리보플라빈 일수화물 또는 리보플라빈 이수화물의 종자결정을 에탄올과 물의 혼합물, 바람직하게는 70부피% 내지 90부피%의 에탄올을 함유하는 혼합물에 의해 멸균시킬 수 있다. 놀랍게도, 이러한 조건하에서 종자결정의 결정형은 변화되지 않는다는 것을 발견하였다.
이 시점에서 리보플라빈의 갓 제조된 종자결정은 본 발명에 따른 공정의 단계 (a)에서 사용하기 위해 준비한다. XRD는, 멸균 후 결정형이 변화되지 않는다는 것을 보여준다. 놀랍게도, 멸균된 종자결정이 실온에서 80% 알콜 및 20% 물을 함유하는 용액 중에서 안정하다는 것을 발견하였다. 그러나, 보다 높은 알콜 농도는 결정형의 변화를 유도한다.
본 발명에 따른 공정의 바람직한 실시양태에서, 증기 멸균 및 용매에 의한 멸균은 혼합된다. 바람직하게 종자결정을 오븐에서 100℃ 초과, 바람직하게 약 140℃의 온도에서 약 50분동안 증기에 의해 멸균시킨다. 이어서, 종자결정을 10 내지 200분, 바람직하게 20 내지 40분동안 0 내지 1000중량 등가량, 바람직하게 5 내지 100중량 등가량의 에탄올에 현탁시킨다. 단계 (a)에 사용하기 전에, 바람직하게 0 내지 100부피 등가량의 멸균 H2O를 액체의 보다 양호한 취급을 위해 첨가한다.
본 발명에 따른 공정의 바람직한 실시양태에서 종자결정은 리보플라빈 수화물, 바람직하게 리보플라빈 일수화물 또는 리보플라빈 이수화물을 포함한다. 바람직하게 종자결정을 희석된 리보플라빈의 농도가 리보플라빈 이수화물일 있는(온도에 따라) 보다 가용성인 결정형의 용해도 한계치를 초과할 때 단계 (a)에서 발효배지에 첨가한다. 리보플라빈 이수화물 및 리보플라빈 무수화물 I의 용해도 한계치 초과에서는 리보플라빈 무수화물 I의 준안정성 대역이 존재한다.
리보플라빈 무수화물 I의 자발적 결정화는 일어나지 않는다. 바람직하게, 접종은 36 내지 43℃의 온도 및 배양 배지 중 0.16 내지 0.23g/ℓ의 리보플라빈 농도에서 일어난다.
본 발명에 따른 공정의 단계 (b)에서, 리보플라빈의 제 1 결정형을 분리한다. 이는 단계 (a)가 발효기내에 함유된 조질 반응 슬러리로부터 개시될 때, 바람직하게 생물량의 주요부가 반응 슬러리로부터 제거된다는 것을 의미한다. 바람직하게 리보플라빈의 제 1 결정형을 옮김으로써, 즉 침전물로부터 오버헤드(overhead)의 분리(생물량 분리)에 의해 단리시킨다. 본 발명에 따른 공정의 단계 (b)는 대개 순수한 리보플라빈의 단리를 유발하지 않는다. 일반적으로 단리된 리보플라빈의 제 1 결정형은 추가의 정제단계에서 분리되어야 하는 불순물을 여전히 함유한다. 본 발명은 특히 이러한 불순물의 제거와 관련한다.
본 발명에 따른 공정의 바람직한 실시태양에서, 단계 (a)에서 침전되고 단계 (b)에서 단리된 리보플라빈의 제 1 결정형을 바람직하게 단계 (b) 이후, 바람직하게 단계 (c) 이전에 저온살균시킨다. 바람직하게 저온살균은 단계 (b)에서의 초기의 반응 슬러리 중에 포함된 주요량의 생물량으로부터 분리되는 리보플라빈의 제 1 결정형을 가열시킴으로서 수행된다. 바람직한 실시양태에서 저온살균은 40 내지 80℃, 바람직하게 60 내지 75℃의 온도에서 수행된다. 바람직하게 저온살균은 산성 조건하에서 수행된다. 저온살균은 바람직하게 pH 6 미만, 보다 바람직하게 pH 4 미만에서 수행된다. 리보플라빈의 제 1 결정형의 수현탁액에 첨가될 수 있는 바람직한 산은 무기산, 바람직하게 황산 또는 질산, 또는 유기산, 바람직하게 카복실산, 가장 바람직하게 포름산 또는 옥살산이다.
