CN111644163B - 一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料及其制备方法及其应用 - Google Patents

一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料及其制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111644163B
CN111644163B CN202010575362.9A CN202010575362A CN111644163B CN 111644163 B CN111644163 B CN 111644163B CN 202010575362 A CN202010575362 A CN 202010575362A CN 111644163 B CN111644163 B CN 111644163B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pfil
ionic liquid
msio
nsio
tripodal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010575362.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111644163A (zh
Inventor
王斌斌
梁洪泽
蒋雨菲
梁炜达
刘彬
蒋银丽
林嘉宇
卢俐衡
桑坤明
黎思蕴
闫迎华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ningbo University
Original Assignee
Ningbo University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ningbo University filed Critical Ningbo University
Priority to CN202010575362.9A priority Critical patent/CN111644163B/zh
Publication of CN111644163A publication Critical patent/CN111644163A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111644163B publication Critical patent/CN111644163B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/20—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising free carbon; comprising carbon obtained by carbonising processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/06—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising oxides or hydroxides of metals not provided for in group B01J20/04
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/10—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate
    • B01J20/103—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate comprising silica
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/20—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising free carbon; comprising carbon obtained by carbonising processes
    • B01J20/205—Carbon nanostructures, e.g. nanotubes, nanohorns, nanocones, nanoballs
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/223—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material containing metals, e.g. organo-metallic compounds, coordination complexes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
    • B01J20/28009—Magnetic properties
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/282—Porous sorbents
