CN107486156B - 一种磁性纳米颗粒吸附分离牛血清白蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种磁性纳米颗粒吸附分离牛血清白蛋白的方法，属于生化分离技术领域。本发明采用共沉淀法以及硅烷化、氨基化修饰技术制备了一种功能性修饰的磁性纳米材料。该磁性纳米材料具有超顺磁性，材料具有较高的比表面积，在溶液中有极强的分散性，材料表面的功能性修饰使其具有较好的生物相容性。由本发明方法制备的氨基硅烷化磁性颗粒具有优良的重复使用性能，对牛血清白蛋白的吸附与解吸反应条件温和，反应简单快速，最大吸附量可达17.2mg蛋白/g磁材料，具备工业化大规模生产和应用的潜力。

Description

一种磁性纳米颗粒吸附分离牛血清白蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种磁性纳米颗粒吸附分离牛血清白蛋白的方法，属于生化分离技术领域。
背景技术
牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)，作为一种等电点为4.7的模式蛋白，被广泛地应用在各种生物化学实验中。牛血清白蛋白可以保护酶的活性位点免受到金属离子及其它化学物质等的影响，同时它具有维持体系渗透压的作用。因此牛血清白蛋白常常用于修饰酶、限制酶的保存和反应液中。有些酶在较低浓度下活性较低，在加入牛血清白蛋白后，可起到保护作用。在不含白蛋白的缓冲液中，在体温下内切酶往往只能存活10分钟甚至更短的时间，而加入牛血清白蛋白后可使内切酶的稳定性大大提高。因而牛血清白蛋白在遗传工程学研究、医药材料研究、医药保健食品等领域具有广阔的应用前景。
目前，盐析法、离子交换法等方法是蛋白质分离的主要方法。但是这些方法不但过程复杂繁琐，而且蛋白质损失较大，甚至会引起蛋白质的变性、失活。磁性纳米材料由于具有优良的超顺磁性和较高的矫顽力，易在外加磁场的作用下从反应体系中分离出来。在磁材料表面接枝或者聚合上具有化学活性的官能团，可赋予磁材料特定的功能性质，使其易于与蛋白质等生物大分子结合。将磁材料制备成纳米级别的大小，极大地提高了材料的比表面积，使得其吸附性能大大提高。
将磁性纳米材料进行功能化改性，再与目标蛋白质形成磁材料-蛋白质复合物，然后在外加磁场作用下将复合物从体系中分离出来，最后进行蛋白质脱附，实现蛋白质的富集与纯化。与目前应用较广的盐析、离子交换等传统蛋白质分离方法相比，蛋白质的磁分离具有产品纯度高、速度快等优点。然而目前磁性纳米材料对于蛋白质的分离纯化受限于吸附量、材料的重复使用次数和反应条件，因而仍处于实验室研究阶段，尚未能够进行大规模工业化应用。
发明内容
本发明制备了一种具有优良重复使用性能的氨基硅烷修饰磁性颗粒，该颗粒对于牛血清白蛋白的吸附分离条件温和、反应简单快速，吸附与解吸效果较好，具备工业化大规模制备和应用的潜力，通过本发明可为磁性纳米材料在牛血清白蛋白及其他蛋白的工业化分离纯化奠定基础。
所述具有优良重复使用性能的氨基硅烷修饰磁性颗粒的制备方法包括Fe3O4磁核的制备、磁性纳米材料的氨基硅烷化修饰以及对牛血清白蛋白进行吸附、解吸。
本发明提供了制备所述氨基硅烷化修饰的磁性颗粒的方法，包括以下步骤：
1、Fe3O4磁核的制备：
称取一定的七水合硫酸亚铁和六水合氯化铁(混合物中的二价铁和三价铁的摩尔比为1:3)。在三口烧瓶中，加入20％乙醇溶液，反应体系中的铁离子总浓度为0.05mol/L。在氮气流保护下，将上述混合物混匀，在60℃，以1000r/min的转速搅拌20min，加入适量氨水，使得反应溶液的pH值在10.0到11.0的范围内，此时，反应溶液的颜色从橙色变成黑色。继续搅拌10min使反应充分。对所得混合溶液施加外加磁场分离沉淀，并用乙醇和去离子水多次清洗沉淀，45℃真空干燥后即得到Fe3O4磁纳米颗粒。
