CN107576800B - 一种基于96孔板的高通量糖基化肽段除盐富集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白质糖基化修饰领域,涉及一种利用96孔板对肽段进行高通量除盐和糖基化富集的新方法,其包括:通过离心,样品的肽段溶液在填装C18材料的96孔脱盐板上实现溶液的脱盐和有机相转换,洗脱的高有机相溶液即为ZIC‑HILIC材料的上样溶液,直接进入装填ZIC‑HILIC填料的96孔板中进行富集,富集的洗脱液可以浓缩或者直接进入质谱分析。本发明在富集的过程中,无需浓缩和溶液相转化,减少样品损失。在保持了传统的基于移液枪头的亲水相互作用小柱富集方法高特异性的同时,实现了大规模样本的快速富集,节省了样品处理时间。
Description
技术领域
本发明属蛋白质分析领域,涉及一种高通量的糖基化肽段富集的方法,具体涉及通过96孔板,用C18材料,ZIC-HILIC两性离子亲水相互作用材料对肽段进行除盐和糖基化肽富集的高通量一体化的新方法。
背景技术
蛋白质的糖基化是一种常见的蛋白质后修饰。研究显示,糖基化修饰在多种生命活动中起十分重要的作用,如,糖基化修饰在蛋白质的折叠,分子识别,细胞间通讯,信号转导以及肿瘤的发生发展等过程中有十分重要的作用。然而,糖基化蛋白的含量很低,且糖蛋白种类繁杂,糖链呈现微观不均一的特点,目前尚缺乏很好的抗体,因此糖基化蛋白高效的富集对后续的分析显得尤为重要。目前,两性离子亲水相互作用色谱ZIC-HILIC材料是应用最广泛的富集方法之一,该方法操作简单,对带不同糖链的肽段都具有很好的富集效果,富集后的糖肽保留了糖链结构,可以用作位点分析,糖链解析,完整糖肽解析等。但是对于大规模的样品,无论是基于色谱还是基于枪头的ZIC-HILIC富集,都将耗费大量时间和人力;此外,基于移液器枪头的ZIC-HILIC富集,在大规模的样本富集中,很难控制每次的洗脱残留体积,因而很难保持富集效率的重现性;同时,富集起始需要溶液低盐且高乙腈浓度,往往需要在富集前对肽段样品进行除盐和冻干,冻干过程除了耗时外,还会带来的样品损失。
基于现有技术的现状,本申请的发明人拟提供一种新的高通量的糖基化肽段富集的方法,尤其是利用96孔板整合C18材料和ZIC-HILIC材料对肽段进行高通量糖基化肽段富集的方法,该方法可实现大规模样品的同时富集避免了冻干和转移过程带来的样品损失,同时通过96孔板的离心平行控制富集过程中溶液的残留,实现高通量、高特异性和高重现性的糖基化肽段富集方法,从而进一步促进糖蛋白的研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有ZIC-HILIC糖肽富集材料和富集手段存在的不足和缺陷,提供一种操作简单、快速高效、高通量高重现的糖基化肽段富集方法,具体涉及一种基于96孔板的高通量糖基化肽段除盐富集方法,尤其涉及一种利用96孔板整合C18材料和ZIC-HILIC材料对肽段进行高通量糖基化肽段富集的方法。
为了实现上述方案,本发明采用如下的技术方案:
1. 将C18材料和ZIC-HILIC材料分别填入带滤膜的96孔板;
2.在装填C18材料的96孔板中,利用C18材料结合胰酶酶解肽段,对样品进行除盐;
3.将C18除盐的洗脱液直接离心,进入装填ZIC-HILIC材料的96孔板相应孔道中,利用两性离子亲水相互作用使活化好的ZIC-HILIC材料结合并富集酶解溶液中的糖基化肽段;
4.将糖基化肽段洗脱下来并进行进行质谱分析;
具体的,本发明的一种基于96孔板的高通量糖基化肽段除盐富集方法,通过C18、ZIC-HILIC材料和96孔板的组合,对样品中的糖基化肽段进行一步到位完成除盐和高特异性富集操作,并进行质谱分析。
