CN103113509A - 以l-甲状腺素为亲和配基的再生型亲和沉淀剂及制备方法和应用以及相关再生型聚合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及pH响应再生型亲和沉淀剂，包括pH敏感溶解可逆聚合物PMMDN和亲和配基，PMMDN的粘均分子量为7.25×104g/mol，等电点为4.5，由甲基丙烯酸、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸甲酯和羟甲基丙烯酰胺经无规共聚而得到；亲和配基L-甲状腺素通过环氧氯丙烷连接PMMDN，还涉及温度响应再生型亲和沉淀剂，其中载体为温度敏感溶解可逆聚合物PNDN，粘均分子量为2.9×104g/mol，最低临界温度为31.1℃，由异丙基丙烯酰胺、丙烯酸丁酯和羟甲基丙烯酰胺经无规共聚而得到。本发明的以L-甲状腺素为亲和配基的再生型亲和沉淀剂纯化效率高，回收率高，大大降低工业成本，利于亲和沉淀技术的推广，适于大规模推广应用。用于纯化人血清白蛋白，溶菌酶及谷氨酰胺转氨酶，产品纯度可达到电泳纯。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质亲和沉淀技术领域，更具体地，涉及再生型亲和沉淀剂技术领域，特别是指以L-甲状腺素为亲和配基的再生型亲和沉淀剂及制备方法和应用以及相关再生型聚合物。
背景技术
亲和配基能识别生物大分子，特别是酶和抗体等蛋白质，并且能专一性地与亲和对象该物质的分子相结合，亲和配基一般通过多种作用力类型（如范德华相互作用、静电相互作用、氢键和疏水相互作用等）与生物大分子特异性结合。在实际应用过程中，考虑到配基选择的各项要求，比如特异性、安全性和高效性等等，亲和配基的选择在亲和沉淀的过程中显得至关重要。
当环境参数如pH、温度、离子强度和盐度等发生改变，或存在特定离子、有机溶剂以及带相反电荷的聚电解质时，许多大分子聚合物的溶解状态会发生可逆性的改变，这些物质就称之为可逆溶解聚合物。亲和沉淀是在可逆溶解聚合物上连接配基，以专一性地结合目标蛋白，结合完成后，改变条件（pH值、温度、离子强度或加入某种试剂），使该聚合物沉淀，与水溶液分离。然后再改变操作条件使目标蛋白从聚合物-配基复合物上洗脱下来，聚合物重新溶解循环使用。由于亲和沉淀过程中，目标分子与配基的亲和作用是在水溶性状态下进行，传质阻力小，吸附速度快，因此适合在分离过程的初期使用，有利于减少分离步骤，提高产率，降低成本。然而一般能用于亲和沉淀的可逆溶解聚合物数量很少，且存在着难以回收再利用的问题，增加了分离成本，从而影响了亲和沉淀技术的应用。因此，解决载体循环使用问题成为技术关键。
可逆溶解聚合物的回收条件必须与有利于生物分子稳定性及活性的保持，且需价格低廉，易于得到。另外，回收聚合物还存在回收率不高导致其循环使用的次数大大降低。因此，研发用于亲和沉淀生物分子、既能保持生物大分子的稳定性及活性，又可循环使用的聚合物成为本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供以L-甲状腺素为亲和配基的再生型亲和沉淀剂及制备方法和应用以及相关再生型聚合物，该再生型亲和沉淀剂采用专一的、安全的和高效的亲和配基连接到溶解可逆聚合物上形成，进行亲和沉淀，其回收率高，产率提高，从而大大降低工业成本，利于亲和沉淀技术的推广，适于大规模推广应用。
