CN114345308A - 一种外泌体富集磁珠材料的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于外泌体富集领域，公开了一种基于两亲性超分子磁性微球的外泌体富集方法，该方法基于四氧化三铁磁性微球进行修饰，在其表面包硅后修饰两亲性树枝状超分子复合物来捕获外泌体，利用磁性微球的磁响应性以及超分子对外泌体脂质膜的多价协同作用提升了外泌体的捕获效率，磁性微球富集到的外泌体裂解之后检测其内容物。其特征在于磁性微球表面修饰两亲性分子以及树枝状聚合物，其中两亲性分子与树枝状聚合物协同作用于外泌体的脂质膜；所述微球内核为磁性四氧化三铁纳米粒子，能够在外加磁场的作用下迅速分离富集外泌体。这种基于两亲性超分子修饰磁性微球的外泌体富集方法具有特异性强、简易高效、安全环保、可重复性高等优点。
Description
技术领域
本发明属于外泌体富集领域，尤其涉及一种外泌体富集磁珠材料的制备方法与应用。
背景技术
外泌体(Exosome)是具有脂质双分子层膜结构的一种细胞外囊泡，直径范围为40～160nm。外泌体广泛存在于体液中并且运载着来自于不同细胞的蛋白质、DNA、RNA、脂质、小分子代谢物和表面蛋白等，这些内容物可以反映来源细胞的特征。在哺乳动物的繁殖与发育、免疫系统的调节与感染、代谢和心血管病、神经退行性疾病以及各种癌症的发展中起到重要作用，由于在病理状态下外泌体内含物的表达与正常状态具有差异，这使外泌体可以用作疾病诊断的标志物，建立对外泌体具有高选择性的分离策略具有很大的意义。
相对于目前对于肿瘤类疾病常用的组织病理切片检查而言，基于血液，尿液，唾液等常见体液的液体活检方式不仅患者的接受度更高，而且更加易于收集和进行病情监测，外泌体也有可能被用作治疗包括癌症在内的疾病的药物输送囊泡。基于外泌体的液体活检突出了其在诊断和确定患有癌症及其他疾病的患者的预后中的潜在效用，疾病进展和对治疗的反应也可以通过外泌体的多组分分析来确定。除其治疗潜力外，外泌体还具有帮助缓解疾病的潜力。综上所述，作为一种热门的疾病标志物，外泌体在疾病“液体活检”方面具有十分广阔的前景。
目前比较认可的外泌体分离技术包括超高速离心(UC)、尺寸排阻色谱法、聚合物沉淀法以及以免疫亲和沉淀为基础的分离方法和以人工抗体如Aptamer为出发点的技术。超速离心(UC)被认为外泌体分离的“金标准”，但是超高速的离心力不仅会造成外泌体的损失而且整个分离过程非常耗时，通量低而且需要昂贵的设备。其他的一些已经商业化的技术如：聚合物诱导沉淀、基于抗体的外膜蛋白亲和捕获、亲和过滤、尺寸排阻色谱等方法都有其自身的局限性。例如，基于聚合物的沉淀，通常导致低特异性和大量高丰度污染的非EV蛋白质被提取。基于亲和力的外泌体捕获方法确实提供了更好的特异性，但体积较小，导致总体回收率非常低，并且可能受到肿瘤异质性和靶抗原随时间变化的显著限制。
发明内容
本发明通过两亲性超分子对外泌体磷脂双层之间的多价协同作用力提供一种快速、高效的外泌体富集材料，旨在解决限制外泌体基础研究和应用研究的一个技术难点——简化外泌体的提取并提高外泌体的产量。
本发明实施例是这样实现的：
dendrimer-AMB修饰磁珠的制备包括如下步骤：
1)40mL的乙二醇作为反应溶剂，加入7.2g的无水乙酸钠，1g聚乙二醇和1.35g六水合氯化铁40℃反应30min，转移至高压釜中200℃反应16h，反应完成后，将得到的黑色沉淀物先用乙醇洗三次，再水洗三次，并在60℃的环境中干燥过夜；
2)Fe3O4@SiO2分散于300mL浓度为80％乙醇中，超声30min分散材料，加入1.5mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，70℃反应20h，反应完成后将得到的黑色沉淀用乙醇洗涤三次后，60℃真空干燥；
3)500mg的Fe3O4@SiO2-NH2分散在300mL反应溶液中，其反应溶液的配比为乙酸：甲醇＝1:125，加入0.5mL戊二醛和20mg氰基硼氢化钠，在40℃反应10h，所得黑色沉淀用反应缓冲液进行洗涤；
4)将材料磁分离收集并直接分散于300mL反应缓冲液中，向溶液中加入20μL树枝状聚合物和20mg氰基硼氢化钠，40℃反应10h，沉淀物先用反应缓冲液洗涤三次，再甲醇溶液洗涤三次，并在60℃的环境中干燥过夜；
5)2mg的AMB分子溶解于30μL的二甲基亚砜中，80mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和48mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于20mL MES缓冲液中；
