CN1682110A - 固体支持体和由解吸/电离质谱分析固定于该固体支持体上的多种物质或复合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对多种样品进行快速有效的质谱分析的工具；以及快速分析生物物质，例如核酸和蛋白质的方法。上述工具是具有碳层的固体支持体，将通过凝胶电泳分离的物质转移至所述碳层上。上述方法是质谱分析多种物质的方法，其包括通过凝胶电泳分离样品中的物质，将凝胶中分离后的物质转移到上述固体支持体上，使得物质固定化并将固定化的物质进行解吸/电离。

Description

固体支持体和由解吸/电离质谱分析固定于 该固体支持体上的多种物质或复合物的方法
技术领域
本发明涉及固体支持体，用于将在凝胶中分离后的物质转移到其上进行固定化，本发明还涉及通过快速质谱分析化验和分析例如核酸，蛋白质等固定在该固体支持体上的生物物质的方法。
背景技术
大多数生物物质由数量相对少的结构单元按一定规则聚合而成，例如肽、蛋白质、核酸、糖等等。例如，肽和蛋白质是由二十种L-α-氨基酸通过肽键结合而成的这类物质。大多数这些结构单元的分子结构和天然正确的分子量已经得以了解。因此，能够正确测量出生物物质和其片段的分子量时，非常利于对其结构(构型等等)和活体内多种修饰反应的分析，所以质谱分析方法是对如蛋白质等生物物质的结构分析中不可缺少的方法。在质谱分析中激光解吸/电离-飞行时间(ionization-time-of-flight)型质谱分析设备可以将例如DNA、蛋白质等等巨大的大分子离子化，因而作为一种分析生物物质的实用方法而备受关注。
在激光解吸/电离-飞行时间型质谱分析设备中，激光照射到需要进行分析的样品的一个区域上，从该区域释放出的离子在电场中加速。这样，离子的质量/电荷比值越小，也就是说，离子越轻，飞行到达监测器的速度越快。激光解吸/电离-飞行时间型质谱分析是一种质谱分析方法，其利用的原理是根据离子不同的质量电荷比值(m/z)造成了离子不同的飞行时间。
另一方面，在对如DNA、蛋白质等生物物质的结构分析/判定中，有必要通过质谱分析方法分析片段，这些片段通过将某个已分析过的对象分离和提炼成多个组分并使用限制性酶将各个组分片段化而获得，因此必须分析许多样品。并且，在DNA诊断中有必要快速处理从许多人中获得的样品。
相反的，可商品化购买的常规激光解吸/电离-飞行时间型质谱分析设备中，提炼后的各自样品放置在一块样品板上并逐个进行质谱分析。也就是说，激光必须照射取样的各个样品以进行逐一分析。因此，在未经提炼的样品在电泳中解吸时，必须切割下电泳后凝胶的每个条带以分别提炼出所切割出的样品，使用激光解吸/电离-飞行时间型质谱分析设备对其逐一进行质谱分析，因此很难快速地分析多种样品。
此外，尽管已知有一种方法，将经电泳后的生物物质从凝胶转移到由硝酸纤维素等制成的膜上进行分析，但是使用激光的质谱不能在膜上进行分析，而分析受到使用抗原-抗体反应和核酸杂交的荧光检测的限制。这是因为传统使用的膜由硝酸纤维素、PVDF等制成，在激光照射下膜很可能自身会发生分解。也就是说，对于转移到这些膜上的生物物质难以使用激光解吸/电离-飞行时间型质谱分析设备按其本身的样子进行分析。
本发明的一个目的是提供对多种样品进行快速质谱分析的方法和对如核酸、蛋白质等生物物质进行快速分析的方法。
发明公开
作为热切质询以解决该问题的结果，本申请的发明者已完成本发明，发现了一种可以解决该问题的方法，该方法中样品中的物质经凝胶电泳分离后，将凝胶中分离和展开的物质固定于表面形成有碳层的固体支持体上，并通过解吸/电离进行质谱分析。
也就是说，本发明包含以下内容。
(1)固体支持体，其表面包含碳层且其中当样品中所含物质经凝胶电泳分离后，通过转移凝胶中的物质将其固定在固体支持体上。
(2)固体支持体，其表面包含碳层，且其中当样品中所含物质经凝胶电泳分离后，将凝胶分离的物质转移至膜上并再将转移到膜上的物质转移而固定在固体支持体上。
(3)固体支持体，其中通过向固定在根据(1)或(2)的固体支持体上的所述物质中添加与之相互作用的物质而形成复合物。
(4)根据(1)至(3)中任何之一的固体支持体，其中碳层包含金刚石样碳层。
(5)根据(1)至(4)中任何之一的固体支持体，其中碳层厚度为单分子层至100微米。
(6)根据(1)至(5)中任何之一的固体支持体，其中碳层表面经过化学修饰活化。
(7)根据(1)至(6)中任何之一的固体支持体，其中所固定的物质包含核酸或肽。
(8)通过解吸/电离固定在根据(1)至(7)中任何之一的固体支持体上的多种物质或复合物进行质谱分析的方法。
(9)固体支持体，其表面包含碳层并用于根据(8)所述的方法。
附图简述
