CN103157447A - 高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球的制备及其应用。该材料表面含有高密度的硼酸基团，能对富含顺式二羟基的生物分子产生多价协同结合，从而显著提高结合力。该材料对糖蛋白的解离常数为10-5～10-6M，与通常的硼酸功能化材料比较结合力提高了3-4个数量级，并且能富集浓度低至2×10-14M的糖蛋白。此外该材料还具有抗干扰能力强，结合容量高，结合/解析速度快等优点。由于该材料具有磁性，通过施加外磁场可以方便地对样品进行处理。本发明的高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球可以便捷地对复杂样品中低丰度的富含顺式二羟基的生物分子进行富集、纯化和分离。
Description
技术领域
本发明涉及功能化材料领域，也涉及顺式二羟基的生物分子的富集、纯化和分离。
背景技术
顺式二羟基生物分子是含有顺式二羟基结构的一类化合物，如糖类，糖蛋白和糖肽，核苷和核苷酸，它们分别是糖组学、蛋白质组学及代谢组学等领域的主要研究对象。这些顺式二羟基生物分子具有很重要的研究价值，如糖类在生命活动过程中起着重要的作用，是一切生命体维持生命活动所需能量的主要来源。许多糖蛋白是临床上癌症的生物标志物及治疗的靶标，如甲胎蛋白、癌胚抗原、CA125以及前列腺特异性抗原等。但是糖蛋白在样本中的丰度非常低，并且往往伴随着高丰度的干扰组分。因此对其进行选择性富集，同时有效的去除高丰度干扰组分对这些糖蛋白的分析至关重要。
取代硼酸是一类独特的配基，它和顺式二羟基结构在高pH值下共价结合形成环状酯，该酯可以在酸性条件下解离。这种pH开关的性质使取代硼酸成为一种重要的用于分离富集顺式二羟基化合物的配基。尽管取代硼酸已经显示了在选择性富集顺式二羟基化合物方面的应用前景，但亲和力弱这一致命缺陷却阻碍了其广泛的应用。大部分取代硼酸与顺式二羟基化合物的解离常数在10-1到10-4之间[参见Tetrahedron2004,60,11205–11209;Anal.Chem.2013,85,2361–2369]，因此从本质上讲取代硼酸不能富集浓度很低的顺式二羟基化合物，而一些重要的糖蛋白和聚糖等通常在生物样品中丰度却很低。所以，高亲和力的硼酸功能化材料是至关重要的。
类似树枝状硼酸功能化磁性微球及其制备和应用方面的材料目前尚未有文献和专利报道。
发明内容
为了克服现有取代硼酸及其功能化材料亲和力弱的缺点，本发明的第一目的在于提供一种高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球。
本发明的第二目的在于提供一种便捷地制备高亲和力、高容量的树枝状硼酸功能化磁性微球的方法，
本发明的第三目的在于提供上述高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球在各种复杂样品中的低丰度的糖蛋白和聚糖等的富集、纯化和分离等应用。
为了解决上述目的，本发明的技术方案如下：
一种高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球，它是在磁性载体上引入树枝状高分子后经过硼酸功能化得到的树枝状硼酸功能化磁性材料。
由于树枝状高分子含有大量的表面基团，经硼酸修饰后，材料表面含有高密度的硼酸基团，能对富含顺式二羟基的生物分子如糖蛋白等产生多价协同结合，从而显著提高结合力。
所述磁性载体为磁性纳米粒子，或者磁性微米粒子。
上述磁性纳米粒子为氨基功能化磁性纳米粒子、或者其他含有活性基团，如羧基功能化，巯基功能化，环氧基团功能化，羟基功能化以及醛基功能化的纳米粒子；
所述磁性微米粒子为羧基功能化磁性微米粒子，或者其他含有活性基团，如氨基功能化，巯基功能化，环氧基团功能化，羟基功能化以及醛基功能化的磁性微米粒子。
本发明中，所述树枝状高分子为聚酰胺-胺（PAMAM）树枝状高分子，或者其他的的树枝状高分子。上述聚酰胺-胺（PAMAM）树枝状高分子为其第四代至第七代中的任何一代。
上述高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球的制备方法，该方法包括如下步骤：
1）将树枝状高分子固载于磁性载体上：首先将磁性载体活化，然后将活化得到的磁性载体分散在树枝状高分子溶液中，室温下搅拌得到树枝状高分子修饰的磁性材料；
