KR20230026494A - 발효 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 효율이 증가하고 환경에 미치는 영향이 작은 지속가능한 발효 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 하나의 발효 공정에서 2개 이상의 발효 산물, 즉 "1차" 발효 산물 및 "2차" 발효 산물, 특히 이때 하나의 발효 산물이 수용성 유기 화합물이고 하나의 발효 산물이 지용성 유기 화합물(특히, 지용성 비타민, 바람직하게는 비타민 K2)인 발효 산물이 생산되고 분리될 수 있는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 효율이 증가하고 환경에 미치는 영향이 작은 지속가능한 발효 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하나의 발효 공정에서 2개 이상의 발효 산물, 즉 "1차(primary)" 발효 산물 및 "2차(secondary)" 발효 산물, 특히 하나의 발효 산물이 수용성 유기 화합물이고 하나의 발효 산물이 지용성 유기 화합물 (특히, 지용성 비타민, 바람직하게는 비타민 K2)인 발효 산물이 생산되고 분리될 수 있는 방법에 관한 것이다.
비타민, 효소, 항생제, 아미노산, 연료를 포함한 많은 제품은 오늘날 화학 합성을 통해 생산되는 것이 아니라 대규모 발효에 의해 생산된다. 생명 공학의 여러 이점 중 일부는 보다 건강한 제품 및 천연 또는 바이오-기반 제품으로 이끄는 저독성 성분의 사용이다. 일반적으로, 이러한 발효 방법에서 숙주 세포(발효 산물의 생산을 가능하게 하는 이종 유전자를 발현하는 유전적으로 변형된 숙주 세포 포함)는 적절한 조건 하에서 배양되고, 발효 산물은 바이오매스로부터 추출/분리된다. 여전히 존재하고 환경에 유해한 재조합 DNA를 제거하기 위해, 상기 바이오매스는 결국 특정 처리 후, 대부분 "처분"되거나 폐기된다.
생명공학적 방법이 더 많은 바이오-기반 제품을 생산하고 있지만, 배양 배지로부터의 발효 산물의 추출은 경제적 및 생태학적 측면과 관련하여 여전히 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 많은 발효 산물(예를 들면, 비타민 K2)의 분리는 효율적인 추출 전에 (예를 들면, 당 업계에 공지된 바와 같이 초임계 CO2를 통하는 것과 같은) 바이오매스의 건조를 필요로 하고, 따라서 일반적으로 매우 비용이 많이 드는 절차이다. 현장에서 일반적으로 사용되는 헥산 또는 헵탄을 포함한 용매의 사용(식품 응용 분야에는 금지됨) 또한, 환경 및 건강에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 피해야 한다.
뿐만 아니라, 특히 UN의 지속 가능한 개발 목표(UN Sustainable Development Goals)를 달성하기 위해, 폐기물 및 온실 가스 배출의 감소에 대한 강한 필요성이 존재한다. 즉, 더 환경-친화적이고 지속가능한 생산 방법, 예컨대 공지된 방법과 비교하여 비독성 또는 저독성의 절차를 사용하는 지속 가능한 방식으로, 바이오매스를 재활용하고/하거나 상기 바이오매스로부터 가치 있는 화합물을 추출하는 방법을 찾아야 한다.
놀랍게도, 우리는 이제 유기 화합물의 발효 생산을 최적화하는 방법을 발견했고, 여기서는 하나의 (공통) 숙주 세포를 사용하는 하나의 발효 공정으로써, 2개 이상의 가치 있는 발효 산물, 즉 “1차” 발효 산물 및 “2차” 발효 산물, 특히 하나의 발효 산물이 수용성이고 하나의 발효 산물이 지용성인 발효산물을 수득할 수 있다.
특히, 본 발명은, 하나의 발효 산물은 수용성이고 하나의 발효 산물은 지용성(특히 지용성 비타민, 바람직하게는 비타민 K, 더 바람직하게는 비타민 K2)인 2개 이상의 발효 산물을 공동-생산할 수 있는 적합한 숙주 세포에서의 공동-발효 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 1차 발효 산물이 수용성이고 2차 발효 산물이 지용성이다.
본 개시내용에서, 용어 "하나의 발효 공정"은, 1차 발효 산물이 형성되는 방식으로 적절한 배양 조건 하에서 적합한 숙주 세포를 배양하고, 상기 1차 발효 산물이 생산 스트림으로부터 분리되고(isolated), 즉 바이오매스로부터 분리되고(separated), 추가적으로, 상기 바이오매스로부터 2차 발효 산물이 추출되는 것을 의미한다. 용어 “하나의 발효 공정” 및 “공동-발효 방법”은 본 개시내용에서 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 또한 하나의 숙주 세포를 사용한 2개 이상의 발효 산물의 공동-생산을 포함할 수 있고, 두 발효 산물은 동시에 추출되거나 분리되고(isolated), 나중에 분리된다(separated).
본 개시내용에서, “가치 있는 발효 산물”은 비타민, 효소, 올리고당, 또는 아미노산으로부터 선택되는 수용성 및/또는 지용성 유기 화합물 모두로부터 선택될 수 있으며, 특히 이러한 발효 산물 중 하나는 수용성 화합물이고 이러한 발효 산물 중 하나는 지용성 화합물이다. 본 발명의 범위 내에서 적합한 효소는 프로테아제(protease), 아밀라아제(amylase), 글루코시다제(glucosidase), 셀룰라아제(cellulase) 등으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 범위 내에서 적합한 아미노산은 라이신, 트립토판, 또는 글루탐산 일나트륨(monosodium glutamate)으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 범위 내에서 적합한 비타민은 수용성 또는 지용성 비타민, 예를 들어, 비타민 B2 (리보플라빈), 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B12, 비타민 B3, 비타민 B1, 비타민 D, 비타민 K, 또는 비타민 B7, 특히 비타민 B2, B5, B6, B12, 비타민 K, 특히 비타민 K2, 보다 특히 비타민 B2 및 비타민 K2로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은, 하나 또는 둘 이상의 비타민이 공동-생산되고, 특히 발효 산물 중 하나 이상이 수용성 비타민이고 발효 산물 중 하나가 지용성 비타민, 특히 비타민 K, 바람직하게는 비타민 K2인, 공동-발효 방법에 관한 것이다. 특히, 1차 발효 산물은 예를 들면, 비타민 B2, 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B12, 비타민 B3, 비타민 B1, 또는 비타민 B7, 특히 비타민 B2, B5, B6, B12로 이루어진 군으로부터 선택된 비타민, 보다 특히 비타민 B2인, 수용성 비타민으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 1차 발효 산물은 예를 들면, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)와 같은 바실러스(Bacillus)에서 생산되는 비타민 B2이다 (비타민 B2의 생합성에 대해서는, 예를 들어, EP 405370, EP 1186664의 도 2, 또는 문헌[Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 7th ed., 2007, Chapter Vitamins]를 참조한다).
따라서, 바람직한 실시양태에서, 1차 발효 산물은 수용성 비타민, 더 바람직하게는 비타민 B1, B2, B3, B5, B6, B7, B12로부터 선택되는 비타민, 가장 바람직하게는 비타민 B2이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은, 하나 또는 둘 이상의 비타민이 공동-생산되고, 특히 하나 이상의 발효 산물이 지용성 비타민이고, 특히 지용성 비타민이 2차 발효 산물로서 생산되고, 상기 2차 발효 산물이 1차 발효 산물의 바이오매스 또는 “생산 스트림”으로부터 추출되는, 즉 상기 2차 발효 산물이 1차 발효 산물(특히, 1차 발효 산물이 상기에 정의된 수용성 비타민으로부터 선택되는)의 발효 생산 동안에 생성된 바이오매스로부터 추출되는, 공동-발효 방법에 관한 것이다. 이러한 지용성 비타민의 예는 비타민 K이고, 천연형 중 하나로서, 메나퀴논(menaquinone)으로도 알려진 비타민 K2가 바람직하며, 더 바람직하게는 다른 동형체(isoform)와 비교했을 때 약 80% (중량/중량) 이상 백분율의 MK-7을 가지는 동형체로서, MK-7, MK-4, MK-6, MK-3을 포함하는 비타민 K2가 바람직하다.
