CN105771942A - 一种磁性纳米材料及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到糖基化蛋白样品的预处理过程。具体来讲就是一种用于糖基化蛋白样品预处理的新型磁性纳米材料。该方法基于磁性纳米材料的制备，后续糖肽树枝状大分子的修饰，以及利用亲水作用色谱对糖基化多肽的富集作用。所述的方法灵敏度高，适用于生物样品中糖基化蛋白的预处理。
Description
技术领域
本发明涉及新型磁性纳米材料的合成以及糖基化蛋白的样品预处理，具体地说是一种用于糖基化蛋白质快速样品预处理的磁性纳米材料，该磁性材料可用于糖基化多肽的富集。
背景技术
蛋白质的翻译后修饰(PTMs)是近年来蛋白质组学研究的热点。蛋白质糖基化修饰是最常见，也是最重要的蛋白质翻译后修饰方式之一。它在很多重要的生命活动过程中起着关键的调节作用，如蛋白质折叠，细胞间相互作用，分子识别、免疫应答和炎症反应等。此外，异常的蛋白质糖基化修饰还是癌症及其他一些疾病发生发展的重要标志。许多疾病的诊断标记物及治疗的靶标都来自于糖基化蛋白。因此，研究蛋白质的糖基化修饰对于疾病的诊断以及治疗具有重要的意义。
目前，糖基化蛋白以及糖基化位点的研究主要依赖于质谱分析技术(MS)。然而，由于生物样品的复杂程度较高，其中糖基化蛋白的丰度较低，因此，酶解后糖基化多肽的质谱信号就会受到非糖基化多肽的干扰抑制。所以，在质谱鉴定之前，将糖基化多肽从生物样品中选择性地高效地富集出来是非常重要的样品预处理过程。
当前，糖基化多肽的富集方法主要有凝集素法、肼化学反应法、硼酸亲和色谱法和亲水相互作用色谱法。其中，一种凝集素只能选择性地富集某一种糖型的糖基化多肽；肼化学法操作繁琐，破坏了糖结构；硼酸亲和色谱法则由于亲和作用比较弱，限制了其在微量生物样品中的应用。亲水相互作用色谱法利用材料和糖结构的亲水相互作用实验对糖基化肽段的富集。并且该方法操作简单，不会破坏糖结构。虽然，大量的亲水材料被用于糖肽的富集，但是亲水材料的富集灵敏度和特异性仍需要提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于微量糖基化蛋白预处理的磁性纳米材料。
为实现上述目的，申请人在了解了亲水相互作用色谱法预处理糖基化蛋白质样品原理的基础上，合成了具有易分离、高亲水、多作用位点的磁性纳米材料。
本发明提供的磁性纳米材料结构为在磁性纳米粒子的表面包覆有一层硅层，利用硅层易于修饰的特点，对磁性纳米颗粒进行了叠氮基多肽树枝状大分子的修饰，然后再“叠氮-叁键”的点击化学修饰上了麦芽糖。
所述磁性纳米粒子为Fe3O4，粒径为175-200nm；
所述硅层为SiO2，厚度为10-25nm；
所述叠氮基多肽树枝状大分子的修饰量为125-145μmol/g磁性纳米颗粒；
所述麦芽糖的修饰量为75-95μmol/g磁性纳米颗粒。
该磁性材料具有亲水特性，且具有多作用化位点。
本发明合成用于糖基化蛋白样品富集的磁性纳米材料所采用的技术方案主要包括以下步骤：
1)将Fe3O4颗粒分散到稀盐酸中，超声处理，然后用去离子水洗涤至中性，分散到乙醇、水和的浓氨水的混合液中，搅拌，滴加四乙氧基硅烷(TEOS)，反应后分离磁性材料，得到Fe3O4SiO2纳米颗粒；
2)取上述Fe3O4SiO2纳米颗粒分散到异丙醇中，在N2保护下滴加氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，反应后分离磁性材料，得到Fe3O4SiO2-NH2磁性材料；
3)取叠氮基多肽树枝状大分子(N3-pepDendrimer：[(azidoacetyl-Tyr)2-Lys-Glu]2-Lys，杭州中肽生化有限公司，产品编号：876430)分散到PBS缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行反应；然后将分散有Fe3O4SiO2-NH2磁性材料的PBS缓冲液加入到产物溶液中，形成反应混合液，继续进行反应，反应过程中分次加入EDC和NHS；反应结束后，分离磁性材料，得到MNPs-dN3纳米颗粒；