2）对树枝状高分子修饰的磁性载体进行硼酸功能化：将步骤1）得到的树枝状高分子修饰的磁性材料分散在取代硼酸溶液中，室温下搅拌反应即得到所述树枝状硼酸功能化磁性微球。
一种制备磁性纳米粒子的方法如下：
步骤1），氨基功能化磁性纳米粒子分散在适量戊二醛的无水甲醇中，室温下机械搅拌6-12小时，制得醛基活化的磁性纳米粒子；将所得的醛基活化的磁性纳米粒子分散在适量的聚酰胺-胺树枝状高分子和NaCNBH3的无水甲醇中，室温下机械搅拌12-24小时,得到树枝状高分子修饰的磁性纳米粒子；
步骤2），将步骤1）得到的树枝状高分子修饰的磁性纳米粒子分散在含有适量4-甲酰基苯硼酸以及NaCNBH3的无水甲醇溶液混合，室温下搅拌反应12-24小时即得到树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子。
一种制备磁性微米粒子的方法如下：
步骤1），羧基功能化磁性微米粒子分散在2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液中，加入适量的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，适量的聚酰胺-胺树枝状高分子，超声混合均匀，机械搅拌6-12个小时，即得树枝状高分子修饰的磁性微米粒子；
步骤2），将得到的树枝状高分子修饰的磁性微米粒子再次分散于2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液，加入适量的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，适量的4-羧基苯硼酸混合，室温下搅拌反应6-12小时即得到树枝状硼酸功能化的磁性微米粒子。
本发明制备方法中，步骤2）中所用的取代硼酸可以是含有甲酰基、或羧基、或氨基活性基团的苯硼酸，或杂环硼酸。
上述的高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球在富含顺式二羟基的生物分子中的富集、纯化和分离中的应用。尤其是在复杂样品体系中低丰度糖蛋白和聚糖等生物分子的应用。与通常的硼酸功能化材料相比，该材料对富含顺式二羟基的生物分子的结合能力显著增强。
有益效果：与现有技术相比，本发明首次描述了一种高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球及其制备方法，该方法使硼酸对富含顺式二羟基的生物分子的亲和力显著提高。实验结果表明，由于树枝状高分子含有大量的表面基团，经硼酸修饰后，材料表面含有高密度的硼酸基团，能对富含顺式二羟基的生物分子产生多价协同结合，从而显著提高结合力。树枝状硼酸功能化材料弥补了硼酸亲和力弱的缺陷，使硼酸与糖蛋白的亲和力提高3-4个数量级，并且能富集浓度低至2×10-14M的糖蛋白；此外，该材料抗干扰能力强，能在1000倍的非糖蛋白的干扰下选择性富集糖蛋白，并且具有结合容量高和结合/解析速度快等优点。非常适合于低浓度糖蛋白和聚糖等顺式二羟基生物分子的选择性富集。
附图说明
图1为树枝状硼酸修饰磁性微球的结构示意图。
图2为树枝状硼酸修饰磁性纳米粒子的红外表征图，其中，a为氨基功能化磁性纳米粒子；b为树枝状高分子修饰的磁性纳米粒子；c为树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子。
图3为树枝状硼酸修饰磁性纳米粒子的热重表征图，其中，a为氨基功能化磁性纳米粒子；b为树枝状高分子修饰的磁性纳米粒子；c为树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子。
图4树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子对糖蛋白的最低富集浓度。
图5树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子在高浓度非糖蛋白的干扰下对糖蛋白的选择性富集，
其中，a为1mg/mL糖蛋白辣根过氧化物酶(HRP)和1mg/mL非糖蛋白牛血清白蛋白(BSA)的混合物质谱谱图；b为树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子在1μg/mL HRP和1mg/mLBSA（质量比1:1000）样品中的萃取物的质谱谱图；