上述步骤中，采用氮气作为保护气体，反应温度60℃，加入的碱溶液采用氨水，这些反应条件都有利于简化反应步骤，降低反应难度，使反应更加温和，从而为磁颗粒的制备由实验室小规模操作转向工业化大规范制备奠定基础。
2、磁性纳米颗粒的氨基硅烷化修饰：
裸露的Fe3O4磁纳米颗粒具有较高的化学活性，在空气中容易被氧化从而导致颗粒磁性的损失和分散性的降低，进而导致磁性颗粒出现明显的团聚现象，无法直接应用于蛋白质的分离纯化，因而需要对裸露的磁性纳米颗粒进行功能化修饰。
将Fe3O4颗粒溶于90％乙醇混合液中，在氮气流的保护下加入1mL氨水，在30℃下1000r/min转速搅拌20min。分别加入正硅酸乙酯(TEOS)和3-(2-氨乙基)氨丙基甲基二甲氧基硅烷(APTMS)，在30℃下反应6h，对磁材料进行氨基化硅烷化修饰。反应结束后在外加磁场作用下分离沉淀，并用去离子水和乙醇依次清洗沉淀多次，直到溶液的pH值呈中性。将沉淀物真空干燥即可得到Fe3O4@SiO2-NH2材料。
上述步骤制得的氨基硅烷化磁性颗粒，具有优良的磁响应性，该颗粒用于蛋白质的分离纯化分离条件更温和，反应简单迅速，具备大规模工业化应用的潜力。
本发明还提供了应用所述氨基硅烷化修饰的磁性颗粒分离纯化蛋白的方法，包括将Fe3O4@SiO2-NH2磁纳米颗粒与含待分离蛋白的溶液混合，在20-40℃条件下震荡吸附10-120min，达到吸附平衡后，通过施加外加磁场的作用，使得磁性纳米材料-蛋白质复合体与上清液分离；将氨基硅烷化磁性颗粒-蛋白复合体，利用pH5.0-9.0的磷酸盐缓冲液在恒温水浴摇床条件下进行解吸，解吸时间为0.5-2h，解吸结束后，在外加磁场作用下收集含待分离蛋白的上清溶液和Fe3O4@SiO2-NH2磁性颗粒。
具体地，包括以下步骤：
1、氨基硅烷化磁性颗粒对牛血清白蛋白的吸附分离：
在50mL的锥形瓶中，均匀混合50mgFe3O4@SiO2-NH2磁纳米颗粒与5mL浓度为0.2-1.6mg/mL，pH分别为6.5-9.0的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液，在20-40℃条件下150r/min震荡吸附10-120min，达到吸附平衡后，通过施加外加磁场的作用，使得磁性纳米材料-蛋白质复合体与上清液分离。
2、氨基硅烷化磁性颗粒-蛋白复合体的解吸
将氨基硅烷化磁性颗粒-蛋白复合体置于50mL锥形瓶中，利用pH5.0-9.0的磷酸盐缓冲液在恒温水浴摇床(30℃-60℃)条件下进行解吸，解吸时间为0.5-2h，解吸结束后，在外加磁场作用下收集上清溶液和Fe3O4@SiO2-NH2磁性颗粒，Fe3O4@SiO2-NH2磁性颗粒可进行下一轮的牛血清白蛋白吸附解吸。
发明特点：
本发明通过制备一种具有优良重复使用稳定性的氨基硅烷化修饰的四氧化三铁磁性纳米材料，为牛血清白蛋白的吸附分离开拓一条新的途径。该方法可实现牛血清白蛋白的温和、快速分离纯化，并具有较好的工业化大规模应用潜力。本发明提供的Fe3O4@SiO2-NH2磁性颗粒经解吸、清洗数次后进行冷冻干燥，将回收得到的磁性颗粒重复用于牛血清白蛋白的吸附与解吸30次，结果发现经过30次重复吸附、解吸后，Fe3O4@SiO2-NH2磁性颗粒对牛血清白蛋白的最大吸附载量只有较小程度的降低，最大吸附载量仍能达到15mg蛋白/g磁颗粒以上。在材料的重复使用中，材料的回收率可以反映材料的重复使用稳定性。经过30次重复吸附、解吸后，Fe3O4@SiO2-NH2磁性颗粒的质量产生一定的损耗，但其最终质量仍能保持在初始质量的90％以上。磁颗粒重复吸附解吸过程中对牛血清白蛋白的最大吸附载量和磁性材料的回收率均表明本发明制备的氨基硅烷化磁性颗粒具有优良的重复使用性能，具备大规模工业化应用于蛋白质分离纯化的潜力。
附图说明
图1为Fe3O4@SiO2-NH2和Fe3O4磁性纳米材料的傅里叶红外谱图
具体实施方式
磁性纳米材料对牛血清白蛋白的吸附量采用(1)式进行计算：
式中：
q—Fe3O4@SiO2-NH2磁性纳米材料对牛血清白蛋白的吸附量，mg/g；
