CN108827930A - 一种磁性纳米材料及其在检测黄素蛋白、黄素蛋白与其配体相互作用方面的应用 - Google Patents

一种磁性纳米材料及其在检测黄素蛋白、黄素蛋白与其配体相互作用方面的应用 Download PDF

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Abstract

一种磁性纳米材料及其在检测黄素蛋白、黄素蛋白与其配体相互作用方面的应用，属于SERS检测技术领域。本发明首次应用生物相容的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料作为SERS基底，设计了一种检测黄素蛋白的方法。TiO2作为公认的生物相容性好的材料，而且在表面增强拉曼技术中也经常作为半导体基底来研究拉曼增强机理和检测。而对于磁性Fe3O4，其可以实现快速分离的作用。黄素在参与如呼吸作用等的生物化学过程中，需要经历氧化还原过程，其还原态容易被氧化，所以选用磁性材料作为实验手段，以Fe3O4为核、TiO2为壳组成的核壳结构则集快速分离和生物相容性于一身的特点，使得SERS检测黄素蛋白及其功能成为可能，从而为线粒体中生命活动的作用机理提供一定的依据。

Description

一种磁性纳米材料及其在检测黄素蛋白、黄素蛋白与其配体 相互作用方面的应用
技术领域
本发明属于SERS检测技术领域，具体涉及一种生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料及其在作为表面增强拉曼散射基底检测黄素蛋白、检测黄素蛋白与其配体间相互作用方面的应用。
背景技术
黄素即维生素B2及其衍生物，其中以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为主，以辅酶的形式在生物体内的各项生命活动中扮演着不可或缺的角色。黄素的主要结构是其分子中的异咯嗪环，其1,5位的两个N原子是整个分子的氧化还原中心，既可以接受一个电子成半醌形式，也可以接受两个电子，来将电子传递给下一个受体。结合FAD或FMN辅基的蛋白称为黄素蛋白。多数的黄素蛋白会参与线粒体中的呼吸链组成，与电子转移有着重要关系，如NADH (还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)脱氢酶以FMN为辅基，是呼吸链的组分之一，介于NADH与其他电子传递体之间；呼吸作用里的柠檬酸循环中，FAD作为琥珀酸脱氢酶的辅酶将琥珀酸环氧化为延胡索酸来传递电子到呼吸链中；还有脂肪酰CoA脱氢酶与琥珀酸脱氢酶类似，也属于FAD辅基的黄素蛋白，需要另外一个FAD辅基的黄素蛋白作用，使电子进入呼吸链中；此外，在线粒体之外，有谷胱甘肽还原酶中FAD以辅酶形式来调节GSH(还原型谷胱甘肽)和GSSG(氧化型谷胱甘肽)的比值来维持生命体正常活动。
线粒体在真核细胞生命活动过程中发挥着至关重要的作用，是一种含有双层膜结构的细胞器，有内外膜、膜间隙、基质，甚至还有少量的DNA，在线粒体的内外膜及膜间隙中发生着众多生命活动，如呼吸反应等，而真正发挥作用的就是其中的蛋白质，这些蛋白绝大多数是由核基因编码的，在细胞质中合成未成熟的前体蛋白，然后通过TOM(translocaseof outer membrane)复合体，在前导肽和蛋白酶的帮助下定位转运带外膜、内膜或基质中。蛋白质在生成过程中需要二硫键的折叠，这个过程主要发生在内质网和线粒体膜间隙(IMS)中。线粒体膜间隙是位于内膜和外膜之间的空隙，其含有众多具有生物功能的组分，如代谢酶类、参与呼吸链的蛋白、多肽和金属离子转运体等。这些蛋白是在细胞质合成，然后输入到线粒体膜间隙中进行折叠，进而发挥其作用。在这个过程中，线粒体膜间隙中的Mia40～Erv1二硫键传递系统发挥着重要作用，而参与此过程的两个重要的成分——巯基氧化酶(Erv1)和二硫键氧化还原酶(Mia40)，其中Erv1是以 FAD作为辅酶发挥作用的。
底物蛋白通过线粒体外膜的TOM转运蛋白进入膜间隙中，与二硫键氧化还原酶Mia40相互作用，Mia40将底物蛋白折叠形成二硫键，而其本身的二硫键被打开成两个巯基，之后与Erv1相互作用，Erv1为二聚体，两个亚基的外臂上的二硫键会被还原为巯基，进而与亚基中非共价键结合的FAD传递电子，FAD被还原为 FADH·或FADH2，此时Erv1再与细胞色素c相互作用，将电子传递进入呼吸链中。
