CN115715328A - 发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有增加的效率和更少的环境影响的可持续性发酵方法。具体地，本发明涉及一种方法，其中在一种发酵方法中可以产生和分离两种或更多种发酵产物，即“初级”发酵产物和“次级”发酵产物，特别地其中一种发酵产物是水溶性有机化合物，并且一种发酵产物是脂溶性有机化合物，特别是脂溶性维生素，优选地维生素K2。

Description

发酵方法
本发明涉及具有增加的效率和更少的环境影响的可持续性发酵方法。具体地，本发明涉及一种方法，其中在一种发酵方法中可以产生和分离两种或更多种发酵产物，即“初级”发酵产物和“次级”发酵产物，特别地其中一种发酵产物是水溶性有机化合物，并且一种发酵产物是脂溶性有机化合物，特别是脂溶性维生素，优选地维生素K2。
如今，包括维生素、酶、抗生素、氨基酸、燃料在内的许多产品都是通过大规模发酵生成的，而不是通过化学合成生产的。生物技术的众多优势中有几个是使用毒性较低的成分，从而导致更健康和更天然的或基于生物的产品。通常，在此类发酵方法中，在合适的条件下培养宿主细胞(包括表达异源基因以使得能够产生发酵产物的经遗传修饰的宿主细胞)，并且从生物质中提取/分离发酵产物。生物质大部分最终在对所述生物质进行特定处理以消除仍然存在且对环境有害的重组DNA之后被“处置”或丢弃。
尽管生物技术方法可能会导致更多的基于生物的产品，但是从培养基中提取发酵产物可能仍会在经济和生态方面具有一些负面影响：例如，许多发酵产物(例如维生素K2)的分离需要在有效提取之前干燥生物质，例如经由如本领域已知的超临界CO2干燥，因此该工序通常非常昂贵。使用本领域中常用的溶剂，包括己烷或庚烷，也对环境和健康有一些负面影响(对于食品应用不宜使用的)，并且因此应避免。
除此之外，并且尤其是为了实现联合国可持续发展目标(UN SustainableDevelopment Goal)，强烈需要减少废物和温室气体排放，即寻找更加环保和可持续的生产方法，所述生产方法包括与已知方法相比，使用无毒或毒性较小的工序以可持续方式回收生物质和/或从所述生物质中提取有价值的化合物。
令人惊讶的是，我们现在发现了一种优化有机化合物发酵生产的方式，其中用使用一种(共同)宿主细胞的一种发酵方法，可以获得至少两种有价值的发酵产物，即“初级”发酵产物和“次级”发酵产物，特别地其中所述发酵产物中的一种发酵产物是水溶性的并且一种发酵产物是脂溶性的。
具体地，本发明涉及一种在合适的宿主细胞中的共发酵方法，所述宿主细胞能够共同产生至少两种发酵产物，其中一种发酵产物是水溶性的并且一种发酵产物是脂溶性的，特别地为脂溶性维生素，优选地维生素K，更优选地维生素K2。优选地，初级发酵产物是水溶性的，而次级发酵产物是脂溶性的。
如本文所用，术语“一种发酵方法”意指在合适的培养条件下以形成初级发酵产物的方式培养合适的宿主细胞，将所述初级发酵产物与生产料流分离，即与生物质分离，以及另外地，是从所述生物质中提取第二发酵产物。术语“一种发酵方法”和“共发酵方法”在本文中可互换使用。这也可能包括使用一种宿主细胞共同生产至少两种发酵产物，其中所述两种发酵产物同时提取或分开，然后分离。
如本文所用，“有价值的发酵产物”可选自水溶性和/或脂溶性有机化合物，所述水溶性和/或脂溶性有机化合物选自维生素、酶、寡糖或氨基酸，特别地其中一种此类发酵产物是水溶性化合物并且一种此类发发酵产物是脂溶性化合物。本发明范围内的合适的酶可以选自蛋白酶、淀粉酶、葡糖苷酶、纤维素酶等。本发明范围内的合适氨基酸可选自赖氨酸、色氨酸或谷氨酸钠。本发明范围内的合适维生素可选自水溶性或脂溶性维生素，例如维生素B2(核黄素)、维生素B5、维生素B6、维生素B12、维生素B3、维生素B1、维生素D、维生素K或维生素B7，特别是维生素B2、B5、B6、B12，维生素K，特别是维生素K2，更特别地是维生素B2和维生素K2。
在一个实施方式中，本发明涉及一种共发酵方法，其中共同生产至少一种或两种维生素，特别地其中所述发酵产物中的至少一种发酵产物是水溶性维生素并且所述发酵产物中的一种发酵产物是脂溶性维生素，特别是维生素K，优选地维生素K2。具体地，所述初级发酵产物选自水溶性维生素，例如选自由以下组成的组的维生素：维生素B2、维生素B5、维生素B6、维生素B12、维生素B3、维生素B1或维生素B7，特别是维生素B2、B5、B6、B12，更特别地是维生素B2。在优选的实施方式中，初级发酵产物是在芽孢杆菌属(Bacillus)，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中产生的维生素B2，(关于维生素B2的生物合成，参见例如EP405370、EP1186664中的图2或Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry，第7版，2007，Vitamins章节)。
因此，在优选的实施方式中，所述初级发酵产物是水溶性维生素，更优选地选自维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B12的维生素，最优选地维生素B2。
在另外的实施方式中，本发明涉及一种共发酵方法，其中共同生产至少一种或两种维生素，特别地其中所述发酵产物中的至少一种发酵产物是脂溶性维生素，特别地其中所述脂溶性维生素是作为次级发酵产物生产的，其中所述次级发酵产物是从初级发酵产物的生物质或“生产料流”中提取的，即其中所述次级发酵产物是从初级发酵产物的发酵生产期间生成的生物质中提取的，特别地所述初级发酵产物选自如上所定义的水溶性维生素。这种脂溶性维生素的示例是维生素K，其中作为天然形式中的一种天然形式的维生素K2，也称为甲基萘醌，是优选的，更优选地是作为同种型的维生素K2，包括MK-7、MK-4、MK-6、MK-3，其中与其他同种型相比，MK-7的百分比为至少约80％(wt/wt)。
如本文所用，在发酵方法的上下文中的术语“生产料流”是指包含所需发酵产物(即至少如本文所定义的初级发酵产物和次级发酵产物)的质量料流。