图6树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子对糖蛋白的萃取速度，其中，A)萃取时间；B)解析时间。
图7树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子选择性富集唾液中的糖蛋白，其中，
A)为唾液直接分析的质谱谱图；B)为树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子在唾液中的萃取物的质谱谱图。
具体实施方式
实施例1：4-甲酰基苯硼酸功能化的树枝状硼酸修饰的磁性纳米粒子的制备（第四代PAMAM）
200mg氨基功能化磁性Fe3O4纳米粒子[参见Chem.Eur.J.,2006,12,6341-6347]分散在40mL含5%(w/w)戊二醛的无水甲醇中，室温下机械搅拌12小时，制得醛基活化的磁性纳米粒子，将所得的醛基活化的磁性纳米粒子分散在30mL含0.5g第四代PAMAM树枝状高分子和1%(w/w)NaCNBH3的无水甲醇中，室温下机械搅拌12小时,得到树枝状高分子修饰的磁性纳米粒子。将得到的树枝状高分子修饰的磁性纳米粒子分散在40mL含10mg/mL4-甲酰基苯硼酸和1%(w/w)NaCNBH3的无水甲醇溶液混合，室温下搅拌反应24小时即得到树枝状硼酸功能化的磁性纳米粒子。各步反应红外表征和热重表征如图2和图3所示。
实施例2：嫁接第七代PAMAM树枝状高分子的硼酸功能化磁性纳米粒子的制备
将实施例1得到的氨基醛基活化的磁性纳米粒子分散在30mL含0.3g第七代PAMAM树枝状高分子和1%(w/w)NaCNBH3的无水甲醇中，室温下机械搅拌12小时,得到树枝状高分子修饰的磁性纳米粒子。将得到的树枝状高分子修饰的磁性纳米粒子分散在40mL含10mg/mL4-甲酰基苯硼酸和1%(w/w)NaCNBH3的无水甲醇溶液混合，室温下搅拌反应24小时即得到树枝状硼酸功能化的磁性纳米粒子。
实施例3：4-羧基苯硼酸功能化的树枝状硼酸修饰的磁性纳米粒子的制备
将实施例1得到的树枝状高分子修饰的磁性纳米粒子分散于50mL的0.1mol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液(MES，pH6.3)，加入500mg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和1g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，500mg4-羧基苯硼酸混合，室温下搅拌反应12小时即得到树枝状硼酸功能化的磁性纳米粒子。
实施例4：3-氨基苯硼酸功能化的树枝状硼酸修饰的磁性纳米粒子的制备
将实施例1得到的树枝状高分子修饰的磁性纳米粒子再次分散在40mL含5%(w/w)戊二醛的无水甲醇中，室温下机械搅拌12小时，将所得材料清洗三次，分散在40mL含10mg/mL3-氨基苯硼酸和1%(w/w)NaCNBH3的无水甲醇溶液混合，室温下搅拌反应24小时即得到树枝状硼酸功能化的磁性纳米粒子。
实施例5：高亲和力树枝状硼酸修饰的磁性微米粒子的制备
1g羧基功能化微米级磁性Fe3O4微球分散在分散于50mL0.1mol/L2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲溶液（MES，pH6.3），加入500mg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和1g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，1g第四代PAMAM树枝状高分子，超声混合均匀，机械搅拌12个小时。即得树枝状高分子修饰的磁性微球。将得到的微球再次分散于50mL0.1mol/L MES，加入500mg EDC和1gNHS，500mg4-羧基苯硼酸混合，室温下搅拌反应12小时即得到树枝状硼酸功能化的磁性微球。
实施例6：树枝状硼酸修饰的磁性纳米粒子对糖蛋白作用力的考察
