CN104267017A - 血红素蛋白功能化的磁性表面增强拉曼活性基底及其应用 - Google Patents

Abstract

一种血红素蛋白功能化的磁性表面增强拉曼活性基底及其在对有毒小分子的高灵敏度检测和对其毒性快速去除方面的应用，属于环境和食品中有毒成份监控检测技术领域。包括磁性银纳米材料的合成、制备和包被；血红素蛋白的共价吸附；表面增强拉曼散射(SERS)光谱检测等步骤。一些有毒小分子的吸附会引起血红素蛋白共振拉曼峰的位移，并且这种位移是分子特异性的，因此利用SERS光谱可以对这些小分子进行多组份检测。外加磁场条件下磁性纳米材料的聚集可以提高待测分子的浓度以及SERS增强能力。本发明所涉及的磁性银纳米材料在食品安全、环境监测和保护等领域具有很大的应用潜力。

Description

血红素蛋白功能化的磁性表面增强拉曼活性基底及其应用

技术领域

本发明属于环境和食品中有毒成份监控检测技术领域，具体涉及一种血红素蛋白功能化的磁性表面增强拉曼活性基底及其在对有毒小分子的高灵敏度检测和对其毒性快速去除方面的应用。

背景技术

环境和食品安全问题与人们的日常生活息息相关，环境和食品中常见的一些小分子(氰化物、亚硝酸盐、一氧化氮、一氧化碳等)的毒性对人们的健康具有潜在的威胁。氰化物广泛存在于自然界中的食物和植物中，环境中的汽车尾气和香烟的烟雾中也都存在氰化物。氰根离子对重金属离子具有超强的络合能力，能够抑制含金属酶的活性，从而抑制细胞呼吸作用中的电子传递链。亚硝酸盐在食品加工业常被用作保色剂和防腐剂，然而其潜在的毒性不容忽视。亚硝酸盐能使血液中携带氧的血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，导致其携氧能力的丧失从而引起组织缺氧。亚硝酸盐是致癌物，在胃酸等环境下亚硝酸盐食物中的仲胺、叔胺和酰胺等反应生成强致癌物N‐亚硝胺。因此，建立快速、高灵敏性和特异性的针对环境或食品中的有害分子的分析检测技术，引起了人们的高度重视并得到了越来越多的关注。

目前用于检测这些有毒小分子的方法主要有化学发光法、荧光法、质谱法、电化学法等，各种检测技术的迅速发展提高了这些有毒小分子的检测灵敏度，然而现有技术在检测技术本身的可操作性、多组份分析以及检测后分析物的处理等方面还存在很多局限。

表面增强共振拉曼散射(SERRS)光谱技术能够在复杂的体系中选择性增强某一类分子，具有超高的检测灵敏度，适宜条件下可实现单分子检测。SERS检测条件温和，可用于气、液和固态分析物的检测。更重要的是，与紫外、荧光等光谱不同，SERS光谱特异性高，由于其非常窄的半峰宽，避免了结构类似的分子间光谱的重叠，因此可以实现同一体系内多组份检测。

磁性纳米材料以其独特的磁响应性在生物和医学研究领域得到了越来越多的应用。磁性纳米材料可以制备成多种尺寸，在外部磁场的条件下可以用于生物分子的分离、医学成像和药物传送等。血红素蛋白广泛存在于生物体中，具有传递电子、氧传输、酶等生理机能。一些小分子的毒性机理在于这些小分子能够结合生物体内的血红素蛋白，从而引起这些蛋白机能的缺陷甚至丧失。在血红蛋白的特征SERS光谱中，v₄振动模式对其配体(具有毒性的小分子)的结合及其敏感，而且该振动峰的变化是对配体小分子特异性的。因此利用此振动峰位的变化可以对小分子定性和定量分析。

发明内容

本发明以SERS为主要检测手段，以磁性银纳米材料为SERS活性基底和血红蛋白载体，能够实现对环境和食品中有害成份的多组份检测，而且不破坏原有体系中有益的成分。本发明在环境和食品的安全评价、潜在毒性成分的监控和去除等方面具有很大的应用潜力。