因此，本发明涉及至少两种发酵产物的共同生产，其中所述发酵产物中的一种发酵产物是作为次级发酵产物生产的维生素K2，例如经由从如本文所定义的初级发酵方法的生产料流中提取或分开，所述维生素K2包含百分比为至少约80％(wt/wt)的MK-7，例如在至少约85％(wt/wt)、90％(wt/wt)、92％(wt/wt)、95％(wt/wt)、96％(wt/wt)、98％(wt/wt)、99％(wt/wt)或甚至100％(wt/wt)范围内的MK-7。
在另一方面中，本发明涉及至少两种发酵产物的共同生产，其中所述发酵产物中的一种发酵产物是作为次级发酵产物生产的维生素K2，例如经由从如本文所定义的初级发酵方法的生产料流中提取或分开，所述维生素K2包含百分比为每g发酵产物(例如维生素K2)10ng DNA或更少的DNA，特别是重组DNA，优选地其中所述维生素K2包含百分比为至少约80％(wt/wt)的MK-7，例如在至少约85％(wt/wt)、90％(wt/wt)、92％(wt/wt)、95％(wt/wt)、96％(wt/wt)、98％(wt/wt)、99％(wt/wt)或甚至100％(wt/wt)范围内的MK-7。
因此，本发明尤其可用于使用经遗传修饰的或重组微生物的发酵方法中，其中将重组DNA去除至终浓度范围为约10ng/g发酵产物(例如作为如本文所定义的次级发酵产物的基于生物的维生素K2)，如通过已知的PCR方法测量的。
在一个实施方式中，本发明涉及至少两种发酵产物的共同生产，其中所述发酵产物中的一种发酵产物是作为次级发酵产物生产的维生素K2，例如经由从如本文所定义的初级发酵方法的生产料流中提取或分开，所述维生素K2包含百分比为每1g发酵产物(例如维生素K2)1个菌落形成单位(colony forming unit,CFU)的生产菌株，特别是重组生产菌株，优选地其中所述维生素K2包含百分比为每g发酵产物10ng DNA或更少的DNA，特别是重组DNA，和/或包含百分比为至少约80％(wt/wt)的MK-7，例如在至少约85％(wt/wt)、90％(wt/wt)、92％(wt/wt)、95％(wt/wt)、96％(wt/wt)、98％(wt/wt)、99％(wt/wt)或甚至100％(wt/wt)范围内的MK-7。
CFU通常如本领域中已知的那样测量，例如通过以下方式来可视化地计数：将产物在琼脂平板上铺平板、在允许生产菌株生长的代表性条件下孵育所述琼脂平板并随后对所述平板上的菌落的量进行计数，以及结合确认所述菌落是生产菌株(通过DNA测序)。
合适的宿主细胞可以选自乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、伊丽莎白菌属(Elizabethingia)或埃希氏菌属(Escherichia)的菌株，优选地选自芽孢杆菌属，更优选地选自解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、纳豆枯草芽孢杆菌(B.subtilisnatto)、多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，或选自选自以下的菌株：黄杆菌属种属(Flavobacterium so.)、脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethingiameningoseptica)、大肠杆菌(E.coli)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactisssp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis ssp.cremonis)、脑膜炎脓毒性黄杆菌、黄杆菌属种属(Flavobacterium sp)或谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)。最优选地，所述宿主细胞选自芽孢杆菌属，特别是枯草芽孢杆菌。
因此，本发明涉及如上所述的共发酵，其中产生至少初级发酵产物和次级发酵产物，特别是如本文所定义的水溶性维生素(如例如维生素B2)以及脂溶性维生素(如例如维生素K2)，所述共发酵是在合适的宿主细胞中执行的，所述宿主细胞选自由以下组成的组：乳球菌属、乳杆菌属、肠球菌属、明串珠菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、伊丽莎白菌属和埃希氏菌属，优选地选自解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、黄杆菌属种属(例如脑膜炎脓毒性黄杆菌)、脑膜炎败血伊丽莎白菌、大肠杆菌，乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、脑膜炎脓毒性黄杆菌或黄杆菌属种属或谷氨酸棒杆菌。最优选地，所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌。
在一个优选的实施方式中，本发明包括维生素B2作为初级发酵产物在枯草芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌RB50::[pRF69]n中的发酵生产，所述枯草芽孢杆菌含有多(n)个拷贝(例如约5个至约20个拷贝)的pRF69，所述pRF69编码rib操纵子，所述rib操纵子经强启动子Pspo15修饰以增强rib基因的转录(关于构建菌株和培养条件以产生维生素B2，参见例如EP405370或Perkins等人，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.,22:8-18,1999)。为了增加维生素B2的产量，菌株可携带进一步的修饰，例如一种或多种核黄素生物合成基因，特别是ribA的过表达；在宿主细胞中引入多个拷贝的rib操纵子，例如在枯草芽孢杆菌菌株RB50中所实施的(参见例如EP405370)；将rib操纵子与强启动子融合；吡哆醛磷酸酶[EC 3.1.3.74]的异源表达；生长与核黄素产生的解偶联，例如经由引入营养缺陷型，例如在EP1186664中针对例如生物素所述；和/或进一步与经修饰的转酮醇酶基因的引入组合，如例如在WO2007051552中所述；和/或此外与经修饰的rib前导序列的使用组合，如例如在WO2010052319中所述。技术人员知道如何操纵生产菌株以增加相应发酵产物，特别是作为初级发酵产物的维生素B2的产量，以及如何将这种生产菌株用于如本文所述的共发酵，特别是与作为次级发酵产物的维生素K2的共发酵。
