CN100374858C - 对微量蛋白或多肽溶液同步富集、脱盐并进行鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生化分析鉴定技术领域，具体为一种对微量蛋白或多肽溶液同步富集、脱盐并直接进行鉴定的方法。该方法以氧化硅纳米粒子作为吸附剂，对蛋白质以及蛋白质酶解多肽进行高效吸附，并能克服高浓度盐的干扰。由于氧化硅纳米粒子与MALDI-MS有很好的相容性，被吸附的样品无需洗脱步骤可直接进行MALDI-TOF/MS分析，操作简单，避免了洗脱过程带来的样品损失。本发明可克服4M氯化钠或8M尿素对质谱的干扰，对蛋白的富集效率可达100倍。
Description
技术领域
本发明属于生化分析鉴定技术领域，具体涉及一种对微量蛋白或多肽溶液同步富集、脱盐并直接进行鉴定的方法。
背景技术
基质辅助激光解吸离子化/质谱(MALDI/MS)以其分析速度快、灵敏度高、易于操作等特点成为蛋白质组学研究中的有效工具。但是存在于分析样品中的大量盐或其它非蛋白质成分(样品前期处理过程中加入)会使得质谱灵敏度大大降低，被称为质谱研究中的压制效应(suppression effect)。避免压制效应的有效方法就是对样品进行脱盐处理。另外在蛋白质组学研究过程中，有大量承担生物体重要生命活动的蛋白是低丰度蛋白，其极低的含量给后续的分析和检测带来困难。因此，实现低丰度蛋白的有效富集是实现其准确分析和鉴定的首要条件之一。目前最常用的溶剂蒸发法在样品浓缩的同时也会使其中盐等杂质得到富集，而传统的脱盐方法是采用Millipore公司推出的用于微量样品制备带有C18填料的ZipTipTM吸嘴脱盐或采用去离子水对样品进行靶上洗脱去盐，但是这两种方法脱盐能力有限。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单、价格便宜、效果良好，能对微量多肽或蛋白同步富集、脱盐，并进行鉴定的新方法。
本发明提出的对微量蛋白或多肽同步富集、脱盐，并进行鉴定的方法，具体步骤如下：
(1)以氧化硅纳米粒子作为纳米吸附剂，加入多肽或蛋白质样品的水溶液或盐溶液中，通过静电吸附、亲/疏水作用富集样品，样品浓度为10-11M-10-6M之间，富集时间5-180分钟之间，富集温度4-90℃，氧化硅纳米粒子用量为0.02-2000微克之间；
(2)对经步骤(1)的溶液进行离心处理，弃除上清液，收集下层氧化硅沉淀，再用50％的乙腈稀释；当溶液中含有高浓度的盐时，富集和脱盐可一步完成。
(3)上述被富集的样品无需洗脱，直接与有机基质均匀混合，形成均匀细致的结晶，进行MALDI/MS分析；
(4)根据质谱结果，鉴定多肽或蛋白质。
本发明中，氧化硅纳米粒子3-200nm，范围较为合适。该范围的氧化硅纳米粒子具有大的比表面积，丰富可调的表面性质。
本发明中，多肽或蛋白质样品的盐溶液可以是无机盐(例如氯化钠，氯化钙，碳酸氢铵等)或者有机盐(例如尿素)溶液。
本发明中，所用有机基质可以是2-氰基-4-羟基肉桂。
本发明利用氧化硅纳米粒子对蛋白质和多肽良好的吸附作用，高效的脱盐能力以及它与MALDI过程的高度相容性，建立了纳米氧化硅富集同时脱盐-MALDI/MS直接分析的方法分析痕量蛋白质和多肽。
本发明的氧化硅纳米粒子对多肽或蛋白有富集和脱盐作用，与传统的溶剂蒸发浓缩方法相比，氧化硅纳米粒子在富集样品同时可以高效脱盐，其脱盐能力远远高于商品化ZipTipTM吸嘴。