图.1展示实施方案1，其中Cy3蛋白质A和大肠杆菌蛋白质用SDS-PAGE方法进行电泳，迁移后的凝胶使用CBB染色15分钟，染色后使用LAS1000(富士摄影胶卷股份有限公司制造)进行图像拍摄。图.2展示实施方案1，其中电泳后转移凝胶至固体支持体1上，转移后使用FLA8000(富士摄影胶卷股份有限公司制造)对固体支持体的荧光强度进行图像拍摄。图.3展示实施方案1，其中经电泳后凝胶转移至固体支持体1，用PBS清洗10分钟，干燥，随后用于图像拍摄。图.4展示实施方案1，其中经电泳后凝胶转移至固体支持体1，经过PBS清洗10分钟，再用封闭试剂封闭1小时，随后加入Cy3-IgG在室温下反应1小时，使用PBS清洗12小时(室温)，并进行图像拍摄。图.5展示实施方案2，其中Cy3蛋白质A通过SDS-PAGE方法进行电泳，迁移后的凝胶用CBB染色15分钟，脱色后使用LAS1000(富士摄影胶卷股份有限公司制造)进行图像拍摄。图.6展示根据实施方案2的安排，当蛋白质电泳后从凝胶转移到固体支持体2上。图.7展示实施方案2，其中经蛋白质电泳后凝胶转移至固体支持体2，用PBS清洗30分钟并干燥，转移后的凝胶使用FLA8000(富士摄影胶卷股份有限公司制造)进行图像拍摄。图.8展示实施方案3，其中将Cy3蛋白质A和Cy3-IgA通过SDS-PAGE方法进行电泳，迁移后的凝胶使用CBB染色15分钟，脱色后使用LAS1000(富士摄影胶卷股份有限公司制造)进行图像拍摄。图.9展示实施方案3，其中经蛋白质电泳后凝胶转移至固体支持体2，用PBS清洗30分钟并干燥，转移后的凝胶使用FLA8000(富士摄影胶卷股份有限公司制造)进行图像拍摄。图.10展示实施方案4，其中将Cy3蛋白质A通过SDS-PAGE方法进行电泳，凝胶使用CBB染色15分钟，脱色后使用LAS1000(富士摄影胶卷股份有限公司制造)进行图像拍摄。图.11展示根据实施方案4的安排，蛋白质经电泳后从凝胶转移到PVDF膜上。图.12展示根据实施方案4的安排，蛋白质从PVDF膜上转移到固体支持体3上。图.13展示在实施方案4，其中蛋白质从PVDF膜转移后至固体支持体3，用PBS清洗20分钟，干燥，然后使用FLA8000(富士摄影胶卷股份有限公司制造)进行图像拍摄。图.14展示实施方案5中当固定化豆类胰岛素(1eginsulin)结合蛋白质的不锈钢-DLC固体支持体经过TOF-MS分析后的结果。图.15展示在实施方案5中，当豆类胰岛素和固定有豆类胰岛素结合蛋白质的不锈钢-DLC固体支持体相互作用时，经过TOF-MS分析后的结果。
本发明的最优实施模式
根据本发明，样品由凝胶电泳分离并且电泳后的凝胶与其表面上具有碳层的固体支持体紧密接触，由此经电泳分离和提炼作为分析对象的物质转移并固定在固体支持体上。因此，通过解吸/电离固定在固体支持体上的物质对多种物质进行质谱分析。
在本发明中，能够固定在固体支持体上进行分析的物质并无明确限制而是包括了如核酸，比如DNA、RNA等，肽和PNA(肽核酸)等生物物质。本申请说明书中所指的肽包括寡聚肽、多聚肽和蛋白质。特别是，本发明对具有高分子量的物质具有优异的分析能力。作为凝胶电泳对象的样品所包含的物质并无明确限制而是包括了细胞提取物、真菌体提取物、非细胞合成产物、PCR(多聚酶链式反应)产物、酶生成产物、合成的DNA、合成的RNA、合成的肽等等。
用于转移和固定如通过电泳在凝胶中分离的生物物质的固体支持体并无明确限制，只要基质表面具有能固定这些生物物质的碳层。优选在碳层上进行特殊的化学修饰。这是因为使用特殊化学修饰能使作为分析对象的物质更易结合并稳定地固定化。
本发明中所指的基质指用于形成碳层的基础材料，这类基础材料并无明确限制而可以包括如金、银、铜、铝、钨、钼、铬、铂、钛、镍等的金属；如不锈钢、哈氏合金、英科耐尔、蒙乃尔合金、硬铝等的合金；以上金属薄片和陶瓷；玻璃；硅酮；纤维；木材；纸张；如聚碳酸酯、氟树脂等的塑料；塑料和上述金属、陶瓷、金刚石等的混合物。通过在玻璃或塑料表面形成铂、钛等金属的金属层所形成的碱性材料也能使用。金属层可以通过喷镀、真空沉积、离子束沉积、电镀、无电镀沉积等途径形成。
在对固定化的物质进行如激光解吸/电离-飞行时间型质谱分析等质谱分析时，由于对固体支持体施加高电压，优选由导电材料制成基质，比如不锈钢、铝、钛等。
本发明中基质上形成的碳层并无明确限制，而是可包括合成的金刚石、高压合成的金刚石、天然金刚石、软质金刚石(例如，金刚石样碳)、无定形碳和碳质物质(例如，石墨、富勒烯、碳纳米管)，及其混合物，或者由其薄片组成的层，碳化铪、铌碳、碳化硅、碳化钽、碳化钍、碳化钛、碳化铀、碳化钨、碳化锆、碳化钼、碳化铬、碳化钒，或者类似物质之一，而且优选金刚石样碳。本文中，软质金刚石是对金刚石结构不完全的金刚石和碳混合物的统称，例如所谓的金刚石样碳(DLC)，并且混合的比例并无明确限制。
碳层的优点在于其出色的化学稳定性，能抗御化学修饰和与作为分析对象的物质结合时的反应，由于它和作为分析对象的物质以共价键结合，因而结合稳定，由于其没有紫外吸收，显然适于紫外检测系统，而且在电印迹时能承载电流。并且，对作为分析对象的物质进行固化反应时碳层还具有非特异吸附较小的优点。
本发明中，可以已知方法形成碳层。方法包括例如微波等离子体CVD(化学蒸气沉积)法、ECRCVD(电回旋加速器共振化学蒸气沉积)法、IPC(感应耦合等离子体)法，D.C.喷镀法、ECR(电回旋加速器共振)喷镀法、离子化沉积法、弧型沉积法、激光沉积法、EB(电子束)沉积法、阻抗加热沉积法等。
在高频等离子体CVD方法中，通过在电极间由高频率产生的辉光放电将物质气体(甲烷)分解，在基质上形成DLC(金刚石样碳)层。在离子化沉积方法中，使用由钨丝产生的热电子将原料气体(苯)分解/离子化，并运用偏置电压在基质上形成碳层。离子化沉积方法可以在混合气体中形成DLC层，混合气体由占总体积的1到99％的氢气和总体积剩余的99至1％的甲烷组成。
