CN109666063A - 基于离子互补型肽自组装的麦芽糖功能化纳米复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents

基于离子互补型肽自组装的麦芽糖功能化纳米复合材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于离子互补型肽自组装的麦芽糖功能化纳米材料及其制备方法和应用。本发明通过麦芽糖上修饰亲疏水残基交替排列的离子互补型肽在SiO2@Fe3O4和C@Fe3O4等纳米材料表面的自组装，形成稳定的麦芽糖功能化纳米复合材料。本发明复合材料可以选择性富集标准糖蛋白和生物样品酶解液中的糖肽，富集效率高，选择性好，检出限低，性能稳定，可重复利用。该复合材料的制备方法简单，条件温和，绿色无毒，可用于多种纳米富集材料的表面一步功能化。

Description

基于离子互补型肽自组装的麦芽糖功能化纳米复合材料及其 制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米材料表面功能化技术领域，具体涉及一种基于离子互补型肽自组装的麦芽糖功能化纳米复合材料，以及该材料的制备方法和采用该材料选择性富集糖肽的应用。
背景技术
蛋白质糖基化是涉及许多生物过程中最普遍和复杂的翻译后修饰之一，包含了与哺乳动物疾病和遗传性疾病相关的大量信息，是癌症及其他疾病发生的标志。因此，需要对糖蛋白/糖肽进行全面的分析用于生物功能和疾病研究。目前质谱已成为提供糖蛋白组学研究中糖结构、糖基化位点及相应的糖链异质体最为有效的工具。但是糖基化蛋白质/多肽的天然丰度很低，非糖肽的离子抑制和糖肽的低电离效率仍然在基于质谱的糖蛋白组学分析中受到严重干扰。因此，质谱分析之前的富集处理已成为不可或缺的过程。
在过去的十年中，磁性纳米粒子(MNPs)由于具有巨大的比表面积、快速磁分、良好的生物相容性和易于后修饰等优势被广泛用于糖蛋白和糖肽的特异性识别。为了有效避免磁性纳米粒子的团聚，促进进一步的官能化和应用，Fe3O4纳米粒子通常用多种不同材料包被，形成核壳结构的纳米材料，例如SiO2@Fe3O4、C@Fe3O4、FEG@TiO2@Fe3O4、Au@MOF@PDA@Fe3O4等。为了使MNPs富集更具特异性和有效性，研究了多种功能化配体，例如硼酸、凝集素、碳水化合物、亲水聚合物和氨基酸等。迄今为止，几乎所有报道的官能团都是逐步化学键合在纳米材料表面，其处理步骤繁琐，表面依赖性强，条件苛刻(非水溶剂，高温等)。因此需要寻求一种简便、快速和通用的表面功能化方法来提高富集效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于离子互补型肽自组装的麦芽糖功能化纳米复合材料，并为该复合材料提供一种制备方法和应用。
针对上述目的，本发明所采用的复合材料是麦芽糖修饰的离子互补型肽在纳米材料表面自组装形成的稳定的麦芽糖功能化纳米复合材料。
上述麦芽糖修饰的离子互补型肽的结构式如下所示：
式中n＝1或2，M代表疏水氨基酸的残基，X和Y各自独立的代表-COOH或-CH2COOH，Z和W各自独立的代表-CH2NH3 +或-NHCNH2NH3 +。
上述的纳米材料为SiO2、C、GO、SiO2@Fe3O4、C@Fe3O4、GO@Fe3O4、PS@Fe3O4、Au@MOF@PDA@Fe3O4、FEG@TiO2@Fe3O4、PEI@Fe3O4中任意一种。
上述的疏水氨基酸的残基为-CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3、-CH3SCH2CH2中任意一种。
本发明麦芽糖功能化纳米复合材料的制备方法由下述步骤组成：
1、合成麦芽糖修饰的离子互补型肽
采用固相合成法在树脂Fmoc-Rink Amide MBHA上依次连接权利要求1中的离子互补型肽序列后，加入哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次后，再加入甲醇、麦芽糖、氰基硼氢化钠，在70～80℃下回流反应1～3天，抽滤、洗涤，以三氟乙酸、三异丙基硅烷、水的体积比为95:2.5:2.5的混合液为切割液，室温搅拌1～2小时，将滤液加入冷乙醚中，析出沉淀，透析后冷冻干燥，得到麦芽糖修饰的离子互补型肽。
2、制备麦芽糖功能化纳米复合材料
将麦芽糖修饰的离子互补型肽溶于pH＝7.4的磷酸缓冲液中，然后加入NaOH活化处理后的纳米材料，室温震荡30～60分钟，得到麦芽糖功能化纳米复合材料。
上述步骤1中，所述的Fmoc-Rink Amide MBHA树脂与麦芽糖、氰基硼氢化钠的摩尔比为1:10～60:4～20。
上述步骤2中，所述的麦芽糖修饰的离子互补型肽与pH＝7.4的磷酸缓冲液的质量-体积比为1～10mg:1mL，麦芽糖修饰的离子互补型肽与NaOH活化处理后的纳米材料的体积-质量比为1mL:20～200mg。
本发明麦芽糖功能化纳米复合材料可用于糖肽的富集。
本发明的有益效果如下：
