CN111057185A - 一种用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料，制备步骤如下：制备四氧化三铁颗粒，以四乙氧基硅烷为硅源，制备包覆二氧化硅的四氧化三铁颗粒；在水溶液中加入含糖基与含正电荷的功能单体，与烯丙基三乙氧基硅烷，在引发剂存在下自由聚合，向混合液中通入氮气除氧，常温反应；聚合完成后，加入包覆二氧化硅的四氧化三铁，水浴下反应；得到的材料用蒸馏水洗涤、干燥，即得。本发明功能磁性材料生物相容性好、分散性好，材料粒径均一，对胃蛋白酶具有较强的吸附性能，性能稳定，可以实现重复利用，可以重复利用至少六次，在室温干燥的环境中放置半年后，仍能用于对胃蛋白酶的分离，极大地节约了使用的生产成本，具有广阔的应用前景。

Description

一种用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料和应用
技术领域
本发明属于功能化材料制备技术领域，尤其是一种用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料和应用。
背景技术
生物体的生命活动与蛋白质间相互作用息息相关。生物体内的一些蛋白对生物体生理功能的调节起着十分重要的作用。现在所研究的蛋白主要是体外蛋白质，蛋白质要从生物体的组织内提取出来，然后再进行分析。胃蛋白酶是哺乳动物胃肠道中重要的多肽水解酶，因此无论是在动物饲料营养方面还是医药方面皆有重要应用，而胃蛋白酶众多特性及丰富的酶系为其充分利用提供了重要的理论依据。关于其研究的热点多放在不同物种中胃蛋白酶的分离纯化。开发合成简单、高效分离的功能分离材料受到了科研工作者的关注。
目前，用于胃蛋白酶分离的材料多种多样，包括经过修饰的纳米硅球、纳米线、二氧化钛等。近年来，固相金属离子亲和色谱法和金属氧化物亲和色谱法被广泛应用于胃蛋白酶分离。
近年来磁性材料得到了广泛地应用，因为它的磁性能与其他技术相比具有独特的优势。磁性材料，具有可控的尺寸和外部操纵的能力(在外加磁场存在下能够迅速从混合溶液中分离出来)。磁性材料可被其他组分(如适当的配体、金属氧化物、酶、抗体等)功能化，根据功能化的类型不同，能与各种蛋白质有特别的识别能力。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术环境压力胁迫问题的不足之处，提供一种用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料和应用，该功能磁性材料生物相容性好、分散性好，材料粒径均一，对胃蛋白酶具有较强的吸附性能，性能稳定，可以实现重复利用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料，制备步骤如下：
⑴将六水合氯化铁、无水乙酸钠和聚乙二醇-1500溶解于乙二醇中，六水合氯化铁：无水乙酸钠：聚乙二醇-1500：乙二醇的比例g：g：g：mL为3-4：7-8：0-2：60-80，得到均匀的黄色溶液，然后将溶液转移至Teflon-lined不锈钢高压反应釜中，180℃～200℃下反应10～12h，得到黑色沉淀，用乙醇和蒸馏水洗涤，于真空干燥箱中干燥，即得到四氧化三铁颗粒；
⑵将步骤⑴得到的四氧化三铁颗粒分散到含有乙醇、蒸馏水和氨水的混合溶液中，向混合液中加入四乙氧基硅烷，在室温下机械搅拌持续10～12h，得到黑色颗粒，用蒸馏水、无水乙醇分别洗涤，于真空烘箱中干燥，即得到包覆二氧化硅的四氧化三铁颗粒；
其中，所述混合溶液中乙醇：蒸馏水：氨水的体积比为40：10：1，氨水的质量浓度为25-28％，所述四氧化三铁：氨水：四乙氧基硅烷的比例mg：mL：mL为100：1：1；
⑶在含有二甲基亚砜的水中加入带糖基与带正电荷的功能单体，与硅烷偶联剂，在引发剂存在下自由聚合，向混合液中通入氮气除氧，常温反应，机械搅拌3～6h，使其聚合，聚合过程在氮气保护下进行；所述功能单体在混合液中的质量百分数分别为1.0％～20％，硅烷偶联剂在混合液中的质量百分数为2.5％～30％，引发剂在混合液中的质量百分数为0.15％～2.5％，水：二甲基亚砜的体积比为100：1；