본 개시내용에서, 발효 방법의 맥락에서 용어 “생산 스트림”은 원하는 발효 산물 (즉, 본 개시내용에서 정의되는 것과 같은 적어도 1차 및 2차 발효 산물)을 포함하는 물질 스트림을 의미한다.
따라서, 본 발명은 2개 이상의 발효 산물의 공동-생산에 관한 것으로, 이때 하나의 발효 산물은, 예를 들면, 본 개시내용에서 정의된 1차 발효 방법의 생산 스트림으로부터 추출 또는 분리를 통해, 2차 발효 산물로서 생산된 비타민 K2이고, 상기 비타민 K2는 약 80% (중량/중량) 이상의 백분율, 예를 들면 약 85, 90, 92, 95, 96, 98, 99 이상의 범위, 또는 심지어 100% (중량/중량)의 백분율의 MK-7을 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 2개 이상의 발효 산물의 공동-생산에 관한 것으로, 이때 하나의 발효 산물은, 예를 들면, 본 개시내용에서 정의된 1차 발효 방법의 생산 스트림으로부터 추출 또는 분리를 통해, 2차 발효 산물로서 생산된 비타민 K2이고, 상기 비타민 K2는 비타민 K2와 같은 발효 산물의 g당, 10ng 이하의 DNA, 특히 재조합 DNA의 비율을 포함하고, 바람직하게는 상기 비타민 K2는 약 80% (중량/중량) 이상의 백분율, 예를 들면 약 85, 90, 92, 95, 96, 98, 99 이상의 범위, 또는 심지어 100% (중량/중량)의 백분율의 MK-7을 포함한다.
따라서, 본 발명은, 공지된 PCR 방법으로 측정시 약 10 ng/발효 산물 g (예를 들면, 본 개시내용에서 정의된 2차 발효산물로서의 바이오-기반 비타민 K2와 같은) 범위의 최종 농도까지 재조합 DNA가 제거되는, 유전적으로 변형된 또는 재조합 미생물을 사용하는 발효 방법에 특히 유용하다.
한 실시양태에서, 본 발명은 2개 이상의 발효 산물의 공동-생산에 관한 것으로, 이때 하나의 발효 산물은, 본 개시내용에서 정의된 1차 발효 방법의 생산 스트림으로부터, 예를 들면 추출 또는 분리를 통해, 2차 발효 산물로서 생산된 비타민 K2이고, 상기 비타민 K2는, 비타민 K2와 같은 발효 산물의 1g당 1 콜로니 형성 단위(CFU)의 생산 균주, 특히 재조합 생산 균주의 비율을 포함하고, 바람직하게는 상기 비타민 K2는, 발효 산물의 g당 10ng 이하의 DNA, 특히 재조합 DNA의 비율을 포함하고/하거나, 약 80% (중량/중량) 이상의 백분율, 예를 들면 약 85, 90, 92, 95, 96, 98, 99% 이상의 범위, 또는 심지어 100% (중량/중량)의 MK-7의 백분율을 포함한다.
CFU는, 일반적으로 당 업계에 공지된 바와 같이, 예를 들면, 한천평판(agar-plate) 상에 산물을 플레이팅하고, 생산 균주의 성장을 허용하는 대표적인 조건 하에서 한천평판을 인큐베이션하고, 이어서 (DNA 시퀀싱에 의해) 평판 상의 콜로니가 생산 균주인지 확인하는 것과 함께, 콜로니의 양을 카운팅함으로써, 시각적으로 카운팅하여 측정된다.
적합한 숙주 세포는 락토코커스(Lactococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 엔테로코커스(Enterococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 스트렙토코커스(Streptococcus), 바실러스(Bacillus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 슈도모나스(Pseudomonas), 플라보박테리움(Flavobacterium), 엘리자베스킹기아(Elizabethkingia) 또는 에쉐리키아(Escherichia)의 균주로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 바실러스로부터 선택될 수 있고, 더 바람직하게는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(B. amyloliquefaciens), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 리첸니포르미스(B. licheniformis), 바실러스 서브틸리스 나토(B. subtilis natto), 바실러스 폴리믹사(B. polymyxa), 바실러스 퍼무스(B. firmus), 바실러스 메가테리움(B. megaterium), 바실러스 세레우스(B. cereus), 바실러스 투린지엔시스(B. thuringiensis)로부터, 또는 플라보박테리움(Flavobacterium) 속, 플라보박테리움 메닌고셉티쿰(Flavobacterium meningosepticum), 엘리자베스킹기아 메닌고셉티카(Elizabethkingia meningoseptica), 대장균(E. coli), 락토코커스 락티스 아종 락티스(Lactococcus lactis ssp. lactis), 락토코커스 락티스 아종 크레모리스(Lactococcus lactis ssp. Cremoris), 플라보박테리움 메닌고셉티쿰(Flavobacterium meningosepticum) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)으로부터 선택된 균주로부터 선택될 수 있다. 가장 바람직하게는, 숙주 세포가 바실러스로부터 선택되고, 특히 바실러스 서브틸리스이다.
따라서, 본 발명은, 상기에 기재된 공동-발효에서 적어도 1차 및 2차 발효 산물, 특히 지용성 비타민(예를 들어, 본 개시내용에서 정의된 바와 같은 비타민 K2)과 함께 수용성 비타민(예를 들어, 비타민 B2)이 생산되고, 상기 공동-발효는 락토코커스, 락토바실러스, 엔테로코커스, 류코노스톡, 스트렙토코커스, 바실러스, 코리네박테리움, 슈도모나스, 플라보박테리움, 엘리자베스킹기아, 및 에쉐리키아로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리첸니포르미스, 바실러스 서브틸리스 나토, 바실러스 폴리믹사, 바실러스 퍼무스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 세레우스, 바실러스 투린지엔시스, 플라보박테리움 메닌고셉티쿰와 같은 플라보박테리움 속, 엘리자베스킹기아 메닌고셉티카, 대장균, 락토코커스 락티스 아종 락티스, 락토코커스 락티스 아종 크레모리스, 플라보박테리움 메닌고셉티쿰 또는 코리네박테리움 글루타미쿰으로 이루어진 군으로부터 선택된 적합한 숙주 세포 내에서 수행되는 공동 발효에 관한 것이다. 가장 바람직하게는, 숙주 세포가 바실러스 서브틸리스이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 예를 들면, rib 유전자의 전사를 향상시키기 위해 강한 프로모터 Pspo15로 변형된 rib 오페론을 암호화하는 다수의 (n개의) pRF69 복제부(예를 들어 약 5 내지 약 20 개의 복제부)를 함유하는 바실러스 서브틸리스 RB50::[pRF69]n 와 같은 바실러스 서브틸리스 내에서, 1차 발효 산물로서의 비타민 B2의 발효 생산을 포함한다. (비타민 B2 생성을 야기하는 균주의 구성 및 배양조건은 예를 들어, EP 405370 또는 문헌[Perkins et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 22:8-18, 1999] 참조.) 비타민 B2의 생산을 증가시키기 위해, 균주는 하기와 같은 추가적인 변형을 수행할 수 있다: 예를 들면, 하나 이상의 리보플라빈 생합성 유전자(들)(특히 ribA)의 과발현; 바실러스 서브틸리스 균주 RB50에서 구현되는 것과 같은, 숙주 세포 내의 다수의 rib 오페론 복제부의 도입 (예를 들어 EP 405370 참조); rib 오페론과 강한 프로모터의 융합; 피리독살 포스파타제(pyridoxal phosphatase)의 이종 발현[EC 3.1.3.74]; 예를 들면 비오틴(biotin)에 대한 (예를 들어, EP1186664에 기술된 바와 같은) 영양요구성 도입을 통한 리보플라빈 생산에서 성장물의 분리(decoupling) 및/또는 (예를 들어, WO2007051552에 기술된 바와 같은) 변형된 트랜스케톨라아제(transketolase) 유전자의 도입 및/또는 (예를 들어, WO2010052319에 기술된 바와 같은) 변형된 rib 선도 서열의 사용의 조합. 당업자는 각각의 발효 산물, 특히 1차 발효 산물이 되는 비타민 B2의 생산을 증가시키기 위해 생산 균주를 어떻게 조작하는지 알고 있고, 이를 본 개시내용에 기재된, 특히 2차 발효 산물로서의 비타민 K2와의 공동-발효에 어떻게 사용하는지 알고 있다.
