KR20050058398A - 고체지지체 및 그 고체지지체상에 고정화된 복수의 물질또는 복합체를 탈리/이온화함으로써 질량분석하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 과제는, 다수의 시료를 신속하게 질량분석하는 수단을 제공하고, 핵산 및 단백질 등의 생체분자의 해석을 신속하게 실시하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 상기 수단은, 카본층이 형성되고 그 위에 겔 전기영동으로 분리된 물질이 전사되는 고체지지체이며, 본 발명에 따른 상기 방법은, 시료중의 물질을 겔 전기영동으로 분리후, 겔중에 분리된 물질을 상기 고체지지체상에 전사함으로써 고정화하고, 고정화된 물질을 탈리/이온화함으로써 복수의 물질을 질량분석하는 방법이다.

Description

고체지지체 및 그 고체지지체상에 고정화된 복수의 물질 또는 복합체를 탈리/이온화함으로써 질량분석하는 방법{SOLID SUPPORT AND METHOD OF MASS SPECTROMETRY OF MULTIPLE SUBSTANCES OR COMPOSITES IMMOBILIZED ON THE SOLID SUPPORT THROUGH DESORPTION/IONIZATION}

본 발명은, 겔중에 분리된 물질을 전사함으로써 그 물질이 고정화되어서 이루어지는 고체지지체, 그 고체지지체에 고정화된 핵산 및 단백질 등의 생체분자를 신속하게 질량분석함으로써 분석 및 해석하는 방법에 관한 것이다.

펩티드, 단백질, 핵산 및 당쇄 등 생체분자의 대부분은 비교적 소수의 구성단위가 일정한 규칙으로 중합되어 만들어지고 있다. 예를 들면, 펩티드나 단백질은 20종의 L-α-아미노산이 펩티드 결합으로 연결된 분자이다. 이들의 구성 단위의 분자의 구조는 이미 대부분 밝혀졌으며, 당연히, 이들의 정확한 분자량도 밝혀졌다. 따라서, 생체분자나 그 단편의 분자량을 정확하게 측정할 수 있으면, 그 구조(배열 등)나 생체내에서 받는 여러가지 수식 반응의 해석에 크게 기여할 수 있다는 점에서, 질량분석법은 DNA, 단백질 등의 생체분자의 구조해석에 빠트릴 수 없는 수단으로서 위치지어지고 있다. 질량분석 중에서도 레이저탈리/이온화-비행시간형 질량분석장치는, DNA, 단백질 등의 거대고분자를 이온화할 수 있기 때문에, 생체분자의 유용한 해석 수단으로서 주목받고 있다.

레이저탈리/이온화-비행시간형 질량분석장치에 있어서는, 분석하고 싶은 시료부위에 레이저를 조사하고, 그곳으로부터 탈리해 온 이온을 전장에 의해 가속시킨다. 그렇게 하면, m/z값이 작은 이온, 즉 가벼운 이온일수록 고속으로 비행해서 검출기에 도착한다. 레이저탈리/이온화-비행시간형 질량분석은, 이러한 질량전하비(m/z값)의 차이에 의해 이온의 비행시간이 다른 것을 이용해서 질량분석을 행하는 방법이다.

한편, 질량분석에 의한 DNA, 단백질 등의 생체분자의 구조해석/결정에는, 분석 대상을 다수의 성분으로 분리 정제하고, 또한 각각의 성분을 제한 효소로 단편화한 것을 분석할 필요가 있어, 상당히 다수의 시료를 분석하지 않으면 안된다. 또한, DNA진단에 있어서는, 다수의 인간으로부터 얻은 시료를 신속하게 처리할 필요가 있다.

그것에 대해서 시판되고 있는 일반적인 레이저탈리/이온화-비행시간형 질량분석장치는, 정제한 각각의 시료를 샘플 보드에 배치하고, 이것을 1개씩 질량분석해 간다. 즉, 샘플링한 시료 각 점에 레이저를 조사해서 1개씩 분석해 갈 필요가 있었다. 따라서, 미정제의 시료를 전기영동에 의해 분리한 경우는, 영동후의 겔을 밴드마다 잘라내어 각각 정제하고 나서 1개씩 레이저탈리/이온화-비행시간형 질량분석장치에 의해 질량분석할 필요가 있어, 다수의 시료를 신속하게 분석하는 것은 매우 곤란했다.

또한, 전기영동한 생체분자를 겔로부터 니트로셀룰로오스 등의 멤브레인상에 전사해서 이것을 분석하는 방법도 알려져 있지만, 멤브레인상의 분석에 있어서는 레이저를 이용한 질량분석을 행할 수는 없어, 항원항체반응이나 핵산 교배를 이용한 형광검출 등에 한정된다. 왜냐하면, 종래 사용되어지고 있는 니트로셀룰로오스나 PVDF 등의 멤브레인은, 레이저를 조사하면 멤브레인 자체의 분해가 일어날 가능성이 높기 때문이다. 즉, 이들 멤브레인상에 전사된 생체분자를 그대로 상기와 같은 레이저탈리/이온화-비행시간형 질량분석장치로 분석하는 것은 곤란했다.

본 발명의 과제는, 다수의 시료를 신속하게 질량분석하는 수단을 제공하고, 핵산 및 단백질 등의 생체분자의 해석을 신속하게 실시하는 방법을 제공하는 것이다.