在弧型沉积方法中，通过在固体石墨原料(阴极蒸气源)和真空容器(阳极)之间使用D.C.电压造成真空中的弧形放电而从阴极产生碳原子的等离子体，并对基质施加比蒸气源更大负值的偏置电压，将等离子体中的碳原子向基质加速，从而形成碳层。
在激光沉积方法中，碳层可以通过辐射形成，例如，Nd：YAG激光(脉冲振荡)照射在目标石墨平板上将其熔化使碳原子积累到玻璃基质上。
根据本发明固体支持体表面上的碳层通常的厚度在单分子层到100微米的尺寸。优选厚度为2纳米到1微米，更优选厚度为5纳米至500纳米，因为厚度太小时，可能会局部暴露出衬着的固体支持体，相反厚度太大时导电性会降低。另外，整个固体支持体也可由碳原料制成。
为了在物质从电泳后的凝胶中转移后直接进行激光解吸/电离-飞行时间型质谱分析等，本发明中的固体支持体优选为平板形。固体支持体的大小并无明确限制，不过通常大小尺寸为10到200毫米宽×10到200毫米长×0.1到20毫米厚。
为固化如核酸、肽等生物物质，优选对其上形成碳层的基质表面通过化学修饰进行活化。本领域技术人员可适合地选择对目的物质的固定化有促进作用的此类表面活化，并无明确限制，而是包括例如引入氨基基团、羧基基团、环氧基团、甲酰基团、羟基基团、碳二亚胺基团和活性酯基团。并且，引入例如螯合镍、螯合钴等金属螯合物是有效的。
氨基基团的引入可以通过照射紫外射线实现，例如，对氯气中的碳层进行氯化，随后在氨气中对其进行紫外线照射。或者可以通过将如亚甲基二胺、亚乙基二胺等多价胺与经氯化的碳层反应实现基团引入。或者通过对碳层表面用氨等离子体或者亚乙二胺等离子体处理实现基团引入。
羧基基团的引入可以通过例如将用上述方法氨基化的碳层和适当的多价羧酸反应实现。
环氧基团的引入可以通过例如将用上述方法氨基化的碳层和适当的多价环氧化合物反应实现。或者通过将有机过氧化物和碳层中的碳碳双键进行反应实现基团引入。这里列出的有机过氧化物有乙酰氢过氧化物、过氧苯甲酸、双过氧邻苯二甲酸、过甲酸、三氟乙酰氢过氧化物等等。
甲酰基团的引入可以通过例如将用上述方法氨基化的碳层和戊二醛反应实现。
羟基基团的引入可以通过例如将用上述方法氯化的碳层和水反应实现。
碳二亚胺基团的引入可以通过例如将用上述方法氨基化的碳层和碳二亚胺反应实现。
活性酯基团的引入可以通过下述方法实现，例如氯气中紫外射线照射碳层进行氯化，随后在氨气中对其进行紫外线照射而氨化，使用合适的酸氯化物或者二羧基酸酐将碳层羧基化，并使远端羧基基团和碳二亚胺或者双环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺脱水缩合。由于这个过程的作用，使得通过胺键可以在烃基团的远端形成能和如N-羟基琥珀酰亚胺等活性酯基团结合的基团。
在固定化例如DNA、RNA等核酸时，优选引入N-羟基琥珀酰亚胺基团、碳二亚胺基团、环氧基团和甲酰基团。
在固定化肽时，优选引入N-羟基琥珀酰亚胺基团、碳二亚胺基团、环氧基团、甲酰基团和金属螯合物。当固体支持体引入了金属螯合物时，就可能有效和稳定地将一个具有如多聚组氨酸构型等金属离子亲和标记的肽固化。可以通过例如将形成有碳层的基质氯化，然后氨基化基质，并加入例如氯乙酸等的卤羧酸来引入螯合配基。通过众所周知的方法本领域的技术人员可引入多聚组氨酸构型的标记。
本发明中可用于分离样品的电泳方法并无明确限制，而是包括例如琼脂糖凝胶电泳法、筛分琼脂糖凝胶电泳法、变性琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦凝胶电泳法、双相电泳法等。本领域技术人员可以根据作为分离对象物质的种类和分子量适当选择使用一种电泳方法。
琼脂糖凝胶电泳法充分用于核酸的分离。由于和聚丙烯酰胺凝胶相比琼脂糖凝胶的胶网格更大，可以根据不同的长度和分子结构分离几十至几百Kbp的DNA片段。由于整个DNA片段的带电荷状态主要由磷酸基团的数目决定，迁移率和DNA片段的尺度大小呈对应关系。在电场方向间歇性地改变下进行迁移时，还可能分离例如酵母染色体等的巨型DNA(脉冲场电泳)。
核酸的聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种主要用于分析DNA片段的方法，并且和琼脂糖凝胶电泳的情况相比，聚丙烯酰胺凝胶利用微小网格以长度和分子结构为基础分离短链(最长达1Kbp)片段。由于受DNA立体结构(构象)的极大影响，对DNA链长度的估计仅限于在双链DNA进行迁移时的情况。由于对单链DNA的预期认为其有不同的结构，没有发现迁移率和DNA链长度之间的联系，并且在某些情况下此类DNA检测出为多条带。即使DNA碱基中微小的不同也会产生结构上的变化从而影响迁移模式。DNA片段分析法(SSCP：单链构象多样性)已经开发用于对基因突变的分析。已经知道含有特殊构型(重复的构型，碱基偏差(deviationof base)等)的双链DNA片段会扭曲DNA结构，而且聚丙烯酰胺电泳法也不能对DNA进行构象·构型分析。此外，单链DNA还可以在含有尿素修饰过的凝胶中根据链的长度进行分离，而不会影响结构。
SDS(十二烷基硫酸钠)-聚丙烯酰胺电泳法(SDS-PAGE法)是一种目的蛋白质变性形成高度规则化的结构，并依据分子量的不同大小进行分离的方法。由于聚丙烯酰胺凝胶孔径致密，其适于分离100至200KDa或以下的蛋白质和肽。由于该方法简单易行，重复性好，因而在蛋白质电泳中应用最为频繁。通常，制备迁移样品时加入如β-巯基乙醇、DTT(二硫苏糖醇)等还原剂用来断裂蛋白质的S-S键(二硫键)。由于分子的电荷基本上由SDS的结合量决定，可以根据分子量用电泳分离多肽分子。由于SDS是一种强阴离子表面活性剂，适合对不可溶的蛋白质如膜蛋白进行增溶。