    • B01J20/283—Porous sorbents based on silica
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/52—Sorbents specially adapted for preparative chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/54—Sorbents specially adapted for analytical or investigative chromatography
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/54—Improvements relating to the production of bulk chemicals using solvents, e.g. supercritical solvents or ionic liquids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料及其制备方法，及该材料在含有磷酸化肽的样品中，富集磷酸化肽的应用。制备方法包括以下步骤：(1)将含有机膦酸功能化离子液体的三足螯合结构修饰到基底材料上；(2)将金属离子结合到含有机膦酸功能化离子液体的三足螯合结构上。本发明制备的功能化材料具有大的比表面积，更好的亲水性、固定金属离子的能力、耐酸碱性和稳定性，对磷酸化肽具有良好的特异选择性结合，适合于复杂生物样品的磷酸化肽的富集纯化。该材料在生物医学领域具有广泛的应用前景。

Description

一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料及其制备方法及其应用
技术领域
本发明属于功能材料、生命科学领域，具体涉及一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料，同时还涉及该材料的制备方法及其应用。
背景技术
自从蛋白质组学建立以来，开启了生命科学研究发展的新阶段。蛋白磷酸化/去磷酸化作为一种重要的翻译后修饰过程，据报道超过50％的蛋白质在他们的生命周期中是磷酸化的。蛋白质磷酸化是生物体内普遍存在的重要调节机制之一，与细胞的新陈代谢、增殖、凋亡，信号传导、分子识别等密切相关(T.E.Thingholm,O.N.Jensen,M.R.Larsen,Proteomics 2009,9,1451-1468.)。对蛋白磷酸化的充分认识，对疾病诊断学和病理学研究，以及寻找生物标志物，开发新药具有重要意义。磷酸化蛋白降解可以得到多种磷酸化多肽。因此，分离和鉴定磷酸化多肽具有重要意义。质谱技术的发展，使得质谱在蛋白组学研究中应用越来越广泛(X.S.Li,B.F.Yuan,Y.Q.Feng,Trac-Trend Anal Chem 2016,78,70-83.)。然而，蛋白质磷酸化的动态可逆性、瞬时性，以及磷酸化多肽的低丰度、低离子化效率，使得相关检测困难。因此，在质谱分析前，对样品中磷酸化肽的富集，是获得有效检测的关键。
金属离子固定化亲和色谱(immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)材料，是近些年来发展起来最快一类富集材料。但现有IMAC材料仍然存在这抗干扰性不够强、特异性不够强、检测灵敏度不够高，材料重复使用性不够好，成本偏高等缺陷。
发明内容
基于现有技术中所存在的问题，本发明引入一种有机膦功能化离子液体(PFIL)，通过季胺化反应，获得有机膦酸基团功能化的三足螯合配体，并将其修饰在基底材料的表面。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决。
一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料，该材料通过以下方法制备：
(1)将基底材料B分散在无水甲苯中，加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷，并进行搅拌、加热，得到氨基修饰的纳米材料，即B-NH2，洗涤、烘干；所述的基底材料为以下六种中任意一种：G@nSiO2、G@mSiO2纳米复合物、nSiO2、mSiO2纳米颗粒、Fe3O4@nSiO2、Fe3O4@nSiO2@mSiO2磁性纳米颗粒；(2)将上述得到的材料B-NH2分散于无水甲苯中，然后向其中加入二乙基(3-溴丙基)膦酸酯，搅拌、加热后，材料B-NH2表面的氨基被季胺化，将固体产物洗涤、干燥后，则可以得到有机膦酸基团修饰的纳米材料(B-NH2-PFIL)；(3)将得到的材料B-NH2-PFIL分散于氢溴酸中，搅拌、加热后，用NaOH溶液(pH＝10)洗涤至中性，烘干；(4)将步骤(3)得到的材料分散于金属盐溶液中，室温下反应2h，将得到的固体用去离子水多次洗涤，烘干后，即可得到固定金属离子的亲和材料，即B-NH2-PFIL-Mn+，也即三足离子液体材料。
