CN108079957B - 一种n-磷酸化肽段和蛋白质富集材料及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能在中性条件下识别N‑磷酸化肽段和蛋白质的新型硅胶材料及其在N‑磷酸化肽段和蛋白质富集中的应用：采用种子生长法制备无孔硅胶微球，通过模板引导溶解和再沉积的方法形成核壳微球初始壳层，最后经过酸回流得到具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶。通过N‑叔丁氧羰基‑L‑酪氨酸与N,N′‑二甲基吡啶胺反应形成支撑分子，在其上络合金属离子形成磷酸识别功能分子。最后将磷酸识别功能分子与具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶通过酰胺键共价结合得到新型磷酸识别功能硅胶材料。该新型磷酸识别功能硅胶材料能够在中性缓冲体系下快速地对N‑磷酸化肽段和蛋白质进行特异性富集。

Description

一种N-磷酸化肽段和蛋白质富集材料及其制备和应用
技术领域
本发明涉及一种能在中性条件下识别N-磷酸化肽段和蛋白质的新型硅胶材料及其在N-磷酸化肽段和蛋白质富集中的应用。
背景技术
蛋白质的磷酸化修饰是自然界中最常见的翻译后修饰之一，它参与了细胞增殖、凋亡、发育、分化、信号传导等所有生命活动(Nat.Biotechnol,2005,23,94-101)。磷酸化修饰按照其发生的氨基酸不同主要分为O-磷酸化修饰(发生在丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸上)、N-磷酸化修饰(发生在组氨酸、赖氨酸或精氨酸上)、S-磷酸化修饰(发生在半胱氨酸上)。其中，O-磷酸化修饰是研究最多的翻译后修饰，其P-O键在强酸条件下具有很好的稳定性，因此很容易在强酸条件下通过亲和色谱(IMAC或MOAC)进行富集(Nat Protoc,2013,8,461-480)。然而，N-磷酸化修饰，由于其P-N键在pH小于3时会迅速水解，导致磷酸化修饰的丢失，因此无法将传统的富集O-磷酸化肽段或蛋白质的方法应用于N-磷酸化肽段或蛋白质的富集。因此，发展中性条件下富集N-磷酸化肽段或蛋白质的方法具有非常重要的科学意义。
含有空轨道的金属离子可以与磷酸基团中的氧原子产生配位作用，而且不取决于体系pH，因此这些金属离子可以在中性条件下实现对磷酸基团的特异性识别。由于具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶具有比表面积大、传质快的优点，因此作为基质材料不仅可以增加磷酸识别分子的固载量，而且可以减少样品的孵育时间，降低N-磷酸化修饰的水解程度。因此，将磷酸识别分子固载于具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶上可以实现中性条件下对N-磷酸化修饰肽段和蛋白质的特异性富集。
发明内容
本发明涉及一种能在中性条件下识别N-磷酸化肽段和蛋白质的新型硅胶材料及其在N-磷酸化肽段和蛋白质富集中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
采用种子生长法制备无孔硅胶微球，通过模板引导溶解和再沉积的方法形成核壳微球初始壳层，最后经过酸回流得到具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶。通过N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸与N,N′-二甲基吡啶胺反应形成支撑分子，在其上络合金属离子形成磷酸识别功能分子。最后将磷酸识别功能分子与具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶通过酰胺键共价结合得到新型磷酸识别功能硅胶材料。具体操作步骤如下：
1.采用种子生长法制备无孔硅胶微球，通过模板引导溶解和再沉积的方法形成核壳微球初始壳层，最后经过酸回流得到具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶,其步骤如下：
(1)将水解液和0.1-10mL正硅酸乙酯混合；水解液由0.1-10mL氨水、0.1-10mL水和0.1-100mL无水乙醇混合而成；
(2)向步骤(1)所得溶液中加入0.1-1mL水和1-10mL正硅酸乙酯，25-100℃反应1-60min，并重复此加入和反应过程2-20次，分离收集固体，得到Sead1；
(3)将0.001-100g Sead1加入0.01-100mL新配水解液中，然后加入0.1-1mL水和1-10mL正硅酸乙酯，25-100℃反应1-60min，并重复此加入和反应过程2-20次，分离收集固体，得到Sead2；水解液由0.1-10mL氨水、0.1-10mL水和0.1-100mL无水乙醇混合而成；
(3)将0.001-100g Sead2分散于0.01-100mL水中，加入1-10g十六烷基三甲基氯化铵或者十六烷基三甲基溴化铵、0.1-10mL十三烷、0.1-100mg氟化铵和0.1-10mL氨水，80-95℃反应0.1-100h，得到NPs；
(4)将烘干的NPs于100-1000℃烧结0.1-24h形成核壳微球初始壳层；
(5)将0.001-100g烧结后NPs分散于10-30mL 1-10N的HCl、H2SO4、HNO3、H3PO4、HF中的一种或两种以上酸溶液中，100-200℃反应10-24h。