等电聚焦电泳是一种利用等电点(pI)的不同分离蛋白的电泳方法并且可实现对目的蛋白质的等电点测量和分析的电泳方法。组成蛋白质的氨基酸侧链、氨基末端和羧酸末端所带的电荷根据pH环境而改变，而在总电荷量为零时的pH值即为等电点。为了进行等电聚焦电泳，必须在迁移凝胶中形成pH梯度。当迁移凝胶上加入样品并施加电场时，蛋白质分别在凝胶中迁移到与适当pI相同pH值的位置。为了形成pH梯度凝胶，一种可行的方法是通过向凝胶中加入载体两性电解质并施加电场，而一种方法(IPG法：固化pH梯度)是使用带有不同pI侧链的丙烯酰胺衍生物在制备凝胶的同时形成pH梯度，而且IPG法由于具有优异的分离能力，重复性和附加容许值(addition a11owable value)而主要用于蛋白质组学。专门用在IPG法的预制凝胶(Immobiline干条凝胶)有商品化出售。使用载体两性电解质的等电聚焦电泳具有0.01至0.02pH单位的分离能力，而IPG法甚至能实现对只有0.001pH单位范围内差异的分离。
双相电泳法是一种蛋白质在两维度上通过两步分离的电泳方法。通常，使用等电聚焦对蛋白质进行第一相分离，而使用SDS-PAGE法根据分子量在第二相上进行分离。由于两种方法都有很强的分离能力，可以将所有细胞内的蛋白质分离成数目达几千甚至更多的点。通常使用具有更好重复性和更高分辨能力的固化pH梯度法(IPG法)进行第一相迁移。此外，为了获得更多的点，可以在宽pH范围分离结果的基础上对目的pH部分在窄pH IPG凝胶上进行分离，然后使用20厘米甚至更大的大号凝胶进行第二相电泳。
根据本发明，在分离DNA、RNA时优选使用琼脂糖凝胶电泳法，而在分离肽时优选使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法和双相电泳法。本领域技术人员可以通过常用的方法实施这些电泳方法。
电泳后，将凝胶切割成适合放置在所使用的固体支持体上的大小，使凝胶和固体支持体相互紧密接触，使凝胶中被分离和分析的目的物质转移到固体支持体之上进行固定化。转移到固体支持体的方法并无明确限制而是可以选择本领域常用的方法。这里举例列出的方法例如，利用毛细现象的毛细型印迹，涉及使用泵抽吸的真空型印迹和使用电方法的电印迹。在转移核酸的情况下，优选使用毛细型印迹，而在转移肽时优选使用电印迹。
电印迹中，尽管可以使用槽型、半干型和半湿型印迹之一，但从缓冲液用量小、反应时间短或类似角度考虑，优选使用半干型电印迹。印迹设备可以使用本领域通常使用的电印迹设备。电印迹中优选的通电条件包括在恒定的200V伏特或更低的电压下，优选0.1至10伏特电压下通电1至500分钟，优选5至100分钟。当电压高于金属基质的氧化电势时，金属会发生解析，因而优选在低于基质金属氧化电势的电压下进行电印迹。
在本发明进一步的实施方案中，作为分析对象的物质不需要电泳可以根据本发明通过直接点样在固体支持体上并通过TOF-MS或类似的方法进行分析。此外，施加在固体支持体上的物质可以固定化，与之相互作用的物质可以通过点样方式进一步固定化，如此相互作用的物质可以通过TOF-MS或类似的方法进行分析。
以下展示本发明中分析样品中蛋白质的电泳和转移的实施方案。首先，将样品中的蛋白质溶解。也就是说，样品中存在的蛋白质水解酶失活，在沸水中进行一定时间的的热处理以有效地依靠SDS和β巯基乙醇将蛋白质变性。随后，将一定量的样品分别注入SDS聚丙烯酰胺凝胶上各泳道中，在作为迁移缓冲液的含有SDS的甘氨酸tris缓冲液中以一定电压进行一定时间的迁移。迁移完毕后，将凝胶浸泡在预冷的甘氨酸tris缓冲液中，进行一定时间的平衡。随后，将凝胶放置在电印迹设备的阴极面而待转移的固体支持体放在阳极面。向转移槽中加入转移缓冲液，置于冰上在一定电压下进行一定时间的转移。此时，从提高转移效率的角度优选在阴极和凝胶之间以及在阳极和固体支持体之间放置滤纸，以吸附缓冲液和离子交换水。对在阴极面滤纸所吸附的缓冲液而言，列出的有Tris、ε-氨基己酸、乙酸、EDTA(乙二胺四乙酸)、磷酸、硼酸、酒石酸、SDS等。在使用含Tris和ε-氨基己酸时，氨基己酸优选具有1000mM以内量级的浓度。阳极面的滤纸优选吸附离子交换水。
在本发明更进一步的实施方案中，电泳后可将目的物质从凝胶转移到现有技术所用的膜上，并根据本发明从膜转移到固体支持体上，由此凝胶中分离的物质可以固定化在固体支持体上。在这种情况下能使用的膜材料列出有硝酸纤维素、PVDF(聚偏二氟乙烯)、尼龙、正电荷尼龙等。转移蛋白质时优选使用和蛋白质结合能力最强的PVDF，而且转移核酸时也优选对核酸非特异吸附小的PVDF。从作为迁移物质的凝胶中转移到膜和从膜转移到固体支持体可以通过使用和上述相同的方法实施。从凝胶转移到膜时，优选使用电印迹，而且优选的电印迹通电条件包括在0.1至50V下进行5至120分钟。从膜转移到固体支持体时，优选使用电印迹设备。