本发明的氧化硅纳米粒子可以与基质均匀混合形成均匀细致的结晶，纳米粒子与基质的混晶体的形成有利于基质将吸收的激光能量转移给氧化硅纳米粒子吸附的样品，实现样品的基质辅助激光解析离子化过程；同时均匀细致的结晶体保证了分析的重现性和结果的可靠性。
本发明样品富集后可直接进行MALDI质谱鉴定，无需样品洗脱步骤，操作简单，避免了洗脱过程带来的样品损失。本方法成本低廉，浓缩效率高，除盐能力强，可以实现10-10M蛋白质酶解产物的成功鉴定。
附图说明
图1氧化硅纳米粒子的扫描电镜照片。由图可看出纳米氧化硅粒子尺寸分布均匀，其粒径均小于100nm。
图2为10-7M泛素样品的MALDI/MS谱图。
图3为氧化硅纳米粒子富集泛素样品的MALDI/MS谱图。样品浓度，10-8M，实验方法依照实例1-3。对比图2和图3可以看出，氧化硅纳米粒子对泛素样品有很强的富集能力。
图4为含4M氯化钠的细胞色素C样品的MALDI/MS谱图。细胞色素C浓度，10-7M。
图5为氧化硅纳米粒子富集细胞色素C同步除氯化钠后的MALDI/MS谱图。细胞色素C浓度，10-7M。氯化钠浓度，4M。对比图4和图5可以看出，氧化硅纳米粒子在富集细胞色素C的同时可以克服高浓度无机盐对质谱信号的干扰。
图6为含8M尿素的细胞色素C样品的MALDI/MS谱图。细胞色素C浓度，10-7M。
图7为氧化硅纳米粒子富集细胞色素C同步除尿素后的MALDI/MS谱图。细胞色素C浓度，10-7M。尿素浓度8M。对比图6和图7可以看出，氧化硅纳米粒子在富集细胞色素C的同时可以克服高浓度有机盐对质谱信号的干扰。
图8为含有1M氯化钠的细胞色素C溶液使用靶上脱盐后的MALDI/MS谱图。细胞色素C浓度，10-7M。实验方法依照实例6。对比图5和图8可以看出，当溶液中盐浓度很高时，靶上脱盐方法效果很差。
图9为含有1M氯化钠的细胞色素C溶液使用ZipTipTM吸嘴脱盐后的MALDITOF/MS谱图。细胞色素C浓度，10-7M。实验方法依照实例7。
图10为含有400mM尿素的细胞色素C溶液使用ZipTipTM吸嘴脱盐后的MALDITOF/MS谱图。细胞色素C浓度，10-7M。对比图5和图9，图7和图10可以看出，本发明脱盐方法远远优于传统ZipTipTM吸嘴脱盐。
图11为含有100mM碳酸氢铵的10-10M马心肌红蛋白酶解样品经氧化硅纳米粒子同步富集并脱盐后的的MALDI/MS谱图。氧化硅纳米粒子富集，实验方法依照实例8，质谱数据的数据库检索结果列于表1。良好的数据结果表明该方法对于复杂的蛋白酶解样品同样适用。
具体实施方式
下面的实例是对本发明所提供氧化硅纳米粒子材料进行样品富集同时脱盐和MALDI/TOF MS直接分析过程的进一步说明。
实例1-3氧化硅纳米粒子对蛋白溶液的富集和MALDITOF/MS测定
取1ml-定浓度的蛋白样品溶液分别加入2μL的10mg/mL氧化硅纳米悬浮液，在37℃下振荡30min；17000g下离心20min，弃除上清，在氧化硅沉淀中加入5μL50％乙腈，振荡使之悬浮。
取前述悬浮液0.5μL滴到MALDI耙板上，再加入等体积5mg/mL α-CHCA的饱和溶液(0.1％TFA，50％乙腈水溶液)，待结晶干燥后，进行质谱分析。所用质谱MALDITOF/TOF(4700Proteomics Analyzer，Applied Biosystems)；激光器为Nd-YAG激光，波长355nm，激光脉冲频率200Hz；加速电压20kV，正离子模式线性TOF检测。
实例4-5氧化硅纳米粒子对高盐蛋白样品的抗盐富集以及MALDI TOF/MS测定
取1ml一定浓度的含有8M氯化钠或4M尿素的蛋白样品溶液，按照实例1-3的方法加入氧化硅纳米悬浮液，离心后点样，正离子模式线性TOF检测。