本发明的目的是提供一种血红素蛋白功能化的磁性表面增强拉曼活性基底及其应用，其可以实现对有毒小分子的高灵敏度检测和对其毒性的快速去除。克服了传统方法在可操作性、多组份检测和毒性去除能力等方面的局限。本发明所涉及的磁性表面增强拉曼活性基底为磁性银核壳结构，兼具磁响应性和SERS活性，血红素蛋白的共价吸附赋予了磁性银纳米粒子吸附有毒小分子的能力。外加磁场条件下磁性纳米材料的汇集在实现了去除体系中小分子所引起的毒性的同时提高了待测分子的浓度和SERS增强能力，为实现其高灵敏度检测提供了便利条件。

本发明所述的一种血红素蛋白功能化的磁性表面增强拉曼活性基底，是由如下步骤制备得到(本发明除非特别说明，溶液均是指水溶液)：

(a)制备Fe₃O₄磁性纳米粒子

共沉淀法：在无氧环境中强力搅拌含0.001M(mol/L)FeCl₂·4H₂O和0.002M FeCl₃·6H₂O的100mL混合水溶液30～40min，之后逐滴加入25～30％(w/w)浓氨水15～20mL，继续搅拌30～50min，在80～90℃条件下加热30～50min后，用乙醇和蒸馏水分别清洗3～5次，烘干后制得Fe₃O₄磁性纳米粒子粉末；

水热法：将1.62g FeCl₃·6H₂O和5.22g乙酸钠在磁力搅拌下溶解在50～80mL乙二醇溶液中，之后转移到反应釜中200～220℃密闭加热8～10h，烘干后制得Fe₃O₄磁性纳米粒子粉末；

(b)为提高其分散性，将100～200mg上述步骤得到的磁性纳米粒子分散到200～300mL浓度为0.3M的柠檬酸钠的水溶液中，80～90℃条件下搅拌1～3h，随后用磁铁分离，分离产物分别用乙醇和纯水清洗3～5次，自然晾干；

(c)制备银纳米粒子：冰浴条件下在200mL含0.01％(w/v)硝酸银和0.76mM柠檬酸钠的水溶液中逐滴加入0.01％(w/v)硼氢化钠的水溶液0.6mL，磁力搅拌2～3小时，得到银纳米粒子溶胶；

(d)制备磁性银纳米粒子：将经过步骤(b)处理过的50～100mg Fe₃O₄磁性纳米粒子粉末分散到120mL乙醇、40mL H₂O和3mL氨水的混合溶液中搅拌15～30min，之后逐滴加入1～2mL正硅酸乙酯，搅拌5～8小时后清洗；随后分散到200mL、1％(v/v)APTMS中搅拌4～10小时，使其表面修饰上氨基，随后用乙醇和蒸馏水分别清洗3～5次，然后分散到100mL水溶液中；再加入步骤(c)制备的银溶胶20～40mL，银纳米粒子通过静电作用吸附在Fe₃O₄磁性纳米材料上，得到磁性银纳米粒子；

(e)制备壳聚糖包被的磁性银纳米粒子：将上述磁性银纳米粒子分散在100mL柠檬酸钠(10mM)、25mL抗坏血酸(0.1M)和5mL壳聚糖(4mg/mL)的混合溶液中，随后逐滴加入0.5mL硝酸银(0.01M)溶液，机械搅拌30～50分钟形成壳聚糖包被的磁性银纳米粒子，用水清洗3～5次后浓缩到1mL水中；

(f)共价吸附血红素蛋白：将上述壳聚糖包被的磁性银纳米粒子分散在2.5％(v/v)的戊二醛溶液中，加入少量(0.01～0.05％,v/v)乙醇溶液，机械搅拌2～5小时后用磁铁分离清洗，之后将其分散到1～3mL、1mg/mL血红素蛋白溶液中温育1～2小时；戊二醛通过与磁性银纳米粒子表面的氨基和血红素蛋白残基中的氨基分别形成希夫碱而使血红素蛋白共价吸附在磁性银纳米粒子表面，从而得到血红素蛋白功能化的磁性表面增强拉曼活性基底。