2.通过N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸与N,N′-二甲基吡啶胺反应形成支撑分子，在其上络合金属离子形成磷酸识别功能分子的过程为：
(1)0.001-100g N,N′-二甲基吡啶胺与0.001-100g多聚甲醛溶解于30-37.5％异丙醇溶液中，用HCl调pH＝8.0-9，50-90℃反应10-60min；
(2)向步骤(1)所得溶液中加入0.001-100g N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸，100-120℃反应6-24h，得到保护的前体分子(Boc-dpa)；
(3)后处理：将异丙醇蒸干，冷却至室温后收集下层油状物，分散于10-100ml乙酸乙酯中，分别用饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液清洗，用硫酸钠干燥过夜；以体积比为氯仿：三乙胺：甲醇＝20-50：0.8-1.2：0.1-0.5溶液为流动相，100-300目二氧化硅为固定相纯化产物；
(4)向0.001-1000g Boc-dpa的二氯甲烷溶液中滴加8-15mL TFA，室温反应1-12h得到dpa溶液；
(5)向dpa溶液中加入戊二酸酐，dpa与戊二酸酐等摩尔比反应12-24h，得到GAPT；
(6)将0.001-100g GAPT分散于体积浓度为30-50％甲醇溶液中，滴加金属离子溶液，室温搅拌反应12-24h。金属离子为：钾、钙、钠、镁、铝、钪、钛、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、镓、锗、铷、锶、钇、锆、铌、铑、钯、银、镉、铟、锡、锑、铂、金中的一种或两种以上，金属离子溶液中金属离子摩尔浓度为0.001-10M；GAPT与金属离子摩尔比为0.001-100。
3.磷酸识别功能分子(GAPT-M)与具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶通过共价结合得到磷酸识别功能硅胶材料的过程为：
将亚二微米核壳硅胶分散于二甲基甲酰胺中，加入GAPT-M，室温搅拌反应24-48h；亚二微米核壳硅胶于二甲基甲酰胺中的浓度为0.001-100g/mL，亚二微米核壳硅胶与GAPT-M的质量比为0.001-100；
GAPT-M的羧基与亚二微米核壳硅胶上的氨基通过缩合反应形成酰胺键，以此将GAPT-M共价结合于亚二微米核壳硅胶上。
4.将以上任一所述方法制备获得的N-磷酸化肽段和蛋白质富集材料应用于pH＝6.5-8.0中性条件下蛋白质组学、代谢组学、生命研究中N-磷酸化肽段和/或蛋白的富集和/或检测过程中。
5.N-磷酸化肽段和/或蛋白质的富集是基于硅胶基质双锌材料中的锌离子对磷酸化修饰中的氧原子的配位作用实现的；富集时加入中性缓冲溶液保证体系pH为6.5-8.0；非特异性吸附的去除是在有机相、盐溶液和和PH＝9-12碱性条件下实现的；磷酸化肽段或蛋白的洗脱是基于竞争结合或通过破坏相互作用实现的。
中性缓冲溶液包括：pH范围为6-8的醋酸缓冲溶液、磷酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液、邻苯二甲酸缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液、硼酸缓冲溶液、羟乙基呱嗪乙硫磺酸缓冲溶液中的一种或两种以上；
N-磷酸化肽段和蛋白质包括：磷酸化翻译后修饰发生在赖氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或两种以上氨基酸侧链胺之上的肽段或蛋白质；
去除非特异性吸附的条件包括：浓度为10％-90％乙腈、甲醇、异丙醇中的一种或两种以上；浓度为10mM-2M的氯化钠、氯化钾、氯化铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵溶液中的一种或两种以上；pH范围为8-12的氨水溶液、氢氧化钾溶液、氢氧化钠溶液、氢氧化钡溶液、氢氧化锂溶液、氢氧化镁溶液、氢氧化钙溶液、乙胺溶液、三乙醇胺溶液、乙醇胺溶液、乙二胺溶液、三乙胺溶液、氨基苯酚溶液、甲胺溶液、丙胺溶液、丁胺溶液溶液中的一种或两种以上；
洗脱缓冲溶液包括：添加有0.1-200mM磷酸盐、0.1-200mM焦磷酸盐、0.1-200mM聚磷酸盐、0.1-10％十二烷基硫酸钠、0.1-200mM乙二胺四乙酸二钠、0.01％-28％氨水、0.1-8M尿素、0.1-8M盐酸胍中的一种或两种以上组成的缓冲溶液A；
缓冲溶液A包括：醋酸缓冲溶液、磷酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液、邻苯二甲酸缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液、硼酸缓冲溶液、羟乙基呱嗪乙硫磺酸缓冲溶液中的一种或两种以上。
所述N-磷酸化肽段和蛋白的富集方法可应用于蛋白质组学、代谢组学、生命研究中关键化学物质的检测和发现。
这种新型磷酸识别功能硅胶材料首次用于N-磷酸化肽段和蛋白质的特异性富集。
本发明具有如下优点：
1)新型磷酸识别功能硅胶材料传质速度快，可以实现N-磷酸化肽段和蛋白质的快速富集。
2)该材料中的金属离子能够特异性结合磷酸基团，能够特异性结合磷酸基团。
3)该材料能够实现在中性条件下富集N-磷酸化肽段和蛋白质，减少N-磷酸化修饰在操作过程中因水解而丢失。
4)该材料对于复杂生物体系中的磷酸化肽段和蛋白质均具有很好的富集效果。