如本文所用的术语“废弃生物质”或“无价值的废物料流”定义了在回收至少初级发酵产物和次级发酵产物后剩余的生物质，所述生物质可以被处置或进一步用作肥料或用于提取另外的有价值的有机化合物。
在一个具体实施方式中，本发明涉及如如本文所定义的初级发酵产物和次级发酵产物的共发酵，其中两种或仅一种发酵产物是在细胞内或细胞膜中产生的，或者其中所述发酵产物中的至少一种发酵产物，特别是初级发酵产物，以晶体形式分泌到宿主细胞外。具体地，初级发酵产物，例如维生素B2，被分泌到细胞外，而次级发酵产物，例如维生素K2，在细胞膜中产生并因此待从生物质(即从如本文所定义的发酵方法的生产料流)中作为次级发酵产物回收。
在一个具体的实施方式中，根据本发明的方法包括几个步骤，所述步骤包括但不限于：
(a)在取决于初级发酵产物的合适条件下和合适培养基中培养宿主细胞，具体地其中所述初级发酵产物选自维生素、氨基酸、酶或寡糖，优选地选自水溶性维生素，更优选地维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7或B12，最优选地维生素B2，
(b)从生产料流中分离所述初级发酵产物，即从生物质中分离初级发酵产物，
(c)从发酵方法的生产料流中，即从第一次发酵产物的发酵/生产期间生成的生物质中回收如本文所定义的次级发酵产物，特别是脂溶性维生素，例如维生素K，特别是维生素K2，以及任选地
(d)纯化所述发酵产物。
任选地，来自步骤(d)的废弃生物质可以被处置或用于提取另外的有价值的有机化合物。
在一个实施方式中，根据本发明的方法提供均为固体形式，例如结晶形式的发酵产物(即初级发酵产物和次级发酵产物)。在一个示例中，本发明涉及维生素B2(作为固体初级发酵产物)和维生素K2(作为固体次级发酵产物)的共同生产，即其中所述两种产物都是固体，其中一种发酵产物被排泄到宿主细胞外部并且一种发酵产物在细胞内积累。
在进一步的实施方式中，根据本发明的方法提供发酵产物(即初级发酵产物和次级发酵产物)，其中所述产物中的一种产物是固体形式而另一种产物是液体形式，并且其中所述液体级分可以与生物质/生产料流分离。
如上所定义的共发酵方法可以分批、分批补料或连续模式执行，例如取决于初级发酵产物，包括但不限于维生素B2的生产，更优选地在根据EP405370或WO2007051552使用枯草芽孢杆菌作为宿主细胞的方法中。
如上所定义的合适宿主细胞的培养可以取决于例如宿主、初级发酵产物、pH、温度和要使用的营养培养基而变化。在使用枯草芽孢杆菌作为宿主细胞进行核黄素生产的情况下，该方法可以执行达约10h至约10天，优选地达约4天至约7天，更优选地约2天至约6天，具体取决于微生物。技术人员知道要与本发明结合使用的合适的微生物/宿主细胞的最佳培养条件。
在一个具体实施方式中，根据本发明的共发酵方法可以例如在为约7.0，优选地在约6至约8，更优选地约6.5至7.5的范围内的pH下进行。用于进行培养的合适温度范围可以是例如约13℃至约70℃，优选地约30℃至约39℃，更优选地约35℃至约39℃，并且最优选地约36℃至约39℃。用于生长的培养基通常可含有营养物质，例如可同化碳源，包括由3个、5个或6个碳原子组成的化合物，例如D-葡萄糖、甘油、浓汁、右旋糖、淀粉、蔗糖或核糖；以及可消化的氮源，例如有机物质，例如蛋白胨、酵母提取物和氨基酸。培养基可以含有或不含尿素和/或玉米浆和/或面包酵母。各种无机物质也可用作氮源，例如硝酸盐和铵盐。此外，生长培养基通常可以含有无机盐，例如硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾和碳酸钙。然后可以将使用上述工序获得的细胞以与如上所述基本上相同的模式、温度和pH条件，在例如上述的底物存在下进一步孵育，以使它们将这些底物转换成所需的(初级)发酵产物，包括维生素、寡糖、氨基酸或酶，例如水溶性维生素，优选地维生素B2。培养可以在富含氮的培养基中进行，所述富含氮的培养基含有例如有机氮源，例如蛋白胨、酵母提取物、面包酵母、尿素、氨基酸和玉米浆；或无机氮源，例如硝酸盐和铵盐，在这种情况下，细胞将能够进一步生长，与此同时产生所需的初级发酵产物。或者，可以在贫氮培养基中进行孵育，在这种情况下细胞将不会显著生长，并且将处于静息细胞模式或生物转化模式。在所有情况下，孵育培养基还可以包含无机盐，例如硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾和氯化钙。技术人员将知道取决于宿主细胞和所产生的发酵产物要施加哪些条件。WO2004113510中描述了用于发酵生产核黄素的合适培养基的示例(VF培养基)，所述培养基对于芽孢杆菌特别有用并且可用于本发明的目的。
取决于发酵产物，如上所定义的初级发酵产物与生物质的分离(即从生产料流中提取产物)可以以不同的方式执行：在初级发酵产物(包括但不限于维生素B2)例如以晶体形式被排泄到细胞外部的情况下，分离可能包括巴氏灭菌步骤，例如经由于70℃加热4小时，之后是一个或多个固液分离步骤，包括但不限于倾析，包括通过离心回收(参见例如WO2005014594)。巴氏杀菌培养液的处理可以经由倾析完成，例如如在维生素B2作为初级发酵产物的情况下优选的。晶体，例如核黄素晶体，可以任选地根据已知方法进一步纯化。在任选的进一步纯化步骤后，所述材料可用作食物/饲料/制药或化妆品行业的组分。在一个非常特定的实施方式中，可以获得每升发酵液至少约280mg量的核黄素。