1、本发明通过在麦芽糖上修饰亲疏水残基交替排列的离子互补型肽，利用离子互补型肽在SiO2@Fe3O4和C@Fe3O4等纳米材料表面的β折叠自组装，形成稳定的麦芽糖功能化纳米复合材料。
2、本发明麦芽糖功能化纳米材料表面涂层性能稳定，在对标准糖蛋白(辣根过氧化酶(HRP)、人体免疫球蛋(lgG))和人血清酶解液中糖肽的富集中选择性好，富集效率高，检出限低，可重复利用。与化学键合糖基的纳米材料相比有更高的灵敏度和相当的选择性与稳定性。
3、本发明复合材料的制备方法简单，条件温和，工艺过程环境友好、普适性强，可实现对多种纳米材料表面的一步功能化，为后续复杂样品中各类糖蛋白或糖肽的富集及糖基化位点的鉴定提供新思路，是一种经济实用性强的绿色工艺。
附图说明
图1是麦芽糖修饰的离子互补型肽的质谱图。
图2是Fe3O4(a)、SiO2@Fe3O4(b)和实施例1得到的麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4复合材料(c)的红外光谱图。
图3是图2中麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4复合材料(c)对应的酰胺I区和II区的拟合图。
图4是Fe3O4(a)、C@Fe3O4(d)和实施例2得到的麦芽糖功能化的C@Fe3O4复合材料(e)的红外光谱图。
图5是图4中麦芽糖功能化的C@Fe3O4复合材料(e)对应的酰胺I区和II区的拟合图。
图6是Fe3O4(a)、SiO2@Fe3O4(b)、C@Fe3O4(c)和实施例1得到的麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4复合材料(d)及实施例2得到的麦芽糖功能化的C@Fe3O4复合材料(e)的X-射线光电子能谱图。
图7是SiO2@Fe3O4(A)和实施例1得到的麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4复合材料(B)对HRP酶解液(0.03ng/μL)中糖肽富集的MALDI-TOF质谱图。
图8是C@Fe3O4(A)和实施例2得到的麦芽糖功能化的C@Fe3O4复合材料(B)对HRP酶解液(0.03ng/μL)中糖肽富集的MALDI-TOF质谱图。
图9是实施例1得到的麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4复合材料对0.001ng/μL(A)和0.02ng/μL(B)HRP酶解液中糖肽富集的MALDI-TOF质谱图。
图10是实施例2得到的麦芽糖功能化的C@Fe3O4复合材料对0.001ng/μL(A)和0.02ng/μL(B)HRP酶解液中糖肽富集的MALDI-TOF质谱图。
图11是实施例1得到的麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4复合材料对0.001ng/μL(A)和0.02ng/μL(B)lgG酶解液中糖肽富集的MALDI-TOF质谱图。
图12是实施例2得到的麦芽糖功能化的C@Fe3O4复合材料对0.001ng/μL(A)和0.02ng/μL(B)lgG酶解液中糖肽富集的MALDI-TOF质谱图。
图13是实施例1得到的麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4对质量比1:50(A)和1:100(B)的HRP和BSA混合液中糖肽选择性富集的MALDI-TOF质谱图。
图14是实施例1得到的麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4纳米复合材料重复使用后对0.02ng/μL HRP酶解液中糖肽富集的MALDI-TOF质谱图，其中a、b、c、d依次是第1次、第3次、第5次、第8次重复利用该材料的富集效果，e是室温放置2个月的富集效果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、合成麦芽糖修饰的离子互补型肽
(1)将0.174g Fmoc-Rink Amide MBHA Resin加入固相合成管，加入5mL二氯甲烷浸泡树脂30分钟，充分溶胀，抽滤除去二氯甲烷，向固相合成管中加入5mL哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液，反应20分钟，抽滤除去混合液，再加入5mL哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液，反应20分钟，抽滤，用二氯甲烷洗涤树脂2次、N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次，每次5mL，完成Fmoc-Rink Amide MBHA Resin脱Fmoc-两次，再加入5mL N,N-二甲基甲酰胺、0.1331g Fmoc-Lys(Boc)-OH、0.03837g 1-羟基苯丙三唑、0.1077g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、99μL N,N′-二异丙基乙胺，室温搅拌1小时，抽滤，用二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺各洗涤树脂2次，每次3mL，抽滤，得到Fmoc-Lys(Boc)-MBHA Resin。