V—溶液的体积，mL；
C0—溶液中牛血清白蛋白的初始浓度，mg/mL；
C1—吸附后上清液中牛血清白蛋白的浓度，mg/mL；
m—Fe3O4@SiO2-NH2磁纳米材料的质量，g。
实施例1
称取0.80g七水合硫酸亚铁和2.34g六水合氯化铁，在三口烧瓶中，加入200mL20％乙醇溶液。在氮气流保护下，将上述称量的混合物混匀在三口烧瓶的溶液中，体系温度维持在60℃，以1000r/min的转速搅拌20min。接着加入适量氨水，使得反应溶液的pH值在10.0到11.0的范围内，此时，反应溶液的颜色从橙色变成黑色。继续搅拌10min使反应充分。对所得混合溶液施加外加磁场分离沉淀，并用乙醇和去离子水多次清洗沉淀，45℃真空干燥后即得到Fe3O4磁纳米颗粒。
取30mg制得的Fe3O4颗粒加入5mL 1.0mg/mL、pH7.4的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡20min，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
结果发现磁颗粒出现凝结成团现象，分散性差，磁颗粒对蛋白吸附量为3.4mg蛋白/g磁材料，蛋白吸附性能较差，说明裸露的Fe3O4颗粒不适于直接应用于蛋白质的吸附分离。
实施例2
称取50mg实施例1制备的Fe3O4颗粒，混匀于200mL90％乙醇溶液中，在氮气流的保护下加入1mL氨水，在30℃下1000r/min转速搅拌20min。加入1mL正硅酸乙酯(TEOS)和0.05mL 3-氨丙基三甲氧基硅烷，在30℃下反应6h，反应结束后在外加磁场作用下分离沉淀，用去离子水和乙醇依次清洗沉淀多次，直到溶液的pH值呈中性。将沉淀物真空干燥。
取30mg制得的沉淀物加入5mL 1.0mg/mL、pH7.4的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡20min，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为5.4mg蛋白/g磁材料。
实施例3
称取50mg实施例1制备的Fe3O4颗粒，混匀于200mL90％乙醇溶液中，在氮气流的保护下加入1mL氨水，在30℃下1000r/min转速搅拌20min。加入1mL正硅酸乙酯(TEOS)和0.05mLγ-氨丙基三乙氧基硅烷，在30℃下反应6h，反应结束后在外加磁场作用下分离沉淀，用去离子水和乙醇依次清洗沉淀多次，直到溶液的pH值呈中性。将沉淀物真空干燥。
取30mg制得的沉淀物加入5mL 1.0mg/mL、pH7.4的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡20min，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为6.6mg蛋白/g磁材料。
实施例4
称取实施例1制备的50mgFe3O4颗粒，混匀于200mL90％乙醇溶液中，在氮气流的保护下加入1mL氨水，在30℃下1000r/min转速搅拌20min。加入1mL正硅酸乙酯(TEOS)和0.05mL 3-(2-氨乙基)-氨丙基甲基二甲氧基硅烷(APTMS)，在30℃下反应6h，反应结束后在外加磁场作用下分离沉淀，用去离子水和乙醇依次清洗沉淀多次，直到溶液的pH值呈中性。将沉淀物真空干燥。
取30mg制得的沉淀物加入5mL 1.0mg/mL、pH7.4的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡20min，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为17.1mg蛋白/g磁材料。
由实施例2-4结果可以发现，氨基化试剂的选择对磁颗粒的蛋白吸附量具有明显影响，3-(2-氨乙基)-氨丙基甲基二甲氧基硅烷(APTMS)为最佳氨基化试剂。