도1은, 실시예1에 있어서, Cy3-프로테인A 및 대장균 단백질을 SDS-PAGE법으로 전기영동하고, 영동후의 겔을 15분간 CBB염색하고, 탈염색한 후, LAS1000(후지 샤신 필름 가부시키가이샤 제품)으로 화상촬영한 것이다.

도2는, 실시예1에 있어서, 전기영동후의 겔을 고체지지체(1)에 전사하고, 전사후의 고체지지체의 형광강도를 FLA8000(후지 샤신 필름 가부시키가이샤 제품)으로 화상촬영한 것이다.

도3은, 실시예1에 있어서, 전기영동후의 겔을 전사한 고체지지체(1)를, PBS로 10분간 세정하고, 건조한 후, 화상촬영한 것이다.

도4는, 실시예1에 있어서, 전기영동후의 겔을 전사한 고체지지체(1)를, PBS로 10분간 세정하고, 다시 블록킹시약으로 1시간 블록킹하고, 그 후 Cy3-IgG를 첨가해서 실온에서 1시간 반응시키고, PBS로 12시간 세정하여(실온), 화상촬영한 것이다.

도5는, 실시예2에 있어서, Cy3-프로테인A를 SDS-PAGE법으로 전기영동하고, 영동후의 겔을 15분간 CBB염색하고, 탈염색한 후, LAS1000(후지 샤신 필름 가부시키가이샤 제품)으로 화상촬영한 것이다.

도6은, 실시예2에 있어서, 단백질을 전기영동후의 겔로부터 고체지지체(2)에 전사할 때의 배치를 나타낸 것이다.

도7은, 실시예2에 있어서, 전기영동후의 겔로부터 단백질을 전사한 고체지지체(2)를, PBS로 30분간 세정해서 건조한 것 및 전사후의 겔을 FLA8000(후지 샤신 필름 가부시키가이샤 제품)으로 화상촬영한 것이다.

도8은, 실시예3에 있어서, Cy3-프로테인A 및 Cy3-IgA를 SDS-PAGE법으로 전기영동하고, 영동후의 겔을 15분간 CBB염색하고, 탈염색한 후, LAS1000(후지 샤신 필름 가부시키가이샤 제품)으로 화상촬영한 것이다.

도9는, 실시예3에 있어서, 전기영동후의 겔로부터 단백질을 전사한 고체지지체(2)를, PBS로 30분간 세정해서 건조한 것 및 전사후의 겔을 FLA8000(후지 샤신 필름 가부시키가이샤 제품)으로 화상촬영한 것이다.

도10은, 실시예4에 있어서, Cy3-프로테인A를 SDS-PAGE법으로 전기영동하고, 겔을 15분간 CBB염색하고, 탈염색한 후 LAS1000(후지 샤신 필름 가부시키가이샤 제품)으로 화상촬영한 것이다.

도11은, 실시예4에 있어서, 전기영동한 후의 겔로부터 단백질을 PVDF 멤브레인에 전사할 때의 배치를 나타낸 것이다.

도12는, 실시예4에 있어서, 단백질을 PVDF 멤브레인으로부터 고체지지체(3)에 전사할 때의 배치를 나타낸 것이다.

도13은, 실시예4에 있어서, PVDF 멤브레인으로부터 단백질이 전사된 고체지지체(3)를, PBS로 20분간 세정하고, 건조한 후, FLA8000(후지 샤신 필름 가부시키가이샤 제품)으로 화상촬영한 것이다.

도14는, 실시예5에 있어서, 레그인슐린(leginsulin)결합 단백질을 고정화한 스텐레스-DLC 고체지지체를 TOF-MS로 분석한 결과를 나타내는 도이다.

도15는, 실시예5에 있어서, 레그인슐린결합 단백질을 고정화한 스텐레스-DLC 고체지지체에 레그인슐린을 상호작용시켜서, 이것을 TOF-MS로 분석한 결과를 나타내는 도이다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의검토의 결과, 시료중의 물질을 겔 전기영동으로 분리한 후, 겔중에 분리 전개된 물질을, 표면에 카본층이 형성된 고체지지체상에 고정화하고, 이것을 탈리/이온화해서 질량분석하는 방법에 의해, 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.

(1)시료중의 물질을 겔 전기영동으로 분리한 후, 겔중에 분리된 물질을 전사함으로써 상기 물질이 고정화되어 이루어지는, 표면에 카본층을 갖는 고체지지체.

(2)시료중의 물질을 겔 전기영동으로 분리한 후, 겔중에 분리된 물질을 멤브레인에 전사하고, 상기 멤브레인상에 전사된 물질을 다시 전사함으로써 상기 물질이 고정화되어서 이루어지는, 표면에 카본층을 갖는 고체지지체.

(3)(1) 또는 (2)에 기재된 고체지지체상에 고정화된 물질에, 이것과 상호작용하는 다른 물질을 첨가해서 복합체를 형성시켜서 이루어지는 고체지지체.

(4)카본층이, 다이아몬드 라이크 카본층인 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 고체지지체.

(5)카본층의 두께가 단분자층∼100㎛인 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 고체지지체.

(6)카본층의 표면이 화학수식에 의해 활성화되어 있는 (1)∼(5) 중 어느 하나에 기재된 고체지지체.

(7)고정화된 물질이 핵산 또는 펩티드인 (1)∼(6) 중 어느 하나에 기재된 고체지지체.

