CN111323283B - 一种富集n-磷酸化蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

一种富集N‑磷酸化蛋白的方法，涉及蛋白质富集。利用一种连接有双官能团连接剂的磁性纳米粒子固定功能蛋白，并在交联剂的作用下交联底物蛋白，达到富集磷酸化蛋白的目的。包括步骤：1)合成双官能团连接剂H2N‑CH2‑CH2‑S‑S‑CH2‑CH2‑COOH；2)磁性纳米颗粒上羧基‑COOH的活化：3)磁性纳米颗粒与连接剂的连接；4)连接剂上羧基‑COOH的活化；5)磷酸化激酶McsB蛋白的连接；6)多聚甲醛交联磷酸化激酶McsB及其底物蛋白CtsR；7)将富集的蛋白与磁性纳米粒子的分离。原材料简单易得，交联时间短，操作简便，分离过程中不需要高速离心机的使用，整个过程在室温下即可完成。

Description

一种富集N-磷酸化蛋白的方法
技术领域
本发明涉及蛋白质富集，尤其是涉及一种富集N-磷酸化蛋白的方法。
背景技术
磁性纳米粒子与磁性分离技术的结合广泛应用于生物分子的富集和分离。磁性纳米粒子经过适当的表面修饰，可高度选择性地结合目标蛋白，在解决蛋白质的快速分离及高特异性的选择性分离方面具有较高优势。由于N-磷酸化修饰具有酸、热不稳定性、天然丰度低等特性，一直缺乏有效的富集和研究工具，但其在生物体内的作用又十分重要，因此需要开发一种新的简便富集方法，以便后续对N-磷酸化蛋白进行更深入的研究。
目前传统的磷酸化多肽的富集最常用的方法有：
(1)固定金属离子亲和色谱(immobilized metal affinity chromatography，IMAC)：通过把带正电荷的金属离子如Fe(III)或Ga(III)等金属离子螯合在固相硝基三乙酸/亚胺二乙酸树脂上，带负电荷的磷酸根通过静电作用会吸附到树脂中，以此达到富集的目的[如Potel C M,Lin M H,Heck A J R,et al.Widespread bacterial proteinhistidine phosphorylation revealed by mass spectrometry-based proteomics[J].Nat.Methods,2018,15(3):187-190.]。
(2)金属氧化物亲和色谱(metal oxide affinity chromatography，MOAC)：基于磷酸基团与金属氧化物(如TiO2、Al2O3、Fe3O4和SnO2等)之间的亲和能力实现对磷酸化肽段的富集，一般通过Lewis酸碱之间的相互作用，磷酸基团与金属氧化物形成二齿配体，以此达到富集的目的[如Leitner A.Phosphopeptide enrichment using metal oxideaffinity chromatography[J].Trends Anal.Chem.,2010,29(2):177-185.]。
(3)离子交换色谱(ion exchange chromatography，IEC)：多肽通过带正电荷的侧链基团与带负电荷的柱状树脂相互作用而保留在柱子上，等电点不同的多肽可以在柱子上依次洗脱下来。磷酸基团在低pH下的负电荷性质导致磷酸化肽段对负电荷树脂的亲和力低于相同序列的相应非磷酸化肽段，因此磷酸化的多肽首先被洗脱下来，以此达到富集的目的。[如Wolters D A,Washburn M P,Yates J R.An automated multidimensionalprotein identification technology for shotgun proteomics[J].Anal.Chem.,2001,73(23):5683-5690.]。