为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种pH响应再生型亲和沉淀剂，其特点是，包括pH敏感溶解可逆聚合物PMMDN和亲和配基，所述pH敏感溶解可逆聚合物PMMDN的粘均分子量为7.25×104g/mol，等电点为4.5，由式（2）所示化合物、式（3）所示化合物、式（4）所示化合物和式（5）所示化合物经无规共聚而得到，其中式（2）所示化合物、式（3）所示化合物、式（4）所示化合物和式（5）所示化合物的投料摩尔比为58：24：19：6，所述亲和配基为式（1）所示化合物并通过式（8）所示化合物连接所述pH敏感溶解可逆聚合物PMMDN而成所述pH响应再生型亲和沉淀剂，
反应方程式如下：
在本发明的第二方面，提供了一种制备上述的pH响应再生型亲和沉淀剂的方法，其特点是，将所述式（2）所示化合物、所述式（3）所示化合物、所述式（4）所示化合物和所述式（5）所示化合物按投料摩尔比为58：24：19：6加入溶剂中，再加入引发剂，在惰性气体存在下进行聚合反应得到所述pH敏感溶解可逆聚合物PMMDN，接着所述pH敏感溶解可逆聚合物PMMDN结合所述式（8）所示化合物即环氧氯丙烷，然后所述式（8）所示化合物连接所述式（1）所示化合物。
较佳地，合成pH敏感溶解可逆聚合物PMMDN所述溶剂为去无水乙醇，所述引发剂为偶氮二异丁腈，所述惰性气体为氮气，所述聚合反应在60℃的温度、转速为200rpm的条件下振荡反应24小时进行；所述结合在1mol/L氢氧化钠中，在反应温度为40℃、转速为200rpm条件下振荡反应2小时进行；所述连接在反应温度为60℃、转速为200rpm条件下振荡反应24小时进行。
在本发明的第三方面，提供了一种pH敏感溶解可逆聚合物PMMDN，其特点是，所述pH敏感溶解可逆聚合物PMMDN的粘均分子量为7.25×104g/mol，等电点为4.5，由式（2）所示化合物、式（3）所示化合物、式（4）所示化合物和式（5）所示化合物经无规共聚而得到，其中式（2）所示化合物、式（3）所示化合物、式（4）所示化合物和式（5）所示化合物的投料摩尔比为58：24：19：6，
反应方程式如下：
在本发明的第四方面，提供了一种温度响应再生型亲和沉淀剂，其特点是，包括温度敏感溶解可逆聚合物PNBN和亲和配基，所述温度敏感溶解可逆聚合物PNBN的粘均分子量为2.9×104g/mol，最低临界温度为31.1℃，由式（5）所示化合物、式（6）所示化合物和式（7）所示化合物经无规共聚而得到，其中式（5）所示化合物、式（6）所示化合物和式（7）所示化合物的投料摩尔比为5：4：70，所述亲和配基为式（1）所示化合物并通过式（8）所示化合物连接所述温度敏感溶解可逆聚合物PNBN而成所述温度响应再生型亲和沉淀剂，
在本发明的第五方面，提供了一种制备上述的温度响应再生型亲和沉淀剂的方法，其特点是，将所述式（5）所示化合物、所述式（6）所示化合物和所述式（7）所示化合物按投料摩尔比为5：4：70加入溶剂中，再加入引发剂，在惰性气体存在下进行聚合反应得到所述温度敏感溶解可逆聚合物PNBN，接着所述式（8）所示化合物连接所述式（1）所示化合物，然后所述式（8）所示化合物结合所述温度敏感溶解可逆聚合物PNBN。
较佳地，合成温度敏感溶解可逆聚合物PNBN所述溶剂为去无水乙醇，所述引发剂为偶氮二异丁腈，所述惰性气体为氮气，所述聚合反应在60℃的温度、转速为200rpm的条件下振荡反应24小时进行；所述连接在1mol/L氢氧化钠中，在反应温度为60℃、转速为200rpm条件下振荡反应24小时进行；所述结合在反应温度为40℃、转速为200rpm条件下振荡反应2小时进行。