称取一组等量的实施例1中得到的树枝状硼酸修饰磁性纳米粒子，每个样品为2mg，分别置于200μL塑料离心管中,各加入200μL100mM的磷酸盐缓冲溶液(pH8.5)含一定浓度范围的糖蛋白（0.1-1.0mg/mL辣根过氧化物酶（HRP），0.1-1.0mg/mL的鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体(anti-AFP),0.5-10.0mg/mL的人转铁蛋白（TRF）），室温振荡12小时，用分光光度计测定平衡吸附液中糖蛋白的浓度(HRP检测波长为403nm，anti-AFP和TRF检测波长为280nm)。根据结合前后溶液中糖蛋白的浓度变化可计算糖蛋白的结合量Qmax,3次测定结果的平均值用于Scatchard分析。
Scatchard分析：Qe/[S]=(Qmax-Qe)/Kd
式中Qmax为枝状硼酸修饰的磁性纳米粒子的饱和吸附容量，Qe为树枝状硼酸修饰的磁性纳米粒子对糖蛋白的平衡吸附量，[S]为在吸附平衡时的游离的糖蛋白浓度，Kd为解离常数。Qe/[S]对Qe进行线性回归，其斜率为-1/Kd，截距为Qmax/Kd，可以计算得到解离常数Kd和饱和吸附容量Qmax。测定结果如表1所示。
表1树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子与三种糖蛋白的解离常数与饱和吸附容量。
实施例7：树枝状硼酸修饰磁性纳米粒子对糖蛋白的最低富集浓度
称取一组等量的实施例1得到的树枝状硼酸修饰磁性纳米粒子，每个样品为10mg，分别置于10mL塑料离心管中,各加入9.0mL100mM磷酸盐缓冲溶液(pH8.5)含有1.0pg/mL至10.0ng/mL糖蛋白HRP，室温振荡2h，分别用9.0mL pH8.5的100mM磷酸盐溶液清洗3次后，加入15μL100mM醋酸进行解吸，解吸液使用灵敏的检测方法TMB(3,3,5',5'-四甲基联苯胺)显色反应取450nm的波长进行检测。
具体操作如下：2.0μL解吸夜和200μL TMB显色液室温下孵育10分钟，然后加入20.0μL终止液（1.0M H2SO4），得到的溶液在20分钟内检测450nm波长下的紫外吸收。其中，TMB储备液配制为：15mg TMB溶于0.3mL二甲亚砜，然后用水稀释至5.0mL。显色液配制为：5.0μL TMB储备液与2.0mL0.1M Na2HPO4，2mL0.1M柠檬酸充分混合后加入5.0μL30%的双氧水。
检测结果如图4所示，使用TMB显色反应对辣根过氧化物酶直接检测最低检测浓度为0.1ng/mL(信噪比为5.5)，经过树枝状硼酸修饰的磁性纳米粒子富集后，最低检测浓度1.0pg/mL(信噪比为14)，即2×10-14M。
实施例8：树枝状硼酸修饰磁性纳米粒子在高浓度非糖蛋白的干扰下对糖蛋白的选择性富集
取2mg实施例1得到的树枝状硼酸修饰磁性纳米粒子置于1.5mL塑料离心管中加入1mL pH8.5的0.25M醋酸铵含0.50M NaCl的缓冲溶液含1μg/mL的辣根过氧化物酶（糖蛋白）和1mg/mL的牛血清白蛋白（非糖蛋白）混合溶液，室温震荡1小时，分别用1mL0.25M的醋酸铵含有0.50M NaCl的缓冲溶液(pH8.5)和0.05M醋酸铵溶液(pH8.5)各清洗3次后，然后将树枝状硼酸修饰磁性纳米粒子转移到200μL的微型朔料管，加入15μL100mM醋酸溶液进行解吸一个小时。解吸液使用基体辅助激光解吸离子化-时间飞行质谱（MALDI-TOF MS）分析。结果如图5所示，a为1mg/mL糖蛋白辣根过氧化物酶(HRP)和1mg/mL非糖蛋白牛血清白蛋白(BSA)的混合物质谱谱图；b为树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子在1μg/mL HRP和1mg/mL BSA（质量比1:1000）样品中的萃取物的质谱谱图。结果表明树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子在糖蛋白和非糖蛋白1：1000时可以选择性富集糖蛋白。
实施例9：富集时间和解吸时间的考察
称取一组等量的实施例1得到的树枝状硼酸修饰磁性纳米粒子，每个样品为2mg，分别置于200μL塑料离心管中,各加入200μL100mM磷酸盐溶液(pH8.5)含浓度为1.0mg/mL糖蛋白HRP，考察了0.5-60min的范围内硼酸功能化的树枝状磁性纳米粒子对HRP的富集情况（解析时间均为1小时）和解析情况（富集时间均为1小时），。考察结果如图6所示，结果表明达到萃取平衡仅需要1分钟，达到解析平衡仅需要5分钟，这对于处理实际样品非常有利。
实施例10：树枝状硼酸修饰磁性纳米粒子选择性富集唾液中的糖蛋白