次级发酵产物的回收可以经由从自初级发酵产物的发酵获得的生物质或生产料流中提取/回收来执行，所述提取/回收以可持续方式执行，特别地其中所述提取过程没有有环境问题的溶剂，例如己烷等。
因此，本发明涉及一种共发酵方法，其中使用不含己烷的溶剂，优选地选自水溶液(乙醇水溶液)的溶剂，从生产料流中分离，例如从在初级发酵产物的生产期间获得的生物质中提取次级发酵产物，所述溶剂特别地具有百分比为至少约80％(wt/wt)的乙醇，例如至少约85％(wt/wt)、90％(wt/wt)、92％(wt/wt)、94％(wt/wt)、95％(wt/wt)、96％(wt/wt)、97％(wt/wt)、98％(wt/wt)或甚至100％(wt/wt)的乙醇。要用于所述步骤的其他合适的溶剂可以选自包含异丙醇或丙酮的水溶液。
在一个具体实施方式中，所回收的初级/次级发酵产物可以通过执行例如一个或几个过滤步骤，包括例如微滤、超滤和/或纳滤，来进一步纯化。在一个优选的实施方式中，使用具有低截止值，例如在低于10kDA的范围内的截止值的膜执行过滤。任选地，进一步蒸发溶剂并且在冷却步骤之后分离初级/次级发酵产物的晶体。在一个非常优选的实施方式中，作为如本文所定义的次级发酵产物的基于生物的维生素K2的晶体被分离，其中MK-7的百分比为至少约80％(wt/wt)。
初级发酵产物(例如维生素B2)和次级发酵产物(例如维生素K2)，即两种基于生物的产品，还可以用作营养产品，例如用作食物、饲料、化妆品的组合物，所述组合物包含根据本发明生成的此类维生素B2和/或维生素K2晶体。
本发明涉及一种发酵产物，特别是维生素K2，其中重组DNA的量减少，例如减少至每g发酵产物约10ng DNA或更少的范围，如可以通过本领域已知的PCR方法测量的。
本发明还涉及一种发酵产物，特别是维生素K2，其中源自生产菌株的DNA的量减少，例如减少到低于每g产物约1CFU的范围，如可以经由产物的稀释、孵育和接种测量并且如本领域中已知的。
在另一方面中，本发明涉及一种发酵产物，特别是维生素K2，所述发酵产物包含百分比在至少约80％(wt/wt)范围内，优选地在至少约85％(wt/wt)、90％(wt/wt)、92％(wt/wt)、95％(wt/wt)、96％(wt/wt)、98％(wt/wt)、99％(wt/wt)或甚至100％(wt/wt)MK-7范围内的MK-7，特别地具有最大含量的DNA，优选地重组DNA，例如在每g维生素K2约10ng DNA的范围内，如通过PCR测量的。次级发酵产物，例如维生素K2可能包含以次痕量存在的其他同种型，例如量少于约20％(wt/wt)、15％(wt/wt)、10％(wt/wt)、5％(wt/wt)、4％(wt/wt)、3％(wt/wt)、2％(wt/wt)或1％(wt/wt)的MK-4、MK-5、MK-6。维生素K2及其同种型的分析可以经由如本领域已知的或实施例中进一步描述的HPLC进行。
在一个方面中，本发明涉及包含基于生物的维生素K2(例如具有至少约80％(wt/wt)的MK-7和约20％(wt/wt)、15％(wt/wt)、10％(wt/wt)、5％(wt/wt)、4％(wt/wt)、3％(wt/wt)、2％(wt/wt)或1％(wt/wt)或更少的如本文所定义的MK-4、MK-5和MK-6的晶体)的营养产品的生产，特别是用作/用于食物、饲料或化妆品的组合物的制备，所述组合物包含固体或液体制剂，例如固体粒子，所述固体或液体制剂包含根据本发明生产的基于生物的维生素K2。
根据本发明生产的用于食物、饲料或化妆品制剂的基于生物的维生素K2可以与选自由以下组成的组的一种或多种成分混合：包封剂、有机溶剂、油、超临界流体、抗氧化剂、糖、共结晶剂、凝聚层以及它们的组合，具体取决于食物、饲料或化妆品行业中的最终应用并且如本领域中所已知的。
要在包含如本文所定义的的基于生物的维生素K2的制剂中使用的合适包封剂包括但不限于改性(食物)淀粉、棕榈酸抗坏血酸酯、果胶、藻酸盐、角叉菜胶、叉红藻胶、糊精衍生物、纤维素和纤维素衍生物(例如醋酸纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、木质素磺酸盐、多糖树胶(例如阿拉伯树胶(gum acacia/gum arabic)、改性阿拉伯树胶、TIC胶、亚麻籽胶、印度树胶、罗望子树胶和阿拉伯半乳聚糖)、明胶(牛、鱼、猪、家禽)、植物蛋白(例如豌豆、大豆、蓖麻籽、棉花、土豆、甘薯、木薯、油菜籽、向日葵、芝麻、亚麻籽、红花、扁豆、坚果、小麦、稻、玉米、大麦、黑麦、燕麦、羽扇豆和高粱)、动物蛋白(包括乳或乳清蛋白)、卵磷脂、脂肪酸聚甘油酯、脂肪酸单甘油酯、脂肪酸甘油二酯、脱水山梨糖醇酯和糖酯(以及它们的衍生物)，特别是麦芽糖糊精、改性食物淀粉或树胶，例如阿拉伯树胶。
要在包含如本文所定义的维生素K2的制剂中使用的合适有机溶剂包括但不限于卤代脂肪族烃、脂肪族醚、脂肪族和环状碳酸酯、脂肪族酯和环状酯(内酯)、脂肪族和环状酮、脂肪醇或它们的混合物。卤代脂肪烃的有用示例可以包括单或多卤代直链、支链或环状C1至C15烷烃，特别是单或多氯代或溴代直链、支链或环状C1至C15烷烃，优选地单或多氯代直链、支链或环状C1至C15烷烃，最优选地亚甲基氯或氯仿。脂肪族或环状酯的有用示例可包括乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯或γ-丁内酯。有用的脂肪族或环状酮的示例可包括丙酮、二乙基酮或异丁基甲基酮或环戊酮或异佛尔酮。环状碳酸酯的示例可包括碳酸乙烯酯、碳酸丙烯酯或或它们的混合物。脂肪族醚的示例可包括二烷基醚，其中所述烷基部分具有1个至4个碳原子。一个优选的示例是二甲醚。合适的脂肪族醇的示例是乙醇、异丙醇、丙醇或丁醇。
要在包含如本文所定义的基于生物的维生素K2的制剂中使用的合适的油(即甘油三酯)包括但不限于橙油、柠檬烯等。
要在包含如本文所定义的维生素K2的制剂中使用的合适的抗氧化剂包括但不限于水溶性或脂溶性抗氧化剂，例如选自如本领域已知的生育酚、抗坏血酸和/或它们的衍生物。
