CN106608890A - 一类磷酸化精氨酸类似物及其合成方法与应用 - Google Patents
一类磷酸化精氨酸类似物及其合成方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106608890A CN106608890A CN201510687571.1A CN201510687571A CN106608890A CN 106608890 A CN106608890 A CN 106608890A CN 201510687571 A CN201510687571 A CN 201510687571A CN 106608890 A CN106608890 A CN 106608890A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- arginine
- phosphorylation
- protein
- phosphorylated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- CCTIOCVIZPCTGO-BYPYZUCNSA-N phosphoarginine Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(=N)NP(O)(O)=O CCTIOCVIZPCTGO-BYPYZUCNSA-N 0.000 title abstract description 15
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 title abstract 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 72
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims abstract description 65
- 101150003479 Parg gene Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 7
- FSZRTCACEQYIPZ-UHFFFAOYSA-N 2-(oxo-lambda5-phosphanylidyne)ethanimidamide Chemical group P(=O)#CC(=N)N FSZRTCACEQYIPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 230000008827 biological function Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 150000002611 lead compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 claims abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 22
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 21
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 claims description 8
- -1 cycloalkyne Chemical class 0.000 claims description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 125000000637 arginyl group Chemical class N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 7
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 101100082332 Geobacillus stearothermophilus ywle gene Proteins 0.000 claims description 4
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims description 4
- 125000002769 thiazolinyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 101150096038 PTH1R gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000009509 drug development Methods 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 claims description 3
- DCWXELXMIBXGTH-QMMMGPOBSA-N phosphonotyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 claims description 3
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 claims description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000001925 cycloalkenes Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000006245 phosphate protecting group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 2
- DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N (2s)-4-hydroxy-2-(propylamino)butanoic acid Chemical compound CCCN[C@H](C(O)=O)CCO DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N 0.000 claims 1
- 102100038356 Kallikrein-2 Human genes 0.000 abstract description 5
- 108010035158 arginine esterase Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 4
- 150000001483 arginine derivatives Chemical class 0.000 description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 21
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 11
- 101100341609 Drosophila melanogaster jing gene Proteins 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 6
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 5
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 238000004679 31P NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 241001416149 Ovis ammon Species 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 108090000980 Protein arginine kinases Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 2
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 2
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N phosphotyrosine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWGRDBSNKQABCB-UHFFFAOYSA-N 4,4-difluoro-N-[3-[3-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)-8-azabicyclo[3.2.1]octan-8-yl]-1-thiophen-2-ylpropyl]cyclohexane-1-carboxamide Chemical compound CC(C)C1=NN=C(C)N1C1CC2CCC(C1)N2CCC(NC(=O)C1CCC(F)(F)CC1)C1=CC=CS1 BWGRDBSNKQABCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003143 4-hydroxybenzyl group Chemical group [H]C([*])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002407 ATP formation Effects 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 108010020366 Arginine kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- NDRZSRSWWHQDKQ-UHFFFAOYSA-N C(=O)OC(CNCC)(C)C Chemical class C(=O)OC(CNCC)(C)C NDRZSRSWWHQDKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KEBKDTPTDBQASH-UHFFFAOYSA-N