人类中很多严重的疾病来自于线粒体的蛋白变异，这些变异会在一定程度上影响线粒体的生命活动，如基因突变导致的线粒体中参与呼吸链的复合酶I、II、 III、IV，导致线粒体功能障碍，从而引发各种疾病。帕金森病(parkinson’s disease，PD)是目前临床上发病率仅次于阿尔茨海默病，具有致命性、遗传性的神经退行性疾病。患者的主要临床表现为行动迟缓、静止性震颤、肌强直、姿势异常等，其病理特质神经元内路易小体的出现。该疾病的致病机理尚未清楚，大量证据证实PD细胞中发生线粒体形态和功能障碍。线粒体氧化呼吸链复合物蛋白活性或表达水平降低，线粒体自噬清除受损，线粒体未折叠蛋白反应等与 PD有关，其中线粒体未折叠蛋白反应与线粒体膜间隙的二硫键系统相关，所以研究这个系统有重要意义。
表面增强拉曼散射(SERS)是一种超灵敏的表面分析技术，借助分子在SERS 活性基底的吸附可将分子本身的拉曼信号显著增强。在一些特殊体系中，SERS 的增强因子可以达到1014～1015，使单分子检测成为可能。经历了30年的发展，近年来SERS已被广泛应用在表面吸附、电化学和催化反应、生物医学检测等诸多领域。由于水对信号无影响，使得拉曼光谱受到生物科学工作者的青睐。与其他超灵敏检测技术相比，拉曼光谱有其自身的优点：1)极高的检测灵敏度：可以实现单分子检测，对拉曼信号较弱的蛋白质检测提供了一种非常好的方法。 2)极高的选择性：表面选择定则和共振增强的选择性使得SERS可以在极其复杂的体系中只增强目标分子或集团。3)微区与原位检测：光学检测，样品尺寸可以小到微米级。4)无损检测：采用的是可见光，对材料和人体都是非破坏性的。
众所周知，生物相容性磁性纳米材料可以与生物蛋白结合，从而与其相关配体相互作用来监测蛋白分子之间的相互作用，将拉曼技术与生物相容性的磁性纳米粒子相结合，通过拉曼信号的位移和强度的变化来判断相互作用。
发明内容
针对现在技术中存的上面的问题，本发明首次应用生物相容的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料作为SERS基底，设计了一种检测黄素蛋白的方法。TiO2作为公认的生物相容性好的材料，而且在表面增强拉曼(SERS)技术中也经常作为半导体基底来研究拉曼增强机理和检测。而对于磁性Fe3O4，其可以实现快速分离的作用。黄素在参与如呼吸作用等的生物化学过程中，需要经历氧化还原过程，其还原态容易被氧化，所以选用磁性材料作为实验手段，以Fe3O4为核、TiO2为壳组成的Fe3O4@TiO2核壳(core～hell)结构则集快速分离和生物相容性于一身的特点，使得SERS检测黄素蛋白及其功能成为可能，从而为线粒体中生命活动的作用机理提供一定的依据。
本发明所述的生物相容性磁性纳米材料检测黄素蛋白及其与其配体相互作用的方法包括：生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料的制备；以FAD为辅基的巯基氧化酶Erv1与其配体细胞色素c(cyt c)相互作用研究。
本发明所述的方法包括三个部分：
1.生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料的制备
1.1磁性Fe3O4的制备：
称取0.45～0.50g无水FeCl3和2.5～3.0g无水乙酸钠固体于50mL烧杯中，加入25～35mL乙二醇，磁力搅拌下得到棕黄色的混合液，将此混合液在190～210℃条件下溶剂热反应7～9h；待反应结束之后，用磁铁富集，倒去上清液，用无水乙醇冲洗富集物2～3次，然后在低于相对压力～0.08MPa的真空和 50～70℃条件下干燥，得到磁性Fe3O4。
1.2Fe3O4@TiO2的合成
将80～105mL的无水乙醇和25～35mL的乙腈混合，体积比例为3：1，再加入0.4～0.6mL的氨水(氨水的质量分数为25～28％)，再将40～60mg磁性Fe3O4分散于上述混合液中；在搅拌条件下，加入0.8～1.3mL的钛酸四丁酯，搅拌 1.5～2h；用磁铁富集，倒去上清液，用无水乙醇冲洗富集物2～3次，然后在低于相对压力～0.08MPa的真空和50～70℃条件下干燥，得到无定型TiO2包裹的 Fe3O4，即Fe3O4@TiO2；
1.3生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料的制备