⑷聚合完成后，向反应体系中滴加氨水并加入包覆二氧化硅的四氧化三铁颗粒，功能单体：氨水：包覆二氧化硅的四氧化三铁颗粒的比例mol：mL：mg为1.0-1.5：0.5-1.0：45-50，氨水质量浓度为25-28％，水浴60℃-80℃下机械搅拌持续10～12h，转速为180～200rpm，得到黑色颗粒，用蒸馏水和乙醇洗涤，于真空烘箱中干燥，即得用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料。
而且，所述步骤⑴中用乙醇和蒸馏水洗涤的次数分别为3～5次。
而且，所述步骤⑴中干燥的具体条件为60℃～80℃，12～16小时。
而且，所述步骤⑵中用乙醇和蒸馏水洗涤的次数分别为3～5次。
而且，所述步骤⑵中干燥的具体条件为60℃～80℃，12～16小时。
而且，所述步骤⑶中带糖基的功能单体为糖基氧乙基甲基丙烯酸酯溶液，带正电荷的功能单体为甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液。
而且，所述步骤⑶中硅烷偶联剂为稀丙基三乙氧基硅烷，引发剂为过硫酸铵和四甲基乙二胺；或者，所述二甲基亚砜为分析纯。
而且，所述步骤⑷中用乙醇和蒸馏水洗涤的次数分别为3～5次。
而且，所述步骤⑷中干燥的具体条件为60℃～80℃，12～16小时。
如上所述的用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料在胃蛋白酶分离方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明功能磁性材料生物相容性好、分散性好，材料粒径均一，对胃蛋白酶具有较强的吸附性能，性能稳定，可以实现重复利用，可以重复利用至少六次，在室温干燥的环境中放置半年后，仍能用于对胃蛋白酶的分离，极大地节约了使用的生产成本，具有广阔的应用前景。
2、本发明功能磁性材料的制备合成过程简单，条件易于控制，所制得的材料粒径较均一，较强的生物相容性，可以用于胃蛋白酶的选择性分离，该功能磁性材料实现了对胃蛋白酶更加高效简便的分离。
3、本发明功能磁性材料的制备方法是基于四氧化铁制备的材料，所合成的材料具有快速磁响应，外部磁场存在下能快速进行磁分离，可以更好的将材料进行优化后投入应用，具有很广的应用前景。
4、本发明功能磁性材料的制备反应过程简单，提高了工作效率。
5、本发明功能磁性材料主要基于糖羟基与蛋白质上多个氨基酸残基(带有氨基、羧基、羟基等活性基团)有很强的氢键作用，以及蛋白质在不同pH下所带电荷的不同，制备的糖基单体与正电荷单体功能化的磁性材料，用于对胃蛋白酶的选择性分离。
附图说明
图1为本发明功能磁性材料的透射电镜图，其中，a为四氧化三铁，b为包覆二氧化硅的四氧化三铁，c为功能磁性材料，d为四氧化三铁，e为包覆二氧化硅的四氧化三铁，f为功能磁性材料；从图1中可看出本发明颗粒大小较均一，颗粒直径约为300nm；
图2为本发明功能磁性材料的热重图，从图2中可看出本发明材料热稳定相良好；
图3为本发明功能性磁性纳米材料对胃蛋白酶吸附的选择性图，选用牛血清白蛋白、溶菌酶、胰蛋白酶、卵清蛋白作为参照蛋白；从图3中可以明显地看出，功能磁性材料对胃蛋白酶具有较高的吸附容量，其他蛋白的吸附都很少，对于溶菌酶、胰蛋白酶、卵清蛋白几乎没有吸附能力，显示了功能磁性材料对胃蛋白具有选择性识别；
图4为本发明功能磁性材料从混合样品中选择性分离胃蛋白酶的凝胶电泳图，其中Lane 1为标准蛋白(marker)，Lane 2和Lane 6是吸附前的混合样，Lane 3和Lane 7是吸附后的混合样，Lane 4和Lane 8是对吸附材料的洗脱液，Lane 5和Lane 9是标准胃蛋白酶；从图中可以明显看出Lane 3和Lane 7中的胃蛋白酶的特征条带消失或减弱，而Lane 4和Lane 8中出现胃蛋白酶的特征条带，这说明所制备的功能化磁性材料能够有效地从混合样中分离富集胃蛋白酶，说明材料适用于蛋白混合样品，使用范围极广；