要在包含如本文所定义的维生素K2的制剂中使用的合适的共结晶剂包括但不限于如本领域中已知的氨基酸、可用性增强剂和小分子。
要在包含如本文所定义的维生素K2的制剂中使用的合适的凝聚层包括但不限于酶促交联步骤，例如经由酶促键催化实现。
用于制备包含如本文所定义的基于生物的维生素K2的固体组合物，例如固体粒子或微胶囊的方法是已知的并且公开于例如CN101422446、WO2007045488或WO2015169816中。用于制备如本文所定义的此类固体维生素K2组合物的特别有用的成分选自由以下组成的组：黄原胶、阿拉伯树胶、瓜尔胶、明胶、蔗糖、明胶/蔗糖和/或糊精的混合物、淀粉、改性食物淀粉、葡萄糖浆、棕榈油、菜籽油。
关于本发明，应当理解的是，生物(诸如微生物、真菌、藻类或植物)也包括具有相同生理性质的此类物种的同义词或基名(basonyms)，如由国际原核生物命名法(International Code of Nomenclature of Prokaryotes)或关于藻类、真菌和植物的国际命名法(International Code of Nomenclature)(Melbourne法)所限定的。
如本文所用，术语“核黄素”还包括核黄素前体、黄素单核苷酸(flavinmononucleotide,FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)以及它们的衍生物。核黄素、FMN或FAD的核黄素前体和衍生物包括但不限于：2,5-二氨基-6-核糖基氨基-4(3H)-嘧啶酮-5'-磷酸酯(DRAPP)；5-氨基-6-核糖基氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5'-磷酸酯；2,5-二氨基-6-核糖醇基氨基-4(3H)-嘧啶酮-5'-磷酸酯；5-氨基-6-核糖醇基氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5'-磷酸酯；5-氨基-6-核糖醇基氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮；6,7-二甲基-8-核糖醇基二氧四氢蝶啶(DMRL)；和黄素蛋白。核黄素的衍生物包括但不限于核黄素-5-磷酸酯及其盐，例如核黄素-5-磷酸钠。
术语“核黄素”和“维生素B2”在本文中可互换使用。参与核黄素生物合成的基因以及用于核黄素的发酵生产的方法，特别是使用芽孢杆菌菌株的发酵生产，是已知的(参见例如EP405370或Ullman'sEncyclopedia of Industrial Chemistry，第7版，2007，Vitamins章节)。这些方法也可用于使用经修饰的宿主细胞，特别是如本文所述的芽孢杆菌属来生产核黄素。
如本文所用，术语“维生素K2”和“甲基萘醌”(MK-n；其中“n”是链长)在本文中可互换使用。它包括MK-4、MK-5、MK-6、MK-7、MK-9、MK-10、MK-11、MK-12、MK-13和MK-14，其中MK-7是最重要和优选的同种型。
如本文所用的“发酵”或“生产”或“发酵方法”可以是使用本领域技术人员已知的培养基、条件和工序来使用生长细胞；或使用已经通过使用本领域技术人员已知的培养基、条件和工序，在用于将合适的底物转换成核黄素的合适条件下培养之后的非生长的所谓静息细胞。
结合本发明的术语“基于生物的”表示产物，即如本文所定义的发酵产物，包括维生素、酶、寡糖和/或氨基酸，是通过生物技术手段而不是经由化学合成生产的。
术语“生产”或“生产率”是本领域公认的并且包括在给定时间内以给定发酵体积(例如，kg产品/小时/升)形成的核黄素的浓度。术语“生产效率”包括达到特定生产水平所需的时间(例如，细胞达到发酵产物的特定输出速率需要多长时间)。术语“产率”是本领域公认的并且包括碳源转换成产物(即，核黄素)的效率。这通常写成，例如，kg产物/kg碳源。“增加化合物的产率和/或产量/生产率”意指在给定量的培养物中在给定量的时间内所述化合物的回收分子或有用回收分子的量增加。
用于确定核黄素或维生素K2的产率/生产率的分析方法是本领域中已知的。此类方法可包括但不限于HPLC或使用指示剂菌株(参见例如Bretzel等人，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.22,19-26,1999)。
本发明的具体实施方式如下：
(1)用于在酶、氨基酸、寡糖或维生素的发酵生产中从废物料流中回收资源，包括从发酵废物料流中回收维生素K2的方法。
(2)如实施方式(1)所述的方法，其中所述回收的维生素K2包含百分比为至少约80％(wt/wt)的同种型MK-7。
(3)如实施方式(1)或(2)所述的方法，其中选自维生素、氨基酸、寡糖或酶的发酵产物中的DNA，特别是重组DNA的百分比在每g发酵产物约10ng或更少DNA的范围内，所述发酵产物包括维生素K2。
(4)如实施方式(1)、(2)或(3)所述的方法，其中每克发酵产物的生产菌株，特别是重组生产菌株的菌落形成单位(CFU)在每1g发酵产物约1CFU或更少的范围内，所述发酵产物包括维生素K2。
(5)如实施方式(1)、(2)、(3)或(4)所述的方法，所述方法包括一种或多种选自由蛋白酶、淀粉酶、葡糖苷酶、纤维素酶、赖氨酸、色氨酸、谷氨酸单钠、核黄素(维生素B2)、维生素B5、维生素B6、维生素B12、维生素B3、维生素B1、维生素D和维生素B7组成的组的发酵产物的发酵生产，优选地维生素B2的发酵生产。
(6)如实施方式(1)、(2)、(3)、(4)或(5)所述的方法，所述方法在选自由以下组成的组的宿主细胞中进行：乳球菌属、乳杆菌属、肠球菌属、明串珠菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、伊丽莎白菌属或埃希氏菌属，优选地选自解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌、纳豆枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、黄杆菌属种属、脑膜炎脓毒性黄杆菌、脑膜炎败血伊丽莎白菌、大肠杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、脑膜炎脓毒性黄杆菌、黄杆菌属种属或谷氨酸棒杆菌。