본 발명의 공정에 따른 단계 (c)에서, 리보플라빈의 제 1 결정형을 희석된 DNA를 분해하는 조건하에서 리보플라빈의 제 2 결정형으로 전환시킨다. 주변온도(바람직하게 23℃)에서 리보플라빈의 제 1 결정형이 리보플라빈의 제 2 결정형보다 열동력학적으로 덜 안정하다는 것이 본 발명에 따른 공정의 필수적인 특징이다. 바람직하게 리보플라빈의 제 1 결정형은 주변온도 초과의 온도에서도 리보플라빈의 제 2 결정형보다 덜 안정적이다.
발효기에서 유전자 조작 미생물을 사용함으로써 재조합 DNA(rDNA)가 배양 배지에 존재한다. 최종 산물의 요구 내역에 따라, 재조합 DNA는 하부스트림동안, 특히 정제단계동안 완전히 제거되거나 또는 분해되어야 한다. 본 설명에서, "DNA"란 용어는 리보플라빈 결정에 포함되고, 리보플라빈 결정의 표면에서 흡수되고, 리보플라빈 결정과 접촉시 안정화되는 임의의 DNA 유형(예를 들어 천연 또는 재조합 DNA)을 포함한다.
리보플라빈 산물에서 DNA의 함량은 표준 PCR(중합효소 연쇄 반응)에 의해 검색될 수 있다. 현재 당분야에서는 PCR을 기재로 하는 분석 툴(tool)을 rDNA의 정의된 서열(예를 들어 200염기쌍을 함유하는 생산 균주의 DNA의 특이 서열의 정의된 서열)을 검색하는데 사용된다. 크로마토그래피 방법, 예컨대 기체 또는 액체 크로마토그래피와 비교할 때, PCR은 크기 순서에 대해 민감하다. 검출 한계치는 다양한 매개변수, 예를 들어 사이클 횟수, 프라이머 유형, 중합효소 종류 등에 따라 좌우된다. 결정성 리보플라빈과 관련하는 정의된 서열의 rDNA와 관련하여, PCR의 특징적인 검출 한계치는 대략 0.2ppb이다. 본 발명에 따른 공정의 바람직한 실시양태에서, 리보플라빈 결정 중에 염기쌍의 길이, 바람직하게는 50 내지 10000염기쌍, 보다 바람직하게는 100 내지 1000염기쌍, 가장 바람직하게는 약 200염기쌍을 갖는 DNA의 함량은 대략 0.2ppb의 검출 한계치 미만으로 감소된다.
희석된 DNA를 분해하는 조건은 종래기술에 공지되어 있다. 10-4 내지 10-3mol/ℓ 초과의 농도의 산의 존재하에서 희석된 DNA는 승온에서 충분히 빠르게 분해된다(문헌[Lindahl T. and Nyberg B.; Rate of Depurination of Native Deoxiribonucleic Acid; Biochemistry, 11, 19(1972) 3610-3618]에 개시된 pH 값에 따른 DNA의 분해도 참조). 약 10-3mol/ℓ 농도의 시트르산이 1시간내에 60℃에서 DNA를 분해시킨다는 것이 보고되었다(문헌[Schriftenreihe des Fonds der Chemischen Industrie zu Forderung der Chemie und Biologischen Chemie im Verband der Chemischen Industrie e.V.; 60329 Frankfurt; Karlstrasse 21; Heft 32, Informationsband "Sicherheitsforschung in der Biotechnologie"] 참조).
본 발명에 따른 공정의 바람직한 실시양태에서, 단계 (c)에서 DNA를 분해하는 조건은 산성 조건이다. 산성 조건은 바람직하게 0.5 내지 50중량%, 바람직하게 2 내지 10중량%의 리보플라빈을 함유하는 수성 슬러리에 현탁된 리보플라빈의 제 1 결정형에 산을 첨가시킴으로써 수득된다. 바람직한 실시양태에서, 산은 황산, 질산, 인산, 염화수소산 및 브롬화수소산으로 이루어진 군으로부터 선택된 무기산 또는 아세트산, 포름산 및 옥살산으로 이루어진 군으로부터 선택된 유기산이다. 수성 슬러리에서 산의 농도는 바람직하게 10-4mol/ℓ보다 높은 농도, 바람직하게 10-4 내지 10-1mol/ℓ의 농도, 가장 바람직하게 약 5x10-4mol/ℓ의 농도이어야 한다. 수성 슬러리의 pH 값은 바람직하게 6 미만, 보다 바람직하게 5 미만, 가장 바람직하게 4 미만이어야 한다.
본 발명에 따른 공정의 또다른 바람직한 실시양태에서 단계 (c)에서 DNA를 분해하는 조건은 염기성 조건이다. 염기성 조건은 바람직하게 0.5 내지 50중량%, 바람직하게 2 내지 10중량%의 리보플라빈을 함유하는 수성 슬러리에 현탁된 리보플라빈의 제 1 결정형에 염기를 첨가시킴으로써 수득된다. 바람직한 실시양태에서, 염기는 NaOH, KOH 및 Ca(OH)2로 이루어진 군으로부터 선택된 무기염기이다. 수성 슬러리에서 염기의 농도는 바람직하게 10-4mol/ℓ보다 높은 농도, 바람직하게 10-4 내지 10-1mol/ℓ의 농도, 가장 바람직하게 약 5x10-4mol/ℓ의 농도이어야 한다. 수성 슬러리의 pH 값은 바람직하게 8 초과, 보다 바람직하게 9 초과, 가장 바람직하게 10 초과이어야 한다.