一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料的制备方法，包括以下步骤：(1)将基底材料B分散在无水甲苯中，加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷，并进行搅拌、加热，得到氨基修饰的纳米材料，即B-NH2，洗涤、烘干；所述的基底材料为以下六种中任意一种：G@nSiO2、G@mSiO2纳米复合物、nSiO2、mSiO2纳米颗粒、Fe3O4@nSiO2、Fe3O4@nSiO2@mSiO2磁性纳米颗粒；(2)将上述得到的材料B-NH2分散于无水甲苯中，然后向其中加入二乙基(3-溴丙基)膦酸酯，搅拌、加热后，材料B-NH2表面的氨基被季胺化，将固体产物洗涤、干燥后，则可以得到有机膦酸基团修饰的纳米材料(B-NH2-PFIL)；(3)将得到的材料B-NH2-PFIL分散于氢溴酸中，搅拌、加热后，用NaOH溶液(pH＝10)洗涤至中性，烘干；(4)将步骤(3)得到的材料分散于金属盐溶液中，室温下反应2h，将得到的固体用去离子水多次洗涤，烘干后，即可得到固定金属离子的亲和材料，即B-NH2-PFIL-Mn+，也即三足离子液体材料。
进一步的，所述步骤(1)中，反应的温度为110℃，反应时间为24h。
进一步的，所述步骤(2)中，反应的温度为85℃，反应时间为12h。
进一步的，所述步骤(1)和(2)中洗涤液均为乙醇。
本申请中的三足离子液体材料在富集磷酸化肽中的应用：将上述三足离子液体材料用于富集磷酸化肽。
本发明的原理如下：本发明通过将氨基化纳米材料的氨基季胺化，得到三足有机膦功能化离子液体修饰的纳米材料，即B-NH2-PFIL；在酸化处理后，继而在有机膦酸基团上修饰金属离子，得到B-NH2-PFIL-Mn+固定金属离子亲和色谱材料。
本发明通过改变基底材料B，制备了六种不同基底材料的IMAC吸附剂，即B-NH2-PFIL-Mn+(其中，B＝G@nSiO2或G@mSiO2或nSiO2或mSiO2或Fe3O4@nSiO2或Fe3O4@nSiO2@mSiO2)。
本发明具有以下优点和优异特性：(1)本发明的修饰方法简单，易于操作，并且不会破坏基底材料的基本形貌特征，三足螯合结构有强的络合金属离子能力；制备得到的亲和材料，具有良好的稳定性，耐酸碱性，增加了该材料的实用性。(2)本发明中所合成的固定金属离子亲和材料—B-NH2-PFIL-Mn+作为IMAC吸附剂，利用金属离子和磷酸化肽中磷酸基团间的亲和性，具有良好的特异选择性，可用于磷酸化肽的特异性富集，并且成功地将合成的材料用于标准肽、多肽混合液以及人类唾液样品中磷酸化肽的富集。
附图说明
图1为B-NH2-PFIL-Mn+(以nSiO2-NH2-PFIL-Ti4+为例)的合成流程图。类似地，利用其它基底材料制备得到对应的IMAC吸附剂。
图2为β-酪蛋白酶解液的质谱图；其中，图2a为β-酪蛋白酶解液的直接检测图；图2b为β-酪蛋白酶解液经过G@nSiO2-NH2-PFIL-Ti4+处理后的质谱图；图2c为β-酪蛋白酶解液经过G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+处理后的质谱图；图2d为β-酪蛋白酶解液经过nSiO2-NH2-PFIL-Ti4+处理后的质谱图；图2e为β-酪蛋白酶解液经过mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+处理后的质谱图；图2f为β-酪蛋白酶解液经过Fe3O4@nSiO2-NH2-PFIL-Ti4+处理后的质谱图；图2g为β-酪蛋白酶解液经过Fe3O4@nSiO2@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+处理后的质谱图；磷酸化肽信号用*表示，去磷酸残基则用#表示。
图3为β-酪蛋白酶解液用G@mSiO2-NH2-PFIL-Zr4+处理后的质谱图；磷酸化肽信号用*表示，去磷酸残基则用#表示。
图4为β-酪蛋白和牛血清蛋白BSA的酶解混合液(摩尔比为1：1000)的质谱图；其中，图4a为G@mSiO2-NH2-PFIL-Zr4+处理后的质谱图；图4b为G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+处理后的质谱图；磷酸化肽信号用*表示，去磷酸残基则用#表示。
图5为β-酪蛋白(1.43pmol)和牛血清蛋白BSA的酶解混合液(摩尔比为1：15000)在G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+处理后的质谱图，磷酸化肽信号用*表示。
图6为唾液的质谱图；其中，图6a为唾液样品直接分析的质谱图；图6b为G@mSiO2-NH2-PFIL-Zr4+处理后的质谱图；图6c为G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+处理后的质谱图；磷酸化肽信号用*表示。
图7为β-酪蛋白酶解液的质谱图；其中，图7a为G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+对β-酪蛋白酶解液第1次富集的质谱图；图7b为G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+对β-酪蛋白酶解液第5次富集的质谱图；图7c为G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+对β-酪蛋白酶解液第10次富集的质谱图；磷酸化肽信号用*表示，去磷酸残基则用#表示。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