在本发明的第六方面，提供了一种温度敏感溶解可逆聚合物PNBN，其特点是，所述温度敏感溶解可逆聚合物PNBN的粘均分子量为2.9×104g/mol，最低临界温度为31.1℃，由式（5）所示化合物、式（6）所示化合物和式（7）所示化合物经无规共聚而得到，其中式（5）所示化合物、式（6）所示化合物和式（7）所示化合物的投料摩尔比为5：4：70，
在本发明的第七方面，提供了式（1）所示化合物即L-甲状腺素在亲和沉淀中作为亲和配基的应用，
因此，本发明提供了一种新型的亲和配基——L-甲状腺素，其分子式C15H11O4I4N，分子量776.93，如式I所示化合物，是由甲状腺所分泌的激素。可由牛、羊、猪等的甲状腺中提取，或由人工合成。其安全无毒，能和某些蛋白质进行专一高效的结合而首次作为亲和配基被使用在亲和沉淀技术中。
在本发明的第八方面，提供了上述的pH响应再生型亲和沉淀剂或上述的温度响应再生型亲和沉淀剂在纯化血清白蛋白、溶菌酶及谷氨酰胺转氨酶中的应用。还可以是其它生物产品，例如生物大分子，即酶制剂等蛋白质。
具体做法是：在上述生物大分子溶液中，加入一定比例的亲和沉淀剂，通过调节亲和配基密度、pH、盐离子浓度等来调节亲和沉淀剂对目标生物大分子的吸附，通过改变pH或温度达到回收的目的；再通过加入不同种类的洗脱剂将吸附上目标物的亲和沉淀剂溶解并使其分离，最终将亲和沉淀剂回收从而达到纯化目的。
在本发明中：式（1）所示化合物、式（2）所示化合物、式（3）所示化合物、式（4）所示化合物、式（5）所示化合物、式（6）所示化合物、式（7）所示化合物和式（8）所示化合物均为市售品。
本发明的有益效果具体为：本发明设计并合成的亲和沉淀剂与现有的亲和沉淀剂相比，使用了新的溶解可逆聚合物和亲和配基，既能保持生物大分子的稳定性及生物活性，配基具有安全性，又可实现循环使用，从而大大降低工业成本，利于亲和沉淀技术的推广，适于大规模推广应用。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。
实施例1聚合物PMMDN合成实例
在具塞三角烧瓶中加入5ml甲基丙烯酸、2ml甲基丙烯酸甲酯、4ml甲基丙烯酸二甲氨基乙酯和0.6g羟甲基丙烯酰胺，在100ml无水乙醇中充分溶解，0.05gAIBN作为引发剂，充氮气10～15分钟，以充分去除氧气。塞子封住三角烧瓶口，60℃水浴摇床，200rpm转速下，反应24小时。反应结束，产物直接沉淀在三角瓶底部，沉淀物经无水乙醇和丙酮洗涤三次，再经过真空干燥至恒重，得到最终产物PMMDN。聚合反应得率为85-88%。其粘均分子量为7.25×104，等电点为4.5。
实施例2亲和沉淀剂PMMDN-T合成实例
将一定量聚合物PMMDN溶于1mol/L的NaOH中，40℃水浴，摇床200rpm，加入环氧氯丙烷和聚合物反应2小时使聚合物上的羟基活化，活化后，加入L-甲状腺素，60℃，摇床200rpm，反应24小时，调节pH使亲和沉淀剂PMMDN-T沉淀出来，即得到可应用于亲和沉淀，不同配基密度的亲和沉淀剂。配基密度为39.89～71.08μmol/g。调节pH至等电点离心收集沉淀计算所得到的PMMDN-T的回收率分别为：97.3％、97.5％、97.2％。理论上可以使用50次以上。
实施例3聚合物PNBN合成实例