본 개시내용에서 사용되는 용어 "폐 바이오매스" 또는 "가치 없는 폐 스트림"은 적어도 1차 및 2차 발효 산물의 회수 후 남은 바이오매스를 정의하며, 이는 처분될 수 있거나, 비료로서 또는 추가로 가치 있는 유기 화합물의 추출을 위해 추가로 사용될 수 있다.
한 특정 실시양태에서, 본 발명은, 본 개시내용에서 정의된 바와 같은 1차 및 2차 발효 산물의 공동-발효에서, 둘 다 또는 단지 하나의 발효 산물(들)이 세포 내부에서 또는 세포막에서 생산되거나, 하나 이상의 발효 산물이, 특히 1차 발효 산물이, 결정 형태로 숙주 세포 외부로 분비되는 공동-발효에 관한 것이다. 특히, 1차 발효 산물(예를 들면, 비타민 B2)은 세포 외부로 분비되는 반면, 2차 발효산물은 세포막에서 생산되어 바이오매스로부터(즉, 본 개시내용에서 정의된 발효 방법의 생산 스트림으로부터) 2차 발효산물(예를 들면, 비타민 K2)로서 회수된다.
한 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 하기 단계를 비제한적으로 포함하는 여러 단계를 포함한다:
(a)
1차 발효 산물에 따라 적절한 조건 및 적절한 배양 배지 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 특히 1차 발효 산물이 비타민, 아미노산, 효소 또는 올리고당으로부터, 바람직하게는 수용성 비타민으로부터, 더 바람직하게는 비타민 B1, B2, B3, B5, B6, B6, 또는 B12로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 B2인, 단계,
(b)
생산 스트림으로부터 상기 1차 발효 산물을 분리하는 단계, 즉 1차 발효 산물을 바이오매스로부터 분리하는 단계,
(c) 발효 방법의 생산 스트림으로부터, 즉 1차 발효 산물의 발효/생산동안 생성된 바이오매스로부터 본 개시내용에서 정의된 바와 같은 2차 발효 산물, 특히 비타민 K와 같은 지용성 비타민, 특히 비타민 K2를 회수하는 단계, 및 임의적으로
(d) 발효 산물(들)을 정제하는 단계.
임의적으로, 단계 (d)로부터의 폐 바이오매스는 처분될 수 있거나 추가로 가치 있는 유기 화합물의 추출을 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 발효 산물(즉, 1차 및 2차 발효 산물) 모두를 예를 들면 결정 형태와 같은 고체 형태로 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 (1차 고체 발효 산물로서의) 비타민 B2 및 (2차 고체 발효 산물로서의) 비타민 K2의 공동-생산에 관한 것으로, 이때 두 산물 모두 고체이고, 하나의 발효 산물은 숙주 세포 외부로 배출되며 하나는 세포 내에 축적된다.
추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 발효 산물(즉, 1차 및 2차 발효 산물)을 제공하되, 산물 중 하나는 고체 형태이고 다른 산물은 액체 형태이며, 이때 액체 분획은 바이오매스/생산 스트림으로부터 분리될 수 있다.
상기에서 정의된 공동-발효 방법은 예를 들면, 1차 발효 산물(비제한적으로 비타민 B2의 생산을 포함)에 따라 회분식(batch), 유가식(fed-batch), 또는 연속 모드로 수행될 수 있으며, 더 바람직하게는 EP405370 또는 WO2007051552에 따라 숙주 세포로서 바실러스 서브틸리스를 사용하는 방법으로 수행된다.
상기 정의된 바와 같은 적합한 숙주 세포의 배양은 예를 들어 숙주, 1차 발효 산물, pH, 온도 및 사용될 영양 배지에 따라 달라질 수 있다. 숙주 세포로서 바실러스 서브틸리스를 사용한 리보플라빈 생산의 경우, 배양 과정은 미생물에 따라, 약 10시간 내지 약 10일 동안, 바람직하게는 약 4 내지 약 7일 동안, 더 바람직하게는 약 2 내지 약 6일 동안 수행될 수 있다. 당업자는 본 발명과 관련하여 사용되는 적합한 미생물/숙주 세포의 최적의 배양 조건을 주지하고 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 공동-발효 방법은 예를 들면 약 7.0, 바람직하게는 약 6 내지 약 8의 범위, 더 바람직하게는 약 6.5 내지 7.5 범위의 pH에서 수행될 수 있다. 배양을 수행하기 위한 적절한 온도 범위는 예를 들면, 약 13℃ 내지 약 70℃, 바람직하게는 약 30℃ 내지 약 39℃, 보다 바람직하게는 약 35℃ 내지 약 39℃, 가장 바람직하게는 약 36℃ 내지 약 39℃일 수 있다. 성장을 위한 배양 배지는 일반적으로, 예를 들면, D-글루코스, 글리세롤, 진한 주스(thick juice), 덱스트로스(dextrose), 전분, 수크로스(sucrose), 또는 리보오스와 같은 3, 5, 또는 6개의 탄소 원자로 구성된 화합물을 포함한 동화 가능한 탄소 공급원, 및 유기 물질(예를 들면, 펩톤, 효모 추출물 및 아미노산)과 같은 소화 가능한 질소 공급원과 같은 영양소를 함유할 수 있다. 배지는 요소 및/또는 옥수수 침지액 및/또는 빵 효모를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 예를 들면, 질산염 및 암모늄 염과 같은 다양한 무기 물질이 또한 질소 공급원으로 사용될 수 있다. 또한, 성장 배지는 일반적으로 예를 들어, 황산마그네슘, 황산망간, 인산칼륨, 및 탄산칼슘과 같은 무기 염을 함유할 수 있다. 상기 기재된 절차를 사용하여 수득된 세포는, 이어서, 상기 기재된 것과 본질적으로 동일한 방식, 온도 및 pH 조건에서, 상기에 기재된 것과 같은 기질의 존재 하에서, 이러한 기질을 비타민, 올리고당, 아미노산, 또는 효소를 포함하는 원하는 (1차) 발효 산물, 예를 들면 수용성 비타민(바람직하게는 비타민 B2)으로 전환시키는 방식으로 추가로 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션은 예를 들면, 유기 질소 공급원(예를 들어, 펩톤, 효모 추출물, 제빵 효모, 요소, 아미노산, 및 옥수수 침지액), 또는 무기 질소 공급원(예를 들어, 질산염 및 암모늄 염)을 함유하는 질소-풍부 배지에서 수행될 수 있고, 이 경우 세포는 원하는 1차 발효 산물이 생산되는 동안 더 성장할 수 있을 것이다. 대안적으로, 인큐베이션은 질소-부족 배지에서 수행될 수 있고, 이 경우 세포는 실질적으로 성장하지 않을 것이고, 휴지 세포 모드, 또는 생물변환(biotransformation) 모드에 있을 것이다. 모든 경우에, 인큐베이션 배지는 또한 무기 염(예를 들어, 황산 마그네슘, 황산 망간, 인산 칼륨, 및 염화 칼슘)을 함유할 수도 있다. 당업자는 숙주 세포 및 생산된 발효 산물(들)에 따라 어떤 조건을 적용해야 하는지 주지하고 있을 것이다. 리보플라빈의 발효 생산에 적절한 배지의 예는 WO2004113510에 기재되어 있고(VF-배지), 이는 바실러스에 대하여 특히 유용하며 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다.