4)取上述MNPs-dN3纳米颗粒分散到含有麦芽糖的甲醇水溶液中，加入亚铜催化剂，搅拌反应；分离磁性颗粒，得到dM-MNPs。
其中步骤一种所用Fe3O4颗粒的合成方法为将三氯化铁(FeCl3·6H2O)溶于乙二醇中，三氯化铁的浓度为13-14g/L；加入无水醋酸钠(CH3COONa),无水醋酸钠的浓度为35.5-36.5g/L；将得的溶液加热到198-202℃反应7.5-8.5h，分离固体产物，即过滤，用乙醇或去离子水中的一种或二种洗涤，真空干燥，得到Fe3O4颗粒。
步骤1)中，稀盐酸的浓度为0.09-0.11M，Fe3O4颗粒的浓度为0.95-1.05g/L，超声处理的时间为25-30min，所述浓氨水的质量浓度为25-28％，混合液中乙醇、水和浓氨水的体积比例为75-85:15-20：0.75-1.25，搅拌时间为25-30min，加入的四乙氧基硅烷(TEOS)与浓氨水的体积比例为0.9:1-1:1.1，反应温度为室温，反应时间为7.5-8.5h，分离磁性材料方法为利用磁铁分离后，用无水乙醇洗涤、真空干燥。
步骤2)中Fe3O4SiO2纳米颗粒在异丙醇中的浓度为3-4g/L，Fe3O4SiO2纳米颗粒在异丙醇中分散后需超声处理25-30min，滴加的氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的终浓度为75-125g/L；反应温度为室温，反应时间为23.5-24h，分离磁性材料方法为利用磁铁分离后，用异丙醇、无水乙醇或水中的一种或二种或三种洗涤，真空干燥。
步骤3)中所述PBS缓冲液pH为5-6，N3-pepDendrimer在PBS缓冲液中的浓度为0.45-0.55mg/mL；加入的EDC与N3-pepDendrimer的质量比例为4.5:1-5.5:1，NHS与N3-pepDendrimer的质量比例为4.5:1-5.5:1；机械搅拌下反应，反应温度为室温，反应时间为25-30min；Fe3O4SiO2-NH2磁性材料在PBS缓冲液中的浓度为4.5-5.5g/L；反应混合液中Fe3O4SiO2-NH2与原始加入的N3-pepDendrimer的质量比例为4.5:1-5.5:1；继续反应的温度为室温，时间为47.5-48h；设反应时间为s，继续反应过程中，所述分次加入指在反应时间内，每过s/N时间加入一次EDC和NHS，每次加入的EDC量相等，每次加入的NHS量相等，共加入N次；N次加入的EDC总量与向N3-pepDendrimer的PBS缓冲溶液中加入的EDC量相等，加入的NHS总量与向N3-pepDendrimer的PBS缓冲溶液中加入的NHS量相等；分离磁性材料的方法为利用磁铁分离，用PBS缓冲液、无水乙醇或水中的一种或二种或三种洗涤，真空干燥；
N为不小于4且不大于7的正整数。
步骤4)中所述麦芽糖为1-炔丙基-O-麦芽糖，甲醇水溶液中1-炔丙基-O-麦芽糖的浓度为6-7g/L，甲醇的体积浓度为45-55％；MNPs-dN3纳米颗粒分散到上述溶液中后的浓度为2.5-3.5g/L；所述亚铜催化剂为含CuSO416-16.5mg/mL、抗坏血酸35-35.5mg/mL的水溶液；反应温度为室温，反应时间为11.5-12h；所述分离磁性颗粒的方法为利用磁铁分离，用甲醇、乙醇或水的一种或二种或三种洗涤，真空干燥。
本发明提供的磁性纳米材料可以用于对糖基化多肽进行选择性富集。
本发明由于采用以上技术方案，其合成的材料具有以下优点：1)易分离，由于磁核的存在，利用磁铁可以在几十秒内实验材料与富集体系的分离；2)亲水性高，由于硅层，树枝状大分子和麦芽糖的存在，材料的亲水性较好；3)适合于微量样品的分析。