在具塞三角烧瓶中加入7.91gN-异丙基丙烯酰胺、0.7ml丙烯酸丁酯和和0.5g羟甲基丙烯酰胺，在100ml无水乙醇中充分溶解，0.05gAIBN作为引发剂，充氮气10～15分钟，以充分去除氧气。塞子封住三角烧瓶口，60℃水浴摇床，200rpm转速下，反应24小时。反应结束，使用减压蒸馏去除无水乙醇后底部有粘稠状物质，加入约20ml丙酮溶解该物质，加入大量正己烷即可将聚合物萃取出来再经过真空干燥至恒重，得到最终产物PNBN。聚合反应得率为75-78%。其粘均分子量为2.9×104，最低临界温度为31.1℃。
实施例4亲和沉淀剂PNBN-T合成实例
将一定量L甲状腺素和适量环氧氯丙烷溶于1mol/L的NaOH中，60℃水浴，200rpm转速摇床中反应24小时，再加入适量聚合物PNBN，40℃水浴，200rpm摇床中反应2小时即可得到PNBN-T，即可应用于亲和沉淀，不同配基密度的亲和沉淀剂。配基密度为39.89～71.08μmol/g。调节温度至最低临界温度离心收集沉淀计算所得到的PNBN-T的回收率分别为：98.1％、98.1％、98.2％。理论上可以使用50次以上。
实施例5使用pH响应亲和沉淀剂PMMDN-T亲和沉淀纯化人血清白蛋白
以人血清白蛋白为目标蛋白，以连接了L-甲状腺素的PMMDN-T为亲和沉淀剂。以血清为待纯化样品，加入一定量的亲和沉淀剂，亲和沉淀剂配基密度为60.0μmol/L，溶液pH值为7.0，150rpm，25℃，吸附2h，调节pH至等电点将PMMDN-T和人血清白蛋白复合物沉淀出来，测上清液的蛋白含量，人血清白蛋白的吸附量达到约13.55mg/g聚合物，吸附率为93.6%，用1mol/L NaSCN溶液洗脱，洗脱率也高达92.7％。SDS-PAGE电泳结果显示为单一条带，表明血清中的人血清白蛋白经亲和沉淀后，得到了高度纯化。
实施例6使用pH响应亲和沉淀剂PMMDN-T亲和沉淀纯化谷氨酰胺转氨酶
以谷氨酰胺转氨酶为目标蛋白，以连接了L-甲状腺素的PMMDN-T为亲和沉淀剂。以微生物发酵的谷氨酰胺转氨酶发酵液为待纯化样品，加入一定量的亲和沉淀剂，亲和沉淀剂配基密度为60.0μmol/L，溶液pH值为5.5，150rpm，25℃，吸附2h，调节pH至等电点将PMMDN-T和谷氨酰胺转氨酶复合物沉淀出来，测上清液的蛋白含量和酶活，谷氨酰胺转氨酶的吸附量达到约20.33mg/g聚合物，吸附率为81.4%，用pH10.0的Gly-NaOH缓冲液洗脱，通过蛋白和酶活测量，其洗脱率高达92.3％。SDS-PAGE电泳结果显示为单一条带，表明以L-甲状腺素为亲和配基的亲和沉淀剂可以从粗酶中提取谷氨酰胺转氨酶。
实施例7使用pH响应亲和沉淀剂PMMDN-T亲和沉淀纯化溶菌酶
以溶菌酶为目标蛋白，以连接了L-甲状腺素的PMMDN-T为亲和沉淀剂。以咸鸭蛋蛋清为待纯化样品，加入一定量的亲和沉淀剂，亲和沉淀剂配基密度为55.0μmol/L，溶液pH值为6.0，含有1mol/LNaCl盐离子，150rpm，25℃，吸附2h，调节溶液pH至PMMDN-T和溶菌酶复合物沉淀出来，测上清液的蛋白含量和溶菌酶酶活，溶菌酶吸附量达到约22.77mg/g聚合物，用含有1mol/L尿素的pH7.0的缓冲溶液洗脱，蛋白和酶活的洗脱率高达97.7％。这表明成功的从咸鸭蛋清中提取纯化了溶菌酶。
实施例8使用热响应亲和沉淀剂PNBN-T亲和沉淀纯化人血清白蛋白
以人血清白蛋白为目标蛋白，以连接了L-甲状腺素的PNBN-T为亲和沉淀剂。以血清为待纯化样品，加入一定量的亲和沉淀剂，亲和沉淀剂配基密度为60.0μmol/L，溶液pH值为7.0，150rpm，15℃，吸附2h，调节溶液温度至PNBN-T和人血清白蛋白复合物沉淀出来，测上清液的蛋白含量，人血清白蛋白的吸附量达到约14.87mg/g聚合物，吸附率为95.3%，用1mol/L NaSCN溶液洗脱，洗脱率也高达93.7％。SDS-PAGE电泳结果显示为单一条带，表明血清中的人血清白蛋白经亲和沉淀后，得到了高度纯化。