(2)合成Fmoc-Ala-Lys(Boc)-MBHA Resin
按照步骤(1)的方法将得到的Fmoc-Lys(Boc)-MBHA Resin用5mL哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，加入5mL N,N-二甲基甲酰胺、0.0884gFmoc-Ala-OH、0.03837g 1-羟基苯丙三唑、0.1077g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、99μL N,N′-二异丙基乙胺，室温搅拌1小时，用二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺各洗涤树脂2次，每次5mL，得到Fmoc-Ala-Lys(Boc)MBH A Resin。
(3)合成Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-Lys(Boc)-MBHA Resin
按照步骤(2)的方法向Fmoc-Ala-Lys(Boc)-MBHA Resin上依次连接0.1331g Fmoc-Lys(Boc)-OH、0.0884g Fmoc-Ala-OH、0.1208g Fmoc-Glu(OtBu)-OH、0.0884g Fmoc-Ala-OH、0.1208g Fmoc-Glu(OtBu)-OH、0.0884g Fmoc-Ala-OH，其他试剂的用量与步骤(2)相同，得到Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-Lys(Boc)-MBHAResin。
上述的Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH与Fmoc-RinkAmideMBHA Resin的摩尔比均为4:1，Fmoc-Rink Amide MBHA Resin与1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为1:4:4:4。
(4)向步骤(3)得到的Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Lys(Boc)-Ala-Lys(Boc)-MBHA Resin中加入5mL哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，各反应20分钟，抽滤除去混合液，用二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺交替洗涤2次，每次5mL，再加入5mL甲醇、1.022g麦芽糖、0.03758氰基硼氢化钠，在80℃下回流反应1天，抽滤、用甲醇、水、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺交替洗涤3次，以三氟乙酸、三异丙基硅烷、水的体积比为95:2.5:2.5的混合液为切割液，室温搅拌1小时，过滤，将滤液加入冷乙醚中，析出沉淀，透析1天后冷冻干燥，得到结构式如下的麦芽糖修饰的离子互补型肽AEAEAKAK(Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Lys)：
由图1可见，麦芽糖修饰的离子互补型肽的相对分子质量为1156，质谱图中有该处的峰，说明麦芽糖与离子互补型肽键合。
2、制备麦芽糖功能化纳米复合材料
将100mg SiO2@Fe3O4纳米粒子(根据文献“Pan,M.；Sun,Y.；Zheng,J.；Yang，W.ACSAppl.Mater.Interfaces 2013,5,8351-8358”中公开的方法制备而成)用1.0mol/L NaOH水溶液超声处理10分钟，再用超纯水冲洗至中性，得到NaOH活化处理后的SiO2@Fe3O4。
将1mg麦芽糖修饰的离子互补型肽AEAEAKAK加入到1.0mL 10mmol/L pH为7.4的磷酸缓冲液中，然后加入100mg NaOH活化处理后的SiO2@Fe3O4，室温震荡60分钟，磁分离，40℃干燥后用水洗除去表面未吸附的麦芽糖修饰的离子互补型肽，40℃干燥，得到麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4复合材料。
实施例2