总之，本发明是一种用于微量糖基化蛋白样品预处理的新型磁性纳米材料，该方法基于磁性纳米材料的制备，后续糖肽树枝状大分子的修饰，以及利用亲水作用色谱对糖基化多肽的富集作用。所述的方法灵敏度高，适用于生物样品中糖基化蛋白的预处理。
附图说明
图1(A)为本发明提供的磁性纳米材料的合成示意图；(B)为对照磁性纳米材料的合成示意图，其中Tyr为酪氨酸，Glu为谷氨酸，Lys为赖氨酸。
图2为糖基化蛋白样品预处理的示意图。具体步骤为：磁性纳米材料均匀分散到上样液中，再将糖基化蛋白酶解液加入其中，室温下轻微震荡完成富集后，利用上样液洗去非糖基化多肽；然后用洗脱液进行糖基化多肽的洗脱；接下来将洗脱液进行MALDI-TOF质谱或LC-MS/MS进行检测分析。
图3为本发明提供的磁性纳米材料用于分析标准糖蛋白的MALDI-TOFMS图。糖基化多肽的峰已标出；(A)IgG酶解液的质谱图；(B)IgG洗脱液1的质谱图；(C)IgG洗脱液2的质谱图；(D)对照磁性纳米材料洗脱液3的质谱图。
图4为磁性纳米材料分析IgG灵敏度实验的MALDI-TOF质谱图，糖基化多肽的峰已标出，其中本发明提供的磁性纳米材料：(A)50fmol；(B)5fmol；(C)0.1fmol；对照磁性纳米材料：(D)50fmol；(E)5fmol；(F)0.1fmol。
具体实施方式
本发明方法的最大特征在于：引入了树枝状大分子，提高材料的亲水性，提高了材料与糖基化多肽的相互作用。下面通过实例介绍具体实施方式。
实施例1
1)磁性纳米颗粒(Fe3O4SiO2-NH2)的合成。
2.70g三氯化铁(FeCl3·6H2O)溶于100mL的乙二醇中，机械搅拌得到黄色透明液体，然后加入7.20g无水醋酸钠(CH3COONa),继续搅拌30分钟后，将所得的溶液转入到200mL的Teflon内衬的不锈钢反应釜中。将反应釜放在200℃下反应8h后，将所得的材料用30mL乙醇和30mL水各洗涤3次后，60℃下真空干燥得到Fe3O4(175nm)。
称取0.2gFe3O4颗粒，分散到50mL的浓度为0.1M的稀盐酸中，超声处理25min。然后将用去离子水洗涤至中性的Fe3O4颗粒分散到160mL乙醇、40mL水和2.0mL的浓氨水的混合液中，机械搅拌25min，逐滴滴加1.0mL四乙氧基硅烷(TEOS)。室温下反应8h后，利用磁铁分离磁性材料，并用30mL无水乙醇洗涤3次，真空干燥得到Fe3O4SiO2,硅层的厚度约为20nm。
称取0.1gFe3O4SiO2纳米颗粒分散到60mL异丙醇中，超声30min后，在N2保护下滴加1.0mL氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)。室温下反应24h。利用磁铁分离材料，利用异丙醇、无水乙醇和水各洗涤3次，真空干燥后得到Fe3O4SiO2-NH2。氨基的接枝量为157.1μmol/g。
2)磁性纳米材料表面接枝糖肽树枝状大分子
称取50mgFe3O4SiO2-NH2磁性材料分散到10mLPBS缓冲液(pH＝5.50,10mMKH2PO4)中,超声30min。称取10mg叠氮基多肽树枝状大分子(N3-pepDendrimer,结构如说明书附图1所示)分散到20mlPBS缓冲液中，然后加入50mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(EDC)和50mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS),机械搅拌，室温下反应30min。然后将分散好的50mgFe3O4SiO2-NH2磁性材料加入到其中，室温下反应48h。当反应4h、8h、12h、24h、36h时，每次加入10mgEDC和10mgNHS，5次共加入50mgEDC和50mgNHS。反应结束后，分离磁性材料，用PBS、无水乙醇和水一次洗涤三次后，真空干燥，得到MNPs-dN3，N3-pepDendrimer的接枝量为：130.8μmol/g。