6)混合步骤4)和步骤5)中所得到的溶液，37℃活化20min，将活化好的AMB与10mg的Fe3O4@SiO2-NH2-Dendrimer混合，室温反应过夜，反应完成之后先使用MES缓冲液洗涤三次，再水洗2次后，在60℃的环境中干燥。
本发明实施例提供的一种外泌体富集磁珠材料的制备方法与应用，具有以下有益效果：
将两亲性超分子探针将其修饰到磁珠上用于外泌体的富集快速富集，作用核心在于两性霉素B分子通过与细胞膜内的固醇分子发生结合，当两性霉素分子与固醇分子在同一平面的平行方向时会发生三种相互作用力，分别是范德华力、氢键网络和π-π相互作用，这三种作用力使得两性霉素B分子能够以垂直的构象插入到单层膜内部与与脂质膜结合，利用树枝状聚合物将两性霉素B分子的作用位点增强，并且游离的大量氨基可为外泌体磷脂膜提供静电作用力，在这几种相互作用的多价协同下实现了对外泌体的高效捕获。这种新的策略可以和磁珠材料结合实现在体外对微量体液中的外泌体进行快速分离和富集。所发展的dendrimer-AMB修饰磁珠的富集外泌体手段操作简便、灵敏度高、分析速度快，有望成为外泌体高通量富集的新平台，为疾病的预警和追踪提供有力的技术支持。
附图说明
图1为本发明实施例提供的dendrimer-AMB磁性材料分别对常见体液的吸附检测图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
实施例1：
dendrimer-AMB复合物修饰磁珠：
1)40mL的乙二醇作为反应溶剂，加入7.2g的无水乙酸钠，1g聚乙二醇(PEG10000)和1.35g六水合氯化铁40℃反应30min，转移至高压釜中200℃反应16h。反应完成后，将得到的黑色沉淀用乙醇洗三次，水洗三次，并在60℃的环境中干燥过夜；
2)Fe3O4@SiO2分散于300mL 80％乙醇中，超声30min分散材料。加入1.5mL APTES，70℃反应20h。反应完成后将得到的黑色沉淀用乙醇洗涤三次后，60℃真空干燥；
3)500mg的Fe3O4@SiO2-NH2分散在300mL反应溶液(乙酸：甲醇＝1:125)中，加入0.5mL戊二醛和20mg氰基硼氢化钠(NaBH3CN)。在40℃反应10h，所得黑色沉淀用反应缓冲液进行洗涤；
4)将材料磁分离收集并直接分散于300mL反应缓冲液中。向溶液中加入20μL的Dendrimer和20mg的NaBH3CN，40℃反应10h。沉淀用反应缓冲液洗涤三次，甲醇溶液洗涤三次，60℃干燥过夜。
5)2mg的AMB分子，溶解于30μL二甲基亚砜中，80mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和48mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于20mL的MES缓冲液中；
6)混合步骤4)和步骤5)中所得到的溶液，37℃活化20min，将活化好的AMB溶液与10mg的Fe3O4@SiO2-NH2-Dendrimer混合，室温反应过夜，反应完成之后先使用MES缓冲液洗涤三次，再水洗2次后，在60℃的环境中干燥。
实施例2：
dendrimer-AMB复合物修饰磁珠对血浆中外泌体的富集与检测：
1)血浆样本在与dendrimer-AMB复合物修饰磁珠孵育前，先于4℃将样本融化。5000g离心10min后取上清。
2)dendrimer-AMB复合物修饰磁珠使用磷酸盐缓冲液润洗，将磁珠分散于PBS缓冲液后，磁吸附弃掉上清。
3)血浆样本用磷酸盐缓冲液100倍稀释，取1mL稀释后的血浆与5mg的dendrimer-AMB复合物修饰磁珠在4℃孵育30min。
4)磁吸附后弃掉上清，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5分钟，弃去上清液。
5)加入24μL的RIPA在0℃下原位裂解，裂解时间为10min。然后加入8μL的4×loading缓冲液，在100℃下煮沸10min。
6)对样本进行Westernblot检测，一抗选用抗外泌体标志蛋白抗，HRP连接的对应的二抗进行信号放大，用Tanon 5200化学发光图像分析系统检测。
实施例3：
dendrimer-AMB复合物修饰磁珠对尿液中外泌体的富集与检测：
1)尿液样本在与dendrimer-AMB复合物修饰磁珠孵育前，先于4℃将样本融化。5000g离心10min后取上清。
2)dendrimer-AMB复合物修饰磁珠使用磷酸盐缓冲液润洗，将磁珠分散于PBS缓冲液后，磁吸附弃掉上清。
3)取1mL尿液样本与5mg的dendrimer-AMB复合物修饰磁珠在4℃孵育30min。