(8)(1) ∼(7) 중 어느 하나에 기재된 고체지지체상에 고정화된 복수의 물질 또는 복합체를 탈리/이온화함으로써 질량분석하는 방법.

(9)(8)에 기재된 방법에 있어서 사용하기 위한, 표면에 카본층을 갖는 고체지지체.

본 발명에서는, 시료를 겔 전기영동으로 분리하고, 영동후의 겔과 표면에 카본층이 형성된 고체지지체를 밀착시키는 것에 의해, 겔중에 분리 전개된 분석 대상물질을 상기 고체지지체상에 전사고정화한다. 그리고, 고체지지체상에 고정화된 물질을 탈리/이온화함으로써 복수의 물질을 질량분석한다.

본 발명에 있어서, 고체지지체에 고정화하고, 분석할 수 있는 물질로서는, 특별히 제한되지 않지만, DNA, RNA 등의 핵산 및 펩티드 등의 생체분자 및 PNA(펩티드 핵산) 등을 들 수 있다. 본 명세서에 있어서 펩티드란, 올리고 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 특히 고분자량의 물질을 분석할 수 있는 점에서 유리하다. 이들의 물질을 포함하는 겔 전기영동의 대상이 되는 시료로서는, 특별히 제한되지 않지만, 세포추출물, 균체추출물, 무세포계 합성산물, PCR(Polymerase chain reaction)산물, 효소처리산물, 합성 DNA, 합성 RNA, 합성 펩티드 등을 들 수 있다.

전기영동에 의해 겔중에 분리된 생체분자 등의 물질을 전사고정화하기 위한 고체지지체는, 기판의 표면에 카본층을 갖고, 이들 생체분자를 고정화할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 카본층에 특정의 화학수식을 실시한 것이 바람직하다. 특정의 화학수식을 실시함으로써 분석 대상이 되는 물질이 결합되기 쉬워지며, 또 안정되게 고정화되기 때문이다.

본 발명에 있어서 기판이란 카본층을 형성시키는 기초가 되는 기재를 의미하고, 이러한 기재로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 금, 은, 구리, 알루미늄, 텅스텐, 몰리브덴, 크롬, 백금, 티타늄, 니켈 등의 금속; 스텐레스, 하스텔로이, 인코넬, 모넬, 듀랄루민 등의 합금; 상기 금속과 세라믹스의 적층체; 유리; 실리콘; 섬유; 목재; 종이; 폴리카보네이트, 불소수지 등의 플라스틱; 및 플라스틱과 상기 금속, 세라믹스, 다이아몬드 등과의 혼합체를 들 수 있다. 유리 또는 플라스틱 등의 표면에 플라티늄, 티타늄 등으로 이루어지는 금속층을 형성시킨 것을 사용할 수도 있다. 금속층의 형성은, 스퍼터링, 진공증착, 이온빔증착, 전기 도금, 무전해 도금 등에 의해 실시할 수 있다.

고정화된 물질에 대해서, 레이저탈리/이온화-비행시간형 질량분석 등에 의해 질량분석을 행하는 경우, 고체지지체에 고전압이 가해지므로, 기판은 도전성을 갖는 것, 예를 들면, 스텐레스, 알루미늄, 티타늄 등이 바람직하다.

본 발명에 있어서 기판상에 형성시키는 카본층으로서는, 특별히 제한되지 않지만, 합성 다이아몬드, 고압합성 다이아몬드, 천연 다이아몬드, 소프트 다이아몬드(예를 들면, 다이아몬드 라이크 카본), 무정형 탄소, 탄소계 물질(예를 들면, 그라파이트, 플러렌, 카본나노튜브) 중 어느 하나, 이들의 혼합물, 또는 이들을 적층체, 탄화 하프늄, 탄화 니오브, 탄화 규소, 탄화 탄탈륨, 탄화 토륨, 탄화 티타늄, 탄화 우라늄, 탄화 텅스텐, 탄화 지르코늄, 탄화 몰리브덴, 탄화 크롬 또는 탄화 바나듐 등으로 이루어지는 층을 들 수 있고, 다이아몬드 라이크 카본(DLC)층이 바람직하다. 여기에서, 소프트 다이아몬드란, 소위 다이아몬드 라이크 카본(DLC:Diamond Like Carbon) 등의, 다이아몬드와 카본의 혼합체인 불완전 다이아몬드 구조체를 총칭하고, 그 혼합 비율은, 특별히 한정되지 않는다.

카본층은, 화학적 안정성이 우수하고 그 후의 화학수식이나 분석 대상물질과의 결합에 있어서의 반응을 견딜 수 있는 점, 분석 대상물질과 공유결합에 의해 결합하기 위해서 그 결합이 안정적인 점, UV흡수가 없기 때문에 검출계 UV에 대해서 투명성인 점, 및 일렉트로블로팅(electroblotting)시에 통전가능한 점에 있어서 유리하다. 또한, 분석 대상물질과의 결합반응에 있어서, 비특이적 흡착이 적은 점에 있어서도 유리하다.

본 발명에 있어서 카본층의 형성은 공지의 방법으로 행할 수 있다. 예를 들면, 마이크로파 플라즈마 CVD(Chemical vapor deposit)법, ECRCVD(Electric cyclotron resonance chemical vapor deposit)법, IPC(Inductive coupled plasma)법, 직류 스퍼터링법, ECR(Electric cyc1otron resonance) 스퍼터링법, 이온화 증착법, 아크식 증착법, 레이저 증착법, EB(Electron beam) 증착법, 저항 가열 증착법 등을 들 수 있다.