更具体的,本发明中利用96孔板装填C18和ZIC-HILIC材料,C18板的洗脱溶液即为ZIC-HILIC富集板的上样溶液,仅通过离心,完成对复杂样品的除盐和富集,其特征为:离心对96孔板中每孔的样品进行平行操作,肽段溶液首先和C18材料结合,溶液中的盐分离子被清洗除去,之后C18除盐洗脱液为高有机相溶液,直接离心进入ZIC-HILIC富集板进行上样,糖肽通过两性离子亲水相互作用和ZIC-HILIC材料结合,非糖肽会被洗去,最后通过离心的方法将糖肽从材料上洗脱下来,实现糖基化肽段的高通量高特异性富集。其包括步骤:
(1)将C18,ZIC-HILIC填料分别均匀地填到带滤膜的96孔板中;
(2)通过离心的方法,在C18除盐板加入相应溶液,依次完成活化,平衡,上样,清洗,使得肽段脱盐;
(3)通过离心,在ZIC-HILIC富集板加入洗脱溶液,进行活化;
(4)在C18除盐板中加入洗脱溶液;并将除盐与富集板叠加在一起,通过离心,使肽段溶液进入富集板相应孔道并离去;
(5)用洗脱溶液清洗材料,通过离心除去清洗溶液;
(6)用平衡溶液洗脱下目标糖肽,收集在新的96孔板中,并转移到EP管中,冷冻干燥;
(7)将冷冻干燥的样品用碳酸氢铵缓冲液重溶,加入去糖链酶PNGase F充分混合;冷冻干燥;
(8)将样品重悬于0.1%甲酸溶液,与有机基质混合后进行基质辅助激光解吸离子化质谱分析或用进行电喷雾质谱分析。
本发明中,将相应的填料称量后加入带滤膜的96孔板相应孔道中,加入平衡溶液,对材料进行吹打重悬和离心操作,使材料均匀地填在孔道底部。
本发明中,所用的活化溶液为100% 乙腈,平衡溶液为0.1% 三氟乙酸,洗脱溶液为75%~80%乙腈,1%三氟乙酸,除盐过程中,所以溶液每次加入200 μL ~300 μL,重复1~2次;
本发明中,所述步骤(2) 中,C18填料与多肽溶液中中肽段质量比为1:15 ~1:50,多肽溶液浓度为0.5~2 μg/μL;
本发明中,所述步骤(2)、(4) 中离心的条件为15~25℃,100 g~1000 g;所述步骤(3)、(5)、(6)中离心的条件为15~25℃,1000 g~2500 g;
所述步骤(5)中,冷冻干燥的样品用25 mM~ 100 mM的碳酸氢铵溶液重悬,肽段溶液的浓度在0.5~2 μg/μL,糖苷酶PNGase F以 500 ~1000单位糖苷酶每微升的比例加入,在37℃反应14 ~18小时,将糖链从样品中释放。
所述步骤(8)中,进行激光辅助机制解析质谱分析时使用的基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)。
本发明使用的96孔板法对大规模样品进行高通量的富集,经试验,结果显示,使用C18和ZIC-HILIC材料结合的方法,C18脱盐板的使用,一方面可以使肽段溶液体系中的盐分除去,提高ZIC-HILIC材料的富集效率;另一方面ZIC-HILIC富集糖基化肽段时肽段需要溶解在高有机相溶液中,脱盐板的使用可快速实现溶液的成分转化从而达到蛋白酶解溶液到糖基化肽段的一步到位的富集,减少样品损失和样品处理时间。此外,本发明始终使用离心的手段,离心可以保证ZIC-HILIC材料对复杂样品的高特异性富集,同时在处理大规模样品时,避免了脱盐溶液转移到富集材料中的操作时间。本发明具有操作简单,快速,高通量,高特异性等特点。
附图说明
图1为100 μg标准糖基化蛋白-去唾液酸胎球蛋白ASF酶解肽段在富集和去糖链后的MALDI-TOF-MS谱图,其中,MALDI-TOF-MS谱图纵坐标为质谱峰的相对强度 (%Intensity),横坐标为质荷比(m/z); a)富集前;b)从100 μg标准糖基化蛋白酶解溶液富集后的MALDI-TOF-MS图,*号为糖肽峰,对比图(a)和图(b)可以看出,经过富集后,糖基化肽可以被选择性地富集出来。