本实施例中，用C@Fe3O4纳米粒子(根据文献“Yang,J.；Li,J.；Qiao,J.；Lian，H.；Chen,H.J.Chromatogr.A 2014,1325,8-15”中公开的方法制备而成)替换实施例1中的SiO2@Fe3O4纳米粒子，其他步骤与实施例1相同，得到麦芽糖功能化的C@Fe3O4复合材料。
将上述实施例1和2中的Fe3O4、SiO2@Fe3O4、C@Fe3O4、麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4复合材料和麦芽糖功能化的C@Fe3O4复合材料进行傅里叶变换衰减全反射红外光谱、X-射线光电子能谱，结果如图2～图6所示。由图可见，麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4复合材料和麦芽糖功能化的C@Fe3O4复合材料(580cm-1处为Fe-O，1100cm-1处为Si-O-Si，1740和1620cm-1处分别为C＝O和C＝C，2900和1350cm-1处分别为-CH2和CH)表面均存在以β-折叠构型(1629cm-1)为主的自组装涂层结构。从X-射线光电子能谱可以看出，SiO2@Fe3O4和C@Fe3O4纳米材料都新出现N元素，说明两种纳米材料表面均自组装了麦芽糖修饰的离子互补型肽。
实施例3
实施例1和2得到的麦芽糖功能化纳米复合材料在糖肽富集中的应用
1、不同材料富集性能对比实验
以体积浓度为90％的乙腈水溶液(0.1％TFA)为富集液，配制0.03ng/μL的HRP酶解液，每组1mL，共四组，分别加入1mg麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4复合材料、麦芽糖功能化的C@Fe3O4复合材料、SiO2@Fe3O4、C@Fe3O4，超声分散，室温下振荡5min进行富集，在外加磁场作用下去除上清液后，用富集液清洗1次，然后加入10μL洗脱液(体积浓度为30％的乙腈水溶液(0.1％TFA))，在室温下超声2min，将富集在材料上的糖肽洗脱下来。将等量(1μL)的洗脱液、基质溶液(2,4-二羟基二苯甲酸，25mg/mL)依次点在MALDI靶板上，待靶板上的点样液干燥、结晶后，将靶板放入质谱仪中进行MALDI-TOF质谱检测，结果见图7和图8。
由图7～8可见，用SiO2@Fe3O4和C@Fe3O4材料富集后只能检测到3个糖肽信号，而用麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4和麦芽糖功能化的C@Fe3O4复合材料富集后可检测到HRP酶解液中的24个糖肽信号，B图的基线较A图更平，说明本发明中麦芽糖功能化的纳米复合材料的富集效果更好。
2、麦芽糖功能化纳米复合材料对HRP酶解液中糖肽的富集
用富集液分别配制成0.001ng/μL和0.02ng/μL的lgG酶解液，每个浓度分两组，均为1mL，分别加入1mg麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4复合材料、麦芽糖功能化的C@Fe3O4复合材料，超声分散，室温下振荡5min进行富集，后续按实验1的步骤操作。实验结果见图9和图10。
由图9～10可见，在0.02ng/μL的HRP酶解液中，只有2个糖肽信号，用麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4和麦芽糖功能化的C@Fe3O4复合材料富集后均可检测到24个糖肽信号；在0.001ng/μL的HRP酶解液中，只有1个糖肽信号，用麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4复合材料富集后仍可检测到3个糖肽信号，用麦芽糖功能化的C@Fe3O4复合材料富集后仍可检测到4个糖肽信号，说明本发明中麦芽糖功能化的纳米复合材料有很低的检出限。
3、麦芽糖功能化纳米复合材料对lgG酶解液中糖肽的富集
用富集液分别配制成0.001ng/μ和0.02ng/μL的lgG酶解液，每个浓度分两组，均为1mL，分别加入1mg麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4复合材料、麦芽糖功能化的C@Fe3O4复合材料，超声分散，室温下振荡5min进行富集，后续按实验1的步骤操作。实验结果见图11和图12。
由图11～12可见，在0.02ng/μL的lgG酶解液中，只有2条糖肽信号，用麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4和麦芽糖功能化的C@Fe3O4复合材料富集后可检测到31个糖肽信号；在0.001ng/μL的lgG酶解液中，只有1个糖肽信号，用麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4和麦芽糖功能化的C@Fe3O4复合材料富集后仍可检测到12个糖肽信号，说明本发明中麦芽糖功能化的纳米复合材料对lgG酶解液中有很低的检出限。