주로, DNA 분자를 함유하는 수용액이, DNA가 분해되는 조건에 노출될 때, DNA 가닥은 빠르게 분해된다. 그러나, DNA가 완전해 용해되지 않을 경우, 예를 들어 DNA가 결정 격자(교합)의 표면에 흡수되거나 포함될 경우, DNA의 분해는 억제된다.
DNA가 표면에서 흡수되어 안정화된다는 것이 보고되었다. 이러한 연구는 DNA를 흡수하는 상이한 담체를 평가하기 위해 수행되었다. 충분히 강한 흡착은 원자력 현미경의 끝의 공격력을 저지하기 위해 필요하다. 흡착의 성질 및 강도는 또한 이온의 존재에 따라 좌우된다. 특히, 이가 양이온, 예컨대 Mg2+ 및 Ca2+는 안정성에 영향을 준다(문헌[Bezanilla et al.; Adsorption of DNA to Mica, Silylated Mica, and Minerals: Characterization by Atomic Force Microscopy; Langmuir 11 (1995) 655-659] 참조). 다른 연구로부터, 표면에 흡착된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 DNA가 심지어 뉴클리아제의 공격을 저항하는 범위로 안정화될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 안정화도는 주위 용액의 조성물에 의해, 예를 들어 일가 또는 이가 이온의 농도에 의해 영향을 받는다. 낮은 pH 값은 보다 강한 안정화 효과를 갖는 것을 알 수 있다(문헌[Khanna M.; Yoder M.; Calamay L. and Stotzky G.; X-ray diffractometry and electron microscopy of DNA from Bacilus subtilis bound on clay minerals; Sciences of soils (1998) 3: 1] 참조).
놀랍게도, DNA의 불순물, 특히 리보플라빈의 결정과 관련된 rDNA의 분해가 리보플라빈의 결정형의 성질에 의해 강하게 좌우된다는 것을 발견하였다. 리보플라빈 무수화물 I가 발효동안 침전되는 경우 rDNA의 분해가 특히 어렵지만, 하부스트림에서 rDNA의 분해는 발효동안 리보플라빈 이수화물이 형성되는 경우 비교적 빠르다. 임의의 이론과 관련되는 개념없이, 수확된 세포로부터 방출되는 rDNA는 리보플라빈 결정과 강하게 관련된다고 추측된다.
리보플라빈의 결정형의 성질은 하부스트림에서 정제공정의 효율, 특히 분석적 방법, 예컨대 PCR의 검출 한계치 미만의 재조합 DNA(rDNA)의 분해에 매우 영향을 미친다. 리보플라빈의 정제동안 특히 리보플라빈 결정과 관련된 재조합 DNA는, 결정 격자가 정제조건하에서 리보플라빈의 제 1 결정형의 전환에 의해 파괴될 때 빠르게 분해될 수 있다. 놀랍게도, 새로운 리보플라빈의 결정형, 즉 리보플라빈 이수화물이 발견되었다. 리보플라빈 이수화물은 바람직하게 발효공정동안 형성되며, 정제동안 주변온도에서 열동력학적으로 보다 안정한 리보플라빈의 제 2 결졍형으로 전환될 수 있다. 필수 데이터는 목적하는 결정형의 형성을 조절하기 위해 설정된다. 종래기술 공정에서 결정형은 변화되지 않는다. 이러한 사실을 근거로 하여 특히 결정으로부터 재조합 DNA를 제거하는 것과 관련하여 새롭고 보다 효율적인 리보플라빈의 정제방법을 발견하였다.
본 발명에 따른 공정의 바람직한 실시양태에서, 단계 (a)에서 침전되는 리보플라빈의 제 1 결정형은 리보플라빈 이수화물이다. 단계 (b)에서 침전된 결정성 리보플라빈 이수화물은 바람직하게 주요 생물량을 이동시키고, 선택적으로 저온살균시킴으로써 단리된다. 수 중에 단리된 결정성 리보플라빈 이수화물을 현탁시키고 70℃ 초과의 온도로 슬러리를 가열시킬 때, 점도가 유의적으로 증가한다는 것을 관찰하였다. 높은 점도는 고속에서 수분동안 교반시 감소될 수 있다.