在本发明更进一步的实施方案中，也可以通过将电泳分离的物质在固体支持体上固定化，引起与之相互作用的物质的反应而形成复合物，并将所形成的复合物离子化而进行质谱分析。本发明中所指的质谱分析是一种以质量差异为基础利用电相互作用对原子/分子的离子进行分析的方法。质谱有生成·分离·检测离子这三种不同的功能。在蛋白质通过上述方法固定化于固体支持体的情况下，可以通过用该蛋白质的抗体反应形成复合物，并用如激光照射的方法将复合物离子化进行质谱分析。此外，在如DNA、RNA等的核酸固定于固体支持体的情况下，使用和该核酸互补的核酸与在固体支持体上的核酸杂交，对形成的双链进行离子化质谱分析。可以利用例如酶反应、生物素-抗生物素蛋白链菌素相互作用等其他相互作用。通过对由相互作用形成的复合物进行质谱分析，可以分析与探针分子特异性相互作用的目的分子碱基序列或者氨基酸序列。此外，可以将与固定于固体支持体上的这些分子相互作用的某种分子离子化而进行质谱分析。
可以对固定于固体支持体的物质通过使用如激光解吸/电离-飞行时间型质谱的方法进行质谱分析。在进行质谱时可行的离子化方法列有基质辅助激光解吸(MALDI)法、通过电子冲击的离子化方法(EI)、光致电离法、电离法，其中使用从放射性同位素辐射出并具有大的LET的α或β射线，二级电离法、高速原子冲击电离法、电场电离法、表面电离法、化学电离(CI)法、场电离(FI)法、通过火花放电的电离方法等等，其中优选基质辅助激光释放(MALDI)法和通过电子冲击的离子化方法(EI)。此外，所列出的分离形式有线性或非线性反射飞行时间(TOF)、单一或多重四极、单一或者多重磁分区、傅立叶变化离子回旋加速器共振(FTICR)、离子捕捉、高频、离子捕捉/飞行时间等等，其中优选使用线性或非线性反射飞行时间(TOF)、高频、离子捕捉/飞行时间等形式。可以通过组合电离方法和分离形式，或者包含其组合的分离形式，和诸如电子记录和拍摄记录的检测形式来实施质谱分析。从将大分子物质如生物物质等和在固体支持体上分析多种物质的角度来看，优选使用激光解吸/电离-飞行时间型质谱分析。
在下文中作为本发明的一个实施方案将对使用MALDI-TOF MS进行质谱分析的程序进行描述。
根据本发明，固体支持体上加入如α-氰羟基肉桂酸、芥子酸等的基质，作为分析对象的物质在基质上固化并干燥。随后，将固体支持体置于MALDI-TOF MS的平面目标上。可以用MassLynx软件等开始质谱。可用Masslynx控制测量的全过程并进行分析。在测量过程中，创建了用于自动测量的参数文件、用于测量结束后数据处理和数据库分析的处理文件、样品列表等文件。使用ProteinLynx软件可以对在MassLynx上处理的数据进行操作。质谱由收集到的数据生成，并且生成的谱通过MaxEnt3(Micromass Ltd.)软件其精确度得以提高，然后转化成单一同位素·峰值数据。随后，进行校准获得质量误差为约50ppm的最终数据。可以在数据中找到与其他物质间相互作用的蛋白质的正确质量。
质谱分析后，可以确定氨基酸序列和蛋白质的鉴定。MALDI-TOF MS的分析模式制成是一种能检测源后衰减(PSD)谱的模式，并分析与其他物质相互作用的蛋白质的氨基酸序列。随后，在氨基酸序列的基础上检索SWI SSPROT数据库从而鉴定蛋白质。或者，将其上固定化有作为分析对象物质的固体支持体置于MALDI-TOF/TOF MS和MALDI Q-TOF MS之上，允许进行氨基酸序列的分析和与其他物质相互作用的蛋白质的鉴定。
本发明将通过实施方案具体的进行描述，但是本发明不局限于实施方案。
实施方案
(实施方案1)转移蛋白质至钛-铂-DLC(金刚石样碳)固体支持体
固体支持体的构建
在大小为76毫米×26毫米×1.1毫米的载片上使用磁控管喷镀形成钛层，并在之上喷镀铂层。喷镀条件如下。对钛层和铂层形成的各金属层的厚度分别为100纳米。
表1
形成钛层和其上的铂层的条件
金属层 B.P.(托) 电压(伏特) 电流(毫安) 时间(分钟) 厚度(纳米)
钛 3×10-5 380  200  3  100
铂 3×10-5 360  200  1  100
金刚石样碳层在有金属层形成的基质上形成。金刚石样碳层通过电离沉积法在如下条件下形成。生成的金刚石样碳层厚度为20纳米。
表2
形成金刚石样碳层的条件
H2(体积.百分比) C H2(体积.百分比) 压力(帕斯卡) Vb电压b(伏特) Va电压a(伏特) 时间(秒)
基质1 2.5 47.5 3 500 50 30
Vb：加速电压
Va：阳极电压
在基质1上以上述方式形成金刚石样碳层后，通过在氯气中照射紫外线1分钟将碳层表面氯化，通过在氨气中紫外线照射10分钟完成氨化，由氯琥珀酸羧基化，并通过N-羟基琥珀酰亚胺活化从而构建成固体支持体1。
通过SDS-PAGE法进行电泳
使用Cy3-蛋白质A(1.5微克，SIGMA Ltd.生产)、大肠杆菌蛋白质(0.5微克)和标记物(预染的宽范围的，0.5微升，BIO RADLtd.生产)以及使用SDS-PAGE设备(ATTO Ltd.制造，AE-7300型)进行电泳。使用10％聚丙烯酰胺凝胶作为迁移凝胶。含有0.1％SDS的甘氨酸tris缓冲液(pH8.3)用作迁移缓冲液，在200伏特下迁移35分钟。在迁移结束后，用CBB染色15分钟，脱色后使用LAS1000(富士摄影胶卷股份有限公司制造)进行图相拍摄(图.1)。检测出Cy3蛋白质A的一条带约为50kDa。
电印迹