고주파 플라즈마 CVD법에서는, 고주파에 의해 전극간에 생기는 글로우 방전에 의해 원료 가스(메탄)을 분해하고, 기판상에 DLC(다이아몬드 라이크 카본)층을 합성한다. 이온화 증착법에서는, 텅스텐 필라멘트로 생성되는 열전자를 이용하여, 원료 가스(벤젠)를 분해·이온화하고, 바이어스 전압에 의해 기판상에 카본층을 형성한다. 수소가스 1∼99체적%와 나머지 메탄가스 99∼1체적%로 이루어지는 혼합 가스중에서, 이온화 증착법에 의해 DLC층을 형성해도 좋다.

아크식 증착법에서는, 고체의 그라파이트 재료(음극증발원)와 진공용기(양극) 사이에 직류 전압을 인가함으로써 진공중에서 아크 방전을 일으켜서 음극으로부터 탄소원자의 플라즈마를 발생시켜 증발원보다 더 마이너스의 바이어스 전압을 기판에 인가함으로써 기판을 향해서 플라즈마중의 탄소 이온을 가속시켜 카본층을 형성할 수 있다.

레이저 증착법에서는, 예를 들면 Nd:YAG 레이저(펄스 발진)광을 그라파이트의 타겟판에 조사해서 용융시키고, 유리 기판상에 탄소원자를 퇴적시키는 것에 의해 카본층을 형성할 수 있다.

본 발명의 고체지지체 표면의 카본층의 두께는, 통상, 단분자층∼1OO㎛정도이며, 너무 얇으면 하지 고체지지체의 표면이 국부적으로 노출될 가능성이 있으며, 반대로 두꺼워지면 생산성이 나빠지므로, 바람직하게는 2nm∼1㎛, 보다 바람직하게는 5nm∼500nm이다. 또, 고체지지체 전체가 탄소재료로 구성되어 있어도 좋다.

영동후의 겔로부터 물질을 전사한 후, 직접 레이저탈리/이온화-비행시간형 질량분석 등을 행하므로, 본 발명의 고체지지체의 형상은 평판상인 것이 바람직하다. 그 사이즈는, 특별히 제한되지 않지만, 통상은, 폭 10∼200mm×길이 10∼200mm×두께 0.1∼20mm정도이다.

핵산이나 펩티드 등의 생체분자를 고정화하기 위해서는, 카본층이 형성된 기판의 표면을 화학수식함으로써 활성화하는 것이 바람직하다. 이러한 표면활성화는, 표적이 되는 물질의 고정화를 촉진하는 것으로서, 당업자라면 적절히 선택할 수 있고, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 아미노기, 카복실기, 에폭시기, 포르밀기, 히드록실기, 카르보디이미드기, 활성 에스테르기를 도입하는 것을 들 수 있다. 또한, 니켈킬레이트, 코발트킬레이트 등의 금속 킬레이트를 도입하는 것도 유효하다.

아미노기의 도입은, 예를 들면, 카본층을 염소가스중에서 자외선 조사해서 염소화한 후, 암모니아 가스중에서 자외선 조사함으로써 실시할 수 있다. 또는, 메틸렌디아민, 에틸렌디아민 등의 다가 아민류를, 염소화한 카본층과 반응시키는 것에 의해 실시할 수도 있다. 또는, 암모니아플라즈마, 에틸렌디아민플라즈마로 카본층 표면을 처리함으로써도 실시할 수 있다.

카복실기의 도입은, 예를 들면, 상기한 바와 같이 아미노화한 카본층에 적당한 다가 카르복실산을 반응시키는 것에 의해 실시할 수 있다.

에폭시기의 도입은, 예를 들면, 상기한 바와 같이 아미노화한 카본층에 적당한 다가 에폭시 화합물을 반응시키는 것에 의해 실시할 수 있다. 또는, 카본층이 함유하는 탄소=탄소 2중결합에 유기과산을 반응시키는 것에 얻을 수 있다. 유기과산으로서는, 과초산, 과안식향산, 디페르옥시프탈산, 과개미산, 트리플루오로 과초산 등을 들 수 있다.

포르밀기의 도입은 예를 들면, 상기한 바와 같이 아미노화한 카본층에, 글루탈알데히드를 반응시키는 것에 의해 실시할 수 있다.

히드록실기의 도입은, 예를 들면, 상기한 바와 같이 염소화한 카본층에, 물을 반응시키는 것에 의해 실시할 수 있다.

카르보디이미드기의 도입은, 예를 들면, 상기한 바와 같이 아미노화한 카본층에, 카르보디이미드류를 반응시키는 것에 의해 실시할 수 있다.

활성 에스테르기의 도입은, 예를 들면, 염소가스중에서 카본층에 자외선을 조사해서 표면을 염소화하고, 계속해서, 암모니아 가스중에서 자외선을 조사해서 아미노화한 후, 적당한 산클로리드 또는 디카르복실산 무수물을 이용해서 카복실화하고, 말단의 카복실기를 카르보디이미드 또는 디시클로헥실카르보디이미드 및 N-히드록시숙신이미드와 탈수 축합함으로써 실시할 수 있다. 이 처리에 의해, 아미드 결합을 통해 탄화수소기의 말단에, N-히드록시숙신이미드에스테르기 등의 활성 에스테르기가 결합된 기를 형성할 수 있다.

