CN1693327A - 一种用于亲和沉淀分离系统的可再生聚合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于亲和沉淀、可循环使用的热敏性聚合物及其制备方法，其由单体化合物(1)、单体化合物(2)和单体化合物(3)经无规共聚而得，所得共聚合物的粘均分子量为3万左右，再共价结合亲和性染料配基(4)，得到可以应用于亲和沉淀的聚合物。与现有用于亲和沉淀的聚合物相比，本发明所涉及的共聚物用于亲和沉淀分离蛋白质等生物分子，既能保持蛋白的生物活性又可实现亲和沉淀聚合物高回收率循环使用。

Description

一种用于亲和沉淀分离系统的可再生聚合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于亲和沉淀分离生物大分子的聚合物，尤其涉及一种共价结合染料配基后用于亲和沉淀、可循环使用的热敏性聚合物以及它的制备方法。

背景技术

当环境参数如pH、温度、离子强度和盐度等发生改变，或存在特定离子、有机溶剂以及带相反电荷的聚电解质时，许多大分子聚合物的溶解状态会发生可逆性的改变，这些物质就称之为可逆溶解聚合物，也称为智能聚合物。亲和沉淀是在智能聚合物上固定配基，以专一性地吸附目标蛋白，吸附完成后，改变条件(pH值、温度、离子强度或加人某种试剂)，使该聚合物沉淀，与水溶液分离。然后再改变操作条件使目标蛋白从聚合物-配基上洗脱下来，或者将复合物重新溶解，让蛋白从复合物上解离，然后将聚合物沉淀下来，目标蛋白留在上清液中。由于亲和沉淀作用中，目标分子与配基的亲和作用是在水溶性状态下进行，传质阻力小，吸附速度快，因此适合在分离过程的初期使用，有利于减少分离步骤，提高产率，降低成本，。然而一般用于亲和沉淀中的载体存在着难以回收再利用的问题，增加了分离成本，从而影响了亲和沉淀技术的应用。因此，解决载体循环使用问题成为研究热点。

亲和沉淀的研究中，现在主要是采用亲和配体—智能聚合物作为蛋白质的亲和沉淀试剂。Seusted和Mattiasson在1989年直接用脱乙酰几丁质分离纯化小麦凝集素的基础上将大豆胰酶抑制剂连接到脱乙酰几丁质上，并用来从粗酶制剂中分离纯化了胰蛋白酶(ChemicalEngineering Science，56(2001)5681-5692)。在这之后，又有一些智能聚合物被用于蛋白质的亲和沉淀，最近Guoqiang等人对Eudragit S和Eudragit L(Eudragit S的成份同Eudragit L相同，但它们所含的异丁烯酸与异丁烯酸甲酯的比例不同)进行了化学修饰，分别连接上了一种芳香族染料(Cibacron blue 3GA)，并用其分离纯化了肌肉乳酸脱氢酶和酵母醇脱氢酶(Bioseperation，7(1999)195-205)。大豆胰蛋白酶抑制剂(ST1)与部分水解的聚(N-乙烯己内酰胺)共价结合成为亲和沉淀胰蛋白酶的异双功能试剂，ST1聚合物与胰蛋白酶结合，升高温度即形成沉淀。离心，沉淀物于室温溶解，调pH至2.5，进行第二次沉淀、离心，胰蛋白酶存在于上清液中，而ST1聚合物则沉淀，酶收率为77％，而聚合物的回收率为82％(Bioteehnol Techn，6(1992)353)。

溶解可逆聚合物的应用及其研究尽管已取得了许多成就，但此项技术还没有得到广泛重视，共聚物的纯化条件必须与有利于生物分子稳定性及活性，且需价格低廉，易于得到。尤为重要的是聚合物的回收再利用，以上研究中虽然可以回收聚合物，但回收率不高导致其循环使用的次数大大降低，因此，研发一种用于亲和沉淀生物分子、既能保持生物大分子的稳定性及活性又可循环使用的聚合物成为本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明目的在于，提供一种用于亲和沉淀生物大分子高聚物、既能保持生物大分子稳定性及活性，又可循环使用的聚合物及其制备方法。

本发明的发明人经广泛及深入的研究，首次合成了一种可用于亲和沉淀且在加热条件下(高于28℃)可再生的共聚物。实现了生物大分子的分离，又可循环使用聚合物之目的。

1、本发明所说的聚合物由下列单体化合物(1)、单体化合物(2)和单体化合物(3)经无规共聚而得，单体化合物(1)、单体化合物(2)与单体化合物(3)的质量比为7∶3∶2，所得共聚合物的粘均分子量为28000-35000，并能与亲和性染料配基(4)共价结合。

(1)

(2)

(3)

(4)

其中：R₁、R₂分别选自H或C₁～C₆的烷基；R₃、R₄分别选自H或C₁～C₆的羟烷基；R₅为C₁～C₆的烷基。

优选方案是：R₁、R₂分别选自H或C₁～C₃的烷基；R₃、R₄分别选自H或C₁～C₃的羟烷基；R₅为C₁～C₄的烷基。

最佳方案是：R₁为H；R₂为异丙基；R₃为H；R₄为羟甲基；R₅为正丁基。

在本发明中：单体化合物(1)是以丙烯酸为起始原料，首先经酰氯化试剂酰氯化获得丙烯酰氯，然后再与相应胺反应后制得；单体化合物(2)是由丙烯酰胺与多聚甲醛反应制得；单体化合物(3)是由丙烯酸与相应的醇经酯化反应制得单体化合物；(4)为市售品。

制备本发明所说共聚物的主要步骤如下：

以无水乙醇为溶剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，将单体化合物(1)、单体化合物(2)及单体化合物(3)按质量比为7∶3∶2加入溶剂中，在有惰性气体氮气存在下于50-80℃反应12-24小时，然后将聚合物中溶剂除去，用丙酮溶解，加入正己烷至沉淀析出，所得沉淀物经干燥后即为本发明所说的共聚物。

在30-50℃下，2％质量百分比的NaCl水溶液中，30mg/ml的Na₂CO₃水溶液存在条件下，加入单体化合物(4)及此共聚物反应12-24小时，即得到可应用于亲和沉淀的配基-聚合物。

本发明设计并合成的可用于亲和沉淀分离系统的共聚物为热敏性共聚物，其在加热条件下(高于28℃)可再生回收(回收率高达95％以上)。

有益效果：与现有用于亲和沉淀分离系统的聚合物相比，本发明所说的共聚物分离生物大分子，既能保持生物大分子的稳定性及生物活性，又可实现循环使用。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围：

                            实施例1

异丙基丙烯酰胺、羟甲基丙烯酰胺、丙烯酸丁酯共聚物制备：

在具塞三角烧瓶中加入14g异丙基丙烯酰胺、6g羟甲基丙烯酰胺和4g丙烯酸丁酯，以100ml无水乙醇中充分溶解，0.6gAIBN作为引发剂，充氮气10～15分钟，以充分去除氧气。塞子封住三角烧瓶口，60℃水浴摇床，250rpm转速下，反应24小时。反应结束，除去溶剂乙醇，用丙酮溶解再用大量正己烷沉淀，沉淀物干燥至恒重，得到最终产物，得率为80％。其粘均分子量为30588.8。

                            实施例2共聚物回收实验：

将2g共聚物溶于10ml水中在25℃以下配成溶液，升温至30℃，30分钟后离心，收集沉淀，得到共聚物的回收率为96.78％、95.85％、96.4％，理论上可以使用50次以上。

                                实施例3

在聚合物上共价结合亲和配基Cibacron Blue F3GA：

将一定量聚合物溶于水中，加入3.0mg/ml的Cibacron Blue F3GA，置于40℃水浴摇床，加入质量百分比2％的NaCl水溶液，一小时后加入30mg/ml的Na₂CO₃水溶液，振荡反应24小时，用去离子水及体积比20％乙醇水溶液洗至无染料洗脱，配基密度为30μmol/g。

                                实施例4

亲和沉淀实例，以溶菌酶为目标蛋白，将其溶于水中，初始浓度为0.3mg/ml，在20℃、pH7.0条件下反应2小时，吸附率可达到90％以上，溶菌酶的吸附容量达3.4mg/g聚合物。超过90％被吸附的酶可以在0.5MKSCN pH8.0条件下解离下来，酶活与加入时的酶活性基本保持一致，为9200U/mg。

Claims (4)

1、一种用于亲和沉淀分离系统的可再生聚合物，其特征在于，所说的聚合物由下列单体化合物(1)、单体化合物(2)和单体化合物(3)经无规共聚而得，单体化合物(1)、单体化合物(2)与单体化合物(3)的质量比为7∶3∶2，所得共聚合物的粘均分子量为28000-35000。

其中：R₁、R₂分别选自H或C₁～C₆的烷基；R₃、R₄分别选自H或C₁～C₆的羟烷基；R₅为C₁～C₆的烷基。

2、如权利要求1所述的聚合物，其特征在于，其中R₁、R₂分别选自H或C₁～C₃的烷基；R₃、R₄分别选自H或C₁～C₃的羟烷基；R₅为C₁～C₄的烷基。

3、如权利要求1或2所述的聚合物，其特征在于，其中R₁为H；R₂为异丙基；R₃为H；R₄为羟甲基；R₅为正丁基。

4、如权利要求1所述的聚合物的制备方法，其特征在于，以无水乙醇为溶剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，将单体化合物(1)、单体化合物(2)及单体化合物(3)按质量比为7∶3∶2加入溶剂中，在有惰性气体氮气存在下于50-80℃反应12-24小时，然后将聚合物中溶剂除去，用丙酮溶解，加入正己烷至沉淀析出，所得沉淀物经干燥后得到所述的共聚物。