5)该材料可以同时富集复杂生物体系中N-磷酸化肽段和蛋白质与O-磷酸化肽段和蛋白质。
附图说明
图1为新型磷酸识别功能硅胶材料合成示意图。
图2为(a)Boc-dpa和(b)GAPT的ESI-MS图。
图3为具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶的透射电镜图。
图4为磷酸识别功能硅胶材料富集N-磷酸化肽段和蛋白质示意图。
图5为磷酸识别功能硅胶材料与N-磷酸化蛋白质(N-磷酸化肌红蛋白)在不同孵育时间下的富集效果SDS-PAGE图，说明该材料的传质速度快，在孵育5min时就已经对N-磷酸化蛋白质产生特异性富集效果。
图6为磷酸识别功能硅胶材料在牛血清蛋白干扰存在下对N-磷酸化蛋白(N-磷酸化肌红蛋白)的富集效果SDS-PAG图。
具体实施方式
实施例1
1.制备具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶：
a)将水解液(6.7mL氨水，5.1mL水和70mL无水乙醇)和4mL正硅酸乙酯混合，22℃水浴搅拌40min，升温至55℃；
b)加入0.64mL水和4mL正硅酸乙酯，55℃反应40min；
c)重复4次步骤(2)得到Sead1；
d)将Sead1的溶液置换为等量新配水解液，重复10次步骤(2)得到Sead2。
e)将Sead2分散于100mL水中，加入1g十六烷基三甲基氯化铵、5.8mL十三烷、0.1-100mg氟化铵和0.1-10mL氨水，90℃反应24h，得到NPs；
f)将烘干的NPs于550℃烧结6h形成核壳微球初始壳层。
g)将NPs分散于30mL5N HCl溶液中，120℃反应回流12h。
2.合成一种磷酸识别功能分子：
a)3.37g N,N′-二甲基吡啶胺与0.813g多聚甲醛溶解于48mL37.5％异丙醇溶液中，用HCl调pH＝8.0，80℃反应30min；
b)加入2g N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸，110℃反应13h，得到保护的前体分子(Boc-dpa)。以氯仿：三乙胺：甲醇＝30：1：0.1为流动相，200目二氧化硅为固定相纯化产物，产物分子量[M+H]＝718Da，[M+Na]＝740Da(见图2(a))。核磁数据(1H-NMR,400MHz,CDCl3)：δ8.53(4H,d,J＝6Hz),7.62(4H,td,J＝7.5Hz),7.47(4H,d,J＝9Hz),7.13(4H,td,J＝6Hz),6.99(2H,s),5.23(1H,d,J＝6Hz),4.49-4.51(1H,m),3.85(8H,s),3.76(4H,s),3.59-3.61(3H,s),2.99(2H,s),1.35(9H,s)。
c)向Boc-dpa的二氯甲烷溶液中滴加12.8mL TFA，室温反应2h得到dpa；
d)dpa与戊二酸酐等摩尔比反应过夜，得到GAPT，产物分子量[M+H]＝732Da，[M+Na]＝754Da(见图2(b))。核磁数据(1H-NMR,400MHz,CDCl3)：δ8.53(4H,d,J＝6Hz),7.61(4H,td,J＝7.5Hz),7.46(4H,d,J＝9Hz),7.13(4H,td,J＝6Hz),7.03(2H,s),3.86(8H,s),3.79(4H,s),3.70-3.65(4H,m),3.01-2.96(1H,m),2.80-2.75(1H,m)。
3.将亚二微米核壳硅胶分散于二甲基甲酰胺中，加入过量GAPT，室温搅拌反应24-48h；将产物烘干后分散于50％甲醇溶液中，滴加20mL与GAPT等摩尔的ZnNO3·6H2O溶液，室温搅拌反应24h得到磷酸识别功能硅胶材料。
4.磷酸识别功能硅胶材料能够在中性缓冲体系下对N-磷酸化蛋白质(N-磷酸化肌红蛋白)进行特异性富集：
a)将10μg N-磷酸化肌红蛋白与10μg/100μg/1000μg牛血清白蛋白溶解于200μL上样缓冲溶液(50mM羟乙基呱嗪乙硫磺酸缓冲溶液，pH 7.7)中，加入20μg磷酸识别功能硅胶材料，室温孵育1h；
b)用200μL上样缓冲溶液洗去材料非特异性吸附蛋白，3次；
c)用20μL 100mM焦磷酸盐的羟乙基呱嗪乙硫磺酸缓冲溶液(pH7.7)进行两次洗脱(E1与E2)，用SDS-PAGE进行结果分析，结果见图5，说明该材料的抗干扰能力较强，可以在一百倍蛋白干扰下对N-磷酸化蛋白质进行特异性富集。
实施例2
1.制备具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶：
a)将水解液(6.7mL氨水，5.1mL水和70mL无水乙醇)和4mL正硅酸乙酯混合，22℃水浴搅拌40min，升温至55℃；
b)加入0.64mL水和4mL正硅酸乙酯，55℃反应40min；
c)重复4次步骤(2)得到Sead1；
d)将Sead1的溶液置换为等量新配水解液，重复10次步骤(2)得到Sead2。
e)将Sead2分散于100mL水中，加入1g十六烷基三甲基溴化铵、5.8mL十三烷、0.1-100mg氟化铵和0.1-10mL氨水，90℃反应24h，得到NPs；
f)将烘干的NPs于550℃烧结6h形成核壳微球初始壳层。
g)将NPs分散于30mL 5N HCl溶液中，120℃反应回流12h。
2.合成一种磷酸识别功能分子：
a)3.37g N,N′-二甲基吡啶胺与0.813g多聚甲醛溶解于48mL 37.5％异丙醇溶液中，用HCl调pH＝8.0，80℃反应30min；