DNA 및 RNA 등의 핵산을 고정화하는 경우는, N-히드록시숙신이미드기, 카르보디이미드기, 에폭시기, 포르밀기를 도입하는 것이 바람직하다.

펩티드를 고정화하는 경우는, N-히드록시숙신이미드기, 카르보디이미드기, 에폭시기, 포르밀기, 금속 킬레이트를 도입하는 것이 바람직하다. 금속 킬레이트를 도입한 고체지지체를 사용하면, 폴리히스티딘 배열 등의 금속 이온과 친화성이 있는 표식을 갖는 펩티드를 효과적이며 안정적으로 고정화할 수 있다. 금속 킬레이트의 도입은, 예를 들면, 카본층이 형성된 기판을 염소화하고, 계속해서 이것을 아미노화한 후, 클로로초산 등의 할로카르복실산을 첨가해서 킬레이트 배위자를 도입함으로써 실시할 수 있다. 폴리히스티딘 배열 등의 표식은, 당업자가 공지의 방법에 의해 도입할 수 있다.

본 발명에 있어서 시료의 분리에 사용할 수 있는 전기영동법으로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 아가로오스겔 전기영동법, sieving 아가로오스겔 전기영동법, 변성 아가로오스겔 전기영동법, 폴리아크릴아미드겔 전기영동법, SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동법, 등전점겔 전기영동법 및 2차원 전기영동법 등을 들 수 있다. 당업자라면, 분리의 대상이 되는 물질의 종류 및 분자량 등으로부터 사용하는 전기영동법의 종류를 적당히 선택할 수 있다.

아가로오스겔 전기영동법은, 핵산을 분리하기 위해서 가장 자주 이용되는 방법이다. 아가로오스겔은 폴리아크릴아미드겔과 비교해서 겔의 메시구조가 크기 때문에, 수십∼수백 Kbp의 DNA 프래그먼트를 길이나 분자구조의 차이로 분리할 수 있다. DNA 프래그먼트 전체의 하전상태는 주로 인산기의 수에 의존하기 때문에, 이동도는 DNA 프래그먼트의 크기에 비례한다. 전장방향을 단속적으로 변화시켜서 영동하면 효모염색체 등의 거대 DNA를 분리할 수도 있다(펄스필드 전기영동).

핵산의 폴리아크릴아미드겔 전기영동은, DNA 프래그먼트의 해석에 주로 이용되며, 폴리아크릴아미드겔의 미세한 메시구조를 이용하여, 아가로오스겔 전기영동의 경우에 비해서 단쇄(∼1Kbp)의 프래그먼트를 길이와 구조에 기초해서 분리하는 방법이다. DNA의 입체구조(컨포메이션)의 영향을 강하게 받기 때문에, DNA쇄 길이의 추정은 2개쇄 DNA를 영동하는 경우에 한정된다. 1개쇄 DNA는 여러가지 구조를 취하는 것이 예상되므로 이동도와 그 DNA쇄 길이와의 사이에 상관은 보여지지 않고, 종종 복수의 밴드로서 검출되는 일도 있다. DNA 염기의 약간의 차이라도 구조변화가 생기고, 영동 패턴에 반영된다. 이것을 이용한 DNA 프래그먼트 해석방법(SSCP:Single-Strand Conformation Polymorphism)도 개발되어 유전자변이해석에 이용되고 있다. 특수한 배열(반복 배열이나 염기의 치우침 등)을 포함하는 2개쇄DNA 프래그먼트는 DNA구조를 변형시키는 것이 알려져 있으며, 폴리아크릴아미드겔 전기영동법은 DNA의 구조·기능 해석에도 사용할 수 있다. 또한, 요소 등을 함유하는 변성 겔중에서는, 1개쇄 DNA도 구조의 영향을 받는 일없이 쇄길이에 따라 분리할 수 있다.

SDS(Sodium dodecyl sulfate)-폴리아크릴아미드겔 전기영동법(SDS-PAGE법)은, 목적 단백질의 고차구조를 변성해서 분자량의 차이에 의해 분리하는 방법이다. 폴리아크릴아미드겔은 겔중의 미세구멍 지름이 작으므로 100∼200KDa이하의 단백질이나 폴리펩티드를 분리하는데에 적합하다. 조작이 간편하고 재현성이 높으므로, 단백질의 전기영동에서는 가장 자주 이용되고 있는 방법이다. 통상은, 영동 샘플의 조제시에 β-메르캅토에탄올이나 DTT(Dithiothreitol) 등의 환원제를 첨가해서 단백질의 S-S결합(디술피드결합)을 절단한다. SDS의 결합량에 의해 분자의 전하가 거의 결정되므로, 전기영동에 의해 폴리펩티드 분자를 분자량에 따라서 분리할 수 있다. SDS는 강력한 음이온 계면활성제이므로, 막단백질 등의 불용성 단백질의 가용화에도 적합하다.