(7)用于同时生产两种或更多种发酵产物的方法，所述方法包括与一种或多种选自以下的初级发酵产物共同生产的维生素K2的发酵生产：维生素、酶、寡糖或氨基酸，优选地所述初级发酵产物选自由以下组成的组：蛋白酶、淀粉酶、葡糖苷酶、纤维素酶、赖氨酸、色氨酸、谷氨酸单钠、核黄素(维生素B2)、维生素B5、维生素B6、维生素B12、维生素B3、维生素B1、维生素D和维生素B7，更优选地选自维生素B2。
(8)如实施方式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)或(7)所述的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在适合生产选自维生素、寡糖、氨基酸或酶的发酵产物的合适条件下和适合培养基中培养宿主细胞，
(b)将来自步骤(a)的发酵产物与生物质分离，
(c)从所述生物质中回收维生素K2，以及任选地
(d)处置废生物质。
(9)基于生物的维生素K2的生产，所述生产包括从经遗传修饰的生物质中回收/提取的步骤，其中所回收的维生素K2的MK-7含量在至少约80％(wt/wt)的范围内，并且通过PCR测量的每g维生素K2的DNA，优选地重组DNA的最大含量为约10ng。
(10)经由如实施方式(9)的方法获得的基于生物的维生素K2产物，所述产物的最大含量为每g维生素K2约1CFU。
(11)如实施方式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)或(7)所述的方法，其中所述发酵产物是以结晶形式产生的，优选地其中所述发酵产物是维生素B2，所述方法包括以下步骤：
(a)在合适的培养条件下用合适的宿主细胞，优选地重组宿主细胞发酵，其中发酵产物以结晶形式积聚，
(b)将结晶级分与含有维生素K2的液体级分分离，
(c)从生物质中提取维生素K2，以及任选地
(d)处置生物质或进一步用作肥料。
(12)如实施方式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)或(7)所述的方法，其中所述发酵产物是在宿主细胞外部产生的，优选地其中所述发酵产物是酶、氨基酸、寡糖，所述方法包括以下步骤：
(a)在合适的培养条件下用合适的宿主细胞，优选地重组宿主细胞发酵，其中发酵产物在宿主细胞外部积聚，
(b)从包含维生素K2的生物质中分离液体级分，
(c)从生物质中提取维生素K2，以及任选地
(d)处置生物质或进一步用作肥料。
(13)如实施方式(11)或(12)所述的方法，其中步骤(c)是在EtOH的百分比为至少约80％(wt/wt)的EtOH水溶液存在下执行的。
(14)用于生产营养产品的方法，所述方法包括将可通过如实施方式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(11)或(13)所述的方法获得的基于生物的微生物K2与一种或多种选自以下的成分混合：包封剂、有机溶剂、油、超临界流体、抗氧化剂、糖、共结晶剂、凝聚层以及它们的组合。
附图说明
图1：枯草芽孢杆菌中维生素K2和核黄素的共提取。虚线框表示维生素K2回收，并且实线框表示维生素B2回收。
以下实施例仅是说明性的，并不意图以任何方式限制本发明的范围。在本申请中引用的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请的内容据此以引用方式并入，特别是EP405370、EP1186664、WO2010052319、WO2004113510、WO2005014594、WO2017036903、WO2007051552、WO20050145949、WO2013124351、EP1814987、CN101422446、WO2007045488、WO2015169816。
实施例
实施例1：通用方法
除非另有说明，否则所有培养基和通用方法都公开于Sambrook等人(编著)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press:NewYork(1989)中或根据WO2017036903。
深孔微量滴定板(deep-well microtiter plate,MTP)中核黄素产量的测定如下执行：在3ml的含有选择性抗生素(在合适的情况下)的VY中从单个菌落进行过夜培养。将预培养物于39℃、550rpm、80％湿度下孵育。在第二天，用起始OD600nm为约0.05的预培养物接种3ml的RSM。MTP中的培养是一式三份进行的，用透气封条盖住孔。将MTP在39℃、550rpm、80％湿度下孵育48小时。用20μl的4M NaOH溶液处理250μl的48小时培养物以溶解核黄素晶体(以300rpm振荡1min)。添加230μl的1M磷酸钾缓冲液，pH6.8(以300rpm振荡1min)。使用具有四元泵、自动进样器、紫外检测器和荧光检测器的Agilent 1100系列HPLC系统，通过HPLC测定核黄素。使用Supelcosil LC-8DB(150mm×4.6mm×5um)实现分离。最佳柱温为20℃。流动相是在15分钟时从100％0.1M乙酸到50/50 0.1M乙酸/甲醇的梯度，每次运行总共33分钟。流速为1.0ml/min，并且进样体积被设置为5μl。监测UV信号并将其用于检测。校准范围从0.1μg/ml至500μg/ml。此外，通过使用二元泵、自动进样器、紫外检测器和折光率检测器烦人Waters HPLC系统分析培养液中葡萄糖的潜在积聚。分离是在CAPCELL PAK NH2UG80柱(4.6mm×250mm，5μm；Shiseido)上实现的。最佳柱温是40℃。流动相是比率为65:35的乙腈和去离子水的混合物。流速为1.0ml/min，并且进样体积被设置为5μl或10μl。监测折射率信号并将其用于检测。每种化合物的校准范围为0.3mg/ml至3mg/ml。