발효 산물에 따라, 상기에 정의된 바와 같은 바이오매스로부터의 1차 발효 산물의 분리(즉, 생산 스트림으로부터 산물의 추출)은 하기와 같이 상이한 방식으로 수행될 수 있다: 1차 발효 산물이 세포 외부로 (예를 들어, 결정, 예컨대 비제한적으로 비타민 B2의 형태로) 배출되는 경우, 분리는 예를 들어, 70°C에서 4시간 동안 가열하는 것과 같은 저온살균 단계에 이어서, 비제한적으로 경사분리(decantation)를 포함하고 원심 분리에 의한 회수를 포함하는 하나 이상의 고체-액체 분리 단계(들)를 포함할 수 있다(예를 들어, WO2005014594 참조). 저온살균된 브로쓰(broth)의 가공은 예를 들어, 1차 발효 산물로서 비타민 B2의 경우에 바람직한 것과 같이 경사분리를 통해 수행될 수 있다. 리보플라빈 결정과 같은 결정은 임의적으로 공지된 방법에 따라 추가로 정제될 수 있다. 임의적인 추가 정제 단계 이후에, 정제된 물질은 식품/사료/제약 또는 화장품 산업에 성분으로서 사용될 수 있다. 하나의 매우 구체적인 실시양태에서, 발효 브로쓰의 리터(l) 당 약 280mg 이상 양의 리보플라빈이 수득될 수 있다.
2차 발효 산물의 회수는 1차 발효 산물의 발효로부터 수득된 바이오매스 또는 생산 스트림으로부터 추출/회수를 통해 수행될 수 있고, 상기 추출/회수는 지속가능한 방식, 특히 추출 방법은 헥산 등과 같은 환경 문제가 있는 용매 없이 수행된다.
따라서, 본 발명은, 헥산-비함유 용매, 바람직하게는 수용액 (수성 에탄올 용액), 특히 약 80% (중량/중량) 이상 비율의 에탄올(예를 들면, 약 85, 90, 82, 94, 95, 96, 97, 98 이상 또는 심지어 100%(중량/중량) 에탄올) 수성 에탄올 용액을 사용하여, 1차 발효 산물의 생산 동안에 수득된 바이오매스로부터 추출되는 것과 같이, 생산 스트림으로부터 2차 발효 산물이 분리되는 공동-발효 방법에 관한 것이다. 상기 단계에 사용되는 추가적인 적절한 용매는 이소프로판올 또는 아세톤을 포함하는 수용액으로부터 선택될 수 있다.
한 특정 실시양태에서, 회수된 1차/2차 발효 산물은 예를 들어, 미세여과, 한외여과(ultrafiltration) 및/또는 나노여과를 포함하는 1회 또는 여러회 여과 단계를 수행함으로써 추가로 정제될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 예를 들어 10kDA 미만의 범위와 같은 낮은 컷오프(cut off)를 갖는 막을 사용하여, 여과가 수행된다. 임의적으로, 용매를 추가로 증발시키고, 냉각 단계 후에 1차/2차 발효 산물의 결정을 분리한다. 하나의 매우 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용에서 정의된 바와 같은 2차 발효 산물로서의 바이오-기반 비타민 K2의 결정은 약 80%(중량/중량) 이상의 MK-7 백분율로 분리된다.
예를 들어 비타민 B2와 같은 1차 발효 산물 및 예를 들어 비타민 K2와 같은 2차 발효 산물, 즉 두 바이오-기반 산물은, 추가로 본 발명에 따라 생성된 이러한 비타민 B2 및/또는 비타민 K2 결정을 포함하는 영양 제품(예를 들어, 식품, 사료, 화장품에 사용되는 조성물)으로서 사용될 수 있다.
본 발명은, 당 업계에 공지된 PCR 방법을 통해 측정될 수 있는 재조합 DNA의 양이 발효 산물의 g당 약 10ng 이하 범위로 감소되는 발효 산물, 특히 비타민 K2에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 산물의 희석, 인큐베이션, 및 플레이팅을 통해 측정될 수 있고 당 업계에 공지된 바와 같은, 생산 균주로부터 유래된 DNA의 양이, 산물의 g당 약 1 CFU 미만의 범위로 감소되는 발효 산물, 특히 비타민 K2에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은, 약 80%(중량/중량) 이상 범위, 바람직하게는 약 85, 90, 92, 95, 96, 98, 99% 이상 범위, 또는 심지어 100%(중량/중량) 비율의 MK-7을 포함하고, 특히 PCR로 측정 시 DNA, 바람직하게는 재조합 DNA의 최대 함량이 예를 들어 비타민 K2의 g당 약 10ng 범위의 DNA인 발효 산물, 특히 비타민 K2에 관한 것이다. 비타민 K2와 같은 2차 발효 산물은 추가로 미량으로 존재하는 동형체(예를 들어, MK-4, MK-5, MK-6)를 약 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1%(중량/중량) 미만의 양으로 포함할 수 있다. 비타민 K2 및 이의 동형체의 분석은 당 업계에 공지된 바와 같이 또는 실시예에서 추가로 기재되는 바와 같이 HPLC를 통해 수행될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 예를 들어, 본 개시내용에 정의된 대로, 약 80%(중량/중량) 이상의 MK-7 및 약 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1%(중량/중량) 이하의 MK-4, MK-5, 및 MK-6을 함유하는 결정과 같은 바이오-기반 비타민 K2를 포함하는 영양 제품의 생산에 관한 것으로, 특히, 본 발명에 따라 생산된 바이오-기반 비타민 K2를 포함하는, 식품, 사료, 또는 화장품으로서 또는 거기에 사용되는 조성물, 예컨대 고체 또는 액체 제제(예를 들어, 고체 입자)의 제조에 관한 것이다.
식품, 사료, 또는 화장품 제제에 사용되는 본 발명에 따라 생산된 바이오-기반 비타민 K2는 식품, 사료, 또는 화장품 산업에서의 최종 적용에 따라, 당 업계에 공지된 바와 같이, 캡슐화제, 유기 용매(들), 오일(들), 초임계 유체, 항산화제(들), 당, 공-결정화제(들), 코아세르베이트(coacervate)(들), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분과 혼합될 수 있다.