实施例9使用热响应亲和沉淀剂PNBN-T亲和沉淀纯化谷氨酰胺转氨酶
以谷氨酰胺转氨酶为目标蛋白，以连接了L-甲状腺素的PNBN-T为亲和沉淀剂。以微生物发酵的谷氨酰胺转氨酶发酵液为待纯化样品，加入一定量的亲和沉淀剂，亲和沉淀剂配基密度为70.0μmol/L，溶液pH值为5.5，150rpm，15℃，吸附2h，调节溶液温度至PNBN-T和谷氨酰胺转氨酶复合物沉淀出来，测上清液的蛋白含量和酶活，谷氨酰胺转氨酶的吸附量达到约21.79mg/g聚合物，吸附率为83.4%，用pH10.0的Gly-NaOH缓冲液洗脱，通过蛋白和酶活测量，其洗脱率高达98.7％。SDS-PAGE电泳结果显示为单一条带，表明以L-甲状腺素为亲和配基的亲和沉淀剂可以从粗酶中提取谷氨酰胺转氨酶。
实施例10使用热响应亲和沉淀剂PNBN-T亲和沉淀纯化溶菌酶
以溶菌酶为目标蛋白，以连接了L-甲状腺素的PNBN-T为亲和沉淀剂。以咸鸭蛋清为待纯化样品，加入一定量的亲和沉淀剂，亲和沉淀剂配基密度为70.0μmol/L，溶液pH值为5.5，150rpm，15℃，吸附2h，调节溶液温度至PNBN-T和溶菌酶复合物沉淀出来，测上清液的蛋白含量和酶活，溶菌酶的吸附量达到约23.97mg/g聚合物，吸附率为93.4%，用pH10.0的Gly-NaOH缓冲液洗脱，通过蛋白和酶活测量，其洗脱率高达92.7％。这表明成功的从咸鸭蛋清中提取纯化了溶菌酶。
综上所述，本发明的以L-甲状腺素为亲和配基的再生型亲和沉淀剂，纯化效率高，回收率高，大大降低工业成本，利于亲和沉淀技术的推广，适于大规模推广应用。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。
Claims (10)
1.一种pH响应再生型亲和沉淀剂，其特征在于，包括pH敏感溶解可逆聚合物PMMDN和亲和配基，所述pH敏感溶解可逆聚合物PMMDN的粘均分子量为7.25×104g/mol，等电点为4.5，由式（2）所示化合物、式（3）所示化合物、式（4）所示化合物和式（5）所示化合物经无规共聚而得到，其中式（2）所示化合物、式（3）所示化合物、式（4）所示化合物和式（5）所示化合物的投料摩尔比为58：24：19：6，所述亲和配基为式（1）所示化合物并通过式（8）所示化合物连接所述pH敏感溶解可逆聚合物PMMDN而成所述pH响应再生型亲和沉淀剂，
2.一种制备根据权利要求1所述的pH响应再生型亲和沉淀剂的方法，其特征在于，将所述式（2）所示化合物、所述式（3）所示化合物、所述式（4）所示化合物和所述式（5）所示化合物按投料摩尔比为58：24：19：6加入溶剂中，再加入引发剂，在惰性气体存在下进行聚合反应得到所述pH敏感溶解可逆聚合物PMMDN，接着所述pH敏感溶解可逆聚合物PMMDN结合所述式（8）所示化合物，然后所述式（8）所示化合物连接所述式（1）所示化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，合成pH敏感溶解可逆聚合物PMMDN所述溶剂为去无水乙醇，所述引发剂为偶氮二异丁腈，所述惰性气体为氮气，所述聚合反应在60℃的温度、转速为200rpm的条件下振荡反应24小时进行；所述结合在1mol/L氢氧化钠中，在反应温度为40℃、转速为200rpm条件下振荡反应2小时进行；所述连接在反应温度为60℃、转速为200rpm条件下振荡反应24小时进行。