称取30mgMNPs-dN3纳米颗粒分散到含有50mg1-炔丙基-O-麦芽糖(结构如说明书附图1所示)的30mL50％甲醇水溶液中，超声30min。加入30μL亚铜催化剂(CuSO4,16.2mg/mL；抗坏血酸，35.0mg/mL；H2O)后，机械搅拌反应12h。利用磁铁分离磁性颗粒，用甲醇、乙醇和水分别洗涤三次后，真空干燥，得到dM-MNPs，1-炔丙基-O-麦芽糖的接枝量为89.9μmol/g。
实施例2基于糖基化蛋白样品预处理的磁性纳米材料分析标准糖蛋白样品
糖蛋白样品的制备:将1mg人免疫球蛋白G(IgG)加入到1mL0.1M的碳酸氢胺/8M尿素溶液(pH8.2)、20μL1M二硫苏糖醇(DTT)，混匀后在60℃中反应1h。在上述溶液中加入7.2mg碘代乙酰胺(IAA)，在室温避光条件下反应40min。再加入40μL(40μg)胰蛋白酶溶液后，体系在37℃中反应16h。所得溶液通过SPE柱进行除盐。获得的蛋白溶液置于-30℃冰箱中保存备用。
基于磁性纳米材料的糖基化蛋白预处理及MALDI-TOFMS分析：该过程首先是糖基化多肽的富集。将20μg实施例1制备的的磁性纳米材料均匀分散到400μL88％ACN/5％TFA/8％H2O中，再将人血清免疫球蛋白G酶解液加入其中，室温下轻微震荡30min完成富集，并用400μL×388％ACN/5％TFA/8％H2O洗去非糖基化多肽。然后是糖基化多肽的洗脱和去糖基化处理。用10μL×230％ACN/0.1％ACN进行糖基化多肽的洗脱，记为洗脱液1。将洗脱液1冻干处理后利用20μL10mM碳酸氢胺缓冲液(其中含有100UPNGaseF)在37℃下反应12h实现去糖基化处理，所得液记为洗脱液2。将上述洗脱液1和洗脱液2直接用MALDI-TOF质谱进行检测分析。所有的MALDI-TOF质谱分析都在ABSciex5800飞行时间质谱仪上完成。
分析结果：由图3B可见，IgG的糖基化多肽很好得富集并鉴定到，非糖基化多肽基本都被去除掉。由图3C可见，通过加入含PNGaseF的缓冲液，磁性纳米材料富集到的糖基化多肽能够完全地被去糖基化，溶液中只含去糖基化的多肽。以上结果说明该纳米材料能很好地用于糖基化蛋白样品的预处理和分析。
有图4可见，磁性纳米材料对IgG的检测限为0.1fmol。因此，本发明提供的磁性纳米材料的预处理能力强于对照磁性纳米材料。
比较例1本发明提供的磁性纳米材料与对照磁性纳米材料的比较
糖蛋白样品的制备:将1mg人免疫球蛋白G(IgG)加入到1mL0.1M的碳酸氢胺/8M尿素溶液(pH8.2)、20μL1M二硫苏糖醇(DTT)，混匀后在60℃中反应1h。在上述溶液中加入7.2mg碘代乙酰胺(IAA)，在室温避光条件下反应40min。再加入40μL(40μg)胰蛋白酶溶液后，体系在37℃中反应16h。所得溶液通过SPE柱进行除盐。获得的蛋白溶液置于-30℃冰箱中保存备用。
基于对照磁性纳米材料的糖基化蛋白预处理及MALDI-TOFMS分析：将20μg对照磁性纳米材料(按照图1(B)步骤合成的)均匀分散到400μL88％ACN/5％TFA/8％H2O中，再将3μL人血清免疫球蛋白G酶解液加入其中，室温下轻微震荡30min完成富集，并用400μL×388％ACN/5％TFA/8％H2O洗去非糖基化多肽。然后用10μL×230％ACN/0.1％ACN进行糖基化多肽的洗脱，洗脱液冻干处理后利用20μL10mM碳酸氢胺缓冲液(其中含有100UPNGaseF)在37℃下反应12h实现去糖基化处理，记为洗脱液3。将上述洗脱液3直接用MALDI-TOF质谱进行检测分析。
分析结果:所获得的MALDI-TOF质谱图见图3D。由图可见，对照磁性纳米材料对IgG的富集能力不如本发明提供的磁性纳米材料。
实施例2基于微反应器的方法分析小鼠肝脏中的糖蛋白