상기 처리에 의해 결정성 리보플라빈 이수화물이 결정성 리보플라빈 무수화물 I로 전환되는 것이 X-선 분말 회절에 의해 증명될 수 있다. 또한, 결정 변형은 단침상(10 내지 20㎛) 내지 장침상(50 내지 200㎛)으로 변화한다. 장침상의 형성은 점도의 유의적인 변화를 유발한다. 결정성 리보플라빈의 형성으로, 결정성 리보플라빈 무수화물 I의 형태로 리보플라빈 분자의 재결정화에 의한 결정 격자의 완전한 붕괴가 일어난다. 불순물, 특히 DNA는 유리되고 완전히 방출되며 주위 매질로 희석된다. 소량의 산(바람직하게 pH 4 미만)의 존재하에서 DNA는, 통상의 PCR(50 내지 70℃ 및 pH 4 미만에서 10 내지 30분이내)의 검출 한계치 미만의 범위로 비교적 저온에서 빨리 분해되고, DNA, 특히 rDNA는 리보플라빈 결정에서 검출되지 않을 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 실시태양에서, 단계 (b)에서 리보플라빈의 제 1 결정형으로부터 리보플라빈의 제 2 결정형으로의 전환은 증가된 온도, 바람직하게 60 내지 75℃, 가장 바람직하게 약 70℃의 온도에서 수행된다. 바람직하게 전환은 산성 조건, 가장 바람직하게 pH 4 미만에서 수행된다.
본 발명에 따른 공정의 바람직한 실시양태에서, 단계 (c)는 하기 (i) 내지 (iii)을 사용하여 60 내지 75℃의 온도에서 수행된다:
(i) 무기산, 바람직하게 H2SO4, HNO3, HCl, HBr, 또는 H3PO4; 또는
(ii) 염기, 바람직하게 NaOH, KOH 또는 Ca(OH)2; 또는
(iii) 유기산, 바람직하게 포름산, 아세트산, 옥살산 또는 시트르산.
본 발명에 따른 공정의 바람직한 실시양태에서, 단계 (c)에서 리보플라빈의 제 1 결정형을 함유하는 수성 슬러리를 압출기 교반기가 장착된 반응기로 전환시킨다. 이어서, 바람직하게 충분한 양의 무기산 또는 유기산을 첨가한다. 온도를 바람직하게 자켓에 의해, 바람직하게 60 내지 75℃, 가장 바람직하게 약 70℃로 증가시킨다. 압축기 교반기의 교반 속도를 약 500rpm으로 설정한다. 점도가 상승되자 마자, 교반 속도가 바람직하게 슬러리를 다시 액화시킬 수 있도록 약 2000rmp까지 증가된다. 처리 후 약 20분 후, 슬러리를 여과시킨다. 수득된 결정을 XRD에 의해 특정화하고 rDNA의 함량은 PCR에 의해 분석할 수 있다.
택일적으로, 생물량 분리 및 저온살균 후, 리보플라빈의 제 1 결정형을 함유하는 슬러리를 산성화시키고, 교반화 다단계 추출기에서 일정하게 펌핑(pumping)시킬 수 있다. 교반화 다단계 추출기에서 체류시간은 바람직하게 5 내지 20분이며, 펌핑 비율에 의해 정의될 수 있다. 바람직하게 추출기는 약 70℃의 목적 온도로 자켓에 의해 가열될 수 있다.
본 발명에 따른 공정의 바람직한 실시양태에서, 단계 (c)에서 리보플라빈의 제 1 결정형을 함유하는 슬러리를 교반화 다단계 추출기에 도입시키기 전에 열 교환기에 의해 약 70℃로 예비가열시킨다. 열 교환기는 수초내로 슬러리를 가열시킬 수 있다. 리보플라빈의 제 1 결정형은 바람직하게 열 교환기를 통해 연속적으로 펑핑되어 목적 온도를 빠르게 달성하며, 바람직하게 높은 전단력을 충분히 적용하도록 가열 자켓 및 다단계 교반 시스템이 장착된 튜브를 통해 추가로 펌핑된다. 교반화 다단계 추출기 대신에 고정 혼합기가 장착된 반응기 튜브도 사용할 수 있다.
전환동안 리보플라빈 결정이 용해되어 결정에 함유되거나 관련된 DNA 분자를 유리시킨다. 그러나, 용해된 리보플라빈은 주변온도(바람직하게 23℃보다 높은 온도)에서 리보플라빈의 제 1 결정형보다 열동력학적으로 더 안정한 리보플라빈의 제 2 결정형으로 즉시 결정화된다.