实例6传统的板上脱盐
先将样品和基质混合点在不锈钢点样板上，置于空气中自然风干。用移液器取1.5μL含0.1％TFA的去离子水点在样品点上，3-5秒后，将样品点的溶液吸掉，如此反复三次。
实例7ZipTipTMC18柱脱盐
美国Millipore公司的10μL ZipTipTMC18柱脱盐，按照说明书要求：1)用50％乙腈溶液润湿吸嘴三次；2)用0.1％TFA水溶液的平衡三次；3)将吸嘴伸入在样品液中吸进压出，5-10个循环；4)用0.1％TFA水溶液洗涤吸嘴三次；5)取一小Ep管吸入5μL基质液(用含0.1％TFA的50％ACN的溶液配制)，将带有样品的吸嘴在其中反复洗脱。
实例8氧化硅纳米粒子对蛋白质酶解物的抗盐富集及直接鉴定
取5mg/ml马心肌红蛋白的NH4HCO3溶液(100mM)，沸水中加热3分钟，以促使蛋白质变性，室温冷却。以底物/酶质量比50∶1的比例加入胰蛋白酶的溶液，37℃下恒温反应12小时以上。用100mM碳酸氢铵溶液将产物稀释至10-10M，取0.8mL样品加入2μL的10mg/mL的纳米氧化硅悬浊液，依照实例1的方法进行样品富集，正离子模式反射式TOF检测的方法进行质谱分析。质谱结果通过Mascot进行数据库检索。
下表是实例8的马心肌红蛋白样品数据库检索结果。“+”代表检索到氨基酸肽段
| 735.51748.46941.511086.611271.711378.891502.731606.921661.941815.981854.04 | HKIPIKALELFRYKELGFQGHLKTEAEMKLFTGHPETLEKHGTVVLTALGGILKHPGDFGADAQGAMTKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKGLSDGEWQQVLNVWGKGHHEAELKPLAQSHATK | 10.006.056.006.765.408.765.214.655.454.377.03 | -0.6000.700-0.800-1.244-0.6451.171-0.7330.153-0.836-0.575-1.082 | +++++++++++ |
| 匹配肽段数 11 | ||||
| 序列覆盖率(％) 78 | ||||
| 蛋白得分 149 | ||||
Claims (3)
1.一种微量蛋白或多肽同步富集、脱盐并进行鉴定的方法，其特征是具体步骤如下：
(1)以氧化硅纳米粒子作为纳米吸附剂，加入多肽或蛋白质样品的水溶液或盐溶液中，通过静电吸附、亲/疏水作用富集样品，样品浓度为10-11M-10-6M之间，富集时间5-180分钟之间，富集温度4-90℃，氧化硅纳米粒子用量为0.02-2000微克之间；
(2)对经步骤(1)的溶液进行离心处理，弃除上清液，收集下层氧化硅沉淀，再用50％的乙腈稀释；
(3)将经步骤(2)处理的被富集的样品的溶液，直接与有机基质2-氰基-4-羟基肉桂均匀混合，形成均匀细致的结晶，进行MALDI/MS分析；
(4)根据质谱结果，鉴定多肽或蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述氧化硅纳米粒子粒径是3-200nm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是多肽或蛋白质样品的盐溶液是无机盐或者有机盐。
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