4)磁吸附后弃掉上清，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5分钟，弃去上清液。
5)加入24μL的RIPA在0℃下原位裂解，裂解时间为10min。然后加入8μL的4×loading缓冲液，在100℃下煮沸10min。
6)对样本进行Westernblot检测，一抗选用抗外泌体标志蛋白抗，HRP连接的对应的二抗进行信号放大，用Tanon 5200化学发光图像分析系统检测。
实施例4：
dendrimer-AMB复合物修饰磁珠对羊水中外泌体的富集与检测：
1)羊水样本在与dendrimer-AMB复合物修饰磁珠孵育前，先于4℃将样本融化。5000g离心10min后取上清。
2)dendrimer-AMB复合物修饰磁珠使用磷酸盐缓冲液润洗，将磁珠分散于PBS缓冲液后，磁吸附弃掉上清。
3)取0.5mL羊水与5mg的dendrimer-AMB复合物修饰磁珠在4℃孵育30min。
4)磁吸附后弃掉上清，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5分钟，弃去上清液。
5)加入24μL的RIPA在0℃下原位裂解，裂解时间为10min。然后加入8μL的4×loading缓冲液，在100℃下煮沸10min。
6)对样本进行Westernblot检测，一抗选用抗外泌体标志蛋白抗，HRP连接的对应的二抗进行信号放大，用Tanon 5200化学发光图像分析系统检测。
实施例5：
dendrimer-AMB复合物修饰磁珠对脑脊液中外泌体的富集与检测：
1)脑脊液样本在与dendrimer-AMB复合物修饰磁珠孵育前，先于4℃将样本融化。5000g离心10min后取上清。
2)dendrimer-AMB复合物修饰磁珠使用磷酸盐缓冲液润洗，将磁珠分散于PBS缓冲液后，磁吸附弃掉上清。
3)脑脊液样本用磷酸盐缓冲液2倍稀释，取1mL稀释后的脑脊液与5mg的dendrimer-AMB复合物修饰磁珠在4℃孵育30min。
4)磁吸附后弃掉上清，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5分钟，弃去上清液。
5)加入24μL的RIPA在0℃下原位裂解，裂解时间为10min。然后加入8μL的4×loading缓冲液，在100℃下煮沸10min。
6)对样本进行Westernblot检测，一抗选用抗外泌体标志蛋白抗，HRP连接的对应的二抗进行信号放大，用Tanon 5200化学发光图像分析系统检测。
实施例6：
dendrimer-AMB复合物修饰磁珠对唾液中外泌体的富集与检测：
1)唾液样本由唾液采集管进行采集，在与dendrimer-AMB复合物修饰磁珠孵育前，使用磷酸盐缓冲液5倍稀释。
2)稀释后的唾液样本于5000g离心10min，取上清。
3)dendrimer-AMB复合物修饰磁珠使用磷酸盐缓冲液润洗，将磁珠分散于PBS缓冲液后，磁吸附弃掉上清。
4)取1mL稀释后的唾液样本与5mg的dendrimer-AMB复合物修饰磁珠在4℃孵育30min。
5)磁吸附后弃掉上清，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5分钟，弃去上清液。
6)加入24μL的RIPA在0℃下原位裂解，裂解时间为10min。然后加入8μL的4×loading缓冲液，在100℃下煮沸10min。
7)对样本进行Westernblot检测，一抗选用抗外泌体标志蛋白抗，HRP连接的对应的二抗进行信号放大，用Tanon 5200化学发光图像分析系统检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种外泌体富集磁珠材料的制备方法，其特征在于，所述外泌体富集磁珠材料的制备方法包括以下步骤：
1)制备两亲性超分子复合物修饰的纳米磁珠；
2)将两亲性超分子修饰磁珠与体液中外泌体特异性结合进行捕获。
2.根据权利要求1所述的外泌体富集磁珠材料的制备方法，其特征在于，所述修饰磁珠的制备包括如下步骤：
1)乙二醇作为反应溶剂，加入无水乙酸钠，聚乙二醇和六水合氯化铁于40℃反应30min，转移至高压釜中200℃反应16h，反应完成后，将得到的黑色沉淀物进行洗涤后干燥；
2)Fe3O4@SiO2分散于80％的乙醇中，超声30min分散材料，加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷，70℃反应20h，反应完成后将得到的黑色沉淀洗涤，60℃真空干燥；