鼠肝样品的制备:将1mg鼠肝样品加入到1mL0.1M的碳酸氢胺/8M尿素溶液(pH8.2)、20μL1M二硫苏糖醇(DTT)，混匀后在60℃中反应1h。在上述溶液中加入7.2mg碘代乙酰胺(IAA)，在室温避光条件下反应40min。再加入40μL(40μg)胰蛋白酶溶液后，体系在37℃中反应16h。所得溶液通过SPE柱进行除盐。获得的鼠肝蛋白溶液置于-30℃冰箱中保存备用。
基于微反应器的糖基化蛋白预处理及LC-MS/MS分析：该过程首先是糖基化多肽的富集。将800μg实施例1制备的磁性纳米材料均匀分散到400μL88％ACN/5％TFA/8％H2O中，将80μg鼠肝样品的酶解液加入其中，室温下轻微震荡30min完成富集，并用400μL×388％ACN/5％TFA/8％H2O洗去非糖基化多肽。然后是糖基化多肽的洗脱和去糖基化处理。用30μL×330％ACN/0.1％ACN进行糖基化多肽的洗脱。将洗脱液冻干处理后利用100μL10mM碳酸氢胺缓冲液(其中含有200UPNGaseF)在37℃下反应12h实现去糖基化处理。去糖基化处理后的洗脱液用LC-MS/MS进行分析。所有的LC-MS/MS实验在Thermo的Q-Exactive上进行，并配置nano-HPLC进行肽段的分离。单次分析梯度为150min，每个样品平行分析三次。所得的质谱数据用Maxquant软件进行处理。
分析结果:从80μg鼠肝蛋白中，三次平行分析中，我们总共鉴定到了1009个糖基化位点，对应572个糖基化蛋白。
比较例2本发明提供的磁性纳米材料与对照磁性纳米材料的比较
糖蛋白预处理及LC-MS/MS分析：取80μg制备好的鼠肝蛋白样品，利用800μg对照磁性纳米材料在400μL88％ACN/5％TFA/8％H2O中进行富集。富集、洗脱、去糖基化、质谱处理和数据处理方法同上。
分析结果:从80μg鼠肝蛋白中，三次平行分析中，我们总共鉴定到了693个糖基化位点，对应398个糖基化蛋白。
由此可见，本发明提供的磁性纳米材料对糖基化蛋白的预处理能力高于对照磁性材料。
Claims (10)
1.一种磁性纳米材料，其特征在于：
结构为在磁性纳米粒子的表面包覆有一层硅层，利用硅层易于修饰的特点，对磁性纳米颗粒进行了叠氮基多肽树枝状大分子的修饰，然后再“叠氮-叁键”的点击化学修饰上了麦芽糖。
2.按照权利要求1所述的磁性纳米材料，其特征在于：
所述磁性纳米粒子为Fe3O4，粒径为175-200nm；
所述硅层为SiO2，厚度为10-25nm；
所述叠氮基多肽树枝状大分子的修饰量为125-145μmol/g磁性纳米颗粒；
所述麦芽糖的修饰量为75-95μmol/g磁性纳米颗粒。
3.按照权利要求1所述的磁性纳米材料，其特征在于：该磁性材料具有亲水特性，且具有多作用化位点。
4.一种权利要求1-3任意所述的磁性纳米材料的制备方法，其特征在于：
包括以下步骤：
1)将Fe3O4颗粒分散到稀盐酸中，超声处理，然后用去离子水洗涤至中性，分散到乙醇、水和浓氨水的混合液中，搅拌，滴加四乙氧基硅烷(TEOS)，反应后分离磁性材料，得到Fe3O4SiO2纳米颗粒；
2)取上述Fe3O4SiO2纳米颗粒分散到异丙醇中，在N2保护下滴加氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，反应后分离磁性材料，得到Fe3O4SiO2-NH2磁性材料；
3)取叠氮基多肽树枝状大分子(N3-pepDendrimer：[(azidoacetyl-Tyr)2-Lys-Glu]2-Lys)分散到PBS缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行反应；然后将分散有Fe3O4SiO2-NH2磁性材料的PBS缓冲液加入到产物溶液中，形成反应混合液，继续进行反应，反应过程中分次加入EDC和NHS；反应结束后，分离磁性材料，得到MNPs-dN3纳米颗粒；
4)取上述MNPs-dN3纳米颗粒分散到含有麦芽糖的甲醇水溶液中，加入亚铜催化剂，搅拌反应；分离磁性颗粒，得到dM-MNPs。
5.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