등전점 전기영동은, 단백질의 등전점(pI)의 차이를 이용해서 분리하고, 목적 단백질의 등전점 측정이나 분석을 행하는 영동방법이다. 단백질을 구성하고 있는 아미노산 측쇄나 아미노 말단, 카복실 말단의 전하는 pH조건에 의해 변화되고, 전하의 총합이 제로가 되는 pH의 값이 등전점이 된다. 등전점 전기영동을 행하기 위해서는, 영동 겔중에 pH구배를 형성할 필요가 있다. 샘플을 영동 겔에 첨가해서 전장을 가하면, 각각의 단백질은 고유의 pI와 같은 pH를 향해서 pH구배를 형성한 겔중을 이동한다. pH구배 겔의 제작에는, 양성 담체(캐리어 양성전해질)를 겔에 첨가해서 전장을 가해서 pH구배를 형성하는 방법과, 여러가지 pI의 측쇄를 갖는 아크릴아미드 유도체를 이용해서 겔제작과 동시에 pH구배를 형성하는 방법(IPG법:Immobilized pH gradient)이 있으며, 프로테오믹스 연구에서는 분리능, 재현성, 첨가 허용량 모두 우수한 IPG법이 주로 이용되고 있다. IPG법 전용의 프리캐스트겔(Immobiline Dry Strip Gel)이 시판되고 있다. 캐리어 양성전해질을 이용하는 등전점 영동의 분리능은 0.01∼0.02pH단위이고, IPG법에서는 0.001pH단위의 차이라도 분리할 수 있다.

2차원 전기영동법은, 2단계의 전기영동에 의해 단백질을 2차원으로 분리하는 방법이다. 일반적으로 1차원째는 등전점 전기영동에 의해 단백질을 분리하고, 2차원째는 SDS-PAGE법에 의해 분자량으로 분리한다. 어느쪽의 방법이나 분리능이 매우 높으므로, 세포 전단백질을 수천이상에나 미치는 스폿으로 분리할 수 있다. 재현성과 해상도가 우수한 고정화 pH구배법(IPG법)을 1차원째 영동에 이용하는 것이 일반적이다. 또한, 보다 많은 스폿을 얻기 위해서, 폭넓은 pH레인지의 분리결과를 기초로 해서 Narrow pH IPG겔로 목적 pH부분만을 분리하거나, 20cm이상의 대형 겔을 이용해서 2차원째 전기영동을 행할 수도 있다.

본 발명에 있어서는, DNA, RNA를 분리하는 경우는, 아가로오스겔 전기영동법을 사용하는 것이 바람직하고, 펩티드를 분리하는 경우는, SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동법 및 2차원 전기영동법을 사용하는 것이 바람직하다. 이들의 전기영동법은, 당기술분야에 있어서의 당업자가 통상 사용하는 방법으로 실시할 수 있다.

전기영동후, 겔을, 사용하는 고체지지체에 탑재되는 크기로 잘라내고, 겔과 고체지지체를 밀착시켜서, 겔중에 분리된 분석 대상물질을 본 발명의 고체지지체상에 전사함으로써 고정화한다. 고체지지체에의 전사방법으로서는, 특별히 제한되지 않고, 당기술분야에서 통상 이용되는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 모세관현상을 이용한 캐필러리식 블로팅, 펌프에 의해 흡인하는 버큠식 블로팅 및 전기적 방법을 이용하는 일렉트로블로팅을 들 수 있다. 핵산을 전사하는 경우는, 캐필러리식 블로팅을 사용하는 것이 바람직하고, 펩티드를 전사하는 경우는, 일렉트로블로팅을 사용하는 것이 바람직하다.

일렉트로블로팅에 있어서는, 탱크식, 세미드라이식 및 세미웨트식의 어느 것이나 사용할 수 있지만, 버퍼 사용량의 적음이나, 반응시간의 짧음 등의 관점에서 세미드라이식 일렉트로블로팅을 사용하는 것이 바람직하다. 블로팅장치로서는, 당기술분야에서 통상 이용되고 있는 일렉트로블로팅장치를 사용할 수 있다. 일렉트로블로팅에 있어서의 통전조건은, 정전압, 200V이하, 바람직하게는 0.1∼10V이며, 1∼500분간, 바람직하게는 5∼100분간이 바람직하다. 단, 전압을 금속기판의 산화전위보다 높게 하면 금속의 용출이 일어나기 때문에, 기판금속의 산화 전위보다 낮은 전압으로 행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 형태에 있어서는, 분석의 대상이 되는 물질을 전기영동하지 않고 본 발명의 고체지지체에 직접 스폿팅함으로써 고정화하고, 이것을 TOF-MS 등에 의해 분석해도 좋다. 또한, 고체지지체상에 있는 물질을 고정화하고, 이것과 상호작용하는 물질을 다시 스폿팅함으로써 고정화하고, 상호작용한 물질을 TOF-MS 등으로 분석해도 좋다.