(4)免疫共沉淀(immunoprecipitation，IP)：利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原(N-磷酸化蛋白)从混合体系沉淀下来，免疫沉淀后的抗体蛋白复合体通过酸或者碱洗涤等方法使其分离，实现磷酸化蛋白的富集[如Fuhrmann J,Subramanian V,Thompson P R.Synthesis and use of a phosphonate amidine to generate an anti-phosphoarginine-specific antibody[J].Angew.Chem.,Int.Ed.,2015,54(49):14715-14718.]。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种富集N-磷酸化蛋白的方法，利用一种连接有双官能团连接剂的磁性纳米粒子固定功能蛋白，并在交联剂的作用下交联底物蛋白，达到富集磷酸化蛋白的目的。
本发明包括以下步骤：
1)合成双官能团连接剂(H2N-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-COOH)；将1.13g 3-巯基丙酸、0.87mL2-氨基乙硫醇盐酸盐溶液和16％双氧水混合，室温下反应，即得双官能团连接剂；
2)磁性纳米颗粒上羧基(-COOH)的活化：取100μL四氧化三铁纳米颗粒悬液，PBS洗涤三次后重悬于1mL PBS中，再加入活化剂混匀反应，然后用PBS缓冲液洗3遍以除去多余的反应物，得活化后的四氧化三铁纳米颗粒悬液；
3)磁性纳米颗粒与连接剂的连接，即磁珠表面的氨基化；向步骤2)活化后的四氧化三铁纳米颗粒悬液中，加入步骤1)中合成的双官能团连接剂，室温下混匀反应，使连接剂上的-NH2与磁珠上的-COOH连接，得到连好连接剂的四氧化三铁溶液；材料在进行下一步反应之前使用PBS缓冲液洗涤以除去多余的反应物；
4)连接剂上羧基(-COOH)的活化；向步骤3)连好连接剂的四氧化三铁溶液中加入活化剂，室温下混匀反应，磁分离后吸出上清液，使PBS缓冲液洗涤以除去多余的反应物，完成连接剂上羧基的活化；
5)磷酸化激酶McsB蛋白的连接：向100μL步骤4)所得溶液中加入500μL纯化获得的McsB蛋白，反应后获得连接好McsB的磁性纳米颗粒；
6)多聚甲醛(PFA)交联磷酸化激酶McsB及其底物蛋白CtsR：向500μL连接好McsB的磁性纳米颗粒中加入终浓度5％的多聚甲醛和0.5～1mg底物蛋白CtsR，混匀反应后再加入100μL 1M甘氨酸溶液终止反应；
7)将富集的蛋白与磁性纳米粒子的分离：外加磁场使磁珠从溶液中分离，用PBS缓冲液洗涤后，向磁珠中加入100μL终浓度0.5～1M的DTT，反应后使连接剂上的二硫键(S-S)断裂，再次磁分离，富集到的N-磷酸化蛋白存在于上清液中，即完成富集N-磷酸化蛋白。
在步骤2)中，所述四氧化三铁纳米颗粒的粒径可为70～300nm；所述活化剂可采用1.9～9.5mg EDC和2.1～10.5mg NHSS溶于100μL PBS缓冲液；所述反应的时间可为1h。
在步骤3)中，所述反应的时间可为2h；所述PBS缓冲液洗涤可洗涤3遍。
在步骤4)中，所述活化剂可为1.9～9.5mg EDC和2.1～10.5mg NHSS溶于100μLPBS缓冲液；所述反应的时间可为1h；所述磁分离可放置于磁力架进行磁分离；所述PBS缓冲液洗涤可洗涤3遍。
在步骤5)中，所述反应可于常温下摇匀反应2h；所述连接好McsB的磁性纳米颗粒优选1mg磁珠表面的连接量为0.26mg蛋白。
在步骤6)中，所述混匀反应的时间可为0.5min。
在步骤7)中，所述反应的温度可为37℃，反应的时间可为30min。
对本发明所得上清液进行SDS-PAGE检测，可以清楚地观察到激酶及其底物蛋白交联后的二聚体蛋白条带(42kDa+17kDa)，证明本发明方法可行。本发明以蛋白质精氨酸磷酸化激酶McsB以及其底物蛋白CtsR为模型，利用双官能团连接剂以及磁性纳米颗粒的快速分离优势，实现对N-磷酸化蛋白进行富集。
与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：
本发明所需原材料简单易得，目前羧基化磁珠非常稳定、廉价、交联时间短，交联时间只需要0.5min就可以完成；本发明方法操作简便，分离过程中不需要高速离心机的使用，整个过程在室温下即可完成。
附图说明
图1为本发明实施例的流程示意图。
图2为本发明实施例经过富集分离得到的蛋白SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