实施例5
称取50mg实施例1制备的Fe3O4颗粒，混匀于200mL90％乙醇溶液中，在氮气流的保护下加入1mL氨水，在30℃下1000r/min转速搅拌20min。加入1mL正硅酸乙酯(TEOS)和0.05mL 3-(2-氨乙基)-氨丙基甲基二甲氧基硅烷(APTMS)，在60℃下反应6h，反应结束后在外加磁场作用下分离沉淀，用去离子水和乙醇依次清洗沉淀多次，直到溶液的pH值呈中性。将沉淀物真空干燥。
取30mg制得的沉淀物加入5mL 1.0mg/mL、pH7.4的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡20min，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为16.9mg蛋白/g磁材料。
实施例6
称取50mg实施例1制备的Fe3O4颗粒，混匀于200mL90％乙醇溶液中，在氮气流的保护下加入1mL氨水，在30℃下1000r/min转速搅拌20min。加入1mL正硅酸乙酯(TEOS)和0.05mL 3-(2-氨乙基)-氨丙基甲基二甲氧基硅烷(APTMS)，在80℃下反应6h，反应结束后在外加磁场作用下分离沉淀，用去离子水和乙醇依次清洗沉淀多次，直到溶液的pH值呈中性。将沉淀物真空干燥。
取30mg制得的沉淀物加入5mL 1.0mg/mL、pH7.4的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡20min，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为14.8mg蛋白/g磁材料。
由实施例4-6的结果可以发现，磁性颗粒氨基硅烷化修饰反应的温度在30℃时，制得的磁性颗粒对蛋白的吸附量即可达到较高水平，反应温度升高到60℃时，磁颗粒对蛋白吸附量与30℃时相差不大，反应温度升高到80℃时，磁颗粒对蛋白吸附量出现下降。因而从选择温和实验条件、降低能耗、方便工业化大规模制备的角度考虑，本发明选择30℃作为磁性颗粒氨基硅烷化反应温度。
实施例7
称取50mg实施例1制备的Fe3O4颗粒，混匀于200mL90％乙醇溶液中，在氮气流的保护下加入1mL氨水，在30℃下1000r/min转速搅拌20min。加入1mL正硅酸乙酯(TEOS)和0.05mL 3-(2-氨乙基)-氨丙基甲基二甲氧基硅烷(APTMS)，在30℃下反应4h，反应结束后在外加磁场作用下分离沉淀，用去离子水和乙醇依次清洗沉淀多次，直到溶液的pH值呈中性。将沉淀物真空干燥。
取30mg制得的沉淀物加入5mL 1.0mg/mL、pH7.4的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡20min，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为12.6mg蛋白/g磁材料。
实施例8
称取50mg实施例1制备的Fe3O4颗粒，混匀于200mL90％乙醇溶液中，在氮气流的保护下加入1mL氨水，在30℃下1000r/min转速搅拌20min。加入1mL正硅酸乙酯(TEOS)和0.05mL 3-(2-氨乙基)-氨丙基甲基二甲氧基硅烷(APTMS)，在30℃下反应12h，反应结束后在外加磁场作用下分离沉淀，用去离子水和乙醇依次清洗沉淀多次，直到溶液的pH值呈中性。将沉淀物真空干燥。
取30mg制得的沉淀物加入5mL 1.0mg/mL、pH7.4的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液中，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡20min，完成吸附后，测定磁颗粒的蛋白吸附量。
测定结果显示磁颗粒对蛋白吸附量为16.8mg蛋白/g磁材料。