本发明所提供血红素蛋白功能化的磁性表面增强拉曼活性基底可以实现对有毒小分子的高灵敏度检测和对其毒性的快速去除，其步骤如下：

(g)有毒小分子的分离：将上述制备得到的吸附血红素蛋白的磁性银纳米粒子分散于含有未知浓度的待测有毒小分子的体系中混合5～10min，吸附有毒小分子后的磁性银纳米粒子在外部磁场的条件下被分离；

(h)SERS光谱检测：将收集到的吸附有毒小分子(H₂O₂，氰化物，亚硝酸盐等)的磁性银纳米粒子进行拉曼光谱检测，利用得到的SERS光谱对有毒小分子进行定性和定量分析；在检测亚硝酸根离子时，每个样品需要加入10～20μL的连二亚硫酸钠(10mg/mL)将氧化型的血红素蛋白还原成还原型；所用激发线的波长范围是350～450nm，检测过程中磁铁始终放在样品皿下方。

本发明所采用的磁性银纳米粒子在有毒小分子的去除和检测方面具有明显的优点：

步骤(a)所述的磁性材料的磁响应性有利于分析物的快速分离，同时磁场条件下磁性材料的汇集浓缩了分析物，为随后的检测提供了有利条件。

步骤(c、d)所述的银纳米粒子的表面等离子体与血红素蛋白的电子吸收峰匹配，因此选择400nm左右的激发光源可以实现SERS的最大增强，此外磁性纳米材料所带动的银纳米粒子的聚集也可以提高银纳米粒子局部的表面等离子共振从而提高SERS的增强能力。

步骤(e)所述的壳聚糖具有良好的生物相容性，用其包被银纳米粒子后可以避免血红蛋白的变性，同时也避免了其表面对体系中其它有益成分的破坏。

步骤(g)所述有毒小分子可以通过磁性材料快速地分离和去除，体系中原有成分不会受到影响。

步骤(h)所述SERS光谱技术操作简单，测试时间可以在20秒内完成。由于拉曼位移对小分子的特异性，本发明还可以实现多组份检测。

综上所述，本发明所涉及的磁性银纳米材料综合了毒性小分子的快速磁性分离、纳米材料的生物相容性和SERS活性等特性，在食品安全、环境监测和保护等领域具有很大的应用潜力。

附图说明

图1：实施例1中氰根离子吸附前后肌红蛋白的SERRS光谱。如图所示，氰根离子吸附后，肌红蛋白的v₄振动峰由吸附氰根离子前的1370cm^-1移动到1373cm^-1，v₃振动峰由1479cm^-1移动到1508cm^-1，此外v₂在1562cm^-1处的振动峰的相对强度明显下降，利用这3种特征峰的变化可以定性检测氰根离子；此外，利用v₂在1562cm^-1处的振动峰的相对于吸附氰根离子之前强度变化的程度可以对氰根离子定量检测。

图2：实施例2中亚硝酸根离子吸附前后肌红蛋白的SERRS光谱。如图所示，亚硝酸根吸附后还原型v₄振动峰在1375cm^-1的相对强度随着其浓度的升高而升高，利用该特征峰可以对亚硝酸根离子定性；此外，利用该特征峰强度的变化程度可以实现定量检测亚硝酸根离子。

图3：实施例3中氰根离子和H₂O₂的多组份检测。如图所示，在两种分子的混合物的SERRS光谱中同时出现了氰根离子和H₂O₂的v₄特征振动峰，说明该方法可以同时定性检测氰根离子和H₂O₂。由于两个特征峰的峰强度随氰根离子和H₂O₂的含量的增加而升高，所以该方法可以实现对这两种分子的定量检测。

