CN104877091A - 一种具有核壳结构的胍基固定化亲和磁球的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有核壳结构的胍基固定化亲和磁球的制备及应用，采用超顺磁性四氧化三铁微球为基质，表面键合3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸酯形成乙烯基修饰的磁球，利用蒸馏沉淀聚合反应得到具有核-壳结构的聚合物包覆磁球；通过对聚合物层进行功能化修饰得到胍基固定化的核-壳结构的聚合物包覆磁球。在本发明的制备材料中，利用胍基与磷酸根问强烈的相互作用，可以分别实现对α-酪蛋白(α-casein)或β-酪蛋白(α-casein)酶解液中多磷酸肽或者全磷酸肽的选择性富集，对磷酸肽富集容量达到200mg/g，对磷酸肽检测限达到0.5fmol，对磷酸肽富集回收率达到91.30％。利用材料的超顺磁性，可在30s内实现快速完全的分离。

Description

一种具有核壳结构的胍基固定化亲和磁球的制备及应用

【技术领域】

本发明涉及磁性纳米材料领域，低丰度特殊结构蛋白质或多肽的分离分析检测领域，具体地是一种利用蒸馏沉淀聚合法制备一种以超顺磁性四氧化三铁微球为内核，聚合物层为外壳包裹的核-壳结构材料，利用其固定胍基实现对特殊结构蛋白质或者多肽的特异性富集检测方法。

【背景技术】

蛋白质可逆磷酸化修饰是一种重要的翻译后修饰方式之一，尽管磷酸化蛋白质组学取得了很大进步，但仍然存在一些问题，如磷酸肽离子化效率低，低丰度磷酸肽信号常被同时存在的高丰度非磷酸肽信号所抑制和干扰。为了解决这些问题，在质谱分析前，需要选择性将磷酸肽从样品中分离出来。

固定金属离子亲和色谱法和金属氧化物亲和色谱法是两种常用的分离富集方法。其中，固定金属离子亲和色谱法在分离富集时偏向富集多磷酸肽，而金属氧化物亲和色谱法则偏向富集单磷酸肽和酸性多肽，单独使用这两种方法均无法全面而深度获得磷酸化蛋白质组学信息。因此，发展精细富集单磷酸肽或多磷酸肽的富集方法是提高其分析能力的有效途径。

磁性纳米颗粒具有优良的生物兼容性、制备简便、表面易于修饰和独特的超顺磁性等特征，被广泛应用于蛋白质和多肽的特异性分离和富集，如去除高丰度蛋白质、萃取低丰度蛋白质和多肽、特异性分离富集糖肽和磷酸肽，吸附组氨酸标记蛋白质和多肽等。核-壳结构聚合物包覆磁性纳米颗粒具有浓密聚合物层、高密度键合基团和良好的磁响应性能等特征，被广泛应用于蛋白质和多肽样品前处理流程。汪等制备出双聚合物层包覆磁球，在磷酸基上螯合钛离子得到磁性固定金属离子亲和色谱吸附剂，用于选择性富集磷酸肽。随后，在甲基丙烯酸聚合物层包覆磁球表面键合苯硼酸，用于在生理条件下高容量富集分离糖蛋白。邹等采用原子自由基聚合反应制备支链状聚乙二醇刷子修饰磁球，在刷子末端固定磷酸酯钛，制备的刷子状亲和色谱吸附剂表面钛离子键合量得到增加，提高对磷酸肽富集容量。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有核壳结构的胍基固定化亲和磁球的制备及应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种具有核壳结构的胍基固定化亲和磁球的制备方法，其具体步骤为：

第一、乙烯基修饰的磁球的制备

将250mg～350mg直径为50nm～500nm超顺磁性四氧化三铁微球均匀分散在比例为4∶1～6∶1之间的水和乙醇的混合溶剂中，加入1mL～2mL浓氨水，逐滴加入0.6mL～1.0mL的3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸酯，温度稳定在50℃～70℃之间，机械搅拌1天～1.5天，得到乙烯基修饰的磁球。

第二、核-壳结构的聚合物包覆磁球的制备

称取40mg～80mg的步骤一中制备的乙烯基修饰的磁球均匀分散在30mL～50mL的乙腈溶液，加入100μL～180μL的甲基丙烯酸缩水甘油酯和120mg～180mg N，N-亚甲基双丙烯酰胺及3mg～7mg偶氮二异丁腈，温度稳定在95℃～105℃之间，维持1h～2h，得到以四氧化三铁微球为内核，聚合物层为外壳，具有核-壳结构的聚合物包覆磁球；