以下实施方式中，自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的原件或具有相同或类似功能的原件，以下通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例一：其中的基底材料B为G@nSiO2。
实施例二：其中的基底材料B为G@mSiO2纳米复合物。
实施例三：其中的基底材料B为nSiO2。
实施例四：其中的基底材料B为mSiO2纳米颗粒。
实施例五：其中的基底材料B为Fe3O4@nSiO2。
实施例六：其中的基底材料B为Fe3O4@nSiO2@mSiO2。
以上六种实施例中材料的制备方法相同：首先制备氨基修饰的纳米复合物，得到B-NH2，再利用二乙基(3-溴丙基)膦酸酯对材料表面的氨基进行季胺化修饰，得到表面修饰有机膦酸基团的B-NH2-PFIL；酸化处理后，再在有机膦酸基团上固载金属离子，得到固定金属离子亲和吸附剂B-NH2-PFIL-Mn+，也就是本申请中的离子液体材料。
具体的制备方法如下：
(1)氨基修饰的纳米材料(B-NH2)的制备,其制备方法如下：将400mg基底材料分散于30mL的无水甲苯中，超声分散后，向其中加0.75mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，油浴加热至110℃，反应24h。反应结束后，离心分离固体，并用乙醇多次洗涤，烘干。
(2)B-NH2-PFIL的制备：称取200mg的B-NH2于20mL的无水甲苯中，超声分散后，向其中加入1.5g的二乙基(3-溴丙基)膦酸酯，在85℃的油浴中磁力搅拌12h。反应结束后，离心分离固体，并用乙醇多次洗涤，烘干，即可得到B-NH2-PFIL。
(3)B-NH2-PFIL的酸化处理：将得到的B-NH2-PFIL分散于5mL的氢溴酸中，在120℃的油浴中搅拌2h。反应结束后，离心分离固体，用氢氧化钠溶液(pH＝10)洗涤至中性，再用去离子水洗涤几次去除残余的氢氧化钠和钠盐。
(4)B-NH2-PFIL-Mn+的制备：将经过酸处理后的B-NH2-PFIL分散于30mL0.1M金属盐溶液中，室温下震荡2h，离心分离固体后，依次用去离子水和乙醇洗涤，85℃烘干，得到的固体即是B-NH2-PFIL-Mn+。所述金属盐溶液为Ti(SO4)2或ZrOCl2溶液。
实验测试及对附图的说明如下：
(1)为了考察六种不同基底的纳米材料在修饰钛离子(B-NH2-PFIL-Ti4+)后对磷酸化肽富集的效果，从而确定不同基底材料对富集的影响，我们比较了六种B-NH2-PFIL-Ti4+吸附剂对标准蛋白β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽的富集效果。
将5mgβ-酪蛋白溶解于1mL 25mM碳酸氢氨缓冲溶液(pH＝8)中；向混合溶液中加入胰蛋白酶(胰蛋白酶与底物的质量比为1：50)，在37℃条件下反应12h。酶解后的产物存放于-20℃的冰箱中待用。
为了比较六种不同基底的IMAC吸附剂B-NH2-PFIL-Ti4+对磷酸化肽的富集效果，我们首先选择标准蛋白β-酪蛋白作为富集的样品。
分别称取5mg六种不同基底的吸附剂于1mL的富集缓冲液(50％ACN，0.1％TFA，v/v)中，超声分散后，取出100μL的分散液用于富集实验，向分散液中加入1μL的标准肽酶解液(200fmol/μL)。然后，将混合液置于恒温金属浴中，在37℃条件下震荡30min，离心或磁性分离固体并用富集缓冲液洗涤固体材料三次。最后，用10μL 0.4M的氨水分散洗涤后的固体材料，在37℃条件下震荡15min，分离后取上清液5μL，与5μL基质溶液(饱和DHB溶液，包含50％ACN和0.1％TFA)混合后，取1μL的混合液滴于MALDI的靶板上，在空气中干燥后进行MALDI-TOF MS分析。
经质谱分析后，其结果如图2所示：在图2a中，样品未经过吸附剂B-NH2-PFIL-Ti4+处理，直接进行MALDI-TOF MS分析，在质谱图中观察不到磷酸化肽信号峰，只有非磷酸化肽峰存在。当该样品分别经六种吸附剂处理后，其分析结果如图2中b-g所示，样品在经过G@nSiO2-NH2-PFIL-Ti4+和G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+、nSiO2-NH2-PFIL-Ti4+和mSiO2-NH2-PFIL-Ti4 +以及Fe3O4@nSiO2-NH2-PFIL-Ti4+和Fe3O4@nSiO2@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+处理后分别可以检测到3、5、2、4、3和4个磷酸化肽信号峰以及对应的3、2、2、1、2和2个去磷酸残基信号峰。从质谱结果可知，磷酸化肽的信号峰强度较大，且背景较干净，实验结果表明这六种吸附剂均可以有效地富集磷酸化肽；从磷酸化肽信号个数以及杂峰的情况综合分析，以G@mSiO2为基底的吸附剂G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+表现出更好的特异性，其原因可能是由于介孔二氧化硅的比表面积大，可以修饰上更多亲水性的离子型链接臂，所以单位质量的基底可以固定更多的金属离子，捕获的磷酸化肽更多。
(2)为了研究不同的金属离子对富集磷酸化肽的效果，我们将不同金属离子(Zr4+、Ti4+)固定于基底G@mSiO2上，比较固定不同金属离子的材料G@mSiO2-NH2-PFIL-Mn+(Zr4+、Ti4 +)对β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽的富集效果。