图5为本发明功能磁性材料的重复利用性能结果图，该合成的吸附材料经过6次的吸附-解析过程后，材料对胃蛋白酶的吸附量仍能达到初始吸附量的85％左右，第7次开始保持不变。由此可得，经过多次的吸附-解析过程后，材料对胃蛋白酶的吸附能力没有发生太大的变化，该材料可以重复利用，展现了其在实际应用中的潜力。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
一种用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料和应用，步骤如下：
⑴四氧化三钠铁粒子的合成：
称取3.46g的FeCl3·6H2O置于含有70mL的乙二醇的250mL烧杯中，然后缓慢加入7.66g无水乙酸钠和2g聚乙二醇-1500，在室温下剧烈搅拌30min直至完全溶解，得到均匀的黄色溶液，然后将溶液转移至100mL的Teflon-lined不锈钢高压反应釜中，200℃下反应10h之后，得到黑色沉淀用无水乙醇洗涤3次，再用去离子水洗涤3次，60℃真空干燥12h，得到的四氧化三钠铁颗粒；
⑵包覆二氧化硅的四氧化三铁粒子：
称取已制备的200mg四氧化三铁粒子加入到含有100mL乙醇/水(4/1，v/v)和2mL氨水(氨水的质量浓度为25％)的三口圆底烧瓶中超声30min，加入2mLTEOS，在室温下机械搅拌持续12h。得到的黑色颗粒用蒸馏水、无水乙醇各洗涤3次，60℃真空干燥12h，得到包覆二氧化硅的四氧化三铁粒子；
⑶将251.4uL糖基氧乙基甲基丙烯酸酯溶液和157uL稀丙基三乙氧基硅烷加入到含有20mL去离子水和200uL二甲基亚砜的三口圆底烧瓶中，通入N2冒泡30min，去除氧气，然后加入500uL过硫酸铵溶液(45.6mg/mL)和200uL四甲基乙二胺作为引发剂，机械搅拌持续3h，使其聚合，聚合过程在N2保护下进行；
⑷步骤⑶反应完成后，向体系中滴加0.5mL氨水(氨水的质量浓度为28％)，再加入48mg包覆二氧化硅的四氧化三铁粒子，60℃水浴下机械搅拌持续12h，转速为200rpm。得到的黑色颗粒，用蒸馏水、乙醇各洗涤3次，60℃真空干燥12h，得到用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料。
实施例2
一种用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料和应用，步骤如下：
⑴四氧化三钠铁粒子的合成：
称取3.46g的六水合氯化铁置于含有70mL的乙二醇的250mL烧杯中，然后缓慢加入7.66g无水乙酸钠，在室温下剧烈搅拌30min直至完全溶解，得到均匀的黄色溶液，然后将溶液转移至100mL的Teflon-lined不锈钢高压反应釜中，200℃下反应12h之后，得到黑色沉淀用无水乙醇洗涤3次，再用去离子水洗涤3次，60℃真空干燥12h，得到的四氧化三钠铁颗粒；
⑵包覆二氧化硅的四氧化三铁粒子：
称取已制备的200mg四氧化三铁粒子加入到含有100mL乙醇/水(4/1，v/v)和2mL氨水(氨水的质量浓度为28％)的三口圆底烧瓶中超声30min，加入2mLTEOS，在室温下机械搅拌持续12h。得到的黑色颗粒用蒸馏水、无水乙醇各洗涤3次，60℃真空干燥12h，得到包覆二氧化硅的四氧化三铁粒子；
⑶将251.4uL糖基氧乙基甲基丙烯酸酯溶液、170uL甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液和157uL稀丙基三乙氧基硅烷加入到含有20mL去离子水和200uL二甲基亚砜的三口圆底烧瓶中，通入N2冒泡30min，去除氧气，然后加入500uL过硫酸铵溶液(45.6mg/mL)和200uL四甲基乙二胺作为引发剂，机械搅拌持续3h，使其聚合，聚合过程在N2保护下进行；