称取20～30mg的Fe3O4@TiO2，分散到20～40mL、体积比为2：1的无水乙醇和去离子水的混合液中，再加入0.4～0.6mL的氨水(氨水的质量分数为 25～28％)，然后将混合液在150～170℃下反应18～24h，得到棕红色产物；用磁铁富集，倒去上清液，用无水乙醇冲洗富集物2～3次，然后在低于相对压力～0.08MPa的真空和50～70℃条件下干燥，得到生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料。
2.检测黄素蛋白
取90～110μL谷胱甘肽还原酶(一种含FAD辅基的黄素蛋白，来自于酿酒酵母，170units/mg)，用9.8～9.9mL磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.4，除氧处理后使用)溶于10mL比色管中，得到谷胱甘肽还原酶溶液，放置于4℃冰箱中保存，待用。
取8～12mg生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料于20mL玻璃瓶中，加入 0.8～1.2mL的谷胱甘肽还原酶溶液，再加入8～9mL的磷酸缓冲液，37℃恒温震荡 3～5h；然后用磁铁富集，倒去上清液，用磷酸缓冲液冲洗富集物2～3次，再分散于9～12mL的磷酸缓冲液中，得到磁性纳米材料－谷胱甘肽还原酶的分散液；
取15～25μL磁性纳米材料－谷胱甘肽还原酶的分散液于Φ6.6×1.7mm的铝样品盘中，用磁铁将磁性纳米材料－谷胱甘肽还原酶组装在铝样品盘底部，用532nm激发线共聚焦拉曼光谱仪检测，激光聚焦在铝样品盘底部。如图3所示，对吸附了谷胱甘肽还原酶的纳米材料进行的拉曼检测，得到的拉曼信号与其辅基FAD的SERS信号相近，说明此材料可以用于黄素蛋白的检测。
本发明中使用的仪器是共聚焦拉曼光谱仪(Renishaw 1000)，激发源波长为532nm功率为10mW，扫描时间为30s，扫描次数为3次。
3.检测黄素蛋白－配体相互作用
取90～120μL以FAD为辅基的巯基氧化酶Erv1，用9.8～9.9mL磷酸缓冲液溶于10mL比色管中，得到Erv1溶液；放置于4℃冰箱中保存，待用。
称取4～6mg的cyt c(巯基氧化酶Erv1的配体)固体，用3.8～3.9mL磷酸缓冲液溶于4mL离心管中，得到180～230μM cyt c溶液，待用；
取8～12mg生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料于20mL玻璃瓶中，加入 0.9～1.2mL的Erv1溶液，再加入8～9mL磷酸缓冲液，37℃恒温震荡3～5h；用磁铁富集，倒去上清液，用磷酸缓冲液冲洗富集物2～3次，再分散于9～12mL磷酸缓冲液中，得到生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料分散液；
称取0.120～0.150g三水合乙酸钠，溶于20.0mL去离子水中，移入100mL容量瓶中，稀释，用去离子水定容至100mL，得到乙酸钠水溶液；称取2.80～3.20g 二硫苏糖醇(DTT)，溶于20.0mL、0.01mol/L乙酸钠水溶液中，过滤除菌后得到DTT溶液，然后分装成1.0mL小份贮存于-20℃冰箱中。
取4～6mL生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料分散液与1.0mL DTT溶液，混合于离心管中，在摇床上搅拌15～20min，用磁铁富集，除去上清液，用磷酸缓冲液冲洗富集物2～3次；迅速加入1.5～2.5mL、180～230μM的cyt c溶液，在摇床上搅拌15～20min，cyt c溶液颜色由红色变为粉色；用磁铁富集，保存上清液，对上清液进行532nm激发线的共振拉曼检测，从而实现对黄素蛋白与其配体间相互作用的检测。
如图4所示，对于氧化态的细胞色素c，其卟啉环中铁离子为3价的，在拉曼信号曲线3中的特征峰在1371cm～1和1411cm～1处；当细胞色素c为还原态时，其卟啉环中铁离子为2价的，其拉曼特征峰会相对于氧化态的有一定的位移，在拉曼信号曲线1中，相应的特征峰会在1393cm～1和1396cm～1处。而且氧化态和还原态的细胞色素c的散射截面不同，后者大于前者，所以后者的拉曼信号强于前者，除了上述两处峰的位移外，在1554cm～1至1638cm～1间，两种形态的细胞色素c也有明显的差别。当将经过还原处理的吸附了巯基氧化酶Erv1的纳米材料加入细胞色素c溶液中后，对细胞色素c溶液进行的拉曼检测得到的拉曼信号(曲线2)与还原态细胞色素c(曲线1)相似，所以证明巯基氧化酶 Erv1会传递电子给细胞色素c，其被还原。