第三、氨基键合的聚合物包覆磁球的制备

将步骤二中制备的核-壳结构的聚合物包覆磁球分散在60mL～100mL的无水乙二胺溶液中，温度稳定在70℃～90℃之间，维持2h～4h，得到氨基键合的聚合物包覆磁球；

第四、将步骤三中制备的氨基键合的聚合物包覆磁球加入体积为20mL～40mL含有5mmol/L～15mmol/L的磷酸盐缓冲溶液中，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸将溶液pH值调整为6.5～8.5，加入80mg～120mg S-乙基异硫脲氢溴酸盐，通入氮气保护，稳定稳定在65℃～75℃之间，维持2h～4h，得到具有核壳结构的胍基固定化的聚合物包覆磁球。

一种具有核壳结构的胍基固定化亲和磁球的应用方法，其具体步骤为：

第一、将胍基固定化的聚合物包覆磁球用水溶液和乙腈溶液依次清洗3～5次，除去表面未反应的试剂；

第二、将步骤一中得到的磁球置于上样液1(45％～55％乙腈-水，0.05mmol/L～0.15mmol/L醋酸)或上样液2(64％～68％乙腈-水，0.01％～0.03％三氟乙酸)，与5mg/L～20mg/L蛋白酶解溶液例如α-酪蛋白(α-casein)和β-酪蛋白(β-casein)酶解液进行混合10min～30min，利用外置磁铁对磷酸根修饰的蛋白质或者多肽进行选择性富集和快速分离，实现对低丰度结构特殊的蛋白质和多肽的特异性富集和分离；

第三，将吸附蛋白质或多肽的磁球用40％～60％乙腈-水，1％～3％三氟乙酸溶液进行洗脱，利用基质辅助激光解析飞行时间质谱仪或者高效液相色谱-质谱联用仪进行检测，计算磁球对磷酸化蛋白质或多肽的富集选择性，富集容量，富集回收率和检测灵敏度。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：

利用本发明制备的以超顺磁性四氧化三铁微球为内核，聚合物层为外壳，具有核-壳结构的复合材料可以分别实现对α-酪蛋白(α-casein)或β-酪蛋白(α-casein)酶解液中多磷酸肽或者全磷酸肽的选择性富集，对磷酸肽富集容量达到200mg/g，对磷酸肽检测限达到0.5fmol，对磷酸肽的富集回收率达到91.30％。利用材料的超顺磁性，可在30s内实现快速完全的分离。

本方法制备的核壳结构磁球的聚合物层存在大量活性作用位点，可固定高容量的胍基配体，实现高度特异性与磷酸化修饰的蛋白质或多肽相结合，具有很高的富集容量、富集回收率和检测灵敏度。此外，该材料具备超顺磁性，能缩短样品前处理时间，提高处理效率，进而提高其分离富集能力。

【附图说明】

图1是以超顺磁性四氧化三铁微球为内核，聚合物层为外壳，具备核-壳结构的复合材料形貌图(a(TEM)和b(SEM))。

图2是以超顺磁性四氧化三铁微球为内核，聚合物层为外壳，具备核-壳结构的磁球，胍基进行功能化修饰的复合材料的傅里叶红外表征图。(a，磁球；b，核-壳结构的聚合物包覆磁球；c，胍基固定化的聚合物包覆磁球。)

图3是具有核壳结构的胍基固定化聚合物包覆磁球用于选择性分离富集β-酪蛋白(β-casein)酶解液中多磷酸肽或全磷酸肽的质谱图。(a，酶解液质谱图；b，选择性富集多磷酸肽质谱图；c，选择性富集全磷酸肽质谱图)

【具体实施方式】

以下提供本发明一种具有核壳结构的胍基固定化亲和磁球的制备及应用的具体实施方式。

实施例1

称取300mg直径为220nm的磁球，分散于50mL体积比4∶1的乙醇和水溶液，加入1.5mL氨水，超声10min，逐滴加入0.8mL的3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸酯，于60℃下机械搅拌24h，得到乙烯基修饰的磁球。

称取60mg乙烯基修饰的磁球分散于40mL乙腈中，加入140μL的甲基丙烯酸缩水甘油酯，180mg N，N-亚甲基双丙烯酰胺和5mg偶氮二异丁腈，超声10min，置于100℃，反应1.5h，得到以超顺磁性四氧化三铁微球为内核，聚合物层为外壳，具有核-壳结构的聚合物包覆磁球。