⑷步骤⑶反应完成后，向体系中滴加1.0mL氨水(氨水的质量浓度为25％)，再加入48mg包覆二氧化硅的四氧化三铁粒子，80℃水浴下机械搅拌持续12h，转速为200rpm。得到的黑色颗粒，用蒸馏水、乙醇各洗涤3次，60℃真空干燥12h，得到用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料。
本发明功能磁性材料的相关实验结果：
1、本发明功能磁性材料的透射电镜检测，结果如图1所示，a为四氧化三铁，b为包覆二氧化硅的四氧化三铁，c为功能磁性材料，e为四氧化三铁，f为包覆二氧化硅的四氧化三铁，d为功能磁性材料，从图1中可看出本发明颗粒大小较均一，颗粒直径约为300nm；
2、本发明功能磁性材料的热重检测，结果如图2所示，从图2中可看出本发明材料热稳定相良好；
3、本发明功能磁性材料对胃蛋白酶的选择性吸附实验：
实验步骤如下：
⑴功能磁性材料对胃蛋白酶选择性吸附：
分别配制浓度为0.5mg/mL的胃蛋白酶、牛血清白蛋白、溶菌酶、胰蛋白酶和卵清蛋白的标准溶液，所用缓冲液为pH＝2.0的0.01M的磷酸缓冲液。分别称取2mg的磁性纳米材料于10mL离心管中，向其中分别加入5mL的五种蛋白标准溶液，分散均匀后，放置在恒温摇床上振荡(150rpm，25℃)，直到吸附达到平衡，施加外部磁场将材料与反应液分离，然后用紫外-可见分光光度计测定吸附后上清液中蛋白的浓度。
其结果如图3所示，图3为本发明功能性磁性纳米材料对胃蛋白酶吸附的选择性，本实验选用牛血清白蛋白、溶菌酶、胰蛋白酶、卵清蛋白作为参照蛋白。从图3中可以明显的看出，功能磁性材料对胃蛋白酶具有较高的吸附容量，其他蛋白的吸附都很少，对于溶菌酶、胰蛋白酶、卵清蛋白几乎没有吸附能力，显示了功能磁性材料对胃蛋白具有选择性识别。
⑵功能磁性材料在蛋白混合样中对胃蛋白酶选择性：
称取胃蛋白酶、牛血清白蛋白、溶菌酶、卵清蛋白各25mg，分别用pH＝2.0的0.01M的磷酸缓冲液溶解，然后定容至25mL的容量瓶中，即可得到1.0mg/mL的混合蛋白溶液，最后将配置好的混合蛋白溶液放置在4℃下备用。
称取一定量的材料加入到5mL的蛋白混合液中，分散均匀后，放置在恒温摇床上振荡(150rpm，25℃)，直到吸附达到平衡，施加外部磁场将材料与反应液分离，然后将分离得到的材料进行洗脱。分别收集混合样吸附前、吸附后、材料洗脱后的溶液，然后进行电泳实验分析。
图4为本发明功能磁性材料从混合样品中选择性分离胃蛋白酶的凝胶电泳图，其中Lane 1为标准蛋白(marker)，Lane 2和Lane 6是吸附前的混合样，Lane 3和Lane 7是吸附后的混合样，Lane 4和Lane 8是对吸附材料的洗脱液，Lane 5和Lane 9是标准胃蛋白酶。从图中可以明显看出Lane 3和Lane 7中的胃蛋白酶的特征条带消失或减弱，而Lane 4和Lane 8中出现胃蛋白酶的特征条带，这说明所制备的功能化磁性材料能够有效的从混合样中分离富集胃蛋白酶，说明材料适用于蛋白混合样品，使用范围极广。
⑶功能磁性材料的重复利用性能
图5为本发明功能磁性材料的重复利用性能结果图，该合成的吸附材料经过6次的吸附-解析过程后，材料对胃蛋白酶的吸附量仍能达到初始吸附量的85％左右，第7次开始保持不变。由此可得，经过多次的吸附-解析过程后，材料对胃蛋白酶的吸附能力没有发生太大的变化，该材料可以重复利用，展现了其在实际应用中的潜力。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

Claims (10)

1.一种用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料，其特征在于：制备步骤如下：
⑴将六水合氯化铁、无水乙酸钠和聚乙二醇-1500溶解于乙二醇中，六水合氯化铁：无水乙酸钠：聚乙二醇-1500：乙二醇的比例g：g：g：mL为3-4：7-8：0-2：60-80，得到均匀的黄色溶液，然后将溶液转移至Teflon-lined不锈钢高压反应釜中，180℃～200℃下反应10～12h，得到黑色沉淀，用乙醇和蒸馏水洗涤，于真空干燥箱中干燥，即得到四氧化三铁颗粒；