附图说明
图1：实施例1中，Fe3O4@TiO2磁性纳米材料的透射电子显微镜表征图；如图所示，Fe3O4核约有500nm左右，而TiO2壳的厚度约为100nm，左下角的内嵌图为TiO2壳的高分辨TEM图，从中可以看到TiO2锐钛矿的晶格条纹结构。
图2：实施例1中，Fe3O4和Fe3O4@TiO2的X-射线衍射光谱表征图；通过上下两张谱图的对比可知，在Fe3O4晶面之外出现了TiO2锐钛矿的特征晶面，如 101、004、105、211等晶面(用“★”表示)。图1的TEM呈现的核壳结构以及TiO2锐钛矿晶格条纹结构和图2的Fe3O4和Fe3O4@TiO2对比出现TiO2锐钛矿特征晶面，均可证明成功制备Fe3O4@TiO2磁性纳米材料。
图3：实施例1中，检测黄素蛋白部分中的辅基FAD和谷胱甘肽还原酶的 532nm激发线的拉曼谱图，其中，曲线3为谷胱甘肽还原酶(GR)溶液的普通拉曼谱图，没有吸附在Fe3O4@TiO2(M-TiO2)上；曲线2的是谷胱甘肽还原酶在M-TiO2的拉曼谱图，与曲线1的辅基FAD在M-TiO2上的拉曼谱图相近，说明谷胱甘肽还原酶吸附到了磁性纳米材料上，并被检测到。
图4：对于氧化态cyt c溶液(曲线3)、还原态cyt c溶液(曲线1)以及通过实施例2中处理得到的吸附了还原态的Erv1(Erv1-FADH2)对cyt c相互作用后的cyt c溶液(曲线2)的532nm激发线的拉曼谱图。可以看到氧化态cyt c在经过吸附了巯基氧化酶Erv1-FADH2的磁性纳米材料处理之后得到的cyt c拉曼谱图(曲线2)与还原态的cyt c(曲线1)一致，说明还原型的巯基氧化酶Erv1将氧化态cyt c还原，证明Erv1会传递电子给cyt c，cyt c被还原，而巯基氧化酶 Erv1回到原来的状态。
具体实施方式
实施例1：检测谷光氨肽还原酶
1.1生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料的制备
1.1.1磁性Fe3O4的制备：
称取0.486g无水FeCl3和2.61g无水乙酸钠固体于50mL烧杯中，加入 25～35mL乙二醇，磁力搅拌下得到棕黄色的混合液，将此混合液在200℃条件下进行溶剂热反应8h；待反应结束之后，将反应液及黑色固体一同倒入烧杯，用磁铁富集，倒去上清液，用无水乙醇冲洗富集物2次，然后在低于相对压力～0.08MPa的真空条件和60℃条件下干燥，得到磁性Fe3O4。
1.1.2Fe3O4@TiO2的合成
将90.0mL的无水乙醇和30.0mL的乙腈混合，混合比例约为3:1，再加入 0.5mL的氨水(氨水的质量分数为25％)，再将50.0mg的1.1步骤中得到的磁性Fe3O4分散于上述混合液中；在搅拌条件下，再加入1.0mL的钛酸四丁酯，搅拌1.5h；用磁铁富集，倒去上清液，用无水乙醇冲洗富集物2次，然后在低于相对压力～0.08MPa的真空条件和60℃条件下干燥，得到无定型TiO2包裹的 Fe3O4，即Fe3O4@TiO2；
1.1.3生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料的制备
称取25.0mg的Fe3O4@TiO2，分散到30.0mL、体积比为2:1的无水乙醇和去离子水的混合液中，再加入0.5mL的氨水(氨水的质量分数为25～28％)，然后将混合液在160℃下反应20h，最终得到棕红色产物；用磁铁富集，倒去上清液，用无水乙醇清洗2次，然后在低于相对压力～0.08MPa的真空条件和60℃条件下干燥，得到生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料。
1.2检测谷胱甘肽还原酶
取100.0μL谷胱甘肽还原酶(一种含FAD辅基的黄素蛋白，来自于酿酒酵母，170units/mg)，用9.9mL磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.4，以下所用皆为除氧处理过的)溶于10mL比色管中，得到谷胱甘肽还原酶溶液，放置于4℃冰箱中保存，待用。
取10.0mg生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料于20mL玻璃瓶中，加入 1.0mL的谷胱甘肽还原酶溶液，再加入9.9mL的磷酸缓冲液，37℃恒温震荡 4h；然后用磁铁富集，倒去上清液，用磷酸缓冲液冲洗2次，再分散于10.0mL 的磷酸缓冲液中，得到磁性纳米材料～～谷胱甘肽还原酶的分散液；
取20.0μL磁性纳米材料－谷胱甘肽还原酶的分散液于Φ6.6×1.7mm的铝样品盘中，用磁铁将磁性纳米材料－谷胱甘肽还原酶组装在铝样品盘底部，用 532nm激发线共聚焦拉曼光谱仪检测，激光聚焦在铝样品盘底部。如图3所示对吸附了谷胱甘肽还原酶的纳米材料进行的拉曼检测，得到的拉曼信号与其辅基 FAD的SERS信号相近，说明此材料可以用于黄素蛋白的检测。
本发明中使用的仪器是共聚焦拉曼光谱仪(Renishaw 1000)，激发源波长为532nm功率为10mW，扫描时间为30s，扫描次数为3次。
实施例2：检测Erv1－细胞色素c间的相互作用
取100μL巯基氧化酶Erv1，用9.9mL磷酸缓冲液溶于10mL比色管中，得到Erv1溶液；放置于4℃冰箱中保存，待用。
称取5mg的cyt c(巯基氧化酶Erv1的配体)固体，用3.9mL磷酸缓冲液溶于4mL离心管中，得到200μM cyt c溶液，待用；
取10.0mg生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料于20mL玻璃瓶中，加入 1.0mL的Erv1溶液，再加入9.0mL磷酸缓冲液，37℃恒温震荡4h。用磁铁富集，倒去上清液，用磷酸缓冲液冲洗2次，再分散于10.0mL磷酸缓冲液中，得到生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料分散液；
称取0.136g三水合乙酸钠，溶于20.0mL去离子水中，移入100mL容量瓶中，稀释，用去离子水定容至100mL，得到乙酸钠水溶液。称取3.09g二硫苏糖醇(DTT)，溶于20.0mL、0.01mol/L乙酸钠水溶液中，过滤除菌后得到DTT溶液，然后分装成1.0mL小份贮存于-20℃冰箱中。
取5.0mL生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料分散液与1.0mL DTT溶液，混合于离心管中，在摇床上搅拌15min，用磁铁富集，除去上清液，用磷酸清洗 2次；迅速加入2.0mL、200μM的cyt c溶液，在摇床上搅拌15min，cyt c溶液颜色由红色变为粉色；用磁铁富集，保存上清液，对上清液进行532nm激发线的共振拉曼检测，从而实现对黄素蛋白与其配体间相互作用的检测。
如图4所示，对于氧化态的细胞色素c，其卟啉环中铁离子为3价的，在拉曼信号曲线3中的特征峰在1371cm～1和1411cm～1处；当细胞色素c为还原态时，其卟啉环中铁离子为2价的，其拉曼特征峰会相对于氧化态的有一定的位移，在拉曼信号曲线1中，相应的特征峰会在1393cm～1和1396cm～1处。而且氧化态和还原态的细胞色素c的散射截面不同，后者大于前者，所以后者的拉曼信号强于前者，除了上述两处峰的位移外，在1554cm～1至1638cm～1间，两种形态的细胞色素c也有明显的差别。当将经过还原处理的吸附了巯基氧化酶Erv1的纳米材料加入细胞色素c溶液中后，对细胞色素c溶液进行的拉曼检测得到的拉曼信号(曲线2)与还原态细胞色素c(曲线1)相似，所以证明巯基氧化酶 Erv1会传递电子给细胞色素c，其被还原。

Claims (6)

1.一种生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料，其由如下步骤制备得到：
1.1磁性Fe3O4的制备
称取0.45～0.50g无水FeCl3和2.5～3.0g无水乙酸钠固体于50mL烧杯中，加入25～35mL乙二醇，磁力搅拌下得到棕黄色的混合液，将此混合液在190～210℃条件下溶剂热反应7～9h；待反应结束之后，用磁铁富集，倒去上清液，用无水乙醇冲洗富集物2～3次，然后在低于相对压力～0.08MPa的真空和50～70℃条件下干燥，得到磁性Fe3O4；
1.2 Fe3O4@TiO2的合成
将80～105mL的无水乙醇和25～35mL的乙腈混合，体积比例为3：1，再加入0.4～0.6mL的氨水，再将40～60mg磁性Fe3O4分散于上述混合液中；在搅拌条件下，加入0.8～1.3mL的钛酸四丁酯，搅拌1.5～2h；用磁铁富集，倒去上清液，用无水乙醇冲洗富集物2～3次，然后在低于相对压力～0.08MPa的真空和50～70℃条件下干燥，得到无定型TiO2包裹的Fe3O4，即Fe3O4@TiO2；
1.3生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料的制备
称取20～30mg的Fe3O4@TiO2，分散到20～40mL、体积比为2：1的无水乙醇和去离子水的混合液中，再加入0.4～0.6mL的氨水，然后将混合液在150～170℃下反应18～24h，得到棕红色产物；用磁铁富集，倒去上清液，用无水乙醇冲洗富集物2～3次，然后在低于相对压力～0.08MPa的真空和50～70℃条件下干燥，得到生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料。
2.如权利要求1所述的一种生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料，其特征在于：氨水的质量分数为25～28％。
3.权利要求1所述的一种生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料在检测黄素蛋白方面的应用。
4.如权利要求3所述的一种生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料在检测黄素蛋白方面的应用，其特征在于：
取90～110μL谷胱甘肽还原酶，用9.8～9.9mL磷酸缓冲液溶于10mL比色管中，得到谷胱甘肽还原酶溶液；
取8～12mg生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料于20mL玻璃瓶中，加入0.8～1.2mL的谷胱甘肽还原酶溶液，再加入8～9mL的磷酸缓冲液，37℃恒温震荡3～5h；然后用磁铁富集，倒去上清液，用磷酸缓冲液冲洗富集物2～3次，再分散于9～12mL的磷酸缓冲液中，得到磁性纳米材料－谷胱甘肽还原酶的分散液；
取15～25μL磁性纳米材料－谷胱甘肽还原酶的分散液于Φ6.6×1.7mm的铝样品盘中，用磁铁将磁性纳米材料－谷胱甘肽还原酶组装在铝样品盘底部，用532nm激发线共聚焦拉曼光谱仪检测，激光聚焦在铝样品盘底部；对吸附了谷胱甘肽还原酶的纳米材料进行的拉曼检测，得到的拉曼信号与其辅基FAD的SERS信号相近，说明此生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料可以用于黄素蛋白的检测。
5.权利要求1所述的一种生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料在检测黄素蛋白与其配体间相互作用方面的应用。
6.如权利要求5所述的一种生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料在检测黄素蛋白与其配体间相互作用方面的应用，其特征在于：
取90～120μL以FAD为辅基的巯基氧化酶Erv1，用9.8～9.9mL磷酸缓冲液溶于10mL比色管中，得到Erv1溶液；
称取4～6mg的cyt c固体，用3.8～3.9mL磷酸缓冲液溶于4mL离心管中，得到180～230μM cyt c溶液；
取8～12mg生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料于20mL玻璃瓶中，加入0.9～1.2mL的Erv1溶液，再加入8～9mL磷酸缓冲液，37℃恒温震荡3～5h；用磁铁富集，倒去上清液，用磷酸缓冲液冲洗富集物2～3次，再分散于9～12mL磷酸缓冲液中，得到生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料分散液；
称取0.120～0.150g三水合乙酸钠，溶于20.0mL去离子水中，移入100mL容量瓶中，稀释，用去离子水定容至100mL，得到乙酸钠水溶液；称取2.80～3.20g二硫苏糖醇(DTT)，溶于20.0mL、0.01mol/L乙酸钠水溶液中，过滤除菌后得到DTT溶液；
取4～6mL生物相容性的Fe3O4@TiO2磁性纳米材料分散液与1.0mL DTT溶液，混合于离心管中，在摇床上搅拌15～20min，用磁铁富集，除去上清液，用磷酸缓冲液冲洗富集物2～3次；迅速加入1.5～2.5mL、180～230μM的cyt c溶液，在摇床上搅拌15～20min，cyt c溶液颜色由红色变为粉色；用磁铁富集，保存上清液，对上清液进行532nm激发线的共振拉曼检测，从而实现对黄素蛋白与其配体间相互作用的检测。
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