在从干燥的生物质中提取分析物后，通过HPLC执行对维生素K2的分析。将生物质冷冻干燥并使用Precellys匀浆器进行提取。施加了两个中断循环。使用四元泵、自动进样器和紫外检测器在Agilent 1200系列HPLC系统(或类似系统)上进行分析。分离是在C18柱，150×4.6mm，3μm上实现的。最佳柱温是15℃。流动相是比率为60:40的甲醇和乙醇的混合物。在15分钟内施加范围从60:40至40:60的MeOH:EtOH的梯度洗脱。流速为1.0ml/min。监测270nm处的UV信号并将其用于定量。
实施例2：芽孢杆菌属或棒状杆菌属菌株中初级发酵产物的发酵生产及维生素K2的回收
对于作为初级发酵产物的核黄素生产，已经执行了根据WO2007051552的方案。在发酵结束时，对培养液进行巴氏杀菌，并进一步处理所倾析的维生素B2晶体(Sedicanter
Figure BDA0004010551800000181
：Flottweg,Germany)(参见例如WO20050145949)。
为了生产医药级核黄素，将晶体溶解在浓HCL中，之后过滤并用水作为抗溶剂进行重结晶。
在芽孢杆菌属中发酵生产作为初级发酵产物的酶的情况下，可以使用根据WO2013124351的方案。
在棒状杆菌属中发酵生产作为初级发酵产物的氨基酸的情况下，可以使用根据EP1814987的方案。
在发酵方法结束时，将来自如上所述使用包含维生素K2的Sedicanter
Figure BDA0004010551800000182
的第1倾析步骤的上清液(生物质浆料)用乙醇作为单一提取溶剂进行处理，之后穿过微滤膜以去除大部分EtOH和废弃生物质。为了去除溶液中仍然存在的剩余rDNA、蛋白质或部分脂质，施加进一步的纯化步骤，包括超滤和/或纳滤，并进一步去除废弃生物质和EtOH。在进一步蒸发和冷却结晶后，执行进一步的过滤和干燥步骤，从而产生纯化的维生素K2晶体，其中含有至少80％(wt/wt)的MK-7，相比之下在如上所述的处理开始时MK-7低于1％(wt/wt)。甲基萘醌级分(尤其含有MK-4、MK-5和MK-6)的纯度也从处理开始时的87％至88％增加到97％至98％。分析了维生素K2晶体的rDNA含量，所述rDNA含量通过PCR测量为低于10ng/g产物。
用如上所述的工序获得的核黄素与维生素K2(MK-7)的比率在1000比1的范围内。
实施例3：固体维生素K2制剂
将含有至少80％(wt/wt)的MK-7的维生素K2晶体于62℃溶解在中链甘油三酯油中。将阿拉伯树胶和糖溶解在水中，并于62℃添加包含维生素K2的油相。
在均质化(例如在转子/定子或高压均质化中)之后，可以将所得分散体喷雾干燥，包括薄的淀粉涂层。理想地，液滴的最终大小为100-800nm。
由此生成的维生素K2微胶囊可以进一步与膳食矿物质(例如MgO、CaCO3)微晶纤维素粉末、硬脂酸镁等混合，以生产固体片剂，如WO2015169816(实施例1至实施例7)中所例示。

Claims (14)

1.一种用于在能够共同生产初级发酵产物和次级发酵产物的合适宿主细胞中共发酵至少两种发酵产物的方法，其中一种发酵产物是水溶性的并且一种发酵产物是脂溶性有机化合物，并且其中所述脂溶性发酵产物优选地是脂溶性维生素，更优选地维生素K，最优选地维生素K2。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述初级发酵产物是水溶性的，而所述次级发酵产物是脂溶性的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述初级发酵产物和所述次级发酵产物选自维生素。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述初级发酵产物选自由以下组成的组：维生素B2、维生素B5、维生素B6、维生素B12、维生素B3、维生素B1、维生素B7，优选地维生素B2、B5、B6、B12，更优选地维生素B2。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述次级发酵产物是从在所述初级发酵产物的所述发酵生产期间生成的所述生物质中提取的。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述次级发酵产物是维生素K2，优选地MK-7的百分比为至少约80％(wt/wt)的维生素K2。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述次级发酵产物是维生素K2，其中DNA的百分比为每g发酵产物，优选地每g维生素K2约10ng或更少。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述次级发酵产物是维生素K2，其中生产菌株的百分比为每1g发酵产物，优选地每g维生素K2小于约1个菌落形成单位(CFU)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，所述方法在选自由以下组成的组的宿主细胞中进行：乳球菌属、乳杆菌属、肠球菌属、明串珠菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、伊丽莎白菌属或埃希氏菌属，优选地选自解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、黄杆菌属种属，更优选地脑膜炎脓毒性黄杆菌、脑膜炎败血伊丽莎白菌、大肠杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、脑膜炎脓毒性黄杆菌或谷氨酸棒杆菌，更优选地枯草芽孢杆菌。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在适用于生产所述初级发酵产物，优选地水溶性维生素的合适条件下和合适培养基中培养所述宿主细胞，