图2为96孔板方法富集250 ug Hela细胞全蛋白中糖基化肽段结果。
具体实施方式
下述的实例是对本发明提出的利用96孔板对肽段进行高通量糖基化富集方法的进一步说明。
实施例1 基于96孔板的高通量糖基化肽段富集方法富集效果考察实验
将C18材料和ZIC-HILIC材料称量40 mg,分别装填到两个带滤膜的96孔板中,分别加入0.1%三氟乙酸水溶液200 μL,用枪头吹打后离心,使材料在孔道中铺匀;用100%乙腈,200 μL对C18板进行活化,重复一次;后用0.1%三氟乙酸,200 μL对C18板进行平衡,重复一次;将100 μg糖基化蛋白去唾液酸胎球蛋白ASF的酶解溶液调整至终浓度1 μg/μL后加入平衡好的96孔板中离心弃去溶液;再向孔道中加入0.1%三氟乙酸水溶液200 μL,洗去盐分,重复一次;以上操作均通过离心弃去溶液,离心转速均为为500 g,15℃;在富集板中加入75%乙腈,1%三氟乙酸溶液200 μL,2400 g,15℃离心弃去溶液,重复三次,将清洗过的从C18板叠加在活化好的ZIC-HILIC板上,500 g离心,完成肽段从C18材料的洗脱,肽段与ZIC-HILIC材料的结合操作;后向富集板孔道中加入75%乙腈,1%三氟乙酸溶液200 μL,2400 g离心,将非特异性糖肽从ZIC-HILIC材料上洗去,重复五次,向清洗过的材料中加入0.1%三氟乙酸200 μL,2400 g离心收集溶液,将糖基化肽段从材料上洗脱下来,重复一次,合并洗脱液并冻干,冻干的肽段用100 mM碳酸氢铵溶液重悬,体积为100 μL,加入0.1 μL PNGase F酶反应,37℃孵育14小时后冷冻干燥,冻干后的样品重溶与10 μL的0.1%甲酸溶液,取1μL点样与MALDI靶板上,干燥后用1 μLα-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液重结晶,干燥结晶后进行MALDI-TOF-MS分析,结果显示,经过富集后,糖基化肽可以被选择性地富集出来(如图1所示)。
实施例2 基于96孔板的高通量糖基化肽段富集方法富集稳定性考察实验
将C18材料和ZIC-HILIC材料称量40 mg,分别装填到两个带滤膜的96孔板中,分别加入0.1%三氟乙酸水溶液200 μL,用枪头吹打后离心,使材料在孔道中铺匀;用100%乙腈,200 μL对C18板进行活化,重复一次,后用0.1%三氟乙酸,200 μL对C18板进行平衡,重复一次,将250 μg Hela细胞全蛋白酶解溶液(体积200 μL) 加入平衡好的96孔板中A12, D6,H1, H12四个位置,离心弃去溶液,再向孔道中加入0.1%三氟乙酸水溶液200 μL,洗去盐分,重复两次次,以上操作均通过离心弃去溶液,离心转速均为为500 g,15℃;在富集板中加入75%乙腈,1%三氟乙酸溶液200 μL,2400 g,15℃离心弃去溶液,重复三次,将清洗过的从C18板叠加在活化好的ZIC-HILIC板上,500 g离心,完成肽段从C18材料的洗脱,肽段与ZIC-HILIC材料的结合操作;后向富集板孔道中加入75%乙腈,1%三氟乙酸溶液200 μL,2400 g离心,将非特异性糖肽从ZIC-HILIC材料上洗去,重复五次,向清洗过的材料中加入0.1%三氟乙酸200 μL,2400 g离心收集溶液,将糖基化肽段从材料上洗脱下来,重复一次,合并洗脱液并冻干,冻干的肽段用100 mM碳酸氢铵溶液重悬,体积为100 μL,加入0.1 μL PNGase F酶反应,37℃孵育14小时后冷冻干燥,干燥后的样品重溶于25 μL的0.1%甲酸溶液,取8 μL进行电喷雾质谱分析,结果如图2所示。