唾液样品准备：收集健康人的唾液，早上离最后摄入食物至少有2小时。收集之前，先用水漱口5次。收集唾液时，将盛放唾液的试管置于冰上。为了减少蛋白质的降解，唾液收集后立即加入蛋白酶抑制剂（1mL唾液加入1μL蛋白酶抑制剂）。然后在4℃下，12000转每分钟的速度离心10分钟。收集上层清液储存于-80℃。使用之前，4℃下复溶样品，用等体积的0.25M醋酸铵含有0.50M NaCl的缓冲溶液(pH8.5)将pH调为8.5。
取2mg实施例1得到的树枝状硼酸修饰磁性纳米粒子分别加入到200μL的唾液样本中提取唾液糖蛋白一个小时。分别用200μL0.25M的醋酸铵含0.50MNaCl的缓冲溶液(pH8.5)和0.05M醋酸铵缓冲溶液(pH8.5)各清洗3次后，树枝状硼酸修饰磁性纳米粒子萃取的糖蛋白使用15μL的100mM醋酸溶液解吸一个小时，解吸液使用MALDI-TOF MS分析。
分析结果如图7所示，对唾液直接进行质谱分析得到图A，从图上观察到10,000-30,000有信号很强的多个峰，为非糖蛋白胱抑素等，55844处有一个信号较弱的峰，为糖蛋白α-淀粉酶。树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子在唾液中的萃取物为图B,与图A比较，10,000-30,000范围内只有14274处的一个尖峰，55844处峰信号明显增强，另外还有五个在A图中观察不到的峰，分别为：27907,57979,70258,112343和168117。其中27907和112343分别为α-淀粉酶的二聚体和二价峰。结果表明树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子能富集复杂体系中痕量的糖蛋白。
Claims (10)
1.一种高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球，其特征在于，它是在磁性载体表面引入树枝状高分子后再经硼酸功能化得到的树枝状硼酸功能化磁性微球。
2.根据权利要求1所述的高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球，其特征在于，所述磁性载体为磁性纳米粒子，或者磁性微米粒子。
3.根据权利要求2所述的高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球，其特征在于，所述磁性纳米粒子为氨基功能化磁性纳米粒子或者其他含有活性基团的磁性纳米粒子；所述磁性微米粒子为羧基功能化磁性微米粒子或者其他含有活性基团的磁性纳米粒子。
4.根据权利要求1所述的高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球，其特征在于，所述树枝状高分子为聚酰胺-胺树枝状高分子，或者其他的树枝状高分子。
5.根据权利要求4所述的高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球，其特征在于，所述聚酰胺-胺树枝状高分子为其第四代至第七代中的任何一代。
6.根据权利要求1所述的高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1）将树枝状高分子固载于磁性载体上：首先将磁性载体活化，然后将活化得到的磁性载体分散在树枝状高分子溶液中，室温下搅拌得到树枝状高分子修饰的磁性材料；
2） 对树枝状高分子修饰的磁性载体进行硼酸功能化：将步骤1）得到的树枝状高分子修饰的磁性材料分散在取代硼酸溶液中，室温下搅拌反应即得到所述树枝状硼酸功能化磁性微球。
7.根据权利要求6所述的高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球的制备方法，其特征在于，当磁性载体为磁性纳米粒子时的制备方法如下：
步骤1），氨基功能化磁性纳米粒子分散在适量戊二醛的无水甲醇中，室温下机械搅拌6-12小时，制得醛基活化的磁性纳米粒子；将所得的醛基活化的磁性纳米粒子分散在适量的聚酰胺-胺树枝状高分子和NaCNBH3的无水甲醇中，室温下机械搅拌12-24小时, 得到树枝状高分子修饰的磁性纳米粒子；
步骤2），将步骤1）得到的树枝状高分子修饰的磁性纳米粒子分散在含有适量的4-甲酰基苯硼酸以及NaCNBH3的无水甲醇溶液混合，室温下搅拌反应12-24小时即得到树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子。