본 개시내용에 정의된 바이오-기반 비타민 K2를 포함하는 제제에 사용되는 적합한 캡슐화제는 비제한적으로 변형된 (식품) 전분, 아스코빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate), 펙틴(pectin), 알지네이트(alginate), 카라기난(carrageenan), 퍼셀라란(furcellaran), 덱스트린(dextrin) 유도체, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체(예를 들어, 셀룰로스 아세테이트, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스), 리그노설포네이트(lignosulfonate), 다당류 검류(gums)(예를 들면, 아카시아 검/아라비아 검, 변형된 아카시아 검, TIC 검, 아마씨(flaxseed) 검, 가티(ghatti) 검, 타마린드(tamarind) 검 및 아라비노갈락탄(arabinogalactan)), 젤라틴(소, 생선, 돼지고기 , 가금류), 식물성 단백질(예를 들어, 완두콩, 콩, 피마자씨, 목화, 감자, 고구마, 카사바, 유채, 해바라기, 참깨, 아마인, 홍화, 렌틸콩, 견과류, 밀, 쌀, 옥수수, 보리, 호밀, 귀리, 루핀 및 수수), 우유 또는 유장(whey) 단백질을 포함한 동물성 단백질, 레시틴(lecithin), 지방산의 폴리글리세롤 에스터, 지방산의 모노글리세리드, 지방산의 다이글리세리드, 소르비탄 에스터, 및 당 에스터(및 이의 유도체), 특히 말토덱스트린, 변형된 식품 전분 또는 검류(예를 들어, 아카시아 검)를 포함한다.
본 개시내용에서 정의된 비타민 K2를 포함하는 제제에 사용되는 적합한 유기 용매는 비제한적으로 할로겐화 지방족 탄화수소, 지방족 에테르, 지방족 및 환형 카보네이트, 지방족 에스터 및 환형 에스터(락톤), 지방족 및 환형 케톤, 지방족 알코올 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 할로겐화 지방족 탄화수소의 유용한 예는 모노- 또는 폴리할로겐화 선형, 분지형, 또는 환형 C1- 내지 C15-알칸, 특히 모노- 또는 폴리염화 또는 브롬화 선형, 분지형, 또는 환형 C1- 내지 C15-알칸, 바람직하게는 모노- 또는 폴리염화 선형, 분지형, 또는 환형 C1- 내지 C15-알칸, 가장 바람직하게는 메틸렌 클로라이드 또는 클로로폼을 포함할 수 있다. 지방족 또는 환형 에스터의 유용한 예는 에틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, n-부틸 아세테이트, 또는 
-부티로락톤을 포함할 수 있다. 지방족 또는 환형 케톤의 유용한 예는 아세톤, 다이에틸 케톤, 또는 이소부틸 메틸 케톤, 또는 사이클로펜타논, 또는 이소포론을 포함할 수 있다. 환형 카보네이트의 예는 에틸렌 카보네이트, 프로필렌 카보네이트, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 지방족 에테르의 예는 알킬 부분이 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 다이알킬 에테르를 포함할 수 있다. 하나의 바람직한 예는 다이메틸 에테르이다. 적합한 지방족 알코올의 예는 에탄올, 이소프로판올, 프로판올, 또는 부탄올이다.
본 개시내용에서 정의된 바이오-기반 비타민 K2를 포함하는 제제에 사용되는 적합한 오일(즉, 트라이글리세리드)은 비제한적으로 오렌지 오일, 리모넨 등을 포함한다.
본 개시내용에서 정의된 비타민 K2를 포함하는 제제에 사용되는 적합한 항산화제는 비제한적으로 예를 들어, 당업계에 공지된 바와 같은 토코페롤, 아스코브 산 및/또는 이들의 유도체로부터 선택되는, 수용성 또는 지용성 항산화제를 포함한다.
본 개시내용에서 정의된 비타민 K2를 포함하는 제제에 사용되는 적합한 공-결정화제는 비제한적으로 당 업계에 공지된 바와 같은 아미노산, 가용성 향상제, 및 소분자(small molecules)를 포함한다.
본 개시내용에서 정의된 비타민 K2를 포함하는 제제에 사용되는 적합한 코아세르베이트는 비제한적으로 예를 들어, 효소 결합 촉매를 통해 달성되는 효소의 가교결합 단계를 포함한다.
본 개시내용에서 정의된 바이오-기반 비타민 K2를 포함하는 고체 조성물(예를 들어, 고체 입자 또는 마이크로캡슐)을 제조하는 방법은 예를 들어, CN101422446, WO2007045488, 또는 WO2015169816에 공지 및 개시되어 있다. 본 개시내용에서 정의된 이러한 고체 비타민 K2 조성물의 제조에 특히 유용한 성분은 잔탄(xanthan), 아라비아 검, 구아 검(guar gum), 젤라틴, 수크로스, 젤라틴/수크로스의 혼합물, 및/또는 덱스트린, 전분, 개질된 식품 전분, 포도당 시럽, 팜유(palm oil), 유채씨유로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명과 관련하여, 예를 들어 미생물, 균류, 조류(algae) 또는 식물과 같은 유기체는 원핵생물의 국제 명명 규약 또는 조류, 균류, 및 식물에 대한 국제 명명 규약(맬버른 규약)에 의해 정의된 바와 같이, 같은 생리적 특성을 가진 이러한 종들의 동의어 또는 기본명(basionyms) 또한 포함하는 것으로 이해된다.
본 개시내용에서 사용되는 용어 “리보플라빈”은 리보플라빈 전구체, 플라빈 모노뉴클레오타이드(FMN), 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드(FAD), 및 이들의 유도체 또한 포함한다. 리보플라빈 전구체 및 리보플라빈 유도체, FMN 또는 FAD는 비제한적으로 2,5-다이아미노-6-리보실아미노-4(3H)-피리미딘온-5'-포스페이트(DRAPP); 5-아미노-6-리보실아미노-2,4(1H,3H)-피리미딘다이온-5'-포스페이트; 2,5-다이아미노-6-리비틸아미노-4(3H)-피리미딘온-5'-포스페이트; 5-아미노-6-리비틸아미노-2,4(1H,3H)-피리미딘다이온-5'-포스페이트; 5-아미노-6-리비틸아미노-2,4(1H,3H)-피리미딘다이온; 6,7-다이메틸-8-리비틸루마진(DMRL); 및 플라보단백질을 포함한다. 리보플라빈의 유도체는 비제한적으로 리보플라빈-5-포스페이트, 및 예를 들어 소듐 리보플라빈-5-포스페이트와 같은 이들의 염을 포함한다.
용어 "리보플라빈" 및 "비타민 B2"는 본 개시내용에서 상호 교환적으로 사용된다. 리보플라빈의 생합성에 관련된 유전자 및 리보플라빈의 발효 생산, 특히 바실러스 균주를 사용한 발효 생산 방법은 공지되어 있다(예를 들어, EP405370 또는 문헌[Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 7th ed., 2007, Chapter Vitamins] 참조). 이들 방법은 또한 본 개시내용에 기술된 바와 같이 특히 바실러스와 같은 변형된 숙주 세포를 사용한 리보플라빈의 생산에 적용될 수 있다.
본 개시내용에서 사용되는 용어 "비타민 K2" 및 "메나퀴논"(MK-n; 이때 "n"은 사슬 길이임)은 본 개시내용에서 상호교환적으로 사용된다. 여기에는 MK-4, MK-5, MK-6, MK-7, MK-9, MK-10, MK-11, MK-12, MK-13, 및 MK-14가 포함되며 MK-7이 가장 중요하고 바람직한 동형체이다.