Claims (5)
1.一种基于96孔板的高通量糖基化肽段除盐富集方法,其特征在于,其包括, 将C18材料和ZIC-HILIC材料分别填入带滤膜的96孔板;在装填C18材料的96孔板中,利用C18材料结合胰酶酶解肽段,对样品进行除盐;将C18除盐的洗脱液直接离心,进入装填ZIC-HILIC材料的96孔板相应孔道中,利用两性离子亲水相互作用使活化的ZIC-HILIC材料结合并富集酶解溶液中的糖基化肽段;将糖基化肽段洗脱并进行质谱分析;包括步骤:
(1)将C18,ZIC-HILIC材料分别填到孔底部带滤膜的96孔板中,滤膜规格为5μm;
(2)在C18 脱盐板中,每孔加入活化液,离心弃去所有溶液,使得C18材料活化;所述活化液为100% 乙腈,所述的离心的条件为15~25℃,100 g~1000 g,
(3)在C18 脱盐板中,每孔加平衡溶液,离心弃去所有溶液使得C18材料平衡;所述的平衡溶液为0.1% 三氟乙酸,所述的离心的条件为15~25℃,100 g~1000 g;
(4)每孔加入相应的样品,肽段和C18材料结合,离心弃去溶液;肽段的浓度为500ng/μL~ 5 μg/μL,肽段样品和材料的质量比为1:15~1:50;所述的离心的条件为15~25℃,100 g~1000 g;
(5)每孔加入平衡溶液,离心弃去溶液;所述的的平衡溶液为0.1% 三氟乙酸,所述的离心的条件为15~25℃,100 g~1000 g;
(6)在ZIC-HILIC富集板中每孔加入洗脱溶液,离心弃去使ZIC-HILIC材料活化;所述得洗脱溶液为75%~80%乙腈,1%三氟乙酸;每次加入体积200 μL~300 μL,所述的离心的条件为15~25℃,100 g~1000 g;
(7)在C18脱盐板中每孔加入洗脱溶液,并将C18脱盐板,ZIC-HILIC富集板和普通96孔板叠在一起,进行离心,使C18材料的洗脱液与ZIC-HILIC材料接触后离去;肽段从C18脱盐板中被洗脱下,进入ZIC-HILIC富集板,ZIC-HILIC材料抓取溶液中的糖肽,其他非糖肽则被离去;所述的洗脱溶液为75%~80%乙腈,1%三氟乙酸;每次加入体积200 μL~300 μL,所述的离心的条件为15~25℃,100 g~1000 g;
(8)ZIC-HILIC富集板中每孔加入洗脱溶液,离心弃去,洗去非糖肽;所述得洗脱溶液为75%~80%乙腈,1%三氟乙酸;每次加入体积200 μL~300 μL,所述的离心条件为15~25℃,1000g~2500 g;
(9)ZIC-HILIC富集板中每孔加入平衡溶液 ,离心并收集溶液,洗脱下来的即为富集的糖肽,冷冻干燥作后续质谱分析;所述的平衡溶液为0.1% 三氟乙酸,所述的离心条件为15~25℃,1000 g~2500 g。
2.按权利要求1所述的方法,其特征是,所述步骤(1)中,每孔填料质量为20 ~100 mg,每孔所对应的肽段起始量为20 μg~5 mg。
3.按权利要求1所述的方法,其特征是,所述步骤(2)中活化液每次加入体积200 μL~300 μL,重复1~2次。
4.按权利要求1所述的方法,其特征是,所述步骤(3),(5),(9)中的平衡溶液,每次加入200 μL~300 μL,重复1~2次。
5.按权利要求1所述的方法,其特征是,所述步骤步骤(6),(7)中离心重复1~2次,步骤(8)中洗涤重复3~6次。
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