4、麦芽糖功能化纳米复合材料对HRP酶解液中糖肽富集的选择性
将标准糖蛋白HRP和非糖蛋白BSA的胰蛋白酶酶解产物分别按质量比为1:50和1:150溶于富集液中，各取1mL，分别加入1mg麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4纳米材料，超声分散，室温下振荡5min进行富集，后续按实验1的步骤操作。实验结果见图13。
由图13可见，在质量比为1:50和1:150的混合液中，未检测到糖肽信号，用麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4纳米材料富集后分别可检测到24个和10个糖肽信号，说明本发明中麦芽糖功能化的纳米复合材料具有较高的选择性。
5、麦芽糖功能化纳米复合材料的稳定性
用富集液分别配制成0.02ng/μL的HRP酶解液，取1mL加入1mg麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4复合材料，超声分散，室温下振荡5min进行同实验1的操作后，洗涤3次，循环使用8次。另取室温放置2个月的麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4复合材料进行同样条件的富集，实验结果见图14。
由图14可见，用麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4复合材料从第一次到第八次富集和放置2个月后再富集的效果几乎一致，说明本发明的麦芽糖功能化的纳米复合材料稳定性好，可重复利用。
6、麦芽糖功能化纳米复合材料对对人血清酶解液中糖肽的富集
将10μL血清酶解物溶于富集液中，加入1mg麦芽糖功能化的SiO2@Fe3O4复合材料，超声分散，室温下振荡5min进行富集，后续按实验1的步骤操作。在平行三组数据中，共检测到98个糖蛋白中的282个糖肽信号。

Claims (8)

1.一种基于离子互补型肽自组装的麦芽糖功能化纳米复合材料，其特征在于：该复合材料是麦芽糖修饰的离子互补型肽在纳米材料表面自组装形成的稳定的麦芽糖功能化纳米复合材料；
上述麦芽糖修饰的离子互补型肽的结构式如下所示：
式中n＝1或2，M代表疏水氨基酸的残基，X和Y各自独立的代表-COOH或-CH2COOH，Z和W各自独立的代表-CH2NH3 +或-NHCNH2NH3 +。
2.根据权利要求1所述的麦芽糖功能化纳米复合材料，其特征在于：所述的纳米材料为SiO2、C、GO、SiO2@Fe3O4、C@Fe3O4、GO@Fe3O4、PS@Fe3O4、Au@MOF@PDA@Fe3O4、FEG@TiO2@Fe3O4、PEI@Fe3O4中任意一种。
3.根据权利要求1所述的麦芽糖功能化纳米复合材料，其特征在于：所述的疏水氨基酸的残基为-CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3、-CH3SCH2CH2中任意一种。
4.一种权利要求1所述的麦芽糖功能化纳米复合材料的制备方法，其特征在于该方法由下述步骤组成：
(1)合成麦芽糖修饰的离子互补型肽
采用固相合成法在树脂Fmoc-Rink Amide MBHA上依次连接权利要求1中的离子互补型肽序列后，用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次后，再加入甲醇、麦芽糖、氰基硼氢化钠，在70～80℃下回流反应1～3天，抽滤、洗涤，以三氟乙酸、三异丙基硅烷、水的体积比为95:2.5:2.5的混合液为切割液，室温搅拌1～2小时，将滤液加入冷乙醚中，析出沉淀，透析后冷冻干燥，得到麦芽糖修饰的离子互补型肽；
(2)制备麦芽糖功能化纳米复合材料
将麦芽糖修饰的离子互补型肽溶于pH＝7.4的磷酸缓冲液中，然后加入NaOH活化处理后的纳米材料，室温震荡30～60分钟，得到麦芽糖功能化纳米复合材料。
5.根据权利要求4所述的麦芽糖功能化纳米复合材料的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的Fmoc-Rink Amide MBHA树脂与麦芽糖、氰基硼氢化钠的摩尔比为1:10～60:4～20。
6.根据权利要求4所述的麦芽糖功能化纳米复合材料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的麦芽糖修饰的离子互补型肽与pH＝7.4的磷酸缓冲液的质量-体积比为1～10mg:1mL。
7.根据权利要求4所述的麦芽糖功能化纳米复合材料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的麦芽糖修饰的离子互补型肽与NaOH活化处理后的纳米材料的体积-质量比为1mL:20～200mg。
8.权利要求1所述的麦芽糖功能化纳米复合材料在糖肽富集中的应用。
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