이하에, 시료중의 단백질을 분석하는 경우의 본 발명에 있어서의 전기영동 및 전사의 일형태를 나타낸다. 먼저, 시료중의 단백질을 가용화한다. 즉, 시료에 존재하는 단백질 분해효소를 실활시킴과 아울러, SDS와 β-메르캅토에탄올에 의해 단백질을 효과적으로 변성시키는 목적으로 비등수중에서 일정시간 열처리한다. 다음에 SDS-폴리아크릴아미드겔의 각 레인에 일정량 주입하고, SDS를 함유하는 글리신 트리스버퍼를 영동용 버퍼로 해서, 일정 전압으로 일정 시간 영동시킨다. 영동후, 겔을 미리 냉각해 둔 메탄올을 함율하는 글리신 트리스버퍼(전사용 버퍼)에 일정시간 침지하고, 평형화한다. 계속해서, 겔을 음극측, 전사용 고체지지체를 양극측으로 해서 일렉트로블로팅장치에 장착한다. 전사조에는 전사용 버퍼를 가하고, 빙냉후, 정전압으로 일정시간 전사를 행한다. 이 때, 전사효율을 높이는 관점에서, 음극과 겔 사이, 및 양극과 고체지지체 사이에, 버퍼나 이온 교환수를 함유시킨 여과지를 배치하는 것이 바람직하다. 음극측의 여과지에 포함시키는 버퍼로서는, Tris, ε-아미노카프론산, 초산, EDTA, 인산, 붕산, 주석산, SDS 등을 함유하는 것을 들 수 있다. Tris 및 ε-아미노카프론산을 함유하는 버퍼를 이용하는 경우, 아미노카프론산의 농도는 1000mM이하 정도가 바람직하다. 양극측의 여과지에는, 이온 교환수를 함유시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 형태에 있어서는, 대상물질을 전기영동후의 겔로부터 종래 기술에 있어서 사용되는 멤브레인에 전사하고, 또한 상기 멤브레인으로부터 본 발명의 고체지지체상에 전사함으로써, 겔중에 분리된 물질을 고체지지체상에 고정화할 수도 있다. 이 경우에 사용할 수 있는 멤브레인의 재질로서는, 니트로셀룰로오스, PVDF(폴리불화비닐리덴), 나일론 및 포지티브차지나일론 등을 들 수 있다. 단백질의 전사에 있어서는, 단백질의 결합능력이 가장 높은 PVDF를 사용하는 것이 바람직하고, 핵산의 전사에 있어서도 핵산의 비특이 흡착이 적은 PVDF를 사용하는 것이 바람직하다. 영동 물질의 겔로부터 멤브레인에의 전사 및 멤브레인으로부터 고체지지체에의 전사는, 상기와 같은 방법에 의해 실시할 수 있다. 겔로부터 멤브레인에의 전사에 있어서는, 일렉트로블로팅을 사용하는 것이 바람직하고, 일렉트로블로팅에 있어서의 통전조건은, 0.1∼50V에서 5∼120분간 정도가 바람직하다. 멤브레인으로부터 고체지지체에의 전사에 있어서는, 일렉트로블로팅장치를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 형태에 있어서는, 전기영동에 의해 분리된 물질을 고체지지체상에 고정화하고, 이 물질과 상호작용하는 물질을 반응시켜서 복합체를 형성하고, 형성한 복합체를 이온화함으로써 질량분석을 행할 수도 있다. 본 발명에 있어서 질량분석이란, 전기적 상호작용을 이용해서 원자·분자의 이온을 질량의 차이에 의해 분석하는 방법이다. 질량분석장치는 이온의 생성·분리·검출의 3개의 다른 작용을 가지고 있다. 이미 서술한 방법에 의해, 단백질이 고체지지체상에 고정화되는 경우에는, 상기 단백질에 대한 항체를 반응시켜서 복합체를 형성하고, 상기 복합체에 레이저 조사 등을 행해서 이온화함으로써 질량분석을 행할 수 있다. 또한, DNA 또는 RNA 등의 핵산이 고체지지체상에 고정화되는 경우는, 상기 핵산에 대하여 상보적인 핵산을 고체지지체상의 핵산에 교배시키고, 형성한 2개쇄를 이온화해서 질량분석을 행할 수 있다. 그 밖의 상호작용으로서는, 예를 들면, 효소반응, 비오틴-스트렙트아비딘 상호작용 등을 이용할 수 있다. 상호작용에 의해 형성한 복합체의 질량분석을 행함으로써, 프로브 분자에 특이적으로 상호작용한 타겟 분자의 염기배열 또는 아미노산배열을 해석할 수 있다. 또한, 고체지지체상에 고정화된 분자에 상호작용한 분자만을 이온화해서 질량분석을 행할 수도 있다.

고체지지체상에 고정화된 물질은, 레이저탈리/이온화-비행시간형 질량분석 등의 수단에 의해 그대로 질량분석을 실시할 수 있다. 질량분석할 때 사용할 수 있는 이온화법의 양식으로서는, 매트릭스 보조 레이저 탈착(MALDI)법, 전자충격에 의한 이온화(EI)법, 광이온화법, 방사성 동위체로부터 방사되는 LET의 큰 α또는 β선을 사용하는 이온화법, 2차 이온화법, 고속원자충돌 이온화법, 전계전리 이온화법, 표면전리 이온화법, 화학 이온화(CI)법, 필드 이온화(FI)법, 불꽃방전에 의한 이온화법 등을 들 수 있고, 매트릭스 보조 레이저 탈착(MALDI)법, 전자충격에 의한 이온화(EI)법이 바람직하다. 또한, 분리 양식으로서는, 선형 또는 비선형 반사비행시간(TOF), 단일 또는 다중 4중극, 단일 또는 다중 자기섹터, 푸리에변환 이온 사이클로트론 공명(FTICR), 이온포획, 고주파 및 이온포획/비행시간 등을 들 수 있고, 선형 또는 비선형 반사비행시간(TOF), 고주파 및 이온포획/비행시간을 이용하는 것이 바람직하다. 상기와 같은 이온화법과 분리 양식 또는 이들의 조합을 포함하는 분리 양식, 전기적 기록 및 사진기록과 같은 검출 양식을 조합함으로써 질량분석을 실시할 수 있다. 생체분자 등의 고분자물질을 이온화하고, 및 고체지지체상의 복수의 물질을 분석한다는 관점에서는, 레이저탈리/이온화-비행시간형 질량분석을 이용하는 것이 바람직하다.