본 개시내용에서 사용되는 "발효" 또는 "생산" 또는 "발효 방법"은 적합한 기질을 리보플라빈으로 전환시키는 적절한 조건 하에서, 당업자에게 공지된 배지, 조건, 및 절차를 사용하여 세포를 배양한 후, 당업자에게 공지된 배지, 조건 및 절차를 사용하여 성장하는 세포를 사용하거나 또는 성장하지 않는 소위 휴지(resting) 세포를 사용하는 공정일 수 있다.
본 발명과 관련하여 용어 "바이오-기반"은 산물, 즉 비타민, 효소, 올리고당, 및/또는 아미노산을 포함하는 본 개시내용에 정의된 바와 같은 발효 산물이 화학적 합성을 통해서가 아니라 생명공학적 수단에 의해 생산됨을 나타낸다.
용어 "생산" 또는 "생산성"은 당 분야에 주지되어 있고, 주어진 시간 내에 주어진 발효 부피(예를 들어, 리터 당 시간 당 kg 산물)로 형성된 리보플라빈의 농도를 포함한다. 용어 "생산 효율"은 특정 수준의 생산이 달성되는 데 필요한 시간(예를 들어, 세포가 발효 산물의 특정 생산량 비율에 도달하는 데 걸리는 시간)을 포함한다. 용어 “수율”은 당 분야에 주지되어 있고, 탄소 공급원을 산물(즉, 리보플라빈)로 전환시키는 효율을 포함한다. 이것은 일반적으로 예를 들어, kg 탄소 공급원당 kg 산물로 기록된다. 화합물의 "수율 및/또는 생산/생산성의 증가"는 주어진 시간에 걸친 주어진 배양의 양에서 그 화합물의 회수된 분자, 또는 유용한 회수된 분자의 양이 증가함을 의미한다.
리보플라빈 또는 비타민 K2의 수율/생산성을 결정하기 위한 분석 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 비제한적으로 HPLC 또는 지표 균주의 사용을 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌[Bretzel et al., J. Ind Microbiol. Biotechnol. 22, 19-26, 1999] 참조).
본 발명의 특정 실시양태는 하기와 같다:
(1) 효소, 아미노산, 올리고당, 또는 비타민의 발효 생산에서, 발효 폐 스트림으로부터 비타민 K2의 회수를 포함하는, 폐 스트림으로부터 자원을 회수하는 방법.
(2) 실시양태 (1)에 있어서, 회수된 비타민 K2가 약 80%(중량/중량) 이상 백분율의 동형체 MK-7을 포함하는, 방법.
(3) 실시양태 (1) 또는 (2)에 있어서, 비타민, 아미노산, 올리고당, 또는 효소로부터 선택된 발효 산물에서, DNA의 비율, 특히 재조합 DNA의 비율이, 비타민 K2를 포함하는 발효산물의 g 당 약 10 ng 이하 범위의 DNA인, 방법.
(4) 실시양태 (1), (2) 또는 (3)에 있어서, 발효 산물의 그램 당, 생산 균주, 특히 재조합 생산 균주의 콜로니 형성 단위(CFU)가, 비타민 K2를 포함한 발효 산물 1g 당 약 1 CFU 이하 범위인, 방법.
(5) 실시양태 (1), (2), (3), 또는 (4)에 있어서, 프로테아제, 아밀라아제, 글루코시다제, 셀룰라아제, 라이신, 트립토판, 글루탐산 일나트륨, 리보플라빈(비타민 B2), 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B12, 비타민 B3, 비타민 B1, 비타민 D, 및 비타민 B7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발효 산물의 발효 생산, 바람직하게는 비타민 B2의 발효 생산을 포함하는, 방법.
(6) 실시양태 (1), (2), (3), (4), 또는 (5)에 있어서, 락토코커스, 락토바실러스, 엔테로코커스, 류코노스톡, 스트렙토코커스, 바실러스, 코리네박테리움, 슈도모나스, 플라보박테리움, 엘리자베스킹기아, 또는 에쉐리키아로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 리첸니포르미스, 바실러스 서브틸리스 나토, 바실러스 폴리믹사, 바실러스 퍼무스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 세레우스, 바실러스 투린지엔시스, 플라보박테리움 속, 플라보박테리움 메닌고셉티쿰, 엘리자베스킹기아 메닌고셉티카, 대장균, 락토코커스 락티스 아종 락티스, 락토코커스 락티스 아종 크레모리스, 플라보박테리움 메닌고셉티쿰, 또는 플라보박테리움 속, 또는 코리네박테리움 글루타미쿰.으로부터 선택된 숙주 세포에서 수행되는 방법.
(7) 비타민, 효소, 올리고당, 또는 아미노산으로부터 선택된, 바람직하게는 프로테아제, 아밀라아제, 글루코시다제, 셀룰라아제, 라이신, 트립토판, 글루탐산모노나트륨, 리보플라빈(비타민 B2), 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B12, 비타민 B3, 비타민 B1, 비타민 D, 및 비타민 B7로 이루어진 군으로부터 선택된, 더 바람직하게는 비타민 B2인 하나 이상의 1차 발효 산물과 공동-생산되는 비타민 K2의 발효 생산을 포함하는, 둘 이상의 발효 산물을 동시에 생산하는 방법.
(8) 실시양태 (1), (2), (3), (4), (5), (6), 또는 (7)에 있어서, 하기 단계를 포함하는 방법:
(a) 비타민, 올리고당, 아미노산, 또는 효소로부터 선택된 발효 산물의 생산에 적합한, 적합한 배양 배지 및 적절한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계,
(b) 단계 (a)로부터의 바이오매스로부터 발효 산물을 분리하는 단계,
(c) 바이오매스로부터 비타민 K2를 회수하는 단계, 및 임의적으로
(d) 폐기물 바이오매스를 처분하는 단계.
(9) 유전적으로 변형된 바이오매스로부터 회수/추출하는 단계를 포함하는 바이오-기반 비타민 K2의 생산 방법으로서, 이때 회수된 비타민 K2가 약 80% (중량/중량) 이상 범위의 MK-7 함량 및 PCR로 측정 시, 비타민 K2의 g당 약 10ng의 DNA, 바람직하게는 재조합 DNA의 최대 함량을 가지는, 생산 방법.
(10) 비타민 K2 g당 최대 약 1 CFU의 함량을 가지는, 실시양태 (9)의 방법을 통해 수득된 바이오-기반 비타민 K2 산물.
(11) 실시양태 (1), (2), (3), (4), (5), (6), 또는 (7)에 있어서, 발효 산물은 결정 형태로 생산되고, 바람직하게는 발효 산물은 비타민 B2이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
(a) 결정 형태의 발효 산물을 축적시키면서 적절한 배양 조건 하에서 적합한 숙주 세포, 바람직하게는 재조합 숙주 세포로 발효하는 단계,
(b) 비타민 K2를 함유하는 액체 분획으로부터 결정 분획을 분리하는 단계,
(c) 바이오매스로부터 비타민 K2를 추출하는 단계, 및 임의적으로
(d) 바이오매스를 처분하거나 비료로서 추가로 사용하는 단계.
(12) 실시양태 (1), (2), (3), (4), (5), (6), 또는 (7)에 있어서, 발효 산물은 숙주 세포 외부에서 생산되고, 바람직하게는 발효 산물은 효소, 아미노산, 올리고당이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
(a) 숙주 세포 외부에서 발효 산물을 축적시키면서 적절한 배양 조건 하에서 적합한 숙주 세포, 바람직하게는 재조합 숙주 세포로 발효하는 단계,
(b) 비타민 K2를 포함하는 바이오매스로부터 액체 분획을 분리하는 단계,
(c) 바이오매스로부터 비타민 K2를 추출하는 단계, 및 임의적으로
(d) 바이오매스를 처분하거나 비료로서 추가로 사용하는 단계.