b)加入2g N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸，110℃反应13h，得到保护的前体分子(Boc-dpa)。以氯仿：三乙胺：甲醇＝30：1：0.1为流动相，200目二氧化硅为固定相纯化产物，产物分子量[M+H]＝718Da，[M+Na]＝740Da(见图2(a))。核磁数据(1H-NMR,400MHz,CDCl3)：δ8.53(4H,d,J＝6Hz),7.62(4H,td,J＝7.5Hz),7.47(4H,d,J＝9Hz),7.13(4H,td,J＝6Hz),6.99(2H,s),5.23(1H,d,J＝6Hz),4.49-4.51(1H,m),3.85(8H,s),3.76(4H,s),3.59-3.61(3H,s),2.99(2H,s),1.35(9H,s)。
c)向Boc-dpa的二氯甲烷溶液中滴加12.8mL TFA，室温反应2h得到dpa；
d)dpa与戊二酸酐等摩尔比反应过夜，得到GAPT，产物分子量[M+H]＝732Da，[M+Na]＝754Da(见图2(b))。核磁数据(1H-NMR,400MHz,CDCl3)：δ8.53(4H,d,J＝6Hz),7.61(4H,td,J＝7.5Hz),7.46(4H,d,J＝9Hz),7.13(4H,td,J＝6Hz),7.03(2H,s),3.86(8H,s),3.79(4H,s),3.70-3.65(4H,m),3.01-2.96(1H,m),2.80-2.75(1H,m)。
e)将GAPT分散于50％甲醇溶液中，滴加20mL与GAPT等摩尔的CuCl2溶液，室温搅拌反应24h。
3.磷酸识别功能分子(GAPT-Cu)与具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶通过共价结合得到磷酸识别功能硅胶材料：将亚二微米核壳硅胶分散于二甲基甲酰胺中，加入过量GAPT-Cu，室温搅拌反应24-48h；
4.磷酸识别功能硅胶材料能够在中性缓冲体系下对N-磷酸化肽段(TGIF(Pho)KSAR)进行特异性富集：
a)将10μg N-磷酸化肽段与10μg/100μg/1000μg牛血清白蛋白酶解产物溶解于200μL上样缓冲溶液(50mM羟乙基呱嗪乙硫磺酸缓冲溶液，pH7.7)中，加入50μg磷酸识别功能硅胶材料，室温孵育1h；
b)用200μL上样缓冲溶液洗去材料非特异性吸附肽段，3次；
c)用20μL 100mM焦磷酸盐的羟乙基呱嗪乙硫磺酸缓冲溶液(pH7.7)进行洗脱，用MALDI进行结果分析，说明该材料的抗干扰能力较强，可以在一百倍肽段干扰下对N-磷酸化肽段进行特异性富集。
实施例3
1.制备具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶：
a)将水解液(6.7mL氨水，5.1mL水和70mL无水乙醇)和4mL正硅酸乙酯混合，22℃水浴搅拌40min，升温至55℃；
b)加入0.64mL水和4mL正硅酸乙酯，55℃反应40min；
c)重复4次步骤(2)得到Sead1；
d)将Sead1的溶液置换为等量新配水解液，重复10次步骤(2)得到Sead2。
e)将Sead2分散于100mL水中，加入1g十六烷基三甲基溴化铵、5.8mL十三烷、0.1-100mg氟化铵和0.1-10mL氨水，90℃反应24h，得到NPs；
f)将烘干的NPs于550℃烧结6h形成核壳微球初始壳层。
g)将NPs分散于30mL 5N HCl溶液中，120℃反应回流12h。
2.合成一种磷酸识别功能分子：
a)3.37g N,N′-二甲基吡啶胺与0.813g多聚甲醛溶解于48mL 37.5％异丙醇溶液中，用HCl调pH＝8.0，80℃反应30min；
b)加入2g N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸，110℃反应13h，得到保护的前体分子(Boc-dpa)。以氯仿：三乙胺：甲醇＝30：1：0.1为流动相，200目二氧化硅为固定相纯化产物，产物分子量[M+H]＝718Da，[M+Na]＝740Da(见图2(a))。核磁数据(1H-NMR,400MHz,CDCl3)：δ8.53(4H,d,J＝6Hz),7.62(4H,td,J＝7.5Hz),7.47(4H,d,J＝9Hz),7.13(4H,td,J＝6Hz),6.99(2H,s),5.23(1H,d,J＝6Hz),4.49-4.51(1H,m),3.85(8H,s),3.76(4H,s),3.59-3.61(3H,s),2.99(2H,s),1.35(9H,s)。
c)向Boc-dpa的二氯甲烷溶液中滴加12.8mL TFA，室温反应2h得到dpa；
d)dpa与戊二酸酐等摩尔比反应过夜，得到GAPT，产物分子量[M+H]＝732Da，[M+Na]＝754Da(见图2(b))。核磁数据(1H-NMR,400MHz,CDCl3)：δ8.53(4H,d,J＝6Hz),7.61(4H,td,J＝7.5Hz),7.46(4H,d,J＝9Hz),7.13(4H,td,J＝6Hz),7.03(2H,s),3.86(8H,s),3.79(4H,s),3.70-3.65(4H,m),3.01-2.96(1H,m),2.80-2.75(1H,m)。
3.将亚二微米核壳硅胶分散于二甲基甲酰胺中，加入过量GAPT，室温搅拌反应24-48h；将产物烘干后分散于50％甲醇溶液中，滴加20mL与GAPT等摩尔的ZnCl2溶液，室温搅拌反应24h得到磷酸识别功能硅胶材料。
4.磷酸识别功能硅胶材料能够在中性缓冲体系下对N-磷酸化蛋白(N-磷酸化肌红蛋白)和O-磷酸化蛋白(β-酪蛋白)同时进行富集：