具体实施方式

实施例1:血红素蛋白功能化的磁性表面增强拉曼活性基底应用于氰化物检测

1)在氮气环境中强力搅拌含0.001M FeCl₂·4H₂O和0.002M FeCl₃·6H₂O的100mL混合溶液30min，之后逐滴加入15mL浓氨水(25％，w/w)，继续搅拌30min后，80℃条件下加热30min后，用乙醇和蒸馏水分别清洗3次后，制得Fe₃O₄纳米粒子。

2)为提高其分散性，将上述步骤得到的100mg磁性纳米粒子分散到200mL浓度为0.3M的柠檬酸钠溶液中，80℃条件下机械搅拌1小时，随后用磁铁分离，再分别用乙醇和纯水清洗3次，自然晾干。

3)将上述柠檬酸钠预处理后的50mg Fe₃O₄纳米粒子分散到120mL乙醇、40mLH₂O和3mL氨水的混合溶液中机械搅拌15分钟，之后逐滴加入1mL正硅酸乙酯，然后搅拌5小时后，用乙醇和纯水分别清洗3次。随后分散到1％(v/v)APTMS中搅拌4小时，使其表面被氨基修饰；随后用乙醇和蒸馏水分别清洗3次，分散到100mL水溶液中，得到APTMS修饰的二氧化硅包被的磁性纳米粒子水溶液；

4)冰浴条件下，在200mL含0.01％(w/v)硝酸银和0.76mM柠檬酸钠的溶液中逐滴加入0.01％(w/v)的硼氢化钠溶液0.6mL，磁力搅拌2小时，制得的银纳米粒子平均尺寸为12nm。

5)超声条件下将40mL银纳米粒子分散在的上述APTMS修饰的二氧化硅包被的磁性纳米粒子水溶液中，随后机械搅拌2小时形成磁性银纳米粒子，并用纯水清洗3次，得到磁性银纳米粒子；

6)35℃条件下将上述磁性银纳米粒子分散在100mL柠檬酸钠(10mM)、25mL抗坏血酸(0.1M)和5mL壳聚糖(4mg/mL，体积比1％的醋酸作溶剂)溶液组成的混合溶液中，随后逐滴加入0.5mL硝酸银(0.01M)溶液，机械搅拌30分钟形成壳聚糖包被的磁性银纳米粒子，随后磁性分离并用纯水清洗3次。

7)将上述壳聚糖包被的磁性银纳米粒子分散在100mL戊二醛(2.5％,v/v)溶液中，加入20μL乙醇溶液机械搅拌2小时后用乙醇和纯水清洗；之后将得到的磁性银纳米粒子分散到1mL浓度为1mg/mL肌红蛋白(血红素蛋白中的一种)的磷酸缓冲溶液中，温育1小时后磁性分离并用磷酸缓冲液清洗，并4℃保存。

8)将肌红蛋白共价吸附的磁性银纳米粒子分散到含有20μM氰化钠有毒分子溶液中，5分钟后用磁铁分离。

9)分离后的样品直接用拉曼光谱仪检测，所用激光的激发波长是413nm，曝光时间是20秒，整个检测过程中磁铁一直放在样品的下面。

实施例2:血红素蛋白功能化的磁性表面增强拉曼活性基底应用于亚硝酸盐检测

如同实例1的各步骤操作，不同的是：

步骤7)中将肌红蛋白共价吸附的磁性银纳米粒子分散到不同浓度(1ppb，100ppb，10ppm)的亚硝酸钠溶液中。

步骤8)测量过程中每个样品加入20μL的连二亚硫酸钠(10mg/mL)，此步骤中连二亚硫酸钠能够将氧化型的肌红蛋白还原成还原型，只有还原型的肌红蛋白吸附亚硝酸盐后能够产生1375cm^-1处的拉曼特征峰(其它实例中不需要加连二亚硫酸钠)。

实施例3:血红素蛋白功能化的磁性表面增强拉曼活性基底应用于的氰化物和过氧化氢双组份检测

如同实例1的各步骤操作，不同的是:

步骤7)中将肌红蛋白共价吸附的磁性银纳米粒子分散到10μM氰化物和10μM过氧化氢的混合溶液(体积比1:1)中。

Claims (5)