迁移后的聚丙烯酰胺凝胶浸泡在预冷的转移缓冲液(25mMTris，5％甲醇)中平衡30分钟。随后，聚丙烯酰胺凝胶切割成适合放置于固体支持体1上的大小，与固体支持体紧密接触，依照如下条件通电，聚丙烯酰胺凝胶在阴极面而固体支持体在阳极面。
表格3
通电条件
凝胶大小(毫米) 电压(伏特) 电流(毫安) 时间(分钟)
30×20×1 25 2→0.4 40
荧光强度的测量
使用FLA8000(富士摄影胶卷股份有限公司制造)对转移蛋白质后的固体支持体1测量其荧光强度时，测量值达到28270并且已确定Cy3蛋白质A固定化在固体支持体的表面(图.2)。随后，用PBS将固体支持体清洗10分钟后同样地检测荧光强度，测量值达9766而减少到约1/3(图.3)。当使用封闭试剂(Roche Ltd.生产)封闭1小时后检测荧光强度，荧光强度不变。随后加入500微升的0.05微克每微升的Cy3-IgG在室温下反应1小时，室温下使用PBS清洗12小时后检测荧光强度(图.4)。荧光强度增至16448，据此发现蛋白质A和IgG结合在一起，也就是说，固化后的蛋白质仍然保持结合能力。
(实施方案2)转移蛋白质至不锈钢固体支持体
不锈钢-DLC固体支持体的构建
在不锈钢基质上形成金刚石样碳层。为了减少平面和荧光背景，不锈钢基质事先进行了磨光和之后的电解法抛光。金刚石样碳层通过电离沉积法在以下条件下形成。生成的金刚石样碳层厚度为20纳米。
表4
形成金刚石样碳层的条件
H2(体积.百分比) C H2(体积.百分比) 压力(帕斯卡) Vb电压b(伏特) Va电压a(伏特) 时间(秒)
2.5 47.5 3 500 50 30
Vb：加速电压
Va：阳极电压
将固体支持体浸泡于将6.76克N-羟基琥珀酰亚胺和12克1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于300ml离子交换水所得的溶液中将不锈钢-DLC基质活化20分钟，从而构建得到固体支持体2。
和实施方案1类似，SDS-PAGE(ATTO Ltd.制造，AE-6530型)法用于进行Cy3-蛋白质A(0.2微克，Sigma Ltd.生产)的迁移。迁移终止后用CBB染色15分钟，脱色后使用LAS1000(富士摄影胶卷股份有限公司制造)进行图像拍摄。(图.5)
取出迁移后的凝胶切割至适合放置于固体支持体2上的大小，然后将凝胶浸泡在转移缓冲液B中(25mMTris，5％甲醇)。事先切割成适合放在固体支持体2上大小的滤纸片(ATTO Ltd.生产)，分别浸泡在转移缓冲液A(0.3M的Tris，5％甲醇)、转移缓冲液C(25mMTris，40mMε-氨基己酸，5％甲醇)或者离子交换水中。随后，滤纸片、凝胶和固体支持体以消除气泡进入的方式挨个叠放并放置于如图6所示的半干印迹设备上，在8V和4mA下电泳60分钟使蛋白质转移到固体支持体2上。转移后固体支持体2在室温下用离子交换水清洗30分钟并干燥，然后使用FLA 8000(富士摄影胶卷股份有限公司制造)对固体支持体和转移后的凝胶进行图像拍摄。(图.7)
<1>展示当转移在一种状态下进行时的结果，该状态中使在阴极面和阳极面的滤纸片都含离子交换水。Cy3-蛋白质A从凝胶上迁移得很少，没有固定在固体支持体上。
<2>展示当转移在一种状态下进行时的结果，该状态中使滤纸片I含转移缓冲液C，滤纸片II含有转移缓冲液B，而滤纸片III含有转移缓冲液A。凝胶中的Cy3-蛋白质A稍微有所减少，但是不固定在固体支持体上。
<3>展示当转移在一种状态下进行时的结果，该状态中使滤纸片I含转移缓冲液C，而滤纸片II和III含有离子交换水。凝胶叠放在固体支持体上之前已经除去凝胶上的水分。结果证实了Cy3-蛋白质A从凝胶中脱离，尽管并不均匀。此外，可观察到固体支持体上的固定化，尽管形态不佳。
<4>展示当转移在一种状态下进行时的结果，该状态中使滤纸片I含转移缓冲液C，而滤纸片II和III含有离子交换水，而且凝胶不除去水分直接叠放在固体支持体上。结果证实了Cy3-蛋白质A从凝胶中脱离，尽管并不均匀。此外，Cy3-蛋白质A在固体支持体上发生固定化而且形态良好。
根据以上结果，在将凝胶中的蛋白质转移至固体支持体时，考虑优选在使阴极面滤纸片含有转移缓冲液，阳极面滤纸片含有离子交换水，并且凝胶上的水分不被去除的状态下进行转移。
(实施方案3)将蛋白质转移至不锈钢-DLC固体支持体
和实施方案1类似，用SDS-PAGE法(ATTO Ltd.制造，AE-6530型)将Cy3-蛋白质A(50纳克，SIGMA Ltd.生产)和Cy3-IgA(100纳克，SIGMA Ltd.生产)进行迁移。迁移终止后，用CBB染色15分钟，脱色后使用LAS 1000进行图像拍摄(富士摄影胶卷股份有限公司制造)(图.8)。另外，用12％的聚丙烯酰胺凝胶进行Cy3-IaA的迁移。此外，固体支持体2构建的途径和实施方案2中的相同。
迁移后取出凝胶切割成适于放置在固体支持体2上的大小，随后凝胶浸泡在转移缓冲液中(25mMTris，5％甲醇)。事先切割成固体支持体大小的滤纸(ATTO Ltd.生产)分别用转移缓冲液C1(25mMTris，40mMε-氨基己酸，5％甲醇)、转移缓冲液C2(25mMTris，400mMε-氨基己酸，5％甲醇)、或离子交换水浸泡。随后，滤纸片、凝胶和固体支持体按照实施方案2中图.6的方式叠放，并放置在半干印迹设备上，放置时消除气泡的进入。此时，阴极面上使用三片含有转移缓冲液C1或C2的滤纸，而阳极面上使用的三片滤纸含有离子交换水。在2伏特和2微安条件下通电60分钟以允许蛋白质转移至固体支持体2。转移后的固体支持体2在室温下使用离子交换水清洗30分钟并干燥。然后使用FLA8000(富士摄影胶卷股份有限公司制造)对固体支持体以及转移后的凝胶进行图像拍摄(图.9)。
结果发现当阴极滤纸片含有转移缓冲液C1时，也就是说，在转移至固体支持体的时间中ε-氨基己酸为40mM时，固定化的效率更高。
(实施方案4)从PVDF膜转移蛋白质至钛-铂-DLC固体支持体
按照实施方案1中相同的方式在基质1上形成金刚石样碳层之后并且基质表面通过照射1分钟紫外线在氯气中氯化，通过使用一种电离沉积设备将表面在氨等离子体中处理进行氨化。之后，在用琥珀酸酐处理后进一步使用聚丙烯酸进行处理。然后，用N-羟基琥珀酰亚胺活化而构建成固体支持体3。
此外，按照实施方案1中相同的方式使用聚丙烯酰胺凝胶对Cy3-蛋白质A进行电泳。迁移终止后，用CBB染色15分钟，脱色后使用LAS(1000)进行图像拍摄。(图.10)检测出Cy3-蛋白质A的条带约为50kDa。
准备转移缓冲液A(0.3MTris，5％甲醇)、转移缓冲液B(25mMTris，5％甲醇)和转移缓冲液C(25mMTris，40mMε-氨基己酸，5％甲醇)。取出迁移后的凝胶并浸泡在约200ml转移缓冲液B中轻轻摇动5分钟。将事先已切割成凝胶大小的PVDF膜(ATTO Ltd.生产)在少量体积的甲醇中浸润5秒，随后浸泡在约100毫升的转移缓冲液B中轻摇5分钟或更长时间。两片、一片和三片事先已经切割成凝胶大小的滤纸分别浸泡在约200ml的转移缓冲液A、B、C中。随后，如图11所示以排除气泡的方式将滤纸片、凝胶和PVDF膜叠放起来并放置在一个半干印迹设备上(Nippon Eido Ltd.制造)，在15伏特下通电60分钟。转移后，PVDF膜浸泡在约200毫升的PBS中渗透5分钟。
将迁移后的PVDF膜切割至适于放置于固体支持体3上的大小，并依照图.12所示的顺序叠放，并在其上方施加35克/平方厘米的重量。室温放置1小时，膜上的Cy3-蛋白质A转移至固体支持体3上。随后，在室温下用PBS对固体支持体3清洗20分钟，然后干燥。然后使用FLA8000(富士摄影胶卷股份有限公司制造)在固体支持体上进行图像拍摄。图13展示所拍摄的图像。将膜和图像中围出的区域贴在一起。由于在对应位置上检测到荧光，发现Cy3-蛋白质A固化在固体支持体上。
(实施方案5)使用TOF MS进行分析
将1微升豆类胰岛素结合蛋白质的水溶液(每微升112.5纳克)点到实施方案2中构建的不锈钢-DLC固体支持体上并放置10分钟。随后，摇动固体支持体并用超纯水清洗10分钟，随后干燥后制成(fabricate)固定化豆类胰岛素结合蛋白质的固体支持体。
将1微升豆类胰岛素水溶液(每微升37.5纳克)点到所得的固定化豆类胰岛素结合蛋白质的固体支持体上并放置5分钟。随后，摇动固体支持体并用超纯水清洗5分钟，随后干燥后制成固定化豆类胰岛素结合蛋白质-豆类胰岛素的固体支持体。
将0.5微升基质溶液(ε-氰羟基肉桂酸溶液)加在由上述途径获得的固定化豆类胰岛素结合蛋白质的固体支持体上和固定化豆类胰岛素结合蛋白质-豆类胰岛素的固体支持体上，并干燥。
将这些固体支持体放置到MALDI-TOF-MS(TofSpec-2E制造，Micromass LTD.)的平面目标上。使用MassLynx软件进行质谱分析。所有的测量和分析都可以由MassLynx软件控制。在测量过程中，创建了用于自动测量的参数文件、用于测量结束后数据处理和数据库分析的处理文件、用于数据库分析的处理文件和样品列表等文件。
在MassLynx上使用ProteinLynx软件进行数据处理。质谱由收集到的数据生成，并且生成的谱通过MaxEnt3(Micromass Ltd.)软件其精确度得以提高，然后转化成单一同位素·峰值数据。随后，进行校准获得质量误差为50ppm左右的最终数据。可以在数据中找到与其他物质间相互作用的蛋白质的正确质量。图.14展示了对固定化豆类胰岛素结合蛋白质固体支持体的TOF-MS分析结果。图.15展示了对固定化豆类胰岛素结合蛋白质-豆类胰岛素固体支持体的TOF-MS分析结果。
从TOF-MS图表中的图表中可以发现检测出了3920Da的豆类胰岛素峰。从以上内容显而易见的是固定化在本发明中的固体支持体上的蛋白质可通过TOF-MS进行分析。
产业化适用性
使用根据本发明的方法，在通过电泳将样品所含的多种物质进行分离后可以迅速分析多种样品，不同独立的条带中所包含的物质可以同时固定在固体支持体上并且无需提炼可以直接对多种物质进行质谱分析。
因此，本发明提供的方法对例如核酸、蛋白质等生物物质的分析非常有用。

Claims (9)

1.固体支持体，在其表面包含碳层且其中当样品中含有的物质经凝胶电泳分离后通过转移凝胶中分离的物质将其固定在固体支持体上。
2.固体支持体，在其表面包含碳层且其中当样品中含有的物质通过凝胶电泳分离后通过将凝胶中分离的物质转移至膜上并再将转移到膜上的物质转移而将所述物质固定在固体支持体上。
3.固体支持体，其中通过向与根据权利要求1或2的固体支持体上固定的所述物质中添加与所述物质相互作用的物质而形成复合物。
4.根据权利要求1至3中任何一项的固体支持体，其中碳层包含金刚石样碳层。