a)将10μg N-磷酸化肌红蛋白、10μgβ-酪蛋白与10μg/100μg/1000μg牛血清白蛋白酶解产物溶解于200μL上样缓冲溶液(50mM羟乙基呱嗪乙硫磺酸缓冲溶液，pH 7.7)中，加入50μg磷酸识别功能硅胶材料，室温孵育1h；
b)用200μL上样缓冲溶液洗去材料非特异性吸附肽段，3次；
c)用20μL 100mM焦磷酸盐的羟乙基呱嗪乙硫磺酸缓冲溶液(pH7.7)进行洗脱，用SDS-PAGE进行结果分析，说明该材料的抗干扰能力较强，可以在一百倍蛋白干扰下对N-磷酸化蛋白质进行特异性富集。
实施例4
1.制备具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶：
a)将水解液(6.7mL氨水，5.1mL水和70mL无水乙醇)和4mL正硅酸乙酯混合，22℃水浴搅拌40min，升温至55℃；
b)加入0.64mL水和4mL正硅酸乙酯，55℃反应40min；
c)重复5次步骤(2)得到Sead1；
d)将Sead1的溶液置换为等量新配水解液，重复8次步骤(2)得到Sead2。
e)将Sead2分散于100mL水中，加入1g十六烷基三甲基溴化铵、5.8mL十三烷、0.1-100mg氟化铵和0.1-10mL氨水，90℃反应24h，得到NPs；
f)将烘干的NPs于550℃烧结6h形成核壳微球初始壳层。
g)将NPs分散于30mL 5N HCl溶液中，120℃反应回流12h。
2.合成一种磷酸识别功能分子：
a)3.37g N,N′-二甲基吡啶胺与0.813g多聚甲醛溶解于48mL 37.5％异丙醇溶液中，用HCl调pH＝8.0，80℃反应30min；
b)加入2g N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸，110℃反应13h，得到保护的前体分子(Boc-dpa)。以氯仿：三乙胺：甲醇＝30：1∶0.1为流动相，200目二氧化硅为固定相纯化产物，产物分子量[M+H]＝718Da，[M+Na]＝740Da(见图2(a))。核磁数据(1H-NMR,400MHz,CDCl3)：δ8.53(4H,d,J＝6Hz),7.62(4H,td,J＝7.5Hz),7.47(4H,d,J＝9Hz),7.13(4H,td,J＝6Hz),6.99(2H,s),5.23(1H,d,J＝6Hz),4.49-4.51(1H,m),3.85(8H,s),3.76(4H,s),3.59-3.61(3H,s),2.99(2H,s),1.35(9H,s)。
c)向Boc-dpa的二氯甲烷溶液中滴加12.8mL TFA，室温反应2h得到dpa；
d)dpa与戊二酸酐等摩尔比反应过夜，得到GAPT，产物分子量[M+H]＝732Da，[M+Na]＝754Da(见图2(b))。核磁数据(1H-NMR,400MHz,CDCl3)：δ8.53(4H,d,J＝6Hz),7.61(4H,td,J＝7.5Hz),7.46(4H,d,J＝9Hz),7.13(4H,td,J＝6Hz),7.03(2H,s),3.86(8H,s),3.79(4H,s),3.70-3.65(4H,m),3.01-2.96(1H,m),2.80-2.75(1H,m)。
e)将GAPT分散于50％甲醇溶液中，滴加50mL与GAPT等摩尔的CuNO3溶液，室温搅拌反应48h。
3.磷酸识别功能分子(GAPT-Cu)与具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶通过共价结合得到磷酸识别功能硅胶材料：将亚二微米核壳硅胶分散于二甲基甲酰胺中，加入过量GAPT-Cu，室温搅拌反应48h；
4.磷酸识别功能硅胶材料能够在中性缓冲体系下对N-磷酸化进行特异性富集：
a)将20μg N-磷酸化蛋白(N-磷酸化肌红蛋白)与20μg/200μg/2000μg牛血清白蛋白溶解于400μL上样缓冲溶液(20mM醋酸铵缓冲溶液，pH7.0)中，加入100μg磷酸识别功能硅胶材料，室温孵育0.5h；
b)用400μL上样缓冲溶液洗去材料非特异性吸附肽段，4次；
c)用20μL 100mM焦磷酸盐的醋酸铵缓冲溶液(pH 7.7)进行洗脱，用SDS-PAGE进行结果分析，说明该材料的抗干扰能力较强，可以在一百倍肽段干扰下对N-磷酸化蛋白质进行特异性富集。
实施例5
1.制备具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶：
a)将水解液(6.7mL氨水，5.1mL水和70mL无水乙醇)和4mL正硅酸乙酯混合，22℃水浴搅拌40min，升温至55℃；
b)加入0.64mL水和4mL正硅酸乙酯，55℃反应40min；
c)重复4次步骤(2)得到Sead1；
d)将Sead1的溶液置换为等量新配水解液，重复10次步骤(2)得到Sead2。
e)将Sead2分散于100mL水中，加入1g十六烷基三甲基溴化铵、5.8mL十三烷、0.1-100mg氟化铵和0.1-10mL氨水，90℃反应24h，得到NPs；
f)将烘干的NPs于550℃烧结6h形成核壳微球初始壳层。
g)将NPs分散于30mL 5N HCl溶液中，120℃反应回流12h。
2.合成一种磷酸识别功能分子：
a)3.37g N,N′-二甲基吡啶胺与0.813g多聚甲醛溶解于48mL 37.5％异丙醇溶液中，用HCl调pH＝8.0，80℃反应30min；