Fe3O4颗粒的合成方法为将三氯化铁(FeCl3·6H2O)溶于乙二醇中，三氯化铁的浓度为13-14g/L；加入无水醋酸钠(CH3COONa),无水醋酸钠的浓度为35.5-36.5g/L；将得到的溶液加热到198-202℃，反应7.5-8.5h，分离固体产物，过滤，用乙醇或去离子水中的一种或二种洗涤，真空干燥，得到Fe3O4颗粒。
6.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
步骤1)中，稀盐酸的浓度为0.09-0.11M，Fe3O4颗粒的浓度为0.95-1.05g/L，超声处理的时间为25-30min，所述浓氨水的质量浓度为25-28％，混合液中乙醇、水和浓氨水的体积比例为75-85:15-20：0.75-1.25，搅拌时间为25-30min，加入的四乙氧基硅烷(TEOS)与浓氨水的体积比例为0.9:1-1:1.1，反应温度为室温，反应时间为7.5-8.5h，分离磁性材料方法为利用磁铁分离后，用无水乙醇洗涤、真空干燥。
7.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
步骤2)中Fe3O4SiO2纳米颗粒在异丙醇中的浓度为3-4g/L，Fe3O4SiO2纳米颗粒在异丙醇中分散后需超声处理25-30min，滴加的氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的终浓度为75-125g/L；反应温度为室温，反应时间为23.5-24h，分离磁性材料方法为利用磁铁分离后，用异丙醇、无水乙醇或水中的一种或二种或三种洗涤，真空干燥。
8.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
步骤3)中所述PBS缓冲液pH为5-6，N3-pepDendrimer在PBS缓冲液中的浓度为0.45-0.55mg/mL；加入的EDC与N3-pepDendrimer的质量比例为4.5:1-5.5:1，NHS与N3-pepDendrimer的质量比例为4.5:1-5.5:1；机械搅拌下反应，反应温度为室温，反应时间为25-30min；Fe3O4SiO2-NH2磁性材料在PBS缓冲液中的浓度为4.5-5.5g/L；反应混合液中Fe3O4SiO2-NH2与原始加入的N3-pepDendrimer的质量比例为4.5:1-5.5:1；继续反应的温度为室温，时间为47.5-48h；设反应时间为s，继续反应过程中，所述分次加入指在反应时间内，每过s/N时间加入一次EDC和NHS，每次加入的EDC量相等，每次加入的NHS量相等，共加入N次；N次加入的EDC总量与向N3-pepDendrimer的PBS缓冲溶液中加入的EDC量相等，加入的NHS总量与向N3-pepDendrimer的PBS缓冲溶液中加入的NHS量相等；分离磁性材料的方法为利用磁铁分离，用PBS缓冲液、无水乙醇或水中的一种或二种或三种洗涤，真空干燥；
N为不小于4且不大于7的正整数。
9.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
步骤4)中所述麦芽糖为1-炔丙基-O-麦芽糖，甲醇水溶液中1-炔丙基-O-麦芽糖的浓度为6-7g/L，甲醇的体积浓度为45-55％；MNPs-dN3纳米颗粒分散到上述溶液中后的浓度为2.5-3.5g/L；所述亚铜催化剂为含CuSO416-16.5mg/mL、抗坏血酸35-35.5mg/mL的水溶液；反应温度为室温，反应时间为11.5-12h；所述分离磁性颗粒的方法为利用磁铁分离，用甲醇、乙醇或水的一种或二种或三种洗涤，真空干燥。
10.一种权利要求1-3任一所述磁性纳米材料在对糖基化多肽进行选择性富集中的应用。
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