由实施例4、实施例7、8的结果可以发现，磁性颗粒氨基硅烷化修饰反应的时间在4h时，氨基硅烷化反应不完全，制得的磁性颗粒对蛋白的吸附量较低；反应时间延长到6h时，氨基硅烷化反应已基本完成，磁颗粒对蛋白吸附量达到较高水平，进一步延长反应时间至12h时，磁颗粒对蛋白吸附量与反应6h相比无明显变化，说明由于氨基硅烷化反应已经完全，延长反应时间已经无法进一步提高蛋白吸附量。因而从缩短制备时间，提高生产效率，方便工业化大规模制备的角度考虑，本发明选择6h作为磁性颗粒氨基硅烷化反应时间。
实施例9
在50mL的锥形瓶中，均匀混合50mg实施例4制备的Fe3O4@SiO2-NH2磁性纳米材料与5mL0.2mg/mL、pH6.5的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液，20℃恒温水浴摇床中150r/min振荡30min，完成吸附后，通过施加外加磁场的作用使得磁性纳米材料-蛋白质复合体与上清液分离，在280nm波长下，测定上清液的紫外吸收值，计算可得磁性纳米材料对牛血清白蛋白的吸附量为7.6mg蛋白/g磁材料。
实施例10
在50mL的锥形瓶中，均匀混合50mg实施例4制备的Fe3O4@SiO2-NH2磁性纳米材料与5mL 0.5mg/mL、pH7.0的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液，于20℃恒温水浴摇床中150r/min振荡10min，完成吸附后，通过施加外加磁场的作用使得磁性纳米材料-蛋白质复合体与上清液分离，在280nm波长下，测定上清液的紫外吸收值，计算可得磁性纳米材料对牛血清白蛋白的吸附量为12.0mg蛋白/g磁材料。
实施例11
在50mL的锥形瓶中，均匀混合50mg实施例4制备的Fe3O4@SiO2-NH2磁性纳米材料与5mL 1.0mg/mL、pH 7.4的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液，于25℃恒温水浴摇床中150r/min振荡20min，完成吸附后，通过施加外加磁场的作用使得磁性纳米材料-蛋白质复合体与上清液分离，在280nm波长下，测定上清液的紫外吸收值，计算可得磁性纳米材料对牛血清白蛋白的吸附量为17.2mg蛋白/g磁材料。
实施例12
在50mL的锥形瓶中，均匀混合50mg实施例4制备的Fe3O4@SiO2-NH2磁性纳米材料与5mL 1.6mg/mL、pH 7.4的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液，于30℃恒温水浴摇床中150r/min振荡120min，完成吸附后，通过施加外加磁场的作用使得磁性纳米材料-蛋白质复合体与上清液分离，在280nm波长下，测定上清液的紫外吸收值，计算可得磁性纳米材料对牛血清白蛋白的吸附量为15.0mg蛋白/g磁材料。
实施例13
在50mL的锥形瓶中，均匀混合50mg实施例4制备的Fe3O4@SiO2-NH2磁纳米颗粒与5mL 1.6mg/mL、pH9.0的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液，于40℃恒温水浴摇床中150r/min振荡120min，完成吸附后，通过施加外加磁场的作用使得磁性纳米材料-蛋白质复合体与上清液分离，在280nm波长下，测定上清液的紫外吸收值，计算可得磁性纳米材料对牛血清白蛋白的吸附量为8.3mg蛋白/g磁材料。
根据实施例9-13的结果可知，磁颗粒对牛血清白蛋白的吸附量明显受到蛋白溶液浓度、溶液pH值、吸附反应温度和吸附反应时间等因素的影响，本发明中选取的最优吸附反应条件为蛋白溶液浓度1.0mg/mL，溶液pH7.4，反应温度25℃，反应时间20min，在最优吸附条件下，氨基硅烷化磁性颗粒对牛血清白蛋白的吸附量可达17.2mg蛋白/g磁材料。
实施例14