4.一种pH敏感溶解可逆聚合物PMMDN，其特征在于，所述pH敏感溶解可逆聚合物PMMDN的粘均分子量为7.25×104g/mol，等电点为4.5，由式（2）所示化合物、式（3）所示化合物、式（4）所示化合物和式（5）所示化合物经无规共聚而得到，其中式（2）所示化合物、式（3）所示化合物、式（4）所示化合物和式（5）所示化合物的投料摩尔比为58：24：19：6，
5.一种温度响应再生型亲和沉淀剂，其特征在于，包括温度敏感溶解可逆聚合物PNBN和亲和配基，所述温度敏感溶解可逆聚合物PNBN的粘均分子量为2.9×104g/mol，最低临界温度为31.1℃，由式（5）所示化合物、式（6）所示化合物和式（7）所示化合物经无规共聚而得到，其中式（5）所示化合物、式（6）所示化合物和式（7）所示化合物的投料摩尔比为5：4：70，所述亲和配基为式（1）所示化合物并通过式（8）所示化合物连接所述温度敏感溶解可逆聚合物PNBN而成所述温度响应再生型亲和沉淀剂，
6.一种制备根据权利要求5所述的温度响应再生型亲和沉淀剂的方法，其特征在于，将所述式（5）所示化合物、所述式（6）所示化合物和所述式（7）所示化合物按投料摩尔比为5：4：70加入溶剂中，再加入引发剂，在惰性气体存在下进行聚合反应得到所述温度敏感溶解可逆聚合物PNBN，接着所述式（8）所示化合物连接所述式（1）所示化合物，然后所述式（8）所示化合物结合所述温度敏感溶解可逆聚合物PNBN。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，合成温度敏感溶解可逆聚合物PNBN所述溶剂为去无水乙醇，所述引发剂为偶氮二异丁腈，所述惰性气体为氮气，所述聚合反应在60℃的温度、转速为200rpm的条件下振荡反应24小时进行；所述连接在1mol/L氢氧化钠中，在反应温度为60℃、转速为200rpm条件下振荡反应24小时进行；所述结合在反应温度为40℃、转速为200rpm条件下振荡反应2小时进行。
8.一种温度敏感溶解可逆聚合物PNBN，其特征在于，所述温度敏感溶解可逆聚合物PNBN的粘均分子量为2.9×104g/mol，最低临界温度为31.1℃，由式（5）所示化合物、式（6）所示化合物和式（7）所示化合物经无规共聚而得到，其中式（5）所示化合物、式（6）所示化合物和式（7）所示化合物的投料摩尔比为5：4：70，
9.式（1）所示化合物在亲和沉淀中作为亲和配基的应用，
10.根据权利要求1所述的pH响应再生型亲和沉淀剂或根据权利要求5所述的温度响应再生型亲和沉淀剂在纯化血清白蛋白、谷氨酰胺转氨酶及溶菌酶中的应用。
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2013
- 2013-01-30 CN CN201310037649.6A patent/CN103113509B/zh not_active Expired - Fee Related
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Also Published As
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|---|---|
| CN103113509B (zh) | 2016-05-04 |
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