分别称取5mg两种吸附剂G@mSiO2-NH2-PFIL-Mn+(Zr4+、Ti4+)于1mL的富集缓冲液(50％ACN，0.1％TFA，v/v)中，超声分散后，取出100μL的分散液用于富集实验，向分散液中加入1μL的标准肽酶解液(200fmol/μL)。然后，将混合液置于恒温金属浴中，在37℃条件下震荡30min，离心分离固体并用富集缓冲液洗涤固体材料三次。最后，用10μL 0.4M的氨水分散洗涤后的固体材料，在37℃条件下震荡15min，离心后取上清液5μL，与5μL基质溶液(饱和DHB溶液，包含50％ACN和0.1％TFA)混合后，取1μL的混合液滴于MALDI的靶板上，在空气中干燥后进行MALDI-TOF MS分析。
质谱分析的对比结果如图3和图2c所示。样品分别经过两种吸附剂G@mSiO2-NH2-PFIL-Mn+(Zr4+、Ti4+)处理后，可以观察到相似的富集效果。但与材料G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+(图2c)的富集结果相比，样品经
G@mSiO2-NH2-PFIL-Zr4+(图3)处理后，图谱中存在少量的非磷酸化肽峰；从检测到的单、多磷酸化肽的结果可知，材料G@mSiO2-NH2-PFIL-Zr4+能够更好地富集多磷酸化肽。
(3)为了进一步研究不同的金属离子对磷酸化肽特异性富集的效果，比较了固定不同金属离子的材料G@mSiO2-NH2-PFIL-Mn+(Zr4+、Ti4+)对β-酪蛋白和牛血清蛋白BSA酶解混合液(摩尔比为1：1000)中磷酸化肽的富集效果。
1mg牛血清蛋白溶解在0.1mL 50mM碳酸氢氨变性缓冲液中(包含8M尿素)，变性后加入0.2mL 0.1M二硫苏糖醇(DTT)溶液，并在37℃条件下反应30min，还原蛋白质中的二硫键，然后再加入0.2mL 0.2M碘乙酰胺(IAA)溶液，于室温条件下避光反应30min，使还原的巯基烷基化；将上述产物用50mM碳酸氢氨缓冲溶液(pH＝8.3)稀释至1mL；向混合溶液中加入胰蛋白酶(胰蛋白酶与底物的质量比为1：50)，在37℃条件下反应16h。酶解后的产物存放于-20℃的冰箱中待用。
分别称取5mg两种吸附剂G@mSiO2-NH2-PFIL-Mn+(Zr4+、Ti4+)于1mL的富集缓冲液(50％ACN，0.1％TFA，v/v)中，超声分散后，取出100μL的分散液用于富集实验，向分散液中加入1μL的蛋白酶解混合液。然后，将混合液置于恒温金属浴中，在37℃条件下震荡30min，离心分离固体并用富集缓冲液洗涤固体材料三次。最后，用10μL 0.4M的氨水分散洗涤后的固体材料，在37℃条件下震荡15min，离心后取上清液5μL，与5μL基质溶液(饱和DHB溶液，包含50％ACN和0.1％TFA)混合后，取1μL的混合液滴于MALDI的靶板上，在空气中干燥后进行MALDI-TOF MS分析。
分析结果如图4a所示，G@mSiO2-NH2-PFIL-Zr4+处理样品后，只有一个磷酸化肽信号可以检测到，且存在非磷酸化肽信号、基线较高；但在G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+处理样品后，可以观察到3个磷酸化肽和2个去磷酸残基的信号，且无非磷酸化肽信号，所以，从两个富集样品的富集结果综合分析，G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+对磷酸化肽富集具有更好的特异性。
(4)为了更好地评估G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+纳米复合物对磷酸化肽的吸附能力，我们选择更复杂的蛋白酶解液作为吸附样品，即继续提高β-酪蛋白和牛血清蛋白BSA酶解混合液中BSA酶解液的摩尔比(摩尔比为1：15000)。
称取5mg G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+于1mL的富集缓冲液(50％ACN，1％TFA，v/v)中，超声分散后，取出100μL的分散液用于富集实验，向分散液中加入150μL的蛋白酶解混合液(其中，β-酪蛋白含量为1.43pmol)。然后，将混合液置于恒温金属浴中，在37℃条件下震荡30min，离心分离固体并用富集缓冲液洗涤固体材料三次。最后，用10μL 0.4M的氨水分散洗涤后的固体材料，在37℃条件下震荡15min，离心后取上清液5μL，与5μL基质溶液(饱和DHB溶液，包含50％ACN和0.1％TFA)混合后，取1μL的混合液滴于MALDI的靶板上，在空气中干燥后进行MALDI-TOF MS分析。
质谱检测结果如图5所示，在经过G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+富集后，尽管质谱图中存在少量的非磷酸化肽信号，但仍然可以观察到3个磷酸化肽信号，且磷酸化肽信号主导整个质谱图，且磷酸化肽的相对强度较高，所以，材料G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+对磷酸化肽富集具有良好的特异性。
(5)两种不同富集材料G@mSiO2-NH2-PFIL-Mn+(其中M＝Zr4+或Ti4+)对唾液中内源性磷酸化肽的富集分别称取5mg两种吸附剂