⑵将步骤⑴得到的四氧化三铁颗粒分散到含有乙醇、蒸馏水和氨水的混合溶液中，向混合液中加入四乙氧基硅烷，在室温下机械搅拌持续10～12h，得到黑色颗粒，用蒸馏水、无水乙醇分别洗涤，于真空烘箱中干燥，即得到包覆二氧化硅的四氧化三铁颗粒；
其中，所述混合溶液中乙醇：蒸馏水：氨水的体积比为40：10：1，氨水的质量浓度为25-28％，所述四氧化三铁：氨水：四乙氧基硅烷的比例mg：mL：mL为100：1：1；
⑶在含有二甲基亚砜的水中加入带糖基与带正电荷的功能单体，与硅烷偶联剂，在引发剂存在下自由聚合，向混合液中通入氮气除氧，常温反应，机械搅拌3～6h，使其聚合，聚合过程在氮气保护下进行；所述功能单体在混合液中的质量百分数分别为1.0％～20％，硅烷偶联剂在混合液中的质量百分数为2.5％～30％，引发剂在混合液中的质量百分数为0.15％～2.5％，水：二甲基亚砜的体积比为100：1；
⑷聚合完成后，向反应体系中滴加氨水并加入包覆二氧化硅的四氧化三铁颗粒，功能单体：氨水：包覆二氧化硅的四氧化三铁颗粒的比例mol：mL：mg为1.0-1.5：0.5-1.0：45-50，氨水质量浓度为25-28％，水浴60℃-80℃下机械搅拌持续10～12h，转速为180～200rpm，得到黑色颗粒，用蒸馏水和乙醇洗涤，于真空烘箱中干燥，即得用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料。
2.根据权利要求1所述的用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料，其特征在于：所述步骤⑴中用乙醇和蒸馏水洗涤的次数分别为3～5次。
3.根据权利要求1所述的用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料，其特征在于：所述步骤⑴中干燥的具体条件为60℃～80℃，12～16小时。
4.根据权利要求1所述的用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料，其特征在于：所述步骤⑵中用乙醇和蒸馏水洗涤的次数分别为3～5次。
5.根据权利要求1所述的用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料，其特征在于：所述步骤⑵中干燥的具体条件为60℃～80℃，12～16小时。
6.根据权利要求1所述的用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料，其特征在于：所述步骤⑶中带糖基的功能单体为糖基氧乙基甲基丙烯酸酯溶液，带正电荷的功能单体为甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵溶液。
7.根据权利要求1所述的用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料，其特征在于：所述步骤⑶中硅烷偶联剂为稀丙基三乙氧基硅烷，引发剂为过硫酸铵和四甲基乙二胺；或者，所述二甲基亚砜为分析纯。
8.根据权利要求1所述的用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料，其特征在于：所述步骤⑷中用乙醇和蒸馏水洗涤的次数分别为3～5次。
9.根据权利要求1至8任一项所述的用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料，其特征在于：所述步骤⑷中干燥的具体条件为60℃～80℃，12～16小时。
10.如权利要求1至9任一项所述的用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料在胃蛋白酶分离方面中的应用。
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