将30mg在实施例4条件下制备与吸附的氨基硅烷化磁性颗粒-蛋白复合体置于50mL锥形瓶中，利用pH5.0、40mmol/L磷酸盐缓冲液在45℃恒温水浴摇床中进行震荡解吸，解吸时间为0.5h，解吸结束后，在外加磁场作用下收集上清溶液，测定上清液中牛血清白蛋白浓度，计算牛血清白蛋白的解吸量，可得牛血清白蛋白的最大解吸量为10.8mg/g磁材料。
实施例15
将30mg在实施例4条件下制备与吸附的氨基硅烷化磁性颗粒-蛋白复合体置于50mL锥形瓶中，利用pH7.0、40mmol/L磷酸盐缓冲液在30℃恒温水浴摇床中进行震荡解吸，解吸时间为1h，解吸结束后，在外加磁场作用下收集上清溶液，测定上清液中牛血清白蛋白浓度，计算牛血清白蛋白的解吸量，可得牛血清白蛋白的最大解吸量为16.7mg/g磁材料。
实施例16
将30mg在实施例4条件下制备与吸附的氨基硅烷化磁性颗粒-蛋白复合体置于50mL锥形瓶中，利用pH9.0、40mmol/L磷酸盐缓冲液在60℃恒温水浴摇床中进行震荡解吸，解吸时间为2h，解吸结束后，在外加磁场作用下收集上清溶液，测定上清液中牛血清白蛋白浓度，计算牛血清白蛋白的解吸量，可得牛血清白蛋白的最大解吸量为12.6mg/g磁材料。
实施例17
将30mg在实施例4条件下制备与吸附的氨基硅烷化磁性颗粒-蛋白复合体置于50mL锥形瓶中，利用pH7.0、0.1mol/L氯化钠液在45℃恒温水浴摇床中进行震荡解吸，解吸时间为1h，解吸结束后，在外加磁场作用下收集上清溶液，测定上清液中牛血清白蛋白浓度，计算牛血清白蛋白的解吸量，可得牛血清白蛋白的最大解吸量为13.2mg/g磁材料。
由实施例14-17可知，本发明制备的氨基硅烷化磁性颗粒在对牛血清白蛋白进行吸附后可以有效进行蛋白质的解吸，但解吸效率受到解吸液种类、解吸液pH值、解吸温度和解吸时间的影响。采用pH7.0、40mmol/L磷酸盐缓冲液在30℃恒温水浴摇床中进行震荡解吸1h，牛血清白蛋白的最大解吸量为16.7mg/g磁材料。
实施例18
将在实施例4条件下制备的Fe3O4@SiO2-NH2磁性颗粒在最优条件下进行牛血清白蛋白的吸附与解吸，检测磁性颗粒对于牛血清白蛋白的最大吸附载量以及磁性颗粒的回收率：
经吸附解吸5次后，磁颗粒对蛋白的最大吸附量为17.0mg蛋白/g磁颗粒，磁颗粒回收率99.2％；
吸附解吸10次后，磁颗粒对蛋白的最大吸附量为16.8mg蛋白/g磁颗粒，磁颗粒回收率98.1％；
吸附解吸15次后，磁颗粒对蛋白的最大吸附量为16.2mg蛋白/g磁颗粒，磁颗粒回收率96.3％；
吸附解吸20次后，磁颗粒对蛋白的最大吸附量为15.9mg蛋白/g磁颗粒，磁颗粒回收率95.6％；
吸附解吸25次后，磁颗粒对蛋白的最大吸附量为15.6mg蛋白/g磁颗粒，磁颗粒回收率94.7％；
吸附解吸30次后，磁颗粒对蛋白的最大吸附量为15.2mg蛋白/g磁颗粒，磁颗粒回收率92.9％。
实施例19
将按照实施例5中方法制备的Fe3O4@SiO2-NH2磁性颗粒在最优条件下进行牛血清白蛋白的吸附与解吸，检测磁性颗粒对于牛血清白蛋白的最大吸附载量以及磁性颗粒的回收率：
经吸附解吸5次后，磁颗粒对蛋白的最大吸附量为15.8mg蛋白/g磁颗粒，磁颗粒回收率98.2％；
吸附解吸10次后，磁颗粒对蛋白的最大吸附量为14.6mg蛋白/g磁颗粒，磁颗粒回收率96.1％；
吸附解吸15次后，磁颗粒对蛋白的最大吸附量为13.0mg蛋白/g磁颗粒，磁颗粒回收率93.6％；
吸附解吸20次后，磁颗粒对蛋白的最大吸附量为11.9mg蛋白/g磁颗粒，磁颗粒回收率90.8％；
吸附解吸25次后，磁颗粒对蛋白的最大吸附量为9.6mg蛋白/g磁颗粒，磁颗粒回收率84.2％；
吸附解吸30次后，磁颗粒对蛋白的最大吸附量为8.1mg蛋白/g磁颗粒，磁颗粒回收率82.9％。
实施例20
将按照实施例8中方法制备的Fe3O4@SiO2-NH2磁性颗粒在最优条件下进行牛血清白蛋白的吸附与解吸，检测磁性颗粒对于牛血清白蛋白的最大吸附载量以及磁性颗粒的回收率：