C(C)OP(OCC)(=O)C.N#CC#N Chemical compound C(C)OP(OCC)(=O)C.N#CC#N KEBKDTPTDBQASH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- LFZAGIJXANFPFN-UHFFFAOYSA-N N-[3-[4-(3-methyl-5-propan-2-yl-1,2,4-triazol-4-yl)piperidin-1-yl]-1-thiophen-2-ylpropyl]acetamide Chemical compound C(C)(C)C1=NN=C(N1C1CCN(CC1)CCC(C=1SC=CC=1)NC(C)=O)C LFZAGIJXANFPFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKJPEAGHQZHRQV-UHFFFAOYSA-N Triiodomethane Natural products IC(I)I OKJPEAGHQZHRQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IFSVPLKRDCWNGA-UHFFFAOYSA-N [2-amino-2-(2-aminoethylimino)ethyl]phosphonic acid Chemical compound NCC\N=C(/N)CP(O)(O)=O IFSVPLKRDCWNGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- SXGBREZGMJVYRL-UHFFFAOYSA-N butan-1-amine;hydrobromide Chemical compound [Br-].CCCC[NH3+] SXGBREZGMJVYRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N hydridophosphorus(.) (triplet) Chemical compound [PH] BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000013394 immunophenotyping Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N iodomethane Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037427 ion transport Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000012917 library technology Methods 0.000 description 1
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006609 metabolic stress Effects 0.000 description 1
- 125000002816 methylsulfanyl group Chemical group [H]C([H])([H])S[*] 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000001814 protein method Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000010916 retrosynthetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000001117 sulphuric acid Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical class OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
- C07F9/38—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)]
- C07F9/3804—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)] not used, see subgroups
- C07F9/3808—Acyclic saturated acids which can have further substituents on alkyl
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
一类磷酸化精氨酸类似物及其合成方法与应用,涉及磷酸化精氨酸类似物。所述一类磷酸化精氨酸类似物以磷酰基乙脒结构为主体。所述一类磷酸化精氨酸类似物可以作为半抗原,用于制备识别蛋白上pArg的抗体;应用一类磷酸化精氨酸类似物所制备的抗体,具有识别pArg的专一性,与蛋白质中常见的其他磷酸化修饰形式交叉反应性低;另外,应用一类磷酸化精氨酸类似物所制备的小鼠多克隆抗体,主要为IgG2a型,可用于筛选单克隆抗体。还可作为蛋白磷酸化精氨酸酯酶的抑制剂,作为研究该类酯酶生物功能的生化试剂,或针对该类酯酶进行药物开发的先导化合物。
Description
技术领域
本发明涉及磷酸化精氨酸类似物,尤其是涉及一类磷酸化精氨酸类似物及其合成方法与应用。
背景技术
蛋白质的可逆磷酸化是生物界最普遍、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,也是细胞内信号转导的关键机制之一[1]。与生物学中广泛研究的发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸侧链上的O-磷酸化相比,蛋白质上精氨酸的磷酸化(pArg)作为一种新颖的翻译后修饰形式,大量存在于细菌等原核生物中[2],并被认为参与细菌内基因的转录调控[3]、蛋白质质量控制和响应外界刺激等重要的生物过程[4]。然而,由于pArg本身在抗原呈递过程中不稳定,无法通过直接免疫动物获得有效的抗体,针对蛋白中pArg的抗体还未见报道,因此对pArg生物学功能的研究进展缓慢。除此之外,pArg还具有对酸、热等条件敏感、在很多生化分析条件下不稳定等特殊的性质[5]。发展特异性识别蛋白质上磷酸化精氨酸的抗体,可以拓展科学界对pArg生物学功能的认识,促进以pArg为核心的上游激酶、下游酯酶的功能研究及相应的药物发现。
根据现有的有限的研究结果,游离状态的磷酸化精氨酸(pArg)可能参与以下重要的生物学功能:1)作为无脊椎动物体中的ATP和能量缓冲库。当细胞内ATP浓度降低时,pArg可作为高能物质和磷酸根供体,直接与ADP合成ATP。2)作为一些细胞膜离子泵的调节物质。某些细胞膜离子运输复合物是受以ATP为磷酸基团供体的磷酸化-去磷酸化过程提供能量支持和活性调控的,由于ATP可由pArg直接合成,所以pArg可以间接地调控细胞膜上离子运输复合物的活性和功能。3)作为细胞内有氧代谢供能转向无氧代谢供能的一个中介物质。在细胞活动中,只有当代谢加剧而线粒体不能及时产生足够的ATP时,pArg才充当起ATP的合成和缓冲库的功能。然而,由于pArg本身也由ATP合成,所以在机体受到较大应激条件时,pArg的缓冲能力有限,只能满足部分ATP合成所需的能量。厌氧反应(糖酵解过程)在能量需求高峰期发挥了提供ATP的主要作用,所以,pArg在一定程度上可能是有氧代谢供能转向无氧代谢供能的一个中间物质。4)调节细胞内的pH值。在动物体受到代谢应激时,pArg可以通过自发或酶促的水解过程,捕捉并束缚细胞内的H+,降低细胞液中的[H]+并提高[P3O4]3-的浓度,提高细胞液缓冲能力,维持细胞内的pH值。5)pArg还可以影响到机体的磷酸化能力并进而影响生长。磷酸化能力的降低导致高能磷酸盐只被充分用于维持基本的细胞活动,而阻碍了机体的其他活动如生长和发育,例如一些软体动物的面盘幼体外壳将会由于高能磷酸盐的减少而变形。
最近,对蛋白质上磷酸化精氨酸的研究有了一些新进展。2009年,Tim Clausen发现并鉴定出原核生物中第一个蛋白精氨酸激酶-McsB,并研究了其可能参与的调控功能[3];2012年,在枯草芽孢杆菌中发现了第一个磷酸化精氨酸的磷酸酯酶-YwlE,并通过质谱技术,在以枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌模型,鉴定出87个蛋白中121个精氨酸磷酸化位点[6]。由于目前还没有针对pArg的抗体,因此急需建立制备anti-pArg抗体的方法,进而促进对该领域进行更深入的研究。
国际上目前针对酸不稳定N-磷酸的蛋白的检测(如:磷酸化组氨酸),发展了应用与检测抗原在结构上近似的类似物进行免疫,制备识别真实抗原的抗体的策略[7-8]。
参考文献:
1.Tony Hunter.Cell,2000,100,113-127.
2.Elsholz,A.K.W.,K.Turgay,et al.Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(19),7451-7456.
3.Fuhrmann,J.,A.Schmidt,et al.Science,2009,324(5932),1323-1327.
4.Schmidt A.;Trentini DB.;Spiess S.;Fuhrmann J.;Ammerer G.;Mechtler K.;Clausen T.Mol Cell Proteomics,2014,13,537-550.
5.Besant,P.G.;Attwood,P.V.;Piggott,M.J.Current Protein and PeptideScience,2009,10,536-550
6.Elsholz,Alexander K.W.Turgay,Becher,Hecker,Michael.Gerth,Ulf.Proc.Nati.Acad.Sci.,2012,47,10335-10337.
7.Jung-Min Kee,Bryeanna Villani,Laura R.Carpenter,and Tom W.Muir.J.Am.Chem.Soc.,2010,132(41),14327–14329.
8.Kee,J.M.,R.C.Oslund,et al.Nature Chemical Biology.,2013.9(7):416-428.
发明内容
本发明的目的在于提供一类磷酸化精氨酸类似物及其合成方法与应用。
所述一类磷酸化精氨酸类似物以磷酰基乙脒结构为主体,一类磷酸化精氨酸类似物的化学结构式为:
所述一类磷酸化精氨酸类似物(pArg analog)的合成路线如下:
其中,Z基团包括
R基团包括
R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8分别表示独立的氢,烷基,烯基,环烷基,芳基,芳烷基,杂环,杂环环烷基,或磷酸酯保护基;
X代表一种化学键或一种连接基团,范围包括烯烃,亚烯烃,亚炔烃,环烯烃,环炔烃,杂环烯,-(O-CH2-CH2)n-,或–(CH2)q,以及–(CH2)q中任意-CH2基团被-O-取代;
n取值1~100;q取值1~6;
Y包括H,-OR9,-NR9R10,-SR9,-COOR9,-C(O)NR9R10,-NHJ或者-C(O)Q;
R9和R10分别表示独立的氢,烷基,烯基,环烷基,芳基,芳烷基,杂环,杂环环烷基;
J代表一种氨基保护基团;
Q代表一种羧酸保护基团。
所述R可表示
所述R2和R3可表示H。
所述X可表示烷烃连接基团或-CH2-CH2-。
所述Y可表示-NR9R10,-NHJ;所述R9和R10可表示H。
所述R可代表R2和R3代表H;X代表-CH2-CH2-;Y代表-NR9R10而R9、R10代表H。
本发明通过上述合成方法获得与天然pArg在结构上类似、未见文献报道的新颖的一类磷酸化精氨酸类似物(pArg类似物),所述一类磷酸化精氨酸类似物可以作为半抗原,用于制备识别蛋白上pArg的抗体;应用一类磷酸化精氨酸类似物(如pAIE)所制备的抗体,具有识别pArg的专一性,与蛋白质中常见的其他磷酸化修饰形式(如pSer\pThr\pTyr等)交叉反应性低;另外,应用一类磷酸化精氨酸类似物(如pAIE)所制备的小鼠多克隆抗体,主要为IgG2a型,可用于筛选单克隆抗体。
所述一类磷酸化精氨酸类似物还可作为蛋白磷酸化精氨酸酯酶(如YwlE)的抑制剂(inhibitor),作为研究该类酯酶生物功能的生化试剂,或针对该类酯酶进行药物开发的先导化合物。
本发明提供一种抗体的制备流程,该流程由免疫动物开始(例如,哺乳动物),通过反复用前述免疫原实施免疫,之后从免疫动物身上收集血清,并使用生物常规技术分离血清中的抗体,如实施例2所示。前述免疫原也可用于体外抗体或结合蛋白的筛选,如噬菌体展示库技术,并使用生物常规技术分离与免疫原特异性结合的噬菌体和抗体。体内或体外筛选得到的抗体可能是单克隆或多克隆抗体,如实施例2、实施例5所示。该抗体不识别非磷酸化的蛋白或氨基酸,只识别磷酸化精氨酸残基并对其他磷酸化氨基酸残基没有响应,如实施例4所示。
本发明合成了一类磷酸化精氨酸类似物,还以前述磷酰基乙脒结构式(I)组成半抗原。该半抗原可与载体偶联,为抗磷酸化精氨酸抗体(anti-pArg antibody)的产生和结合提供免疫原。该载体材料可为蛋白、蛋白片段、合成多肽或半合成多肽,如实施例2所示。
本发明进一步涉及到免疫原产生的相应抗体。该抗体在识别蛋白中磷酸化精氨酸(pArg)的同时,并不识别非磷酸化精氨酸(Arg)、非磷酸化多肽、除磷酸化精氨酸外的磷酸化氨基酸、或含其它磷酸化氨基酸残基的多肽,如实施例3、实施例4所示。
本发明所涉及半抗原还可与可检测标记物共价结合。标记物可从酶中选择,还可从发光物质、放射性物质或其混合物中选择。标记物是一种过氧化酶,例如辣根过氧化物酶。发光物质作为标记物可以是生物发光、化学发光或荧光材料。
本发明提供了一种抗体的制备流程。该流程由免疫动物开始,通过反复用前述免疫原实施免疫,之后从免疫动物身上收集血清,并使用生物常规技术分离血清中的抗体,前述免疫原也可用于体外抗体或结合蛋白的筛选,如噬菌体展示库技术,并使用生物常规技术分离与免疫原特异性结合的噬菌体和抗体。体内或体外筛选得到的抗体可能是单克隆或多克隆抗体。该抗体不识别非磷酸化的蛋白或氨基酸,只识别磷酸化精氨酸残基并对其他磷酸化氨基酸残基没有响应。
本发明通过设计合成pArg的稳定类似物,如(2-((2-aminoethyl)amino)-2-iminoethyl)phosphonic acid(pAIE),并通过将其与载体蛋白(如keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联、免疫动物的策略,首次获得了可特异性识别蛋白质上pArg修饰的兔和鼠多克隆抗体。通过酶联免疫分析(ELISA)、蛋白质斑点杂交(dot-blot)、蛋白质电泳(SDS-PAGE)、蛋白质免疫印迹(Western bloting)、抗体免疫分型(isotyping)等多种手段的评价,证明:1)所发展的合成方法可以获得与天然pArg在结构上类似的、未见文献报道的新颖的pArg类似物;2)所合成的pArg类似物可以作为半抗原,用于制备识别蛋白上pArg的抗体;3)应用pArg类似物(如pAIE)所制备的抗体,具有识别pArg的专一性,与蛋白质中常见的其他磷酸化修饰形式(如pSer\pThr\pTyr等)交叉反应性低;4)应用pArg类似物(如pAIE)所制备的小鼠多克隆抗体,主要为为IgG2a型,具备筛选单克隆抗体的条件。
本发明通过分子设计,合成了一类化学性质稳定、与pArg结构类似的pArg类似物,并将此类类似物与载体蛋白偶联免疫动物的方法,建立了制备能识别蛋白质中磷酸化精氨酸抗体的方法并制备了多克隆抗体,此外还涉及所制备的多克隆抗体在生物检测、蛋白富集等生物分析领域中的应用。本发明合成的以磷酰基乙脒结构为主体的磷酸化精氨酸类似物(pArganalog),可以有效作为半抗原生成专一性识别磷酸化精氨酸(pArg)的抗体。本发明中所合成的磷酸化精氨酸类似物(pArg analog)由于与天然存在的pArg具有相似的结构,还可能作为蛋白磷酸化精氨酸酯酶(如YwlE)的抑制剂(inhibitor),作为研究该类酯酶生物功能的生化试剂,或针对该类酯酶进行药物开发的先导化合物。
附图说明
图1是本发明所述一类磷酸化精氨酸类似物的结构通式。
图2是本发明所述一类磷酸化精氨酸类似物的通用合成路线。
图3是合成示例及抗体制备中所用精氨酸类似物pAIE的分子结构式。
图4是实施例1中合成精氨酸类似物pAIE的合成路线图。
图5是实施例2中pAIE与KLH偶联制备免疫抗原的示意图。
图6是实施例2中用于血清滴度检测的精氨酸磷酸化多肽色谱制备图。
图7是实施例2中用于血清滴度检测的精氨酸磷酸化多肽的一级质谱鉴定图。
图8是实施例2中用于血清滴度检测的精氨酸磷酸化多肽的二级质谱图。
图9是实施例2中应用pAIE为半抗原,免疫小鼠后的血清滴度图。
图10是实施例3中免疫血清经蛋白A亲和纯化后,各组份的ELISA测定图。
图11是实施例3中是实施例3中免疫血清经蛋白A亲和纯化后,各组份的电泳图。
图12是实施例4中纯化抗体的斑点印迹(dot-blot)特异性评价图。
图13是实施例5中免疫血清ELISA抗体亚型分析图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
除非另外定义,所有使用的技术及科学词汇含义与一般专业技术词汇的通用理解相同。
图1是本发明所述一类磷酸化精氨酸类似物的结构通式。
图2是本发明所述一类磷酸化精氨酸类似物的通用合成路线。
本发明所述制备识别蛋白质中磷酸化精氨酸抗体的技术路线如下:
1.通过计算模拟磷酸化精氨酸半抗原的电子云结构,设计合成磷酸化精氨酸类似物,如N-(2-乙胺)-2-膦酸乙脒(pAIE)(图3),并通过逆合成分析,设计合成步骤(图4),最终合成精氨酸类似物pAIE,具体合成路线见实施例1。
2.利用化学偶联的方法制备免疫原,将设计合成的磷酸化精氨酸类似物(pAIE)与钥孔戚血蓝素蛋白(KLH)通过戊二醛法偶联,经透析、浓缩,得到pAIE-KLH抗原(图5)。多次使用pAIE-KLH抗原免疫注射小鼠或兔子,静脉采血,并使用pAIE-BSA,pArg-BSA或得到磷酸化精氨酸肽段(pArg-pep)筛选抗原验证血清中所含抗体确实为pAIE半抗原产生,多次免疫并测定抗体滴度,当抗体滴度增长至平台期后,采血,分离抗血清(图9)。
3.筛选抗体所使用的pAIE-BSA利用化学偶联方法获得,筛选抗体所使用的磷酸化精氨酸肽段(pArg-pep)设计自蛋白精氨酸激酶McsB天然底物CtsR,通过固相多肽合成方法获得未磷酸化肽段(pep)后,利用蛋白精氨酸激酶McsB进行体外酶促磷酸化,并经色谱制备分离后,获得pArg-pep(参见图6~8和表1,表1给出b、y离子匹配结果)。
表1
4.抗血清经蛋白A偶联填料纯化后,得到抗磷酸化精氨酸多克隆抗体,利用合成的磷酸化精氨酸肽段(pArg-pep)进行ELISA实验测试亲和纯化组份是否识别磷酸化精氨酸(图10),并利用蛋白电泳,测定各个亲和纯化组份中的蛋白纯度(图11)。使用合成的含磷酸化精氨酸,磷酸化丝氨酸,磷酸化苏氨酸,磷酸化酪氨酸多肽(pArg-pep,pSer-pep,pThr-pep,pTyr-pep),通过dot-blot实验测试亲和纯化抗体的特异性(图12)。最后,利用山羊抗鼠分型二抗(IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3,IgM),通过ELISA实验测试亲和纯化抗体亚型(图13)。
以下给出具体实施例。
实施例1:磷酸化精氨酸类似物N-(2-乙胺)-2-膦酸乙脒(pAIE)的合成
总体合成路线如图4所示。
化合物1(2-二乙基膦酰基-硫代乙酰胺)的合成:
圆底烧瓶中加入氰甲基膦酸二乙酯(5.30g,30mmol),三乙胺(6.05g,60mmol),四丁基溴化铵(125mg),甲苯(25mL)。在氩气保护条件下,向反应瓶中通入干燥的硫化氢(H2S)气体,10℃下搅拌反应5h,随后常温反应12h。反应结束后,向反应液中通入过量氮气,4℃冷却3h后,过滤得到黄色固体。过滤所得黄色固体在氮气保护条件下,用甲苯洗涤,得到产物化合物1(2.34g,产率37%)。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.45(s,1H,NH protons)and 7.73(s,1H,NH protons),4.19(dq,J=14.2,7.1Hz,4H,-OCH2CH3),3.44(d,J=20.7Hz,2H,-PCH2),1.38(dt,J=7.1Hz,6H,-OCH2CH3)ppm.
13C NMR(126MHz,CDCl3):δ198.07(d,J=6.5Hz,-C=S),63.24(d,J=6.7Hz,-OCH2CH3),43.05(d,J=125.4Hz,-PCH2),16.30(d,J=6.1Hz,-OCH2CH3)ppm.
31P NMR(200MHz,CDCl3):δ21.03ppm.
ESI-MS:234.2(理论值[MW+Na]+),234.25(实测值).
化合物2(2-二乙基膦酰基-S-甲基硫代乙酰胺碘盐)的合成:
氩气保护下,将化合物1(470mg,2.23mmol)的溶解于2.5mL丙酮中,室温搅拌下加入碘甲烷(1.26g,8.91mmol)。反应30min后,过滤得到白色固体,产物用无水乙醚洗涤2-3次后,真空干燥,得到化合物2(666mg,产率83%)。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ4.50-4.16(m,4H,-OCH2CH3),3.96(d,J=22.5Hz,2H,-PCH2),3.04(d,J=0.9Hz,3H,-SCH3),2.67(s,2H,-NH2),1.41(dt,J=7.0Hz,6H,-OCH2CH3)ppm.
31P NMR(200MHz,CDCl3):δ15.81ppm.
化合物3(N-(2-乙胺基甲酸叔丁酯)-2-二乙基膦酰基-乙脒)的合成:
将化合物2(611mg,1.73mmol)及N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺(277mg,1.73mmol)溶解于甲醇(5mL),在氩气保护下,室温搅拌反应3h。反应液减压条件下除去溶剂,得到白色固体。将固体用乙醚洗涤两次,得到化合物3(628mg,产率78%)。
1H NMR(400MHz,D2O):δ4.16(p,J=7.2Hz,4H,-OCH2CH3),3.39(d,J=5.8Hz,2H,-C(O)NHCH2CH2),3.28(d,J=5.0Hz,-C(O)NHCH2CH2),1.35(s,9H,-(CH3)3C),1.28(t,J=7.0Hz,6H,-OCH2CH3)ppm.(-CH2P,exchange in D2O)
13C NMR(101MHz,D2O):δ160.21(d,J=6.1Hz,-C=NH),158.15(s,-C=O),81.42(s,-(CH3)3C),65.01(d,J=6.9Hz,-OCH2CH3),42.39(s,-C(O)NHCH2CH2),37.86(s,-C(O)NHCH2CH2),27.70(s,-(CH3)3C),15.69(d,J=5.7Hz,-OCH2CH3)ppm.
31P NMR(162MHz,D2O):δ20.51ppm.
ESI-MS:339.2(理论值[MW+H]+),339.3(实测值).
化合物4(N-(2-乙胺)-2-膦酸乙脒)的合成
化合物3(370mg,0.80mmol)溶解于10mL 33%氢溴酸醋酸溶液,氩气保护下室温搅拌48h。减压浓缩反应混合物,去除溶剂后得到油状粗产物。粗产物溶于2mL 0.1%醋酸后,用0.1%醋酸平衡后的阳离子交换柱(型号AG 50W-X8)纯化,经6mL 0.1%醋酸洗去杂质后,产物用500mM醋酸铵洗脱,多次冷冻干燥后,得到白色固体化合物4(117mg,产率81%)。
1H NMR(500MHz,D2O):δ3.64(t,J=5.8Hz,2H,-C(NH)NHCH2CH2),3.28(t,J=5.9Hz,2H,-CNHCH2CH2),2.90(dd,J=20.0,6.7Hz,2H,-CH2P)ppm.
13C NMR(126MHz,D2O):δ164.39(d,J=4.2Hz,-C=NH),39.73(s,-C(NH)NHCH2CH2),37.15(s,-C(NH)NHCH2CH2),34.57(d,J=117.4Hz,-CH2P)ppm.
31P NMR(200MHz,D2O):δ10.53ppm.
ESI-MS:182.1(理论值[MW+H]+),182.0(实测值).
实施例2:应用磷酸化精氨酸类似物pAIE为半抗原,制备抗磷酸化精氨酸的抗体
pAIE与载体蛋白的化学偶联及免疫:
如图5所示,将pAIE和钥孔血蓝蛋白(KLH)分别溶解于偶联缓冲液(0.1M Na2CO3,0.15MNaCl,pH 8.5)中并按比例混合,其中pAIE终浓度为15mM,KLH终浓度为2mg/mL,缓慢加入25%的戊二醛至终浓度为0.5%,室温孵育2h后,加入NaBH4固体至终浓度10mg/mL,室温反应2h后于PBS 7.4中透析过夜,用Bradford法测定蛋白浓度。
制备的pAIE-KLH作为免疫抗原,通过与等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合乳化后,按200μg/小鼠/次,400μg/兔/次,皮下多点或腋窝注射于6周龄的洁净级小鼠(BALB/C)或6周龄新西兰白兔。免疫间隔14~1天,重复2~次后,静脉采血,分离血清。
检测抗原的制备:
检测抗原使用化学合成的多肽(序列:Ac-KRGGGGYIKIIKV-NH2),经蛋白精氨酸激酶(McsB)体外磷酸化后,得到含有磷酸化精氨酸的多肽(序列:Ac-KpRGGGGYIKIIKV-NH2),经色谱分离制备,具体方法如下。首先包含精氨酸激酶McsB-His6基因的质粒(质粒由Tim Clausen课题组提供)转入到包含pLys基因的大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,挑取单克隆。在1L LB培养基中接种1mL过夜培养的菌液37℃、250rpm条件下培养至至OD600=0.8。加入0.5mM IPTG,在18℃、200rpm的条件下诱导表达12h。菌体在4℃、8000rpm离心收集后,加入15mL裂解液(裂解液:50mM KH2PO4,500mM KCl,1mMβ-巯基乙醇,5%甘油),150μL 100mM PMSF储备液,4℃下超声破碎10min,14000g离心10min,保留上清溶液。将上清液通过镍柱分离,经咪唑梯度洗脱后得到McsB,蛋白纯度经电泳验证,蛋白浓度用Bradford法测定。利用得到的McsB对化学合成的底物多肽(Ac-KRGGGGYIKIIKV-NH2)进行体外磷酸化反应。反应条件为:20mM Tris(pH=8.0),5mM MgCl2,1mM ATP,15μM McsB,40μM多肽,30℃保温1h。
磷酸化的多肽通过HPLC分离纯化后(A相:超纯水0.1%甲酸B相:95%乙腈5%超纯水0.1%甲酸;柱子:TC-C18:4.6um x 15cm;流速:1mL/min。)(图6),纯度和修饰位点分别经过一级质谱(图7)和二级质谱(nano LC-MS/MS)(图8)鉴定。
免疫血清滴度的测定:
每个免疫间隔后获得的小鼠血清,使用含有磷酸化精氨酸的多肽(序列:Ac-KpRGGGGYIKIIKV-NH2)为包被抗原,通过倍比稀释和酶联免疫吸附(ELISA)的方法,进行滴度测定和评价(图9)。具体ELISA条件见实施例3。
实施例3:小鼠抗磷酸化精氨酸多克隆抗体的纯化
结合/洗涤缓冲液:0.15M NaCl,20mM Na2HPO4,pH 8.0。
洗脱缓冲液:0.1M glycine,pH 2.5。
中和缓冲液:1M Tris-HCl,pH 8.5。
取20μL protein A琼脂糖微珠(50%悬浊液)于微型纯化柱中,自然流干,分别用5倍柱体积(50μL)ddH2O和5倍柱体积(50μL)结合缓冲液洗涤。小鼠抗磷酸化精氨酸血清(10μL)用9倍(90μL)结合缓冲液稀释后小心加于柱胶上方,收集流穿,之后用10倍柱体积(100μL)洗涤缓冲液洗涤微珠,以每管20μL接收洗涤组份;之后用10柱体积(100μL)洗脱缓冲液洗涤树脂,以每管20μL接收洗脱组份,收集的洗脱组份立刻用2μL的中和缓冲液中和。
纯化获得的各组分(包含未纯化组分、流穿组分、洗涤组分、洗脱组分)分别用含有磷酸化精氨酸的多肽(序列:Ac-KpRGGGGYIKIIKV-NH2)为包被抗原,通过ELISA进行功能验证(图10),并用SDS-PAGE及银染进行纯度评价。(图11)
ELISA条件:
包被缓冲液:0.032M Na2CO3,0.068M NaHCO3,pH 9.6。
洗涤缓冲液:25mM Tris pH 8.5,137mM NaCl,2.7mM KCl,0.1%(v/v)Tween 20。
在96孔酶标板中,每孔加入50μL(1μM)用包被缓冲液稀释的实施例2中所述多肽(负对照)及磷酸化多肽,室温震荡孵育包被2h;除去溶液后用洗涤缓冲液洗涤1次,随后每孔加入200μL含1%BSA的洗涤缓冲液,室温震荡封闭1h后,除去封闭液。抗体纯化步骤中的上样样品,流穿,洗涤及洗脱各组份,用洗涤缓冲液稀释100倍,以每孔100μL加入酶标板中,每个样品设置3组平行,室温震荡孵育45min。除去溶液后用洗涤缓冲液洗涤3次。山羊抗鼠二抗(GAM-HRP)用洗涤缓冲液稀释5000倍,按每孔100μL加入,室温震荡孵育45min,除去二抗溶液后用洗涤缓冲液洗涤3次。每孔加入Ultra TMB底物100μL,室温孵育5min之后加入50μL2N硫酸终止显色,测定样品在450nm的OD值,并作图。(图10)
实施例4:小鼠抗磷酸化精氨酸多克隆抗体的特异性表征方法
洗涤缓冲液:25mM Tris pH 8.5,137mM NaCl,2.7Mm KCl,0.1%(v/v)Tween 20
将通过固相合成获得的模型多肽pep(序列Ac-KRGGGGYIKIIKV-NH2)、磷酸化丝氨酸多肽pSer-pep(序列Ac-KpSGGGGYIKIIKV-NH2)、磷酸化苏氨酸多肽pThr-pep(序列Ac-KpTGGGGYIKIIKV-NH2)、磷酸化酪氨酸多肽pTyr-pep(序列Ac-KpYGGGGYIKIIKV-NH2)及实施例2中酶促合成的磷酸化精氨酸多肽pArg-pep(序列Ac-KpRGGGGYIKIIKV-NH2)溶解于PBS(pH=7.4),分别取0.2μL(667μM)点于硝酸纤维素膜上,自然干燥后用于随后的蛋白斑点印迹(dot-blot)分析;将干燥的硝酸纤维素膜浸泡于1%BSA的洗涤缓冲液中,室温震荡1h进行封闭后,与1∶100稀释的纯化的小鼠多抗室温震荡孵育45min,随后用洗涤缓冲液洗涤3次(3×5min)。山羊抗鼠二抗(GAM-HRP)用洗涤缓冲液稀释5000倍,加入硝酸纤维素膜,室温震荡孵育45min,除去溶液后用洗涤缓冲液洗涤3次(3×5min)。加入ECL发光底物后,用GE Amersham Imager 600化学发光模式扫描成像,结果如图12所示。
实施例5:小鼠抗磷酸化精氨酸多克隆抗体的免疫分型
包被缓冲液:0.032M Na2CO3,0.068M NaHCO3,pH 9.6。
洗涤缓冲液:25mM Tris pH 8.5,137mM NaCl,2.7Mm KCl,0.1%(v/v)Tween 20。
在96孔酶标板中,每孔加入50μL(1μM)用包被缓冲液稀释的pep(负对照)和pArg-pep,室温震荡孵育包被2h,除去溶液后用洗涤缓冲液洗涤1次。除去溶液后用洗涤缓冲液洗涤1次,随后每孔加入200μL含1%BSA的洗涤缓冲液,室温震荡封闭1h后,除去封闭液。将免疫后获得的小鼠抗血清用洗涤缓冲液稀释100倍,以每孔100μL加入在96孔酶标板中,室温震荡孵育45min,除去溶液后用洗涤缓冲液洗涤3次。每空依次加入100μL 5000倍稀释的山羊抗小鼠分型二抗(IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3,IgM),室温震荡孵育45min,除去溶液后用洗涤缓冲液洗涤3次。每孔加入100μL Ultra TMB底物,室温孵育5min,之后加入50μL 2N硫酸终止液,测定样品在450nm的OD值,实验结果如图13所示。
在此实施例1中磷酰基乙脒结构式I如图3所示。
Claims (10)
1.一类磷酸化精氨酸类似物,其特征在于以磷酰基乙脒结构为主体,一类磷酸化精氨酸类似物的化学结构式为:
2.如权利要求1所述一类磷酸化精氨酸类似物的合成路线如下:
其中,Z基团包括
R基团包括
R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8分别表示独立的氢,烷基,烯基,环烷基,芳基,芳烷基,杂环,杂环环烷基,或磷酸酯保护基;
X代表一种化学键或一种连接基团,范围包括烯烃,亚烯烃,亚炔烃,环烯烃,环炔烃,杂环烯,-(O-CH2-CH2)n-,或–(CH2)q,以及–(CH2)q中任意-CH2基团被-O-取代;
n取值1~100;q取值1~6;
Y包括H,-OR9,-NR9R10,-SR9,-COOR9,-C(O)NR9R10,-NHJ或者-C(O)Q;
R9和R10分别表示独立的氢,烷基,烯基,环烷基,芳基,芳烷基,杂环,杂环环烷基;
J代表一种氨基保护基团;
Q代表一种羧酸保护基团。
3.如权利要求2所述合成路线,其特征在于所述R表示
所述R2和R3可表示H;所述X可表示烷烃连接基团或-CH2-CH2-。
4.如权利要求2所述合成路线,其特征在于所述Y表示-NR9R10,-NHJ;所述R9和R10表示H。
5.如权利要求2所述合成路线,其特征在于所述R代表R2和R3代表H;X代表-CH2-CH2-;Y代表-NR9R10而R9、R10代表H。
6.如权利要求1所述一类磷酸化精氨酸类似物的应用,其特征在于所述一类磷酸化精氨酸类似物作为半抗原,用于制备识别蛋白上pArg的抗体。
7.如权利要求6所述应用,其特征在于所述抗体具有识别pArg的专一性,与蛋白质中常见的其他磷酸化修饰形式交叉反应性低,所述其他磷酸化修饰形式包括pSer,pThr,pTyr;所述抗体为小鼠多克隆抗体,所述小鼠多克隆抗体可为IgG2a型小鼠多克隆抗体,IgG2a型小鼠多克隆抗体可用于筛选单克隆抗体。
8.如权利要求6所述应用,其特征在于所述一类磷酸化精氨酸类似物作为蛋白磷酸化精氨酸酯酶(如YwlE)的抑制剂(inhibitor),作为研究该类酯酶生物功能的生化试剂,或针对该类酯酶进行药物开发的先导化合物。
9.如权利要求6所述应用,其特征在于所述抗体的制备流程如下:
由免疫动物开始,通过反复用免疫原实施免疫,再从免疫动物身上收集血清,并使用生物常规技术分离血清中的抗体;所述免疫原可用于体外抗体或结合蛋白的筛选,如噬菌体展示库技术,并使用生物常规技术分离与免疫原特异性结合的噬菌体和抗体;体内或体外筛选得到的抗体是单克隆或抗体多克隆抗体;该抗体不识别非磷酸化的蛋白或氨基酸,只识别磷酸化精氨酸残基并对其他磷酸化氨基酸残基没有响应;所述免疫动物包括但不限于哺乳动物。
10.如权利要求6所述应用,其特征在于所述半抗原与可检测标记物共价结合,标记物从酶中选择,或从发光物质、放射性物质、发光物质与放射性物质混合物中选择;所述标记物可为过氧化酶,所述过氧化酶可为辣根过氧化物酶。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510687571.1A CN106608890A (zh) | 2015-10-21 | 2015-10-21 | 一类磷酸化精氨酸类似物及其合成方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510687571.1A CN106608890A (zh) | 2015-10-21 | 2015-10-21 | 一类磷酸化精氨酸类似物及其合成方法与应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106608890A true CN106608890A (zh) | 2017-05-03 |
Family
ID=58610792
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510687571.1A Pending CN106608890A (zh) | 2015-10-21 | 2015-10-21 | 一类磷酸化精氨酸类似物及其合成方法与应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106608890A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111323283A (zh) * | 2020-04-20 | 2020-06-23 | 厦门大学 | 一种富集n-磷酸化蛋白的方法 |
CN112028934A (zh) * | 2020-08-17 | 2020-12-04 | 宁波大学 | 一种磷酸化精氨酸类似物的合成方法 |
CN114736238A (zh) * | 2022-04-14 | 2022-07-12 | 厦门大学 | 一种含稳定同位素的蛋白质羧基磷酸化标记试剂及其制备方法与应用 |
-
2015
- 2015-10-21 CN CN201510687571.1A patent/CN106608890A/zh active Pending
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
GUSTAVE BERGNES ET AL.: ""Synthesis and creatine kinase inhibitory activity of non-hydrolyzable analogs of phosphocreatine"", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS》 * |
JAKOB FUHRMANN,ET AL.: ""Synthesis and Use of a Phosphonate Amidine to Generate an Anti-Phosphoarginine-Specific Antibody"", 《ANGEW. CHEM. INT. ED.》 * |
WHARTON, CLIFFORD J. ET AL.: ""Inhibitors of pyrimidine biosynthesis. Part 2. The synthesis of amidine phosphonates as potential inhibitors of carbamoyl phosphate synthase"", 《 JOURNAL OF THE CHEMICAL SOCIETY, PERKIN TRANSACTIONS 1: ORGANIC AND BIO-ORGANIC CHEMISTRY》 * |
美国化学会: ""RN号"", 《STN》 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111323283A (zh) * | 2020-04-20 | 2020-06-23 | 厦门大学 | 一种富集n-磷酸化蛋白的方法 |
CN111323283B (zh) * | 2020-04-20 | 2021-06-25 | 厦门大学 | 一种富集n-磷酸化蛋白的方法 |
CN112028934A (zh) * | 2020-08-17 | 2020-12-04 | 宁波大学 | 一种磷酸化精氨酸类似物的合成方法 |
CN112028934B (zh) * | 2020-08-17 | 2022-09-27 | 宁波大学 | 一种磷酸化精氨酸类似物的合成方法 |
CN114736238A (zh) * | 2022-04-14 | 2022-07-12 | 厦门大学 | 一种含稳定同位素的蛋白质羧基磷酸化标记试剂及其制备方法与应用 |
CN114736238B (zh) * | 2022-04-14 | 2024-05-24 | 广东磷基生物科技有限公司 | 一种含稳定同位素的蛋白质羧基磷酸化标记试剂及其制备方法与应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6971927B2 (ja) | リスペリドンハプテンへの抗体及びその使用 | |
ES2669565T3 (es) | Haptenos de risperidona y paliperidona | |
CA2882492C (en) | Antibodies to aripiprazole haptens and use thereof | |
AU2013305938B2 (en) | Antibodies to paliperidone haptens and use thereof | |
CN100567324C (zh) | 一种微囊藻毒素单克隆抗体及其制备方法与应用 | |
CN102768284B (zh) | 一种卡马西平均相酶免疫检测试剂的制备方法 | |
US20220220134A1 (en) | Phosphohistidine mimetics and antibodies to same | |
CN105277712B (zh) | 一种鉴定赖氨酸ε‑氨基侧链单甲基化修饰的方法 | |
CN106608890A (zh) | 一类磷酸化精氨酸类似物及其合成方法与应用 | |
CN104017070A (zh) | 一种高灵敏度的多菌灵完全抗原的合成方法 | |
CN101776685B (zh) | 检测三甲氧苄胺嘧啶药物的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
Ouyang et al. | Development of a stable phosphoarginine analog for producing phosphoarginine antibodies | |
CN102206270B (zh) | 石房蛤毒素人工抗原和抗体及其制备方法和应用 | |
KR20210143785A (ko) | 미트라기닌에 대한 면역분석 | |
CN109180519B (zh) | 一种喹乙醇代谢物抗原、抗体及酶联免疫检测试剂盒与检测方法 | |
CN104478813A (zh) | 5-氟尿嘧啶衍生物、5-氟尿嘧啶免疫原及其抗体与5-氟尿嘧啶检测试剂盒 | |
JPH02500162A (ja) | 立体選択性シンターゼ活性を示す抗体結合部、およびそれを用いる方法 | |
FASCIGLIONE et al. | Hapten—Carrier Interactions and Their Role in the Production of Monoclonal Antibodies against Hydrophobic Haptens | |
ES2457079T3 (es) | Haptenos e inmunógenos de éxtasis | |
CN106478824A (zh) | 一种精准Fc位点共价偶联标记的生物素化抗体 | |
CN102295698B (zh) | 环孢霉素a免疫原、特异性抗体、检测试剂及检测试剂盒 | |
CN108079957A (zh) | 一种n-磷酸化肽段和蛋白质富集材料及其制备和应用 | |
JPS61180799A (ja) | モノクローナル抗体 | |
CN105968205A (zh) | 一种抗前列腺特异性膜抗原的纳米抗体 | |
CN102617729B (zh) | 他克莫司免疫原、抗他克莫司特异性抗体和他克莫司检测试剂 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170503 |