(13) 실시양태 (11) 또는 (12)에 있어서, 단계(C)가 약 80% (중량/중량) 이상 백분율의 에탄올을 함유하는 수성 에탄올 용액의 존재 하에서 수행되는, 방법.
(14) 캡슐화제, 유기 용매(들), 오일, 초임계 유체, 항산화제(들), 당, 공-결정화제(들), 코아세르베이트, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분과 실시양태 (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (11), 또는 (13)의 방법에 의해 수득된 바이오-기반 비타민 K2를 혼합하는 단계를 포함하는, 영양 제품의 제조 방법.
도 1: 바실러스 서브틸리스에서 비타민 K2 및 리보플라빈의 공동-추출 (점선 상자는 비타민 K2 회수를 나타내고, 실선 상자는 비타민 B2 회수를 나타낸다).
하기 실시예는 예시일 뿐이며, 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된, 모든 참고 문헌, 특허 출원, 특허, 및 공개된 특허 출원의 내용, 특히 EP405370, EP1186664, W02010052319, W02004113510, W02005014594, W02017036903, W02007051552, W020050145949, WO2013124351, EP1814987, CN101422446, W02007045488, WO2015169816은 본원에 참조에 인용되어 포함된다.
실시예
실시예 1: 일반적인 방법
달리 언급하지 않는 한, 모든 배지 및 일반적인 방법은 문헌[Sambrook et al.(eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York, 1989]에 개시되어 있거나 W02017036903에 따른다.
딥웰 마이크로리터 판 (MTP; deep-well microtiter plate)에서 리보플라빈 생산의 분석은 하기와 같이 수행하였다: 적절한 경우 선택적 항생제를 함유하는 3ml의 VY에서 단일 콜로니로부터 밤샘 배양을 수행했다. 전배양물을 39℃, 550rpm, 80% 습도에서 인큐베이션했다. 다음날, 초기 OD600nm가 약 0.05인 전배양물에 3ml의 RSM을 접종했다. MTP에서의 배양을 숨구멍 밀봉재(breath seal)로 웰(well)을 덮으면서 삼중(triplicate)으로 수행했다. MTP는 39℃, 550rpm, 80% 습도에서 48시간동안 인큐베이션되었다. 48시간-배양물 250 
를 20 
의 4M NaOH 용액으로 처리하여 리보플라빈 결정을 용해시켰다(300rpm에서 1분 동안 진탕). pH 6.8의 230 
의 1M 인산칼륨 완충액을 첨가하였다(300rpm에서 1분 동안 진탕). 리보플라빈은 4액 펌프, 오토샘플러, UV 검출기, 및 형광 검출기가 있는 Agilent 1100 series HPLC 시스템을 사용하여 HPLC로 분석했다. 분리는 Supelcosil LC-8 DB(I50mm x 4.6mm x 5um)를 사용하여 이루어졌다. 최적의 컬럼 온도는 20°C였다. 이동상은, 실행당 총 33분 동안, 100% 0.1M 아세트산에서 15분에 50/50 0.1M 아세트산/메탄올로 변화되는 구배였다. 유속은 1.0 ml/min였고 주입 부피는 5 
로 설정되었다. UV 신호가 모니터링되고 검출에 사용되었다. 보정(calibration) 범위는 0.1
/ml 내지 500
/ml였다. 추가로, 배양 브로쓰에서 글루코스의 잠재적인 축적이, 2액 펌프, 오토샘플러, UV- 및 굴절률 검출기를 사용하는 Waters HPLC 시스템에 의해 분석되었다. 분리는 CAPCELL PAK NH2 UG80 컬럼(4.6mm x 250mm, 5um, Shiseido)에서 이루어졌다. 최적의 컬럼 온도는 40°C였다. 이동상은 65:35 비율의 아세토니트릴과 탈이온수의 혼합물이었다. 유속은 1.0 ml/min이었고 주입 부피는 5 
또는 10 
로 설정되었다. 굴절률 신호가 모니터링되고 검출에 사용되었다. 각 화합물의 보정 범위는 0.3mg/ml 내지 3mg/ml였다.
K2 비타머의 분석은 건조된 바이오매스로부터 분석물의 추출 이후 HPLC로 수행되었다. 바이오매스는 동결 건조되고 추출은 Precellys 균질기를 사용하여 수행되었다. 2회의 중단 사이클(disruption cycle)이 적용되었다. 분석은 4액 펌프, 오토샘플러, 및 UV 검출기를 사용하는 Agilent 1200 series HPLC 시스템(또는 그와 유사한 시스템)으로 수행되었다. 분리는 C18 컬럼, 150 x 4.6mm, 3um에서 이루어졌다. 최적의 컬럼 온도는 15°C였다. 이동상은 60:40 비율의 메탄올과 에탄올의 혼합물이었다. 구배 용리는 15분 동안 메탄올:에탄올 60:40에서 40:60까지로 적용되었다. 유속은 1.0 ml/분이었다. 270nm에서의 UV 신호가 모니터링되고 정량화에 사용되었다.
실시예 2: 바실러스 또는 코리네박테리움 균주에서의 1차 발효 산물의 발효 생산 및 비타민 K2의 회수
1차 발효 산물인 리보플라빈 생산을 위해, WO2007051552에 따른 프로토콜이 수행되었다. 발효 종료 시, 브로쓰가 저온 살균되고 경사분리된 비타민 B2 결정(Sedicanter®: 독일의 Flottweg)이 추가로 가공되었다(예를 들어, WO20050145949 참조).
제약-등급 리보플라빈의 생산을 위해, 결정을 농축 HCl에 용해한 다음 여과하고 반용매(anti-solvent)로서의 물로 재결정화했다.
바실러스에서 1차 발효 산물로서 효소를 발효 생산하는 경우, WO2013124351에 따른 프로토콜이 사용될 수 있다.
코리네박테리움에서 1차 발효 산물로서 아미노산을 발효 생산하는 경우, EP1814987에 따른 프로토콜이 사용될 수 있다.
발효 공정의 종료시, 상기에 기재된 바와 같이 Sedicanter®를 사용한 1차 경사분리 단계로부터의 비타민 K2를 포함하는 상층액(바이오매스 슬러리)을 단일 추출 용매로서 에탄올로 처리한 후, 대부분의 에탄올 및 폐 바이오매스를 제거하기 위해 미세여과 막에 통과시킨다. 폐 바이오매스 및 에탄올을 추가로 제거하면서, 용액에 여전히 존재하는 나머지 rDNA, 단백질, 또는 지질의 일부를 제거하기 위해, 한외여과 및/또는 나노여과를 포함하는 추가 정제 단계를 적용하였다. 추가 증발 및 냉각 결정화 후, 추가 여과 및 건조 단계를 수행하여, 상기에 기재된 바와 같은 처리 초기에 MK-7이 1%(중량/중량) 미만이었던 것과 비교하여 MK-7이 80%(중량/중량) 이상인 정제된 비타민 K2 결정을 수득하였다. 메나퀴논 분획(특히 MK-4, MK-5, 및 MK-6 포함)의 순도 또한 처리 시작 시 87 내지 88%에서 97내지 98%로 증가하였다. 비타민 K2 결정은 rDNA 함량에 대해 분석되었으며, 이는 PCR에 의해 10ng/산물 g 미만으로 측정되었다.