3)Fe3O4@SiO2-NH2分散在反应溶液中，其反应溶液的配比为乙酸：甲醇＝1:125，加入戊二醛和氰基硼氢化钠，在40℃反应10h，所得黑色沉淀用反应缓冲液进行洗涤；
4)将材料磁分离收集并直接分散于反应缓冲液中，向溶液中加入树枝状聚合物和氰基硼氢化钠，40℃反应10h，对沉淀物洗涤后，黑色固体为Fe3O4@SiO2-NH2-Dendrimer并在60℃的环境中干燥过夜；
5)称取AMB分子溶解于二甲基亚砜中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于MES，0.1M缓冲液中；
6)混合步骤4)和步骤5)中所得到的溶液，37℃活化20min，将活化好的AMB溶液与Fe3O4@SiO2-NH2-Dendrimer混合，室温反应过夜，反应完成之后使用MES缓冲液洗后在60℃的环境中干燥。
3.根据权利要求1所述的外泌体富集磁珠材料的制备方法，其特征在于，所述纳米磁珠的官能团包括两亲性分子。
4.根据权利要求3所述的外泌体富集磁珠材料的制备方法，其特征在于，所述两亲性分子插入至脂质膜中，与脂质膜中的固醇分子发生分子间相互作用力而结合；
所述两亲性超分子复合物修饰到磁性微球上用于外泌体的捕获；
所述纳米磁珠与外泌体脂质膜发生结合作用。
5.根据权利要求1所述的外泌体富集磁珠材料的制备方法，其特征在于，所述树枝状聚合物与两亲性分子偶联后为两亲性分子提供作用位点。
6.根据权利要求1所述的外泌体富集磁珠材料的制备方法，其特征在于，步骤2)中得到的捕获纳米磁珠与体液进行混合，捕获外泌体。
7.根据权利要求4所述的外泌体富集磁珠材料的制备方法，其特征在于，所述两亲性分子用二甲基亚砜进行超声溶解后，在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的作用下与具有游离氨基的树枝状聚合物分子进行偶联。
8.根据权利要求6所述的外泌体富集磁珠材料的制备方法，其特征在于，捕获纳米磁珠与样品液的孵育时间为30min；
捕获纳米磁珠和捕获外泌体后进行原位裂解。
9.一种如权利要求1-8任一所述的外泌体富集磁珠材料在捕获外泌体中的应用。
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| CN202111668022.1A CN114345308A (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 一种外泌体富集磁珠材料的制备方法与应用 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117511879A (zh) * | 2024-01-04 | 2024-02-06 | 北京理工大学 | 一种基于微流控芯片的一体化实现外泌体富集与小分子萃取的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN105771942A (zh) * | 2014-12-26 | 2016-07-20 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种磁性纳米材料及其制备与应用 |
| US20180369410A1 (en) * | 2017-06-27 | 2018-12-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Dendrimer-exosome hybrid nanoparticles as a delivery platform |
| CN113186166A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-07-30 | 南京鼓楼医院 | 一种基于刺猬状磁性微球的外泌体富集方法 |
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2021
- 2021-12-31 CN CN202111668022.1A patent/CN114345308A/zh active Pending
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| CN117511879B (zh) * | 2024-01-04 | 2024-05-03 | 北京理工大学 | 一种基于微流控芯片的一体化实现外泌体富集与小分子萃取的方法 |
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