5.根据权利要求1至4中任何一项的固体支持体，其中碳层厚度为单分子层至100微米。
6.根据权利要求1至5中任何一项的固体支持体，其中碳层表面经过化学修饰而活化。
7.根据权利要求1至6中任何一项的固体支持体，其中被固定的物质包含核酸或肽。
8.通过解吸/电离固定在根据权利要求1至7中任何一项的固体支持体上的多种物质或复合物进行质谱分析的方法。
9.固体支持体，在其表面包含碳层并用于根据权利要求8所述的方法。
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4113139B2 (ja) * 2004-02-23 2008-07-09 東洋鋼鈑株式会社 固体支持体及び該固体支持体上に複数の物質又は複合体を脱離／イオン化することにより質量分析する方法
AT500618B1 (de) * 2004-04-02 2006-02-15 Physikalisches Buero Steinmuel Target für maldi/seldi-ms
JP2006170857A (ja) * 2004-12-16 2006-06-29 Toyo Kohan Co Ltd 固体支持体上の生体分子を質量分析する方法およびそのための固体支持体
JP4576606B2 (ja) * 2005-01-21 2010-11-10 独立行政法人産業技術総合研究所 質量分析用イオン化基板及び質量分析装置
JP2006292680A (ja) * 2005-04-14 2006-10-26 Toyo Kohan Co Ltd 固体支持体上において相互作用した生体分子を分析する方法およびそのための固体支持体
JP5041680B2 (ja) * 2005-06-17 2012-10-03 株式会社ハイペップ研究所 バイオチップ用基板及びバイオチップ
AU2007338634A1 (en) * 2006-12-26 2008-07-03 Brigham Young University Serum proteomics system and associated methods
JP4802156B2 (ja) * 2007-08-15 2011-10-26 ハイモ株式会社 粘着性ピッチの分析方法
JP4644263B2 (ja) * 2008-03-07 2011-03-02 東洋鋼鈑株式会社 固体支持体及び該固体支持体上に複数の物質又は複合体を脱離／イオン化することにより質量分析する方法
KR101062828B1 (ko) * 2009-01-06 2011-09-07 한국생명공학연구원 다층기질겔을 이용한 기질분해효소의 스크리닝 방법
KR101156795B1 (ko) * 2010-03-10 2012-06-18 삼성전기주식회사 그래핀 코팅된 말디-토프 질량분석용 샘플분석 타겟 및 이를 포함하는 말디-토프 질량분석장치
JP2014232055A (ja) * 2013-05-29 2014-12-11 株式会社島津製作所 Ｍａｌｄｉ質量分析用測定基板
FR3024465B1 (fr) * 2014-07-30 2018-03-23 Biomerieux Caracterisation de micro-organismes par maldi-tof

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6051380A (en) * 1993-11-01 2000-04-18 Nanogen, Inc. Methods and procedures for molecular biological analysis and diagnostics
US6221626B1 (en) * 1998-06-30 2001-04-24 University Of Geneva Kit for electroblotting polypeptides separated on an electrophoresis gel
EP1147414B1 (en) * 1999-01-28 2004-06-09 Universite De Geneve Method and kit for identifying or characterising polypeptides
US6287783B1 (en) * 1999-03-18 2001-09-11 Biostar, Inc. Optical assay device and method

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003257859A1 (en) 2004-03-11
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WO2004019025A1 (ja) 2004-03-04
JP3860130B2 (ja) 2006-12-20
EP1542001A1 (en) 2005-06-15
US20060121473A1 (en) 2006-06-08
JP2004138596A (ja) 2004-05-13

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