상기에 기재된 이러한 절차로 수득된 리보플라빈 대 비타민 K2 (MK-7) 비율은 1000 내지 1의 범위였다.
실시예 3: 고체 비타민 K2 제제
MK-7이 80% (중량/중량) 이상인 비타민 K2 결정을 62°C에서 중쇄 트라이글리세라이드 오일에 용해시킨다. 아카시아 검 및 설탕을 물에 용해하고 비타민 K2를 포함하는 상기 오일-상을 62°C에서 첨가한다.
균질화(예를 들면, 회전자/고정자에서 균질화 또는 고압 균질화) 후 생성된 분산액을 얇은 전분 코팅을 포함하도록 분무-건조할 수 있다. 이상적으로, 액적(droplet)의 최종 크기는 100-800nm이다.
이렇게 생성된 비타민 K2 마이크로캡슐을, WO2015169816 (Ex.1 내지 7)에 예시된 바와 같이, 식이성 미네랄(예를 들면, MgO, CaCO3), 미세결정질 셀룰로스 분말, 스테아르산 마그네슘 등과 추가로 혼합하여 고체 정제를 제조할 수 있다.
Claims (14)
1차(primary) 발효 산물 및 2차(secondary) 발효 산물을 공동-생산할 수 있는 적합한 숙주 세포 내에서 2개 이상의 발효 산물을 공동-발효시키는 방법으로서,
하나의 발효 산물이 수용성이고 하나의 발효 산물이 지용성 유기 화합물이며,
지용성 발효 산물이 바람직하게는 지용성 비타민, 더 바람직하게는 비타민 K, 가장 바람직하게는 비타민 K2인, 방법.
하나의 발효 산물이 수용성이고 하나의 발효 산물이 지용성 유기 화합물이며,
지용성 발효 산물이 바람직하게는 지용성 비타민, 더 바람직하게는 비타민 K, 가장 바람직하게는 비타민 K2인, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 1차 발효 산물이 수용성이고, 상기 2차 발효 산물이 지용성인, 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 1차 발효 산물 및 상기 2차 발효 산물이 비타민으로부터 선택되는, 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 발효 산물이 비타민 B2, 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B12, 비타민 B3, 비타민 B1, 비타민 B7, 바람직하게는 비타민 B2, B5, B6, B12로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더 바람직하게는 비타민 B2인, 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2차 발효 산물이, 상기 1차 발효 산물의 발효 생산 동안 생성된 바이오매스(biomass)로부터 추출되는 것인, 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2차 발효 산물이 비타민 K2, 바람직하게는 약 80% (중량/중량) 이상 백분율의 MK-7을 갖는 비타민 K2인, 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2차 발효 산물이 발효 산물의 g당, 바람직하게는 비타민 K2의 g당, 약 10 ng 이하의 DNA 비율을 갖는 비타민 K2인, 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2차 발효 산물이 발효 산물 1g당, 바람직하게는 비타민 K2의 g당, 약 1 콜로니 형성 단위(CFU) 미만의 생산 균주 비율을 갖는 비타민 K2인, 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 락토코커스(Lactococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 엔테로코커스(Enterococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 스트렙토코커스(Streptococcus), 바실러스(Bacillus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 슈도모나스(Pseudomonas), 플라보박테리움(Flavobacterium), 엘리자베스킹기아(Elizabethkingia) 및 에쉐리키아(Escherichia)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(B. amyloliquefaciens), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 리첸니포르미스(B. licheniformis), 바실러스 서브틸리스 나토(B. subtilis natto), 바실러스 폴리믹사(B. polymyxa), 바실러스 퍼무스(B. firmus), 바실러스 메가테리움(B. megaterium), 바실러스 세레우스(B. cereus), 바실러스 투린지엔시스(B. thuringiensis), 플라보박테리움(Flavobacterium) 속으로부터 선택되고, 더 바람직하게는 플라보박테리움 메닌고셉티쿰(Flavobacterium meningosepticum), 엘리자베스킹기아 메닌고셉티카(Elizabethkingia meningoseptica), 대장균(E. coli), 락토코커스 락티스 아종 락티스(Lactococcus lactis ssp. lactis), 락토코커스 락티스 아종 크레모리스(Lactococcus lactis ssp. Cremoris), 플라보박테리움 메닌고셉티쿰(Flavobacterium meningosepticum) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)인, 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 상기 1차 발효 산물, 바람직하게는 수용성 비타민의 생산에 적합한 적절한 배양 배지 및 적절한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계,
(b) 단계 (a)로부터의 생산 스트림으로부터 상기 1차 발효 산물을 분리하는 단계,
(c) 단계 (a) 동안 생성된 바이오매스로부터 상기 2차 발효 산물, 바람직하게는 비타민 K2를 회수하는 단계, 및 임의적으로
(d) 상기 1차 발효 산물 및/또는 2차 발효 산물을 정제하는 단계
를 포함하는 방법.
(a) 상기 1차 발효 산물, 바람직하게는 수용성 비타민의 생산에 적합한 적절한 배양 배지 및 적절한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계,
(b) 단계 (a)로부터의 생산 스트림으로부터 상기 1차 발효 산물을 분리하는 단계,
(c) 단계 (a) 동안 생성된 바이오매스로부터 상기 2차 발효 산물, 바람직하게는 비타민 K2를 회수하는 단계, 및 임의적으로
(d) 상기 1차 발효 산물 및/또는 2차 발효 산물을 정제하는 단계
를 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
유전적으로 변형된 바이오매스로부터 회수/추출하는 단계를 포함하는 바이오-기반 비타민 K2를 제조하는 방법이고, 이때 회수된 비타민 K2가 약 80% (중량/중량) 이상 범위의 MK-7 함량, 및 PCR로 측정 시, 비타민 K2의 g당 약 10ng의 DNA, 바람직하게는 재조합 DNA의 최대 함량을 가지는, 방법.
유전적으로 변형된 바이오매스로부터 회수/추출하는 단계를 포함하는 바이오-기반 비타민 K2를 제조하는 방법이고, 이때 회수된 비타민 K2가 약 80% (중량/중량) 이상 범위의 MK-7 함량, 및 PCR로 측정 시, 비타민 K2의 g당 약 10ng의 DNA, 바람직하게는 재조합 DNA의 최대 함량을 가지는, 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
헥산-비함유 용매, 바람직하게는 약 80% (중량/중량) 이상의 에탄올을 함유하는 수용액에서 2차 발효 산물로서 비타민 K2를 추출하는 단계를 포함하는 방법.
헥산-비함유 용매, 바람직하게는 약 80% (중량/중량) 이상의 에탄올을 함유하는 수용액에서 2차 발효 산물로서 비타민 K2를 추출하는 단계를 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
영양 제품을 제조하는 단계를 추가로 포함하고, 이때
상기 제조하는 단계는 바이오-기반 발효 산물(들)을 캡슐화제, 유기 용매(들), 오일(들), 초임계 유체, 항산화제(들), 당, 공-결정화제(들), 코아세르베이트(coacervate)(들), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분과 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
영양 제품을 제조하는 단계를 추가로 포함하고, 이때
상기 제조하는 단계는 바이오-기반 발효 산물(들)을 캡슐화제, 유기 용매(들), 오일(들), 초임계 유체, 항산화제(들), 당, 공-결정화제(들), 코아세르베이트(coacervate)(들), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분과 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는, 비타민 K2의 g당 약 1 CFU 이하의 생산 균주 함량을 가진 바이오-기반 비타민 K2.
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