b)加入2g N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸，110℃反应13h，得到保护的前体分子(Boc-dpa)。以氯仿：三乙胺：甲醇＝30：1：0.1为流动相，200目二氧化硅为固定相纯化产物，产物分子量[M+H]＝718Da，[M+Na]＝740Da(见图2(a))。核磁数据(1H-NMR,400MHz,CDCl3)：δ8.53(4H,d,J＝6Hz),7.62(4H,td,J＝7.5Hz),7.47(4H,d,J＝9Hz),7.13(4H,td,J＝6Hz),6.99(2H,s),5.23(1H,d,J＝6Hz),4.49-4.51(1H,m),3.85(8H,s),3.76(4H,s),3.59-3.61(3H,s),2.99(2H,s),1.35(9H,s)。
c)向Boc-dpa的二氯甲烷溶液中滴加12.8mL TFA，室温反应2h得到dpa；
d)dpa与戊二酸酐等摩尔比反应过夜，得到GAPT，产物分子量[M+H]＝732Da，[M+Na]＝754Da(见图2(b))。核磁数据(1H-NMR,400MHz,CDCl3)：δ8.53(4H,d,J＝6Hz),7.61(4H,td,J＝7.5Hz),7.46(4H,d,J＝9Hz),7.13(4H,td,J＝6Hz),7.03(2H,s),3.86(8H,s),3.79(4H,s),3.70-3.65(4H,m),3.01-2.96(1H,m),2.80-2.75(1H,m)。
e)将GAPT分散于50％甲醇溶液中，滴加20mL与GAPT等摩尔的CoCl2溶液，室温搅拌反应24h。
3.磷酸识别功能分子(GAPT-Co)与具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶通过共价结合得到磷酸识别功能硅胶材料：将亚二微米核壳硅胶分散于二甲基甲酰胺中，加入过量GAPT-Co，室温搅拌反应24h；
4.磷酸识别功能硅胶材料能够在中性缓冲体系下对N-磷酸化肽段(TS(Pho)HYSIMAR)进行特异性富集：
a)将10μg N-磷酸化肽段与10μg/100μg/1000μg牛血清白蛋白酶解产物溶解于200μL上样缓冲溶液(50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液，pH7.2)中，加入50μg磷酸识别功能硅胶材料，室温孵育1h；
b)用200μL上样缓冲溶液洗去材料非特异性吸附肽段，3次；
c)用20μL 100mM焦磷酸盐的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(pH7.2)进行洗脱，用MALDI进行结果分析，说明该材料的抗干扰能力较强，可以在一百倍肽段干扰下对N-磷酸化肽段进行特异性富集。
实施例6
1.制备具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶：
a)将水解液(6.7mL氨水，5.1mL水和70mL无水乙醇)和4mL正硅酸乙酯混合，22℃水浴搅拌40min，升温至55℃；
b)加入0.64mL水和4mL正硅酸乙酯，55℃反应40min；
c)重复4次步骤(2)得到Sead1；
d)将Sead1的溶液置换为等量新配水解液，重复10次步骤(2)得到Sead2。
e)将Sead2分散于100mL水中，加入1g十六烷基三甲基溴化铵、5.8mL十三烷、0.1-100mg氟化铵和0.1-10mL氨水，90℃反应24h，得到NPs；
f)将烘干的NPs于550℃烧结6h形成核壳微球初始壳层。
g)将NPs分散于30mL 5N HCl溶液中，120℃反应回流12h。
2.合成一种磷酸识别功能分子：
a)3.37g N,N′-二甲基吡啶胺与0.813g多聚甲醛溶解于48mL 37.5％异丙醇溶液中，用HCl调pH＝8.0，80℃反应30min；
b)加入2g N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸，110℃反应13h，得到保护的前体分子(Boc-dpa)。以氯仿：三乙胺：甲醇＝30：1：0.1为流动相，200目二氧化硅为固定相纯化产物，产物分子量[M+H]＝718Da，[M+Na]＝740Da(见图2(a))。核磁数据(1H-NMR,400MHz,CDCl3)：δ8.53(4H,d,J＝6Hz),7.62(4H,td,J＝7.5Hz),7.47(4H,d,J＝9Hz),7.13(4H,td,J＝6Hz),6.99(2H,s),5.23(1H,d,J＝6Hz),4.49-4.51(1H,m),3.85(8H,s),3.76(4H,s),3.59-3.61(3H,s),2.99(2H,s),1.35(9H,s)。
c)向Boc-dpa的二氯甲烷溶液中滴加12.8mL TFA，室温反应2h得到dpa；
d)dpa与戊二酸酐等摩尔比反应过夜，得到GAPT，产物分子量[M+H]＝732Da，[M+Na]＝754Da(见图2(b))。核磁数据(1H-NMR,400MHz,CDCl3)：δ8.53(4H,d,J＝6Hz),7.61(4H,td,J＝7.5Hz),7.46(4H,d,J＝9Hz),7.13(4H,td,J＝6Hz),7.03(2H,s),3.86(8H,s),3.79(4H,s),3.70-3.65(4H,m),3.01-2.96(1H,m),2.80-2.75(1H,m)。
e)将GAPT分散于50％甲醇溶液中，滴加20mL与GAPT等摩尔的ZnNO3·6H2O溶液，室温搅拌反应24h。
3.磷酸识别功能分子(GAPT-Zn)与具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶通过共价结合得到磷酸识别功能硅胶材料：将亚二微米核壳硅胶分散于二甲基甲酰胺中，加入过量GAPT-Zn，室温搅拌反应24h；