1.一种血红素蛋白功能化的磁性表面增强拉曼活性基底，其由如下步骤制备得到：

(a)将100～200mg的Fe₃O₄磁性纳米粒子分散到200～300mL浓度为0.3M的柠檬酸钠的水溶液中，80～90℃条件下搅拌1～3h，随后用磁铁分离，分离产物分别用乙醇和纯水清洗3～5次，自然晾干；

(b)制备银纳米粒子：冰浴条件下在200mL含0.01％(w/v)硝酸银和0.76mM柠檬酸钠的水溶液中逐滴加入0.01％(w/v)硼氢化钠的水溶液0.6mL，磁力搅拌2～3小时，得到银纳米粒子溶胶；

(c)制备磁性银纳米粒子：将经过步骤(a)处理过的50～100mg Fe₃O₄磁性纳米粒子粉末分散到120mL乙醇、40mL H₂O和3mL氨水的混合溶液中搅拌15～30min，之后逐滴加入1～2mL正硅酸乙酯，搅拌5～8小时后清洗；随后分散到200mL、1％(v/v)APTMS中搅拌4～10小时，使其表面修饰上氨基，随后用乙醇和蒸馏水分别清洗3～5次，然后分散到100mL水溶液中；再加入步骤(b)制备的银溶胶20～40mL，银纳米粒子通过静电作用吸附在Fe₃O₄磁性纳米材料上，得到磁性银纳米粒子；

(d)制备壳聚糖包被的磁性银纳米粒子：将上述磁性银纳米粒子分散在100mL、10mM柠檬酸钠，25mL、0.1M抗坏血酸和5mL、4mg/mL壳聚糖的混合溶液中，随后逐滴加入0.5mL、0.01M硝酸银溶液，机械搅拌30～50分钟形成壳聚糖包被的磁性银纳米粒子，用水清洗3～5次后浓缩到1mL水中；

(e)共价吸附血红素蛋白：将上述壳聚糖包被的磁性银纳米粒子分散在2.5％(v/v)的戊二醛溶液中，加入乙醇溶液，机械搅拌2～5小时后用磁铁分离清洗，之后将其分散到1～3mL、1mg/mL血红素蛋白溶液中温育1～2小时；戊二醛通过与磁性银纳米粒子表面的氨基和血红素蛋白残基中的氨基分别形成希夫碱而使血红素蛋白共价吸附在磁性银纳米粒子表面，从而得到血红素蛋白功能化的磁性表面增强拉曼活性基底。

2.如权利要求1所述的一种血红素蛋白功能化的磁性表面增强拉曼活性基底，其特征在于：采用共沉淀法制备Fe₃O₄磁性纳米粒子，即在无氧环境中强力搅拌含0.001M FeCl₂·4H₂O和0.002M FeCl₃·6H₂O的100mL混合水溶液30～40min，之后逐滴加入25～30％(w/w)浓氨水15～20mL，继续搅拌30～50min，在80～90℃条件下加热30～50min后，用乙醇和蒸馏水分别清洗3～5次，烘干后制得Fe₃O₄磁性纳米粒子粉末。

3.如权利要求1所述的一种血红素蛋白功能化的磁性表面增强拉曼活性基底，其特征在于：采用水热法制备Fe₃O₄磁性纳米粒子，即将1.62g FeCl₃·6H₂O和5.22g乙酸钠在磁力搅拌下溶解在50～80mL乙二醇溶液中，之后转移到反应釜中200～220℃密闭加热8～10h，烘干后制得Fe₃O₄磁性纳米粒子粉末。

4.权利要求1所述的一种血红素蛋白功能化的磁性表面增强拉曼活性基底在对有毒小分子的高灵敏度检测和对其毒性快速去除方面的应用。

5.如权利要求1所述的一种血红素蛋白功能化的磁性表面增强拉曼活性基底在对有毒小分子的高灵敏度检测和对其毒性的快速去除方面的应用，其特征在于：有毒小分子为H₂O₂、氰化物或亚硝酸盐。