G@mSiO2-NH2-PFIL-Mn+(其中M＝Zr4+或Ti4+)于1mL的富集缓冲液(50％ACN，0.1％TFA，v/v)中，超声分散后，取出100μL的分散液用于富集实验，向分散液中加入20μL的唾液样品。然后，将混合液置于恒温金属浴中，在37℃条件下震荡30min，离心分离固体并用富集缓冲液洗涤固体材料三次。最后，用10μL0.4M的氨水分散洗涤后的固体材料，在37℃条件下震荡15min，离心后取上清液5μL，与5μL基质溶液(饱和DHB溶液，包含50％ACN和0.1％TFA)混合后，取1μL的混合液滴于MALDI的靶板上，在空气中干燥后进行MALDI-TOF MS分析。
分析结果如图6所示，图6a为唾液样品直接经质谱分析后的质谱图，从图中可以观察到，非磷酸化肽和杂质信号峰主导整个图谱；
G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+(图6b)、G@mSiO2-NH2-PFIL-Zr4+(图6c)两种吸附剂对样品处理后，分别可以检测到的磷酸化肽的信号峰个数为22和18，表明这两种材料均可以用以唾液中内源性磷酸化肽的富集。从质谱分析结果可知，相比于Zr(Ⅳ)，Ti(Ⅳ)则对磷酸化肽的富集表现出更好的亲和性，以上分析结果表明，吸附剂G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+对唾液中内源性磷酸化肽富集的特异性最佳。
(6)为了表明基于材料设计时的稳定性特性及重复使用性，我们利用材料G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+对β-酪蛋白酶解液进行了10次重复性富集。
称取5mg吸附剂G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+于500μL的富集缓冲液(50％ACN，0.1％TFA，v/v)中，超声分散后，取出100μL的分散液用于富集实验，向分散液中加入β-酪蛋白酶解液(200fmol)。然后，将混合液置于恒温金属浴中，在37℃条件下震荡30min，离心分离固体并用富集缓冲液洗涤固体材料三次。最后，用10μL 0.4M的氨水分散洗涤后的固体材料，在37℃条件下震荡15min，离心后取上清液5μL，与5μL基质溶液(饱和DHB溶液，包含50％ACN和0.1％TFA)混合后，取1μL的混合液滴于MALDI的靶板上，在空气中干燥后进行MALDI-TOFMS分析；脱附后的材料用富集缓冲液洗涤三次，然后在相同的条件下进行下一次的富集—脱附循环实验。
检测结果如图7所示，其中，图7a和7b为材料G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+分别对β-酪蛋白酶解液第1次和第5次富集的检测结果，从图中可以看出，第1次和第5次的富集效果相似；与第1次和第5次检测结果相比，经过10次富集后(图7c)，在质谱图中，虽然磷酸化肽信号强度降低，且有少量非磷酸化肽信号，但仍然可以检测到相同数量的磷酸化肽信号，且多磷酸化肽的强度明显增高。以上结果表明，材料设计的特性—Ti(Ⅳ)同时和三个螯合配体络合的“三足”特性，使得合成的材料表现出良好的稳定性以及重复使用性。
本发明的保护范围包括但不限于以上实施方式，本发明的保护范围以权利要求书为准，任何对本技术做出的本领域的技术人员容易想到的替换、变形、改进均落入本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料，其特征在于，该材料通过以下方法制备：
(1)将基底材料B分散在无水甲苯中，加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷，并进行搅拌、加热，得到氨基修饰的纳米材料，即B-NH2，洗涤、烘干；所述的基底材料为以下六种中任意一种：G@nSiO2、G@mSiO2纳米复合物、nSiO2、mSiO2纳米颗粒、Fe3O4@nSiO2、Fe3O4@nSiO2@mSiO2磁性纳米颗粒；
(2)将上述得到的材料B-NH2分散于无水甲苯中，然后向其中加入二乙基(3-溴丙基)膦酸酯，搅拌、加热后，材料B-NH2表面的氨基被季胺化，将固体产物洗涤、干燥后，则可以得到有机膦酸基团修饰的纳米材料B-NH2-PFIL；
(3)将得到的材料B-NH2-PFIL分散于氢溴酸中，搅拌、加热后，用pH＝10的NaOH溶液洗涤至中性，烘干；
(4)将步骤(3)得到的材料分散于金属盐溶液中，室温下反应2h，将得到的固体用去离子水多次洗涤，烘干后，即可得到固定金属离子的亲和材料，即B-NH2-PFIL-Mn+，也即三足离子液体材料。
2.一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将基底材料B分散在无水甲苯中，加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷，并进行搅拌、加热，得到氨基修饰的纳米材料，即B-NH2，洗涤、烘干；所述的基底材料为以下六种中任意一种：G@nSiO2、G@mSiO2纳米复合物、nSiO2、mSiO2纳米颗粒、Fe3O4@nSiO2、Fe3O4@nSiO2@mSiO2磁性纳米颗粒；
(2)将上述得到的材料B-NH2分散于无水甲苯中，然后向其中加入二乙基(3-溴丙基)膦酸酯，搅拌、加热后，材料B-NH2表面的氨基被季胺化，将固体产物洗涤、干燥后，则可以得到有机膦酸基团修饰的纳米材料B-NH2-PFIL；