将200mg聚合物包覆磁球分散在80mL无水乙二胺溶液，稳定稳定在80℃，机械搅拌3h，得到氨基键合的聚合物包覆磁球。

将氨基键合的聚合物包覆磁球加入体积为30mL，含有10mmol/L的磷酸盐缓冲溶液中，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸将溶液pH值调整为7.5，加入120mg S-乙基异硫脲氢溴酸盐，通入氮气保护，温度稳定在70℃，维持3h，得到胍基固定化的聚合物包覆磁球。

将胍基固定化的聚合物包覆磁球分散于上样液1(50％乙腈-水，0.1mmol/L醋酸)或上样液2(66％乙腈-水，0.02％三氟乙酸)，与10mg/Lβ-酪蛋白(β-casein)酶解液进行混合20min，利用外置磁铁实现分离，加入50％乙腈-水，2％三氟乙酸溶液进行洗脱。洗脱液用基质辅助激光解析飞行时间质谱仪进行检测，用于计算磁球对磷酸化蛋白质或多肽的富集选择性，富集容量，富集回收率和检测灵敏度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种具有核壳结构的胍基固定化亲和磁球的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

第一、乙烯基修饰的磁球的制备：

第二、核-壳结构的聚合物包覆磁球的制备：

第三、氨基键合的聚合物包覆磁球的制备：

第四、将步骤三中制备的氨基键合的聚合物包覆磁球加入体积为20mL～40mL含有5mmol/L～15mmol/L的磷酸盐缓冲溶液中，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸将溶液pH值调整为6.5～8.5，加入80mg～120mg S-乙基异硫脲氢溴酸盐，通入氮气保护，温度稳定在65℃～75℃之间，维持2h～4h，得到具有核壳结构的胍基固定化的聚合物包覆磁球。

2.如权利要求1所述的一种具有核壳结构的胍基固定化亲和磁球的制备方法，其特征在于，所述的乙烯基修饰的磁球的制备：

将250mg～350mg直径为50nm～500nm超顺磁性四氧化三铁微球均匀分散在比例为4∶1～6∶1之间的水和乙醇的混合溶剂中，加入1mL～2mL浓氨水，逐滴加入0.6mL～1.0mL的3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸酯，温度稳定在50℃～70℃之间，机械搅拌1天～1.5天，得到乙烯基修饰的磁球。

3.如权利要求1所述的一种具有核壳结构的胍基固定化亲和磁球的制备方法，其特征在于，所述的核-壳结构的聚合物包覆磁球的制备：

称取40mg～80mg的步骤一中制备的乙烯基修饰的磁球均匀分散在30mL～50mL的乙腈溶液，加入100μL～180μL的甲基丙烯酸缩水甘油酯和120mg～180mg N，N-亚甲基双丙烯酰胺及3mg～7mg偶氮二异丁腈，温度稳定在95℃～105℃之间，维持1h～2h，得到以四氧化三铁微球为内核，聚合物层为外壳，具有核-壳结构的聚合物包覆磁球。

4.如权利要求1所述的一种具有核壳结构的胍基固定化亲和磁球的制备方法，其特征在于，所述的氨基键合的聚合物包覆磁球的制备：

将步骤二中制备的核-壳结构的聚合物包覆磁球分散在60mL～100mL的无水乙二胺溶液中，温度稳定在70℃～90℃之间，维持2h～4h，得到氨基键合的聚合物包覆磁球。

5.一种具有核壳结构的胍基固定化亲和磁球的应用方法，其特征在于，

具体步骤为：

第一、将胍基固定化的聚合物包覆磁球用水溶液和乙腈溶液依次清洗3～5次，除去表面未反应的试剂；

第二、将步骤一中得到的磁球置于上样液1(45％～55％乙腈-水，0.05mmol/L～0.15mmol/L醋酸)或上样液2(64％～68％乙腈-水，0.01％～0.03％三氟乙酸)，与5mg/L～20mg/L蛋白酶解溶液例如α-酪蛋白(α-casein)和β-酪蛋白(β-casein)酶解液进行混合10min～30min，利用外置磁铁对磷酸根修饰的蛋白质或者多肽进行选择性富集和快速分离，实现对低丰度结构特殊的蛋白质和多肽的特异性富集和分离；

第三，将吸附蛋白质或多肽的磁球用40％～60％乙腈-水，1％～3％三氟乙酸溶液进行洗脱，利用基质辅助激光解析飞行时间质谱仪或高效液相色谱-质谱联用仪进行检测，计算磁球对磷酸化蛋白质或多肽的富集选择性，富集容量，富集回收率和检测灵敏度。