(b)从所述生产料流中分离来自步骤(a)的所述初级发酵产物，
(c)从步骤(a)期间生成的所述生物质中回收所述次级发酵产物，优选地维生素K2，以及任选地
(d)纯化所述初级和/或次级发酵产物。
11.一种用于生产根据权利要求1至9中任一项所述的基于生物的维生素K2的方法，所述方法包括从经遗传修饰的生物质中回收/提取的步骤，其中所述回收的维生素K2的MK-7含量在至少约80％(wt/wt)的范围内，并且通过PCR测量的每g维生素K2的DNA，优选地重组DNA的最大含量为约10ng。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，所述方法包括在不含己烷的溶剂中，优选地在具有至少约80％(wt/wt)的乙醇的水溶液中提取作为次级发酵产物的维生素K2。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，所述方法进一步包括生产营养产品，包括将所述基于生物的发酵产物与一种或多种选自由以下组成的组的成分混合：包封剂、有机溶剂、油、超临界流体、抗氧化剂、糖、共结晶剂、凝聚层以及它们的组合。
14.一种通过根据权利要求1至12中任一项所述的方法可获得的基于生物的维生素K2，所述基于生物的维生素K2的生产菌株含量为每g维生素K2约1CFU或更少。
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CN112522338A (zh) * 2020-12-28 2021-03-19 江苏澳创生物科技有限公司 一种提高l-色氨酸发酵产率的方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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JP3881494B2 (ja) * 2000-04-21 2007-02-14 株式会社日本生物科学研究所 納豆菌培養エキス
US6656721B1 (en) 2000-08-08 2003-12-02 Roche Vitamins, Inc. Polynucleotide portions of the biotin operon from B. subtilis for use in enhanced fermentation
JP4713469B2 (ja) 2003-06-18 2011-06-29 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． 胞子形成できない微生物を用いたパントテネート（Ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ）の製造
CN1826342B (zh) 2003-07-22 2010-06-16 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 对核黄素进行纯化的方法
JP4595506B2 (ja) 2004-11-25 2010-12-08 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造方法
CA2615419A1 (en) * 2005-07-18 2007-01-25 Basf Aktiengesellschaft Use of a bacillus meti gene to improve methionine production in microorganisms
CN101291598B (zh) 2005-10-21 2012-10-31 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 具有高生物利用度的脂溶性活性成分的新颖制剂
EP1957640B1 (en) 2005-11-02 2013-05-29 DSM IP Assets B.V. Modified transketolase and use thereof
EP2186880A1 (en) 2008-11-07 2010-05-19 DSM IP Assets B.V. Improved production of riboflavin
CN101422446B (zh) 2008-12-18 2010-06-09 浙江大学 一种维生素k微胶囊的制备方法
DK2817410T3 (en) 2012-02-22 2016-07-04 Novozymes As Improved fermentation management
WO2015169816A1 (en) 2014-05-05 2015-11-12 Basf Se Formulation of fat-soluble vitamin
CN107922464B (zh) 2015-08-28 2022-03-15 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 经改进的维生素生产
CN106701719B (zh) * 2017-01-16 2020-04-21 中国科学院合肥物质科学研究院 利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素k2和纳豆激酶的方法
CN109402187A (zh) * 2018-11-15 2019-03-01 沈阳农业大学 天然维生素k2和血栓溶解酶联产方法
CN110699272B (zh) * 2019-07-02 2023-03-24 广东双骏生物科技有限公司 一种纳豆枯草芽孢杆菌以及生产mk-7的方法

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