8.根据权利要求6所述的高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球的制备方法，其特征在于，当磁性载体为磁性微米粒子时的制备方法如下：
步骤1），羧基功能化磁性微米粒子分散在2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液，加入适量的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，聚酰胺-胺树枝状高分子，超声混合均匀，机械搅拌6-12个小时，即得树枝状高分子修饰的磁性微米粒子；
步骤2），将得到的树枝状高分子修饰的磁性微米粒子再次分散于 2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液，加入适量的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，适量的4-羧基苯硼酸混合，室温下搅拌反应6-12小时即得到树枝状硼酸功能化的磁性微米粒子。
9.根据权利要求6所述的高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球的制备方法，其特征在于，步骤2）中所用的取代硼酸可以是含有甲酰基、或羧基、或氨基活性基团的苯硼酸，或杂环硼酸。
10.权利要求1所述的高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球在富含顺式二羟基的生物分子中的富集、纯化和分离中的应用。
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Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103435762A (zh) * | 2013-09-06 | 2013-12-11 | 复旦大学 | 一种富含硼酯的核壳式磁性复合微球的制备方法及其应用 |
| CN104148030A (zh) * | 2014-07-24 | 2014-11-19 | 上海交通大学 | 富含有机苯硼酸的聚乙烯亚胺修饰的二氧化硅微球及其制备方法和应用 |
| CN104549182A (zh) * | 2014-12-29 | 2015-04-29 | 上海烟草集团有限责任公司 | 一种树枝状硼酸功能化整体柱及其制备方法和应用 |
| CN106732464A (zh) * | 2017-02-02 | 2017-05-31 | 复旦大学 | 一种亲水树枝和c18修饰的磁性石墨烯材料及其制备方法和应用 |
| CN109206614A (zh) * | 2017-07-05 | 2019-01-15 | 大连医科大学 | 一种检测含有糖链生物分子的试剂及其制备方法和应用 |
| CN110221081A (zh) * | 2019-06-26 | 2019-09-10 | 上海执诚生物科技有限公司 | 视黄醇结合蛋白胶乳试剂r2及其制备方法和试剂盒 |
| CN110394163A (zh) * | 2019-07-11 | 2019-11-01 | 江苏大学 | 苯硼酸修饰磁性壳聚糖的制备方法及其选择性分离莽草酸的应用 |
| WO2022111661A1 (zh) * | 2020-04-28 | 2022-06-02 | 康码（上海）生物科技有限公司 | 一种抗体型生物磁性微球及其制备方法和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102658098A (zh) * | 2012-04-26 | 2012-09-12 | 南京大学 | 一种以邻羟甲基苯硼酸为功能单体的硼亲和功能化材料及其制备和应用 |
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2013
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102658098A (zh) * | 2012-04-26 | 2012-09-12 | 南京大学 | 一种以邻羟甲基苯硼酸为功能单体的硼亲和功能化材料及其制备和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BI-FENG PAN ET AL: "Dendrimer modified magnetite nanoparticles for protein immobilization", 《JOURNAL OF COLLOID AND INTERFACE SCIENCE》, vol. 284, 15 January 2005 (2005-01-15) * |