本发明主要提供一种利用连有双官能团连接剂的磁性纳米粒子固定底物蛋白，再在交联剂作用下对N-磷酸化蛋白进行富集的方法，以蛋白质精氨酸磷酸化激酶McsB以及其底物蛋白CtsR为模型，具体步骤包括：对磁性纳米粒子进行氨基化修饰；功能蛋白McsB的固定化；再利用多聚甲醛交联能够将相近的脯氨酸连接起来的特性对底物蛋白CtsR进行富集，最后利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行验证。
本发明实施例具体包括以下步骤：
1)双官能团连接剂(H2N-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-COOH)的合成：将1.13g 3-巯基丙酸和0.87mL2-氨基乙硫醇盐酸盐溶液和16％的双氧水(氧化剂)，室温下混合进行反应，即可得到双官能团连接剂(H2N-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-COOH)。
Figure BDA0002457520090000041
2)磁性纳米颗粒上羧基的活化：首先取100μL四氧化三铁纳米(粒径70～300nm)颗粒悬液(10mg/mL)，PBS洗涤三次，三次后重悬于1mL PBS中。向其中加入新配的活化剂(1.9～9.5mg EDC和2.1～10.5mg NHSS溶于100μL PBS缓冲液)，室温下混匀反应1h。使PBS缓冲液洗3遍以除去多余的反应物。
3)磁性纳米颗粒与连接剂的连接：向上述活化后的四氧化三铁纳米颗粒悬液，加入步骤1)中合成的连接剂，室温下混匀反应2h，使连接剂上的-NH2与磁珠上的-COOH连接。材料在进行下一步反应之前使用PBS缓冲液洗3遍以除去多余的反应物。
4)连接剂上羧基的活化:向上述连好连接剂的四氧化三铁溶液中加入新配的活化剂(1.9～9.5mg EDC和2.1～10.5mg NHSS溶于100μL PBS缓冲液)，室温下混匀反应1h。放置于磁力架进行磁分离，吸出上清液，使PBS缓冲液洗3遍以除去多余的反应物。完成连接剂上羧基的活化。
5)蛋白质磷酸化激酶McsB蛋白的连接:向100μL反应4)中的溶液中，继续加入500μL一定浓度纯化获得的McsB蛋白，常温下摇匀反应2h，获得连接好McsB的磁性纳米颗粒(磁分离吸取上清液测定蛋白浓度，以确定连接到磁珠上蛋白的含量,通常1mg磁珠表面的连接量为0.26mg蛋白)。
6)多聚甲醛(PFA)交联磷酸化激酶McsB及其底物蛋白CtsR:根据一系列条件优化的结果，选取以下交联条件：向上述500μL连接好McsB的磁性纳米颗粒加入多聚甲醛(终浓度5％)和一定量底物蛋白CtsR(0.5～1mg)，混匀反应0.5min，立即加入100μL 1M甘氨酸溶液终止反应。
7)富集的蛋白与磁性纳米粒子的分离:在外加磁场的作用下，磁珠从溶液中分离，用PBS缓冲液洗2遍，向磁珠中加入100μL DTT(终浓度0.5～1M)37℃反应30min，使连接剂上的二硫键(S-S)断裂，再次磁分离，富集到的N-磷酸化蛋白存在于上清液中。
8)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的检测：对步骤7)中的上清液进行SDS-PAGE检测，可以清楚地观察到激酶及其底物蛋白交联后的二聚体蛋白条带(42kDa+17kDa)，证明本发明方法可行。
图1为本发明实施例的流程示意图：将双官能团连接剂连接到对羧基活化的磁性纳米粒子上，对其进行氨基化修饰；将功能蛋白的固定至磁性纳米粒子上的双官能团连接剂上；在交联剂多聚甲醛的交联下对其底物蛋白进行富集；在外加磁场的作用下对磁珠进行分离富集，同时用DTT断开双官能团连接剂上的二硫键，使蛋白二聚体与磁性纳米粒子分离；最后利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行验证。
图2为本发明实施例经过富集分离得到的蛋白SDS-PAGE电泳图：以精氨酸磷酸化激酶McsB以及其底物蛋白CtsR为模型，42kDa的条带为McsB；17kDa的条带为CtsR；42kDa+17kDa的条带为激酶及其底物蛋白交联后的二聚体蛋白条带，证明本发明方法可行。
上述实施例仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (10)

1.一种富集N-磷酸化蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）合成双官能团连接剂H2N-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-COOH；将3-巯基丙酸、2-氨基乙硫醇盐酸盐溶液和双氧水混合，室温下反应，即得双官能团连接剂；
2）磁性纳米颗粒上羧基-COOH的活化：取四氧化三铁纳米颗粒悬液，PBS缓冲液洗涤后重悬于PBS缓冲液中，再加入活化剂混匀反应，然后用PBS缓冲液洗涤以除去多余的反应物，得活化后的四氧化三铁纳米颗粒悬液；
3）磁性纳米颗粒与连接剂的连接，即磁珠表面的氨基化；向步骤2）活化后的四氧化三铁纳米颗粒悬液中，加入步骤1）中合成的双官能团连接剂，室温下混匀反应，使连接剂上的-NH2与磁珠上的-COOH连接，得到连好连接剂的四氧化三铁溶液；
4）连接剂上羧基-COOH的活化；向步骤3）连好连接剂的四氧化三铁溶液中加入活化剂，室温下混匀反应，磁分离后吸出上清液，使PBS缓冲液洗涤以除去多余的反应物，完成连接剂上羧基的活化；
5）磷酸化激酶McsB蛋白的连接：向步骤4）所得溶液中加入磷酸化激酶McsB蛋白，反应后获得连接好磷酸化激酶McsB蛋白的磁性纳米颗粒；
6）多聚甲醛交联磷酸化激酶McsB及其底物蛋白CtsR：向连接好McsB的磁性纳米颗粒中加入终浓度5%的多聚甲醛和底物蛋白CtsR，混匀反应后再加入甘氨酸溶液终止反应；
7）将富集的蛋白与磁性纳米粒子的分离：外加磁场使磁珠从溶液中分离，用PBS缓冲液洗涤后，向磁珠中加入终浓度0.5～1 M的 DTT，反应后使连接剂上的二硫键S-S断裂，再次磁分离，富集到的N-磷酸化蛋白存在于上清液中，即完成富集N-磷酸化蛋白。
2.如权利要求1所述一种富集N-磷酸化蛋白的方法，其特征在于在步骤1）中，所述将3-巯基丙酸、2-氨基乙硫醇盐酸盐溶液和双氧水混合是将1.13g 3-巯基丙酸、0.87mL 2-氨基乙硫醇盐酸盐溶液和16%双氧水混合。
3.如权利要求1所述一种富集N-磷酸化蛋白的方法，其特征在于在步骤2）中，所述取四氧化三铁纳米颗粒悬液，PBS缓冲液洗涤后重悬于PBS缓冲液中是取100 μL四氧化三铁纳米颗粒悬液，PBS缓冲液洗涤三次后重悬于1mL PBS缓冲液中；所述四氧化三铁纳米颗粒的粒径为70～300nm。
4.如权利要求1所述一种富集N-磷酸化蛋白的方法，其特征在于在步骤2）中，所述活化剂采用1.9～9.5 mg EDC和2.1～10.5 mg NHSS溶于100μL PBS缓冲液；所述反应的时间为1h；所述PBS缓冲液洗涤是洗涤3遍。
5.如权利要求1所述一种富集N-磷酸化蛋白的方法，其特征在于在步骤3）中，所述反应的时间为2h。
6.如权利要求1所述一种富集N-磷酸化蛋白的方法，其特征在于在步骤4）中，所述活化剂为1.9～9.5 mg EDC和2.1～10.5 mg NHSS溶于100μL PBS缓冲液；所述反应的时间为1h。
7.如权利要求1所述一种富集N-磷酸化蛋白的方法，其特征在于在步骤4）中，所述磁分离采用放置于磁力架进行磁分离；所述PBS缓冲液洗涤是洗涤3遍。
8.如权利要求1所述一种富集N-磷酸化蛋白的方法，其特征在于在步骤5）中，向100μL反应步骤4）所得的溶液中，继续加入500μL纯化获得的McsB蛋白；所述反应是于常温下摇匀反应2h；所述连接好磷酸化激酶McsB蛋白的磁性纳米颗粒是1mg磁珠表面的酸化激酶McsB蛋白连接量为0.26mg。
9.如权利要求1所述一种富集N-磷酸化蛋白的方法，其特征在于在步骤6）中，所述混匀反应的时间为0.5min。
10.如权利要求1所述一种富集N-磷酸化蛋白的方法，其特征在于在步骤7）中，所述反应的温度为37℃，反应的时间为30 min。
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