4.磷酸识别功能硅胶材料能够在中性缓冲体系下对E.coli酶解产物中的磷酸化肽段进行特异性富集：
a)将1000μg E.coli酶解产物溶解于2000μL上样缓冲溶液(50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液，pH 7.2)中，加入500μg磷酸识别功能硅胶材料，室温孵育1h；
b)用2000μL上样缓冲溶液洗去材料非特异性吸附肽段，3次；
c)用100μL 100mM焦磷酸盐的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(pH7.2)进行洗脱，用ESI-MS进行数据采集，用pFind进行搜库分析，说明该材料的抗干扰能力较强，可以对复杂样品中的N-磷酸化肽段和O-磷酸化肽段同时进行特异性富集。
实施例7
1.制备具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶：
a)将水解液(6.7mL氨水，5.1mL水和70mL无水乙醇)和4mL正硅酸乙酯混合，22℃水浴搅拌40min，升温至55℃；
b)加入0.64mL水和4mL正硅酸乙酯，55℃反应40min；
c)重复4次步骤(2)得到Sead1；
d)将Sead1的溶液置换为等量新配水解液，重复10次步骤(2)得到Sead2。
e)将Sead2分散于100mL水中，加入1g十六烷基三甲基氯化铵、5.8mL十三烷、0.1-100mg氟化铵和0.1-10mL氨水，90℃反应24h，得到NPs；
f)将烘干的NPs于550℃烧结6h形成核壳微球初始壳层。
g)将NPs分散于30mL 5N HCl溶液中，120℃反应回流12h。
2.合成一种磷酸识别功能分子：
a)3.37g N,N′-二甲基吡啶胺与0.813g多聚甲醛溶解于48mL 37.5％异丙醇溶液中，用HCl调pH＝8.0，80℃反应30min；
b)加入2g N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸，110℃反应13h，得到保护的前体分子(Boc-dpa)。以氯仿：三乙胺：甲醇＝30：1：0.1为流动相，200目二氧化硅为固定相纯化产物，产物分子量[M+H]＝718Da，[M+Na]＝740Da(见图2(a))。核磁数据(1H-NMR,400MHz,CDCl3)：δ8.53(4H,d,J＝6Hz),7.62(4H,td,J＝7.5Hz),7.47(4H,d,J＝9Hz),7.13(4H,td,J＝6Hz),6.99(2H,s),5.23(1H,d,J＝6Hz),4.49-4.51(1H,m),3.85(8H,s),3.76(4H,s),3.59-3.61(3H,s),2.99(2H,s),1.35(9H,s)。
c)向Boc-dpa的二氯甲烷溶液中滴加12.8mL TFA，室温反应2h得到dpa；
d)dpa与戊二酸酐等摩尔比反应过夜，得到GAPT，产物分子量[M+H]＝732Da，[M+Na]＝754Da(见图2(b))。核磁数据(1H-NMR,400MHz,CDCl3)：δ8.53(4H,d,J＝6Hz),7.61(4H,td,J＝7.5Hz),7.46(4H,d,J＝9Hz),7.13(4H,td,J＝6Hz),7.03(2H,s),3.86(8H,s),3.79(4H,s),3.70-3.65(4H,m),3.01-2.96(1H,m),2.80-2.75(1H,m)。
3.将亚二微米核壳硅胶分散于二甲基甲酰胺中，加入过量GAPT，室温搅拌反应24-48h；将产物烘干后分散于50％甲醇溶液中，滴加20mL与GAPT等摩尔的ZnNO3·6H2O溶液，室温搅拌反应24h得到磷酸识别功能硅胶材料。
4.磷酸识别功能硅胶材料能够在中性缓冲体系下对E.coli裂解液中的磷酸化蛋白质进行特异性富集：
a)将1000μg E.coli裂解液蛋白溶解于2000μL上样缓冲溶液(50mM羟乙基呱嗪乙硫磺酸缓冲溶液，pH 7.7)中，加入20μg磷酸识别功能硅胶材料，室温孵育1h；
b)用200μL上样缓冲溶液洗去材料非特异性吸附蛋白，3次；
c)用50μL 100mM焦磷酸盐的羟乙基呱嗪乙硫磺酸缓冲溶液(pH7.7)进行两次洗脱(E1与E2)；
d)洗脱的蛋白质用FASP膜进行变性、还原、烷基化和酶解，最后用ESI-MS进行数据采集，用pFind进行搜库分析，说明该材料的抗干扰能力较强，可以对复杂样品中的N-磷酸化蛋白和O-磷酸化蛋白同时进行特异性富集。

Claims (6)

1.一种N-磷酸化肽段和蛋白质富集材料的制备方法，其特征在于：采用种子生长法制备无孔硅胶微球，通过模板引导溶解和再沉积的方法形成核壳微球初始壳层，最后经过酸回流得到具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶；
通过N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸与N,N´-二甲基吡啶胺反应形成支撑分子，在其上络合金属离子形成磷酸识别功能分子；
最后将磷酸识别功能分子与具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶通过酰胺键共价结合得到磷酸识别功能硅胶材料；
所述采用种子生长法制备无孔硅胶微球的过程：
（1）将水解液和0.1-10mL正硅酸乙酯混合；