(3)将得到的材料B-NH2-PFIL分散于氢溴酸中，搅拌、加热后，用pH＝10的NaOH溶液洗涤至中性，烘干；
(4)将步骤(3)得到的材料分散于金属盐溶液中，室温下反应2h，将得到的固体用去离子水多次洗涤，烘干后，即可得到固定金属离子的亲和材料，即B-NH2-PFIL-Mn+，也即三足离子液体材料。
3.根据权利要求2所述的一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，反应的温度为110℃，反应时间为24h。
4.根据权利要求2所述的一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，反应的温度为85℃，反应时间为12h。
5.根据权利要求2所述的一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)和(2)中洗涤液均为乙醇。
6.三足离子液体材料在富集磷酸化肽中的应用，其特征在于，将权利要求1中的三足离子液体材料用于富集磷酸化肽。
CN202010575362.9A 2020-06-22 2020-06-22 一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料及其制备方法及其应用 Active CN111644163B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010575362.9A CN111644163B (zh) 2020-06-22 2020-06-22 一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料及其制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010575362.9A CN111644163B (zh) 2020-06-22 2020-06-22 一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料及其制备方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111644163A CN111644163A (zh) 2020-09-11
CN111644163B true CN111644163B (zh) 2023-04-07

Family

ID=72343721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010575362.9A Active CN111644163B (zh) 2020-06-22 2020-06-22 一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料及其制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111644163B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114272915B (zh) * 2021-11-30 2023-04-25 宁波大学 膦基离子液体修饰纳米复合材料及其制备方法及其在富集磷酸化肽中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1635063A (zh) * 2003-12-30 2005-07-06 中国科学院兰州化学物理研究所 含膦酸酯官能团的离子液体及其制备方法和用途
CN1665790A (zh) * 2002-05-03 2005-09-07 莫莱丘莱尔探针公司 用于检测和分离磷酸化分子的组合物及方法
CN1997671A (zh) * 2004-06-14 2007-07-11 诺和诺德公司 通过硬金属离子亲和层析法的肽纯化
WO2008148645A1 (en) * 2007-06-07 2008-12-11 Syddansk Universitet Separation of mono- from multi-phoshorylated peptides
CN106925241A (zh) * 2017-03-31 2017-07-07 武汉大学 一种利用5‑磷酸吡哆醛制备固定金属亲合材料的方法
CN110575825A (zh) * 2018-06-08 2019-12-17 中国科学院大连化学物理研究所 一种磷酸功能化和Ti-IMAC碳材料及其制备和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101396650B (zh) * 2007-09-26 2010-12-22 中国科学院大连化学物理研究所 一种固定钛离子亲和色谱材料及其制备和应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1665790A (zh) * 2002-05-03 2005-09-07 莫莱丘莱尔探针公司 用于检测和分离磷酸化分子的组合物及方法
CN1635063A (zh) * 2003-12-30 2005-07-06 中国科学院兰州化学物理研究所 含膦酸酯官能团的离子液体及其制备方法和用途