| JEONG HEON LEE ET AL: "Immobilization of Aminophenylboronic Acid on Magnetic Beads for the Direct Determination of Glycoproteins by Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry", 《J AM SOC MASS SPECTROM》, vol. 16, 14 July 2005 (2005-07-14) * |
| SEUNG YEON SONG ET AL: "Boronic acid-modified thin film interface for specific binding of glycated hemoglobin (HbA1c) and electrochemical biosensing", 《SENSORS AND ACTUATORS B》, vol. 140, 7 May 2009 (2009-05-07) * |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103435762B (zh) * | 2013-09-06 | 2017-07-07 | 复旦大学 | 一种富含硼酯的核壳式磁性复合微球的制备方法及其应用 |
| CN103435762A (zh) * | 2013-09-06 | 2013-12-11 | 复旦大学 | 一种富含硼酯的核壳式磁性复合微球的制备方法及其应用 |
| CN104148030A (zh) * | 2014-07-24 | 2014-11-19 | 上海交通大学 | 富含有机苯硼酸的聚乙烯亚胺修饰的二氧化硅微球及其制备方法和应用 |
| CN104549182A (zh) * | 2014-12-29 | 2015-04-29 | 上海烟草集团有限责任公司 | 一种树枝状硼酸功能化整体柱及其制备方法和应用 |
| CN106732464B (zh) * | 2017-02-02 | 2020-11-20 | 复旦大学 | 一种亲水树枝和c18修饰的磁性石墨烯材料及其制备方法和应用 |
| CN106732464A (zh) * | 2017-02-02 | 2017-05-31 | 复旦大学 | 一种亲水树枝和c18修饰的磁性石墨烯材料及其制备方法和应用 |
| CN109206614A (zh) * | 2017-07-05 | 2019-01-15 | 大连医科大学 | 一种检测含有糖链生物分子的试剂及其制备方法和应用 |
| CN109206614B (zh) * | 2017-07-05 | 2020-10-16 | 大连医科大学 | 一种检测含有糖链生物分子的试剂及其制备方法和应用 |
| CN110221081A (zh) * | 2019-06-26 | 2019-09-10 | 上海执诚生物科技有限公司 | 视黄醇结合蛋白胶乳试剂r2及其制备方法和试剂盒 |
| CN110221081B (zh) * | 2019-06-26 | 2023-01-24 | 上海执诚生物科技有限公司 | 视黄醇结合蛋白胶乳试剂r2及其制备方法和试剂盒 |
| CN110394163A (zh) * | 2019-07-11 | 2019-11-01 | 江苏大学 | 苯硼酸修饰磁性壳聚糖的制备方法及其选择性分离莽草酸的应用 |
| CN110394163B (zh) * | 2019-07-11 | 2021-10-08 | 江苏大学 | 苯硼酸修饰磁性壳聚糖的制备方法及其选择性分离莽草酸的应用 |
| WO2022111661A1 (zh) * | 2020-04-28 | 2022-06-02 | 康码（上海）生物科技有限公司 | 一种抗体型生物磁性微球及其制备方法和应用 |
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