经吸附解吸5次后，磁颗粒对蛋白的最大吸附量为16.1mg蛋白/g磁颗粒，磁颗粒回收率98.7％；
吸附解吸10次后，磁颗粒对蛋白的最大吸附量为15.4mg蛋白/g磁颗粒，磁颗粒回收率97.1％；
吸附解吸15次后，磁颗粒对蛋白的最大吸附量为13.4mg蛋白/g磁颗粒，磁颗粒回收率94.3％；
吸附解吸20次后，磁颗粒对蛋白的最大吸附量为11.6mg蛋白/g磁颗粒，磁颗粒回收率91.2％；
吸附解吸25次后，磁颗粒对蛋白的最大吸附量为9.9mg蛋白/g磁颗粒，磁颗粒回收率86.2％；
吸附解吸30次后，磁颗粒对蛋白的最大吸附量为8.3mg蛋白/g磁颗粒，磁颗粒回收率83.4％。
由实施例18-20中的结果发现，在最优制备条件下制备的氨基硅烷化磁性颗粒对牛血清白蛋白经过30次重复吸附、解吸后，颗粒对蛋白的最大吸附载量只有较小程度的降低，在最优吸附条件下，最大吸附载量仍能保持在15mg蛋白/g磁颗粒以上；在材料的重复使用中，材料的回收率可以反映材料的重复使用稳定性。经过30次重复吸附、解吸后，Fe3O4@SiO2-NH2磁性颗粒的质量产生一定的损耗，但其最终质量仍能保持在初始质量的90％以上。与此对照，在磁性颗粒的氨基硅烷化修饰过程中，提高反应温度或延长反应时间，制得的磁性颗粒的重复使用性能出现一定程度的劣变，经过30次吸附与解吸后，磁颗粒对蛋白的最大吸附载量降低至初始载量的50％左右，磁颗粒回收率降低至约80％。
磁颗粒重复吸附洗脱过程中对与牛血清白蛋白的最大吸附载量和磁性材料的回收率均表明本发明制备的氨基硅烷化磁性颗粒具有优良的重复使用性能，具备大规模工业化应用于蛋白质分离纯化的潜力。
由图1的傅里叶红外图谱可以看出，Fe3O4磁性纳米材料成功制备，并且Si-O-Si及-NH3特征吸收峰的存在说明硅烷基团和氨基已经成功修饰在磁材料表面。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (1)

1.一种应用氨基硅烷化修饰的磁性颗粒分离纯化牛血清白蛋白的方法，其特征在于，所述氨基硅烷化修饰的磁性颗粒的制备方法包括以下步骤：
(1)Fe3O4磁核的制备：
以七水合硫酸亚铁和六水合氯化铁为底物，二价铁和三价铁的摩尔比为1:3，加入20％乙醇溶液，反应体系中的铁离子总浓度为0.05mol/L，在氮气流保护下，体系温度维持在60℃，搅拌20min，加入适量氨水，使得反应溶液的pH值在10.0到11.0的范围内，继续搅拌10min使反应充分；对所得混合溶液施加外加磁场分离沉淀，并用乙醇和去离子水多次清洗沉淀，真空干燥后即得到Fe3O4磁纳米颗粒；
(2)磁性纳米颗粒的氨基硅烷化修饰：
将Fe3O4颗粒溶于90％乙醇中，在氮气流的保护下加入1mL氨水，在30℃下搅拌20min，分别加入正硅酸乙酯和3-(2-氨乙基)氨丙基甲基二甲氧基硅烷，在30℃下反应6h，对磁材料进行氨基硅烷化修饰；反应结束后在外加磁场作用下分离沉淀，并用去离子水和乙醇依次清洗沉淀多次，直到溶液的pH值呈中性，将沉淀物真空干燥即得到Fe3O4@SiO2-NH2材料；
所述分离纯化牛血清白蛋白的方法为：均匀混合50mg Fe3O4@SiO2-NH2磁纳米颗粒与5mL浓度为1.0mg/mL，pH为7.4的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液，在25℃条件下150r/min震荡吸附20min，达到吸附平衡后，通过施加外加磁场的作用，使得磁性纳米材料-蛋白质复合体与上清液分离；将氨基硅烷化磁性颗粒-蛋白复合体置于pH7.0、40mmol/L的磷酸盐缓冲液中，在30℃条件下进行解吸，解吸时间为1h，解吸结束后，在外加磁场作用下收集上清溶液和Fe3O4@SiO2-NH2磁性颗粒。
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