水解液由0.1-10mL氨水、0.1-10mL水和0.1-100mL无水乙醇混合而成；
（2）向步骤（1）所得溶液中加入0.1-1mL水和1-10mL正硅酸乙酯，25-100℃反应1-60min，并重复此加入和反应过程2-20次，分离收集固体，得到Sead1；
（3）将0.001-100g Sead1加入0.01-100mL新配水解液中，然后加入0.1-1mL水和1-10mL正硅酸乙酯，25-100℃反应1-60min，并重复此加入和反应过程2-20次，分离收集固体，得到Sead2；水解液由0.1-10mL氨水、0.1-10mL水和0.1-100mL无水乙醇混合而成；
所述通过模板引导溶解和再沉积的方法形成核壳微球初始壳层的过程为：
（1）将0.001-100g Sead2分散于0.01-100mL水中，加入1-10 g十六烷基三甲基氯化铵或者十六烷基三甲基溴化铵、0.1-10mL十三烷、0.1-100mg氟化铵和0.1-10mL氨水，80-95℃反应0.1-100h，得到NPs；
（2）将烘干的NPs于100-1000℃烧结0.1-24h形成核壳微球初始壳层；
所述的经过酸回流得到具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶过程为：将0.001-100g烧结后NPs分散于10-30mL 1-10N的 HCl、H2SO4、HNO3、H3PO4、HF中的一种或两种以上酸溶液中，100-200℃反应10-24h；
所述通过N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸与N,N´-二甲基吡啶胺反应形成支撑分子，在其上络合金属离子形成磷酸识别功能分子的过程为：
通过N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸与N,N´-二甲基吡啶胺在多聚甲醛的存在下反应生成保护的前体分子Boc-dpa，Boc-dpa去保护后与戊二酸酐反应生成支撑分子GAPT，GAPT与金属离子络合生成磷酸识别功能分子GAPT-M；
所述磷酸识别功能分子GAPT-M与具有垂直孔道的亚二微米核壳硅胶通过共价结合得到磷酸识别功能硅胶材料的过程为：
将亚二微米核壳硅胶分散于二甲基甲酰胺中，加入GAPT-M，室温搅拌反应24-48h；亚二微米核壳硅胶于二甲基甲酰胺中的浓度为0.001-100g/mL，亚二微米核壳硅胶与GAPT-M的质量比为0.001-100;
GAPT-M的羧基与亚二微米核壳硅胶上的氨基通过缩合反应形成酰胺键，以此将GAPT-M共价结合于亚二微米核壳硅胶上。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述Boc-dpa的制备过程：
（1）0.001-100g N,N´-二甲基吡啶胺与0.001-100g多聚甲醛溶解于30-37.5%异丙醇溶液中，用HCl调pH=8.0-9，50-90℃反应10-60min；
（2）向步骤（1）所得溶液中加入0.001-100g N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸，100-120℃反应6-24h，得到保护的前体分子Boc-dpa；
（3）后处理：将异丙醇蒸干，冷却至室温后收集下层油状物，分散于10-100 mL乙酸乙酯中，分别用饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液清洗，用硫酸钠干燥过夜；以体积比为氯仿：三乙胺：甲醇=20-50：0.8-1.2：0.1-0.5溶液为流动相，100-300目二氧化硅为固定相纯化产物；
所述的Boc-dpa去保护后与戊二酸酐反应生成支撑分子GAPT的过程：
（1）向0.001-100g Boc-dpa的二氯甲烷溶液中滴加8-15mL TFA，室温反应1-12h得到dpa溶液；
（2）向dpa溶液中加入戊二酸酐，dpa与戊二酸酐等摩尔比反应12-24h，得到GAPT；
所述的GAPT与金属离子络合生成磷酸识别功能分子GAPT-M的过程为：将0.001-100gGAPT分散于体积浓度为30-50% 甲醇溶液中，滴加金属离子溶液，室温搅拌反应12-24h。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述金属离子溶液中金属离子为：钾、钙、钠、镁、铝、钪、钛、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、镓、锗、铷、锶、钇、锆、铌、铑、钯、银、镉、铟、锡、锑、铂、金中的一种或两种以上，金属离子溶液中金属离子摩尔浓度为0.001-10M；GAPT与金属离子摩尔比为0.001-100。
4.一种权利要求1-3任一所述方法制备获得的N-磷酸化肽段和蛋白质富集材料。
5.一种权利要求4所述N-磷酸化肽段和蛋白质富集材料应用于pH=6.5-8.0中性条件下蛋白质组学、代谢组学、生命研究中N-磷酸化肽段和/或蛋白的富集和/或检测过程中。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：N-磷酸化肽段和/或蛋白质的富集是基于硅胶基质双锌材料中的锌离子对磷酸化修饰中的氧原子的配位作用实现的；富集时加入中性缓冲溶液保证体系pH为6.5-8.0；非特异性吸附的去除是在有机相、盐溶液和pH=9-12碱性条件下实现的；磷酸化肽段或蛋白的洗脱是基于竞争结合或通过破坏相互作用实现的。
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