대조적으로, 리보플라빈 무수화물 I의 슬러리를 함유하는 상응하는 발효 액체를 가열할 때, 점도의 증가는 관찰되지 않는다. X-선 회절에 의해 측정된 결정성 구조는 변화되지 않느다. 따라서, 결정형의 변화가 유도되지 않으며, DNA와 관련된 리보플라빈은 용액으로 방출되지 않는다. 리보플라빈 무수화물 I과 관련하여 용매 또는 산성수 중에서 슬러리의 완전한 희석만이 단지 DNA를 유리시킬 수 있다. 그러나, 이러한 조건하에서 DNA는 단지 12시간 이상동안 95℃ 초과의 온도 또는 6시간 이상동안 100℃ 초과의 온도 또는 2시간 이상동안 120℃ 초과의 온도에서 리보플라빈 슬러리를 처리함으로써 PCR 검출 한계치 미만으로 분해될 수 있다.
본 발명에 따른 공정의 바람직한 실시태양에서, 리보플라빈의 제 1 결정형은 리보플라빈 수화물, 바람직하게 리보플라빈 이수화물이고, 리보플라빈의 제 2 결정형은 리보플라빈 무수화물 I이다. 단계 (a)에서 리보플라빈의 제 1 결정형의 침전은 바람직하게 종자결정의 첨가, 보다 바람직하게 리보플라빈 수화물의 종자결정의 첨가, 가장 바람직하게 리보플라빈 일수화물의 종자결정 또는 리보플라빈 이수화물의 종자결정의 첨가에 의해 조절된다.
본 발명에 따른 공정의 바람직한 실시양태에서, 리보플라빈 이수화물은 단계 (a)에서 침전되고(리보플라빈의 제 1 결정형), 이어서, 단계 (c)에서 리보플라빈 무수화물 I(리보플라빈의 제 2 결정형)로 전환된다. 전환 중, rDNA 및 리보플라빈 결정과 관련된 기타 화합물은 주위 매질로 방출된다. 용액에서 용해된 rDNA는 적합한 조건, 예를 들어 용해된 DNA를 분해하는 조건 또는 성분, 예를 들어 무기산 또는 유기산에 의해 쉽게 분해될 수 있다.
본 발명에 따른 공정의 단계 (d)에서 리보플라빈의 제 2 결정형이 단리된다. 바람직하게 리보플라빈의 제 2 결정형을 여과, 원심분리 또는 이동에 의해 단리시킨다. 단계 (d)에서 수득된 결정을 바람직하게 차가운 에탄올 또는 에탄올과 물의 혼합물로 세척시킨 다음, 건조시킨다.
본 발명은 (재조합) DNA가 통상적 PCR의 검출 한계치 미만으로 분해되는, 리보플라빈을 정제 및 결정화하기에 효과적인 공정에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서 본 공정은 적합한 종자결정, 바람직하게 리보플라빈 일수화물 또는 리보플라빈 이수화물의 종자결정이 형성 및 멸균을 포함한다. 바람직한 실시태양에서 리보플라빈의 제 1 결정형, 바람직하게 리보플라빈 이수화물의 침전은, 발효기에서 상기 종자결정에 의해 개시된다. 또한, 본 발명의 공정은 희석된 DNA가 분해되는 조건하에서 리보플라빈의 제 1 결정형, 바람직하게 리보플라빈 이수화물을 리보플라빈의 제 2 결정형, 바람직하게 리보플라빈 무수화물 I로 전환시킴으로써 리보플라빈의 제 1 결정형과 관련된 DNA 분자의 제거를 포함한다. 바람직하게 리보플라빈의 제 1 결정형의 리보플라빈의 제 2 결정형으로의 전환은 산의 존재하에서 현탁된 리보플라빈의 제 1 결정형을 가열시킴으로서 수행된다. 산의 농도는 바람직하게 10-4mol/ℓ 초과이고, 용액의 pH는 바람직하게 6 미만, 보다 바람직하게 5 미만, 가장 바람직하게 4 미만이다.
리보플라빈의 각 결정형, 특히 리보플라빈 무수화물 II, 리보플라빈 무수화물 III, 리보플라빈 이수화물 및 리보플라빈 사수화물은 인간 및 동물 영양, 및 동물 건강 및 인간 건강 분야에 사용될 수 있다.
하기 실시예에서 본 발명에 따른 공정을 보다 더 예시한다.
실시예 1: DVS 및 X-선 회절에 의한 특정화
변형 B/C의 시료(유럽 특허출원 제 995 749 호에 개시된 바와 같음; 리보플라빈 일수화물과 상응함)를 혼합된 DVS-중량측정기 및 혼합된 DVS-x-선 회절에 의해 조사하였다(도 3). 시료를 주변온도 및 52% 상대습도(수증기)에서 고정하였다. 모든 혼합된 방법에서, 상대습도(RH)를 약 96%가 될 때까지 일정하게 증가시켰다. 이어서, 상대습도를 0%까지 일정하게 감소시킨다. 이어서, 상대습도를 52%까지 증가시켜 다시 출발점에 도달시켰다. 이러한 사이클을 2회 반복하였다.
수증기의 증가 또는 감소에 따라 사이클에서 결정성 결합수의 흡수 및 방출은 자기 이력 현상을 따랐다. 자기 이력 현상은 상대습도를 증가시키는 동안 동력학적으로 측정된 흡수 및 상대습도를 감소시키는 동안 결정 수의 지연된 방출에 의해 설명될 수 있다.
상이한 수화물을 유도하는 리보플라빈의 결정형으로 도입되는 물의 이론적인 양은 하기와 같다:
리보플라빈 무수화물로부터 리보플라빈 일수화물: 4.79중량%
리보플라빈 무수화물로부터 리보플라빈 이수화물: 9.57중량%
리보플라빈 무수화물로부터 리보플라빈 삼수화물: 14.36중량%
리보플라빈 무수화물로부터 리보플라빈 사수화물: 19.15중량%
평형 스캔화 X-선 회절은 상이한 상대습도 범위에서 나타나는 결정형에 대해 명확하게 3개 이상의 구별되는 스펙트럼을 나타내었다:
Figure 112006004604712-PCT00006
리보플라빈 무수화물 II는 리보플라빈 무수화물 I과 상이한 X-선 회절그램을 나타내었다. 따라서, 리보플라빈 무수화물 I의 실제의 다형체로서 구분될 수 있다. 상대습도를 증가시킴으로써 결정성 구조는 리보플라빈 일수화물의 형태로 변한다. 상대습도가 20%에 가깝게 도달되는 시점에서 리보플라빈 일수화물의 구조는 여전히 규정되고 있다. 거의 건조된 스폰지에서와 같이, 리보플라빈 결정의 격자에서 몇몇 위치에서만 단지 물분자가 점유하고 있다. 위치는 상대습도를 증가시킴으로써 충진된다. 약 75% 초과의 상대습도에서, 결정 구조가 갑자기 리보플라빈 이수화물의 구조로 변화되고, 리보플라빈 일수화물에 대한 물의 이론적인 양이 흡수된다. 75% 초과의 상대습도에서, 물은 리보플라빈 이수화물의 구조로 빠르게 도입된다. 약 92%의 상대습도에서, 물 흡수는 리보플라빈 이수화물과 상응하는 9.57중량%의 이론적인 양에 도달한다.
물을 상대습도를 감소시킴으로써 일정하게 방출시켰다. 리보플라빈 이수화물의 구조는 20%의 상대습도가 도달될 때까지 그대로 유지되었다. 20%의 상대습도에서, 이수화물의 구조는 리보플라빈 1mol당 약 1.3mol의 물을 여전히 함유하였다. 이어서, 구조는 리보플라빈 무수화물 II로 바로 변화하였다.
3개의 상이한 형태는 라만 분광계에 의해 명확하게 구별될 수 있다.
리보플라빈의 결정형의 제 2 시료를 DVS에 의해 시료 "B/C"를 분석한 것과 동일한 방식으로 분석하였다(도 4). 시료는 미국 특허 제 2,603,633 호에 따라 유형 C로서 구별될 수 있는 결정성 구조를 나타내었다.
2개의 상이한 결정형이 하기 범위로 구별될 수 있다:
Figure 112006004604712-PCT00007
리보플라빈 사수화물의 구조는 유형 C(변형)로서 공지되어 있다. 리보플라빈 무수화물 III은 새로운 결정형이며, 리보플라빈 무수화물 I 및 리보플라빈 무수화물 II 이외의 제 3의 무수 변형이다. 이의 X-선 회절그램은 리보플라빈의 결정형의 모든 기타 회절그램과 상이하였다.
실시예 2: 용해도 및 초포화도를 측정하기 위한 방법
가열 유동 열량계에서 실험을 수행하였다. 가열에 의한 희석 공정 및 냉각에 의한 결정화 공정을 탁도 센서에 의해 검색하였다. 36mg의 리보플라빈 무수화물 I의 결정 또는 60mg의 리보플라빈 일수화물의 결정형 또는 120mg의 리보플라빈 이수화물의 결정을 각각 발효용액에 현탁시키고 0.1℃/분의 비율로 80℃로 가열하였다. 온도를 60분동안 유지시켰다. 이어서, 시스템을 0.1℃/분의 비율로 20℃로 다시 냉각시켰다.
39℃에서 초포화도 곡선의 의존도는 단지 온도와 약한 상관관계이다. 따라서, 또다른 방법(방법 B)을 39℃에서 초포화도를 측정하기 위해 적용하였다: 420mg의 리보플라빈 사수화물의 결정을 현탁시키고 69℃로 가열시킴으로써 완전해 용해시켰다. 리보플라빈의 농도는 0.6mg/㎖였다. 39℃로 다시 냉각시킨 후, 온도를 일정하게 유지시켰다. 3시간 후, 결정화가 천천히 시작되었다(도 2 참조).
동일한 실험을 360mg의 리보플라빈 사수화물의 결정(0.7mg/㎖와 상응함)을 사용하여 수행하였으며 46℃에서 여전히 자발적인 결정화를 유도하였다.
따라서, 39℃에서 초포화도 곡선이 0.6mg/㎖ 미만인 것으로 결론지을 수 있다.
실시예 3: 종자결정의 제조, 멸균 및 접종
10 내지 200분, 바람직하게 20 내지 40분동안 동안 5ml의 에탄올에 현탁된 500mg의 리보플라빈 일수화물의 결정을 오븐에서 50분동안 140℃에서 멸균시키고, 10ml의 멸균 H2O를 액체의 보다 많은 취급을 위하여 첨가하였다. 6시간 후 바늘을 갖는 멸균 병에 의해 현탁액을 생반응기에 첨가하였다. 리보플라빈 이수화물의 결정을 형성시키고 배지에서 모노셉틱(monoseptic)을 유지시켰다. 이러한 실험으로부터, 결정 변형을 리보플라빈 이수화물로 직접 전환이 가능하다는 것을 결론지을 수 있다.
유도된 배지 및 비유도된 배지에서 리보플라빈의 용해성 분획의 측정은 주요한 차리를 나타낸다: 비유도된 배지에서 과포화 용액이 6 내지 9시간 후 수득되었다. 이어서, 1시간내에 용해도가 유의적으로 감소하였다. 유도된 배지의 경우, 이러한 현상이 관찰되지 않았다. 리보플라빈의 용해도(대략 0.4g/ℓ)는 과도하지 않았다. 멸균과정동안 결정의 결정형이 변화되는지의 여부는 x-선 회절에 의해 조절된다.
실시예 4: 배치 작동에 의한 리보플라빈 이수화물의 리보플라빈 결정으로부터 DNA의 제거
생물량의 주요부의 멸균 및 이동 후, 6중량%의 리보플라빈 결정을 함유하는 잔류하는 리보플라빈 슬러리를 무기산, 바람직하게 황산, 질산, 인산 및/또는 유기산, 바람직하게 아세트산, 포름산, 옥살산을 첨가시킴으로써 처리하였다. 산 첨가 후, 슬러리 중 산의 농도는 5x10-4mol/ℓ였다. 산성화 슬러리를 결렬하게 교반하였다.
슬러리를 압축기 교반기로 1.5ℓ 반응기에서 충진하였다. 슬러리를 산성화시키고 온도를 70℃까지 자켓에 의해 증가시켰다. 교반 속도를 500rmp으로 설정하였다. 점도가 증가되자 마자, 교반 속도가 슬러리를 다시 액화시킬 수 있도록 2000rmp까지 증가하였다. 20분동안의 처리 후, 슬러리를 여과 제거하였다. 수득된 슬러리를 XRD에 의해 특정화하였다. rDNA의 함량을 PCR에 의해 분석하였다(도 5 참조).
실시예 5: 연속 작동에 의한 리보플라빈 이수화물의 리보플라빈 결정으로부터 DNA의 제거
실시예 4에 따른 생물량 분리 및 저온살균 후, 슬러리를 산화시키고 교반화 다단계 추출기에서 일정하게 펌핑하였다. 교반화 다단계 추출기에서 체류 시간 5 내지 20분을 펌핑 비율에 의해 정의하였다. 추출기를 자켓에 의해 목적 온도 70℃로 가열할 수 있었다.
상이한 실험에서, 슬러리를 교반화 다단계 추출기에 도입하기 전에 가열 교환기에 의해 70℃로 예비가열하였다. 가열 교환기를 사용하여 슬러리를 수초내에 가열할 수 있었다. 교반화 다단계 추출기 대신에 고정 혼합기가 장착된 반응기 튜브를 사용하였다.
실시예 6
리보플라빈 사수화물의 제조방법은 미국 특허 제 2,603,633 호에 개시되어 있다. 이 공정은 기본적으로 목적하는 사수화물 "유형 C"(변형)를 수득하기 위하여 리보플라빈을 빠르게 침전시킬 수 있는 용매를 사용한다. 이러한 방법에 의해 제조된 시료를 약 100분에 95%의 상대습도에서 리보플라빈 이수화물로 전환시켰다.
리보플라빈 사수화물을 소량으로 제조하는 또다른 공정은 수용액의 증발을 전제로 한다. 공정은 하기에 개시되어 있다:
500mg의 리보플라빈(분석 98중량% 초과, 화학적 제조방법으로부터 제조됨)을 7ℓ의 탈이온수에 용해시켰다. 이어서, 용액을 유리 섬유 여과기 및 5㎛ 테플론 필터로 구성된 사토리어스(Sartorius) 여과기 시스템을 통해 여과시켰다. 이어서, 여과된 용액을 뵈치(Buchi) 회전식 플라스크 증발기 시스템에서 증발시켰다. 20 내지 25mnar의 진공 및 최대 40℃의 욕온도에서 용액을 증발 플라스크로 일정하게 흡수시켰다. 동시에 물을 증발시켰다. 플라스크의 부피를 최대 200ml로 유지시켰다. 결정화는 공정의 말기에서 시작되었다.
마지막으로, 7ℓ 모두를 증발기 플라스크에 흡수시키고 증발시켰다. 증발기 플라스크에서 부피를 약 100ml로 증발시킴으로써 감소시켰다. 이어서, 추가의 세척없이 여과시키고 높은 진공(p<0.05mbar, 최대 35℃)에서 건조시켰다. 이어서, 시료를 x-선 회절에 의해 특정화하여 사수화물의 구조를 확인하였다. 이어서, 시료를 추가의 실험을 위해 사용하였다.
실시예 7
대조군 DNA
생산 균주의 전체 게놈을 PCR 증폭의 양성 대조군으로서 사용하였다. 게놈의 농도는 100ng/㎕ 이하로 사용하였다.
PCR 증폭
2개의 프라이머를 사용하였다. 시료가 0.2ppb보다 높은 농도로 생산 균주의 DNA를 포함할 경우, 프라이머를 사용하여 200염기쌍의 단편을 사용하여 증폭시켰다.
PCR-프로그램
-초기 변성
-45사이클: 40초 94℃
60초 55℃
60초 72℃
마지막으로, 시료를 72℃에서 600초동안 유지시켰다.
추출
50mg의 리보플라빈에 1% 데속시콜레이트를 함유하는 0.5ml의 TE-완충액(pH 8)을 첨가하였다. 10분동안 흔든 후, 0.7ml의 페놀(TE로 포화됨)을 첨가하고 15분동안 다시 흔들었다. 상 분리 후, 50㎕의 수상을 크로마토그래피(마이크로스핀 S200, 암머삼 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech)에 의해 정제하여 잔류 페놀, 데속시콜레이트 및 리보플라빈을 제거하였다.
동정
증폭된 산물을 UV 활성 핵산 균주를 사용하여 아가로즈 겔 전기영동에 의해 동정하여 DNA를 표시하였다.

Claims (12)

  1. (a) 리보플라빈의 제 1 결정형을 침전시키는 단계;
    (b) 리보플라빈의 제 1 결정형을 단리시키는 단계;
    (c) 희석된 DNA를 분해하는 조건하에서 리보플라빈의 제 1 결정형을 리보플라빈의 제 2 결정형으로 전환시키는 단계; 및
    (d) 리보플라빈의 제 2 결정형을 단리시키는 단계
    를 포함하는 리보플라빈의 정제방법으로서, 이때 리보플라빈의 제 1 결정형이 주변온도에서 리보플라빈의 제 2 결정형보다 열동력학적으로 덜 안정한 것을 특징으로 하는 정제방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    단계 (b) 이후, 리보플라빈의 제 1 결정형을 저온살균시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    리보플라빈의 제 1 결정형이 리보플라빈 수화물인 것을 특징으로 하는 정제방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    리보플라빈 수화물이 리보플라빈 이수화물인 것을 특징으로 하는 정제방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    리보플라빈의 제 2 결정형이 리보플라빈 무수화물 I인 것을 특징으로 하는 정제방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (c)에서 희석된 DNA를 분해하는 조건이 산성 또는 염기성 조건인 것을 특징으로 하는 정제방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    산성 조건을 10-4 내지 10-1mol/ℓ의 농도를 갖는 산에 의해 유발시키는 것을 특징으로 하는 정제방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (a)에서 리보플라빈의 제 1 결정형의 침전을 종자결정에 의해 유도시키는 것을 특징으로 하는 정제방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    종자결정이 리보플라빈 수화물의 종자결정을 포함하는 것을 특징으로 하는 정제방 법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    리보플라빈 수화물의 종자결정이 리보플라빈 이수화물의 종자결정 또는 리보플라빈 일수화물의 종자결정인 것을 특징으로 하는 정제방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (c)를, (i) 무기산, (ii) 염기 또는 (iii) 유기산을 사용하여 60 내지 75℃의 온도에서 수행하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (c)에서 리보플라빈의 제 1 결정형을 함유하는 슬러리를 열 교환기를 통해 연속적으로 펌핑(pumping)시키고, 자켓 가열 및 다단계 교반 시스템 또는 고정 혼합기가 장착된 튜브를 통해 추가로 펌핑시키는 것을 특징으로 하는 정제방법.
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