CN1997671A (zh) * 2004-06-14 2007-07-11 诺和诺德公司 通过硬金属离子亲和层析法的肽纯化
WO2008148645A1 (en) * 2007-06-07 2008-12-11 Syddansk Universitet Separation of mono- from multi-phoshorylated peptides
CN106925241A (zh) * 2017-03-31 2017-07-07 武汉大学 一种利用5‑磷酸吡哆醛制备固定金属亲合材料的方法
CN110575825A (zh) * 2018-06-08 2019-12-17 中国科学院大连化学物理研究所 一种磷酸功能化和Ti-IMAC碳材料及其制备和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111644163A (zh) 2020-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103894161B (zh) 一种磁性金属有机骨架复合材料的合成方法及其应用
CN106512965A (zh) 一种金属有机骨架纳米复合材料的合成方法及其应用
Xu et al. Boronic acid-functionalized detonation nanodiamond for specific enrichment of glycopeptides in glycoproteome analysis
CN111617746B (zh) 聚离子液体改性纳米材料及其制备方法及其在富集磷酸化肽中的应用
CN106732409B (zh) 磺酸基修饰的金属有机骨架纳米复合材料的合成方法及其应用
CN113457630B (zh) 一种用于富集糖肽的磁性双亲水性金属有机骨架材料的制备方法
CN106268707A (zh) 一种基于新型磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法
CN106432644B (zh) 一种亲水型聚合物功能化磁性纳米微球及其制备方法和应用
CN107607640A (zh) 一种硼酸修饰的纳米复合材料的糖肽富集与质谱检测方法
Liu et al. Preparation of cotton wool modified with boric acid functionalized titania for selective enrichment of glycopeptides
CN111644163B (zh) 一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料及其制备方法及其应用
Wei et al. Facile fabrication of hydrophilic PAA-Ti/TiO2 nanocomposite for selective enrichment and detection of phosphopeptides from complex biological samples
Zhao et al. Fluorous modified magnetic mesoporous silica composites-incorporated fluorous solid-phase extraction for the specific enrichment of N-linked glycans with simultaneous exclusion of proteins
CN101196527A (zh) 一种在maldi-tof-ms样品靶上快速富集、鉴定磷酸肽的方法
CN106925241B (zh) 一种利用5-磷酸吡哆醛制备固定金属亲合材料的方法
CN101685051A (zh) 一种富集磷酸肽或磷酸化蛋白质的开管毛细管柱及方法
CN113828284A (zh) 一种多金属多功能磁性纳米材料的制备及其使用方法
Jiang et al. Design of Gd 3+-immobilized two-dimensional magnetic magadiite nanosheets for highly selective enrichment of phosphopeptides
CN108079957B (zh) 一种n-磷酸化肽段和蛋白质富集材料及其制备和应用
CN106475055B (zh) 一种功能化修饰纳米介孔材料的制备方法及介孔材料和应用
CN111690006B (zh) 一种基于咪唑基离子液体材料及其制备方法及其用于磷酸化肽富集
CN116813920A (zh) β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料的制备方法及应用
CN114272915B (zh) 膦基离子液体修饰纳米复合材料及其制备方法及其在富集磷酸化肽中的应用
CN107561164A (zh) 一种尿液蛋白质组学样品预处理方法及应用
EP1459072A2 (en) Enzyme/chemical reactor based protein processing method for proteomics analysis by mass spectrometry

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant