CN109916701A - 一种磷酸化蛋白的富集方法和磷酸化蛋白的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种磷酸化蛋白的富集方法和磷酸化蛋白的检测方法,属于磷酸化蛋白富集检测技术领域。本发明所述磷酸化蛋白的富集方法包括以下步骤:将磷酸化蛋白样品、缓冲溶液与壳聚糖功能化磁性材料混合,磁分离后,得到富集有磷酸化蛋白的磁性材料;将所述富集有磷酸化蛋白的磁性材料与酸液混合,磁分离后,得到磷酸化蛋白的富集液;所述壳聚糖功能化磁性材料的内核为Fe3O4,Fe3O4外层依次包裹二氧化硅和壳聚糖聚合材料。本发明提供的富集方法能够克服传统免疫沉淀富集方法抗体的局限,具有广泛的适用性。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质富集检测技术领域,尤其涉及一种磷酸化蛋白的富集方法和磷酸化蛋白的检测方法。
背景技术
蛋白质的翻译后修饰在生命过程中具有非常重要的作用,同一蛋白在不同位点的修饰可能对应不同的功能。蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的修饰方式之一,对许多生物的细胞功能起着生物“开/关”作用。因此,研究磷酸化蛋白质,建立高灵敏度检测技术,对于解析生命体复杂多样的生理和病理过程是非常有必要的。
蛋白质发生磷酸化修饰后,其分子质量会发生相应的改变,通过质谱能够精确测定蛋白质的分子质量。但由于磷酸化蛋白的含量低且动态范围广,且带负电的磷酸化蛋白质在质谱分析较为常用的正离子模式下响应较弱,这些因素使低丰度磷酸化蛋白质相对于普通蛋白质鉴定有更大难度,因而在质谱检测前往往需要对发生修饰的磷酸化蛋白或肽段进行富集。
目前最为常用的是免疫沉淀富集法,也就是利用抗体特异性识别磷酸化蛋白,进一步对富集得到的磷酸化蛋白进行质谱鉴定。但是由于抗体抗原反应的特异性,这种方法的富集效果和选择受到所选抗体的局限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磷酸化蛋白的富集方法和磷酸化蛋白的检测方法,本发明提供的富集方法能够克服传统免疫沉淀富集方法抗体的局限,具有广泛的适用性。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种磷酸化蛋白的富集方法,包括以下步骤:
将磷酸化蛋白样品、缓冲溶液与壳聚糖功能化磁性材料混合,磁分离后,得到富集有磷酸化蛋白的磁性材料;
将所述富集有磷酸化蛋白的磁性材料与酸液混合,磁分离后,得到磷酸化蛋白的富集液;
所述壳聚糖功能化磁性材料的内核为Fe3O4,所述Fe3O4外层依次包裹二氧化硅和壳聚糖聚合材料。
优选的,所述壳聚糖功能化磁性材料由包括Fe3O4、水、正硅酸乙酯、交联剂和壳聚糖的原料制备得到。
优选的,所述缓冲溶液的pH值为10~12。
优选的,所述壳聚糖功能化磁性材料以悬浮液的形式提供,所述悬浮液中壳聚糖功能化磁性材料的浓度为1~10mg/mL。
优选的,所述悬浮液中的液态物质为3wt.%的冰乙酸水溶液。
优选的,所述悬浮液与缓冲溶液的体积比为1:(1~100)。
优选的,所述酸液为质量浓度0.1%的三氟乙酸的水溶液。
优选的,所述酸液与悬浮液的体积比为1:1。
本发明还提供了一种磷酸化蛋白的检测方法,包括以下步骤:将上述技术方案任一项所述富集方法得到的磷酸化蛋白的富集液与芥子酸混合后,点在靶板上,采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪对磷酸化蛋白的含量进行测定。
优选的,所述磷酸化蛋白的富集液与芥子酸的体积比为1:(1~3)。
本发明提供了一种磷酸化蛋白的富集方法,包括以下步骤:将磷酸化蛋白样品、缓冲溶液与壳聚糖功能化磁性材料混合,磁分离后,得到富集有磷酸化蛋白的磁性材料;将所述富集有磷酸化蛋白的磁性材料与酸液混合,磁分离后,得到磷酸化蛋白的富集液;所述壳聚糖功能化磁性材料的内核为Fe3O4,Fe3O4外层依次包裹二氧化硅和壳聚糖聚合材料。本发明所述壳聚糖功能化磁性材料带正电,磷酸化蛋白带负电,混合后,磷酸化蛋白样品中的磷酸化蛋白与壳聚糖功能化磁性材料发生静电吸附,经磁分离后,得到富集有磷酸化蛋白的磁性材料;将所述富集有磷酸化蛋白的磁性材料与酸液混合,在酸性条件下,壳聚糖功能化磁性材料表面电荷发生变化,使磷酸化蛋白从壳聚糖功能化磁性材料表面解吸出来,经磁分离后,得到磷酸化蛋白的富集液,从而实现了磷酸化蛋白的富集。
本发明提供的富集方法,无需采用抗体,因而不用受抗体的局限,具备广泛的适用性。此外,本发明的壳聚糖功能化磁性材料吸附洗脱条件温和,可大容量吸附磷酸化蛋白,从而降低成本,避免了蛋白的变性,增加了整个体系的生物相容性。
本发明的壳聚糖功能化磁性材料在四氧化三铁外包覆一层二氧化硅,二氧化硅层能够保护四氧化三铁内核,使材料具有良好的磁性,便于分离;另外,二氧化硅层使壳聚糖功能化磁性材料还具有良好的亲水性,从而保障了壳聚糖功能化磁性材料在酸水溶液中具有良好的分散性。
将本发明得到的磷酸化蛋白的富集液采用MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸飞行时间质谱)进行测定,具有较高的灵敏度。
附图说明
图1为壳聚糖功能化磁性材料的透射电镜照片;
图2为实施例2测定的酪蛋白的MALDI质谱图;
图3为对比例测定的酪蛋白的MALDI质谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种磷酸化蛋白的富集方法,包括以下步骤:
将磷酸化蛋白样品、缓冲溶液与壳聚糖功能化磁性材料混合,磁分离后,得到富集有磷酸化蛋白的磁性材料;
将所述富集有磷酸化蛋白的磁性材料与酸液混合,磁分离后,得到磷酸化蛋白的富集液;
所述壳聚糖功能化磁性材料的内核为Fe3O4,Fe3O4外层依次包裹二氧化硅和壳聚糖聚合材料。
本发明将磷酸化蛋白样品、缓冲溶液与壳聚糖功能化磁性材料混合,磁分离后,得到富集有磷酸化蛋白的磁性材料。
在本发明中,所述缓冲溶液的pH值优选为10~12,所述缓冲溶液优选为氯化铵/氨水缓冲溶液、碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液。
本发明对所述磷酸化蛋白样品中磷酸化蛋白的含量没有特殊要求,任意含量均可。本发明对所述磷酸化蛋白样品中磷酸化蛋白的具体种类没有特殊要求,任意需要富集的磷酸化蛋白均可。在本发明的具体实施方式中,所述磷酸化蛋白优选为酪蛋白。
在本发明中,所述壳聚糖功能化磁性材料的内核为Fe3O4,所述Fe3O4外层依次包裹二氧化硅和壳聚糖聚合材料。本发明所述的壳聚糖功能化磁性材料在四氧化三铁外包覆一层二氧化硅,二氧化硅层能够保护四氧化三铁内核,使材料具有良好的磁性,便于分离;另外,二氧化硅层使壳聚糖功能化磁性材料还具有良好的亲水性,从而保障了壳聚糖功能化磁性材料在酸水溶液中具有良好的分散性。
在本发明中,所述壳聚糖功能化磁性材料优选由包括Fe3O4、水、正硅酸乙酯、交联剂和壳聚糖的原料制备得到,所述壳聚糖功能化磁性材料的制备优选包括以下步骤:在碱性条件下,将正硅酸乙酯、水与Fe3O4进行反应,得到Fe3O4@SiO2磁性颗粒;将所述Fe3O4@SiO2磁性颗粒与壳聚糖、交联剂进行交联反应,得到壳聚糖功能化磁性材料。
本发明优选在碱性条件下,将正硅酸乙酯、水与Fe3O4进行反应,得到Fe3O4@SiO2磁性颗粒。
本发明对所述正硅酸乙酯的来源没有特殊要求,采用本领域技术人员熟知的市售商品即可。本发明对所述Fe3O4的来源没有特殊要求,采用本领域技术人员熟知的市售商品或自行制备得到均可。
当所述Fe3O4自行制备得到时,所述Fe3O4的制备优选包括以下步骤:
将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O混合,加入酸调整混合液的pH值至酸性,超声一段时间,加入碱调整超声后混合液的pH值>10进行共沉淀反应,经磁分离后得到Fe3O4。
本发明将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O混合,加入酸调整混合液的pH值至酸性,得到酸性混合液。在本发明中,所述FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O的摩尔比优选为4:3。本发明对所述FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O的混合方式没有特殊要求,采用本领域技术人员熟知的混合方式即可。在本发明中,所述酸优选为浓盐酸,所述浓盐酸的质量浓度优选为36~38%。
得到酸性混合液后,本发明对所述酸性混合液进行超声以除去混合液中的氧气。在本发明中,所述超声的时间优选为10min以上。本发明对所述超声的频率和功率没有特殊要求,采用本领域技术人员熟知的超声频率和功率即可。
超声后,本发明优选加入碱调整超声后混合液的pH值>10进行共沉淀反应,经磁分离后得到Fe3O4。在本发明中,所述碱优选为氨水。在本发明中,所述共沉淀反应的温度优选为50~80℃,所述共沉淀反应的时间优选在20min以上,进一步优选为20~50min。本发明所述共沉淀反应优选在搅拌条件下进行。在本发明中,所述搅拌的转速优选为200~1000rpm。搅拌后,本发明优选静置10~60min。本发明所述共沉淀反应过程中,二价铁离子和三价铁离子在氢氧根的作用下,发生共沉淀反应,得到四氧化三铁。
本发明所述Fe3O4优选以Fe3O4的乙醇分散液的形式提供,本发明对所述Fe3O4的乙醇分散液中乙醇的用量没有特殊要求,能够使Fe3O4均匀分散开来即可。在本发明中,所述正硅酸乙酯与Fe3O4的乙醇溶液的体积比优选为(1~5):25;所述水与Fe3O4的乙醇分散液的体积比优选为1:2。
本发明优选先将Fe3O4的乙醇分散液与水混合,超声分散一段时间,调整混合液的pH值至碱性,最后加入正硅酸乙酯进行反应。在本发明中,所述超声的时间优选为5~15min。本发明对所述碱性条件的具体pH值没有特殊要求,只要pH值大于7均可。本发明优选采用氨水调节反应液至碱性条件。
在本发明中,所述反应的温度优选为55~65℃,进一步优选为60℃;所述反应的时间优选为2~4h,进一步优选为3~4h;所述反应优选在搅拌条件下进行。本发明对所述搅拌的速率没有特殊要求,采用本领域技术人员熟知的搅拌速率即可。本发明所述反应过程中,正硅酸乙酯分子发生水解,分子中的乙氧基逐步被水中的羟基所取代,而取代后的产物又不断缩聚,包覆在Fe3O4表面。
反应完成后,本发明优选还包括对反应产物进行洗涤和干燥,得到Fe3O4@SiO2磁性颗粒。在本发明中,所述洗涤的洗涤液优选为乙醇,所述干燥优选为真空干燥。
得到Fe3O4@SiO2磁性颗粒后,本发明优选将所述Fe3O4@SiO2磁性颗粒与壳聚糖、交联剂进行交联反应,得到壳聚糖功能化磁性材料。
本发明优选先将Fe3O4@SiO2磁性颗粒与壳聚糖进行混合,然后加入交联剂进行交联反应。在本发明中,所述壳聚糖优选以壳聚糖溶液的形式进行混合,所述壳聚糖溶液的溶剂优选为乙酸水溶液,所述乙酸水溶液中乙酸的体积分数优选为1~20%,进一步优选为2~10%;所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度优选为0.1~10%,进一步优选为1~5%。在本发明中,所述Fe3O4@SiO2磁性颗粒与壳聚糖的质量比优选为1:6。本发明所述混合优选为振荡混合,所述振荡混合的时间优选为5~15min。在本发明中,所述交联剂优选为戊二醛,所述戊二醛优选以戊二醛水溶液的形式提供,所述戊二醛水溶液中戊二醛的质量浓度优选为40~60%;所述壳聚糖与戊二醛水溶液的固液比优选为0.3g:100μL~500μL。本发明所述壳聚糖在交联剂的作用下发生交联反应,在Fe3O4@SiO2磁性颗粒外包覆一层壳聚糖聚合物。在本发明中,所述交联反应优选在振荡条件下进行。在本发明中,所述振荡的时间优选为10~20min。本发明对所述振荡的频率没有特殊要求。交联反应后,本发明优选还包括对交联反应混合物依次进行磁分离和洗涤。本发明对所述磁分离的实施方式没有特殊要求,能够将壳聚糖功能化磁性材料分离出来即可。在本发明中,所述洗涤采用的洗涤液优选为质量浓度为3%的乙酸水溶液。本发明对所述洗涤的实施方式没有特殊要求,采用本领域技术人员熟知的洗涤方式即可。
得到壳聚糖功能化磁性材料后,本发明将磷酸化蛋白样品、缓冲溶液与壳聚糖功能化磁性材料混合,磁分离后,得到富集有磷酸化蛋白的磁性材料。
本发明优选先将磷酸化蛋白样品与缓冲溶液混合,得到磷酸化蛋白样品的缓冲溶液,然后将磷酸化蛋白样品的缓冲溶液与壳聚糖功能化磁性材料混合,以利于磷酸化蛋白的吸附。
在本发明中,所述磷酸化蛋白样品与缓冲溶液的体积比为1:0.5~10。本发明对所述磷酸化蛋白样品与缓冲溶液的混合方式没有特殊要求,采用本领域技术人员熟知的混合方式即可。在本发明中,所述磷酸化蛋白样品的缓冲溶液与壳聚糖功能化磁性材料的混合优选为振荡混合,所述振荡混合的时间优选为20~40min,最优选为30min。在本发明中,所述壳聚糖功能化磁性材料优选以悬浮液的形式提供,所述悬浮液中的液态物质优选为3%的冰乙酸水溶液,所述悬浮液中壳聚糖功能化磁性材料的浓度优选为1~10mg/mL;所述悬浮液与磷酸化蛋白样品的缓冲溶液的体积比优选为1:(2~20)。由于壳聚糖功能化磁性材料带正电,磷酸化蛋白带负电,混合后,磷酸化蛋白样品中的磷酸化蛋白与壳聚糖功能化磁性材料发生静电吸附,进而使磷酸化蛋白被吸附到壳聚糖功能化磁性材料的表面。
得到富集有磷酸化蛋白的磁性材料后,本发明将所述富集有磷酸化蛋白的磁性材料与酸液混合,磁分离后,得到磷酸化蛋白的富集液。
本发明优选先将富集有磷酸化蛋白的磁性材料与冰乙酸的水溶液混合,然后再与酸液混合。在本发明中,所述酸液优选为质量浓度0.1%的三氟乙酸的水溶液,所述酸液与上述步骤壳聚糖功能化磁性材料悬浮液的体积比优选为1:1。当酸液采用三氟乙酸水溶液,采用MALDI-TOF-MS对磷酸化蛋白的含量进行测定,有利于靶标物的离子化,提高检测灵敏度。在本发明中,所述混合优选为涡旋搅拌混合,所述涡旋搅拌混合的时间优选为30~50min,进一步优选为40~50min。本发明将所述富集有磷酸化蛋白的磁性材料与酸液混合,在酸性条件下,壳聚糖功能化磁性材料表面电荷发生变化,使磷酸化蛋白从壳聚糖功能化磁性材料表面解吸出来,经磁分离去除壳聚糖功能化磁性材料后,得到的上清液即为磷酸化蛋白的富集液。
本发明还提供了一种磷酸化蛋白的检测方法,包括以下步骤:将上述技术方案所述富集方法得到的磷酸化蛋白富集液与芥子酸混合后,点在靶板上,采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪对磷酸化蛋白的含量(MALDI-TOF-MS)进行测定。
在本发明中,所述磷酸化蛋白富集液与芥子酸的体积比优选为1:3。本发明对所述混合的方式没有特殊要求,采用本领域技术人员熟知的混合方式即可。在本发明中,所述靶板优选为不锈钢靶板,本发明优选取1~5μL混合后的溶液点在靶板上进行测定。在本发明中,所述测定的模式优选为正离子直线模式。本发明对所述测定的条件没有特殊要求,采用本领域技术人员熟知的测定条件即可。本发明采用上述技术方案得到的磷酸化蛋白富集液可直接用于MALDI-TOF-MS进行测定且具有较高的检测灵敏度。
下面结合实施例对本发明提供的磷酸化蛋白的富集和检测方法进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
磷酸化蛋白的富集
1)取5.21gFeCl3·6H2O,4.22gFeSO4·7H2O,加入250mL纯水完全溶解后,加入850μL浓盐酸,超声脱氧30min,加入氨水,调pH大于10,80℃1000rpm搅拌40min,停止搅拌,静置60min,利用磁力分离将沉淀从反应介质中分离,分离的磁流体用纯水充分清洗,无水乙醇清洗4次,将所得磁流体分散到500mL无水乙醇;
2)向磁流体中加入250mL纯水,三颈烧瓶中超声分散10min后,向分散液中加入38mL氨水,50mL正硅酸乙酯,60℃搅拌3h,停止反应,乙醇充分洗涤后真空干燥过夜,得到Fe3O4@SiO2磁性颗粒;
3)取3mL冰乙酸溶于97mL纯水中配成3%乙酸水溶液,称0.3g壳聚糖溶于上述乙酸水溶液中配成0.3%壳聚糖溶液;称0.05g Fe3O4@SiO2磁性颗粒,加入5mL0.3%壳聚糖溶液,先振荡15min,然后加入质量浓度50%的戊二醛水溶液400μL,继续振荡15min,磁分离后得到壳聚糖功能化磁性材料,用3%冰乙酸洗涤三次后定容至5mL;
4)取100μL待测的酪蛋白样品用100μL缓冲溶液稀释后,与50μL壳聚糖功能化磁性材料混合反应30min;
5)磁分离去除上清液,分离后的磁性材料加入50μL 0.1%的三氟乙酸水溶液,涡旋40min后磁分离,得到磷酸化蛋白的富集液。
对步骤3)得到的壳聚糖功能化磁性材料进行透射电镜测试,测试结果见图1。由图1可知,磁性材料作为内核,壳聚糖聚合物包裹在磁性内核表面。磁性内核实现材料的快速分离富集,壳聚糖聚合物作为功能基团实现目标物的吸附。
实施例2
磷酸化蛋白的检测
取2μL实施例1得到的酪蛋白富集液与6μL介子酸混合,取混合后的溶液2μL点在不锈钢靶板上,采用MALDI-TOF-MS进行测定,测试结果如图2所示。
对比例
与实施例2不同的是,未对酪蛋白进行富集,采用MALDI-TOF-MS进行测定,测试结果如图3所示。
由图2和图3可知,较未富集净化前相比,经富集后,酪蛋白的MALDI质谱图峰形明显,说明本发明提供的富集方法在无需抗体的情况下,能够实现磷酸化蛋白的富集净化,且用于MALDI-TOF-MS测定,能够达到较高的灵敏度。
由以上实施例可知,本发明提供了一种磷酸化蛋白的富集和检测方法,本发明提供的富集方法能够克服传统免疫沉淀富集方法抗体的局限,具有广泛的适用性,将富集得到的磷酸化蛋白富液用于MALDI-TOF-MS进行测定,具有较高的灵敏度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种磷酸化蛋白的富集方法,包括以下步骤:
将磷酸化蛋白样品、缓冲溶液与壳聚糖功能化磁性材料混合,磁分离后,得到富集有磷酸化蛋白的磁性材料;
将所述富集有磷酸化蛋白的磁性材料与酸液混合,磁分离后,得到磷酸化蛋白的富集液;
所述壳聚糖功能化磁性材料的内核为Fe3O4,所述Fe3O4外层依次包裹二氧化硅和壳聚糖聚合材料。
2.根据权利要求1所述的富集方法,其特征在于,所述壳聚糖功能化磁性材料由包括Fe3O4、水、正硅酸乙酯、交联剂和壳聚糖的原料制备得到。
3.根据权利要求1所述的富集方法,其特征在于,所述缓冲溶液的pH值为10~12。
4.根据权利要求1~3任一项所述的富集方法,其特征在于,所述壳聚糖功能化磁性材料以悬浮液的形式提供,所述悬浮液中壳聚糖功能化磁性材料的浓度为1~10mg/mL。
5.根据权利要求4所述的富集方法,其特征在于,所述悬浮液中的液态物质为3wt.%的冰乙酸水溶液。
6.根据权利要求4所述的富集方法,其特征在于,所述悬浮液与缓冲溶液的体积比为1:(1~100)。
7.根据权利要求4所述的富集方法,其特征在于,所述酸液为质量浓度0.1%的三氟乙酸的水溶液。
8.根据权利要求7所述的富集方法,其特征在于,所述酸液与悬浮液的体积比为1:1。
9.一种磷酸化蛋白的检测方法,包括以下步骤:将权利要求1~8任一项所述富集方法得到的磷酸化蛋白的富集液与芥子酸混合后,点在靶板上,采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪对磷酸化蛋白的含量进行测定。
10.根据权利要求9所述的检测方法,其特征在于,所述磷酸化蛋白的富集液与芥子酸的体积比为1:(1~3)。
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张金波: "《分子生物学技术与应用技巧》", 31 May 2018, 吉林科学技术出版社 * |
李伟伟: "高乳化性大豆蛋白的制备及其界面流变性质的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 * |
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN111323283A (zh) * | 2020-04-20 | 2020-06-23 | 厦门大学 | 一种富集n-磷酸化蛋白的方法 |
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CN112305041A (zh) * | 2020-09-15 | 2021-02-02 | 东莞东阳光医疗智能器件研发有限公司 | 多重定量电化学免疫传感器及其构建方法 |
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