이하에 본 발명의 일형태로서, MALDI-TOF MS를 이용한 질량분석의 순서를 설명한다.

분석 대상물질이 고정화된 본 발명의 고체지지체에, α-시아노히드록시 계피산, 시나핀산 등의 매트릭스를 첨가하고, 건조시킨다. 계속해서 상기 고체지지체를, MALDI-TOF MS의 플랫 타겟에 설치한다. 그리고, MassLynx 소프트웨어 등을 이용해서 질량분석을 시작한다. MassLynx에 의해 측정과 해석 모두를 컨트롤할 수 있다. 측정시에, 자동측정의 파라미터 파일과, 측정후에 행하는 데이터 프로세스 및 데이터베이스 해석의 프로세스 파일, 및 시료 리스트 등을 제작한다. 데이터 프로세싱은, ProteinLynx 소프트웨어를 이용해서 MassLynx상에서 행할 수 있다. 입력된 데이터로부터 질량 스펙트럼을 제작하고, 제작된 스펙트럼은 MaxEnt 3소프트웨어(Micromass사)에 의해, 정밀도를 높인 후, 모토아이소토픽·피크 데이터로 변환한다. 계속해서 캘리브레이션을 행하여 질량오차 약 50ppm의 최종 데이터로 한다. 이 데이터로부터 상호작용한 단백질의 정확한 질량을 구할 수 있다.

질량분석에 계속해서 단백질의 아미노산 배열분석 및 동정을 행할 수 있다. MALDI-TOF MS의 분석모드를 포스트 소스 디케이(PSD) 스펙트럼을 검출할 수 있는 모드로 하고, 상호작용한 단백질의 아미노산배열을 분석한다. 계속해서, 아미노산 배열 데이터를 기초로 SWISSPROT 데이터베이스를 검색하고, 단백질을 동정한다. 또는 MALDI-TOF/TOF MS나 MALDI Q-TOF MS에 분석대상물질이 고정화된 고체지지체를 설치해서 아미노산배열을 분석하고, 상호작용한 단백질을 동정할 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

(실시예1) Ti-Pt-DLC 고체지지체에의 단백질의 전사

고체지지체의 제작

76mm×26mm×1.1mm의 슬라이드 글래스에 Ti층 및 그 위에 Pt층을 마그네트론 스퍼터링에 의해 형성했다. 스퍼터링의 조건은 이하와 같다. 생성한 금속층의 두께는, Ti층 및 Pt층 각각이 100nm였다.

표1 Ti층 및 그 위의 Pt층의 형성조건

금속층	B.P.(torr)	전압(V)	전류(mA)	시간(분)	두께(nm)
Ti	3×10-5	380	200	3	100
Pt	3×10-5	360	200	1	100

그리고, 금속층을 형성한 기판상에 다이아몬드 라이크 카본층을 형성했다. 다이아몬드 라이크 카본층의 형성은 이온화 증착법에 의해 이하의 조건으로 행했다. 생성한 다이아몬드 라이크 카본층의 두께는 20nm였다.

표2 다이아몬드 라이크 카본층의 형성조건

	H2(체적%)	CH4(체적%)	압력(Pa)	Vp(V)	Va(V)	시간(초)
기판1	2.5	47.5	3	500	50	30

Vb:가속전압, Va:애노드전압

상기한 바와 같이 해서 기판1에 다이아몬드 라이크 카본층을 형성한 후, 표면을 염소가스중에서 1분간 자외선을 조사함으로써 염소화하고, 암모니아 가스중에서 10분간 자외선을 조사함으로써 아미노화하고, 또한 숙신산 클로리드에 의해 카르복실화하고, 또한 N-히드록시숙신이미드에 의해 활성화해서 고체지지체(1)를 제작했다.

SDS-PAGE법에 의한 전기영동

Cy3-프로테인A(1.5μg, SIGMA사 제품), 대장균 단백질(0.5μg) 및 마커(Prestained Broad Range, 0.5μl, BIO RAD사 제품)를 시료로서 이용하고, SDS-PAGE용 장치(ATTO사 제품 AE-7300형)를 이용해서 전기영동을 행했다. 영동용의 겔로서는, 10% 폴리아크릴아미드겔을 사용했다. 영동용 버퍼는 0.1% SDS를 함유하는 글리신 트리스버퍼(pH8.3)를 이용하고, 영동은 200V에서 35분간 행했다. 영동 종료후, 15분간 CBB염색하고, 탈염색한 후, LAS1000(후지 샤신 필름 가부시키가이샤 제품)으로 화상촬영했다(도1). 약 50kDa부근에 Cy3-프로테인A의 밴드가 검출되었다.

일렉트로블로팅

영동후의 폴리아크릴아미드겔을, 미리 냉각해 둔 전사용 버퍼(25mM Tris, 5% 메탄올)에 30분간 침지하고, 평형화했다. 계속해서, 폴리아크릴아미드겔을 고체지지체(1)에 탑재하는 크기로 자르고, 상기 고체지지체와 밀착시켜, 폴리아크릴아미드겔을 음극, 고체지지체를 양극에 설치하고, 하기 조건으로 통전했다.

표3 통전조건

겔사이즈(mm)	전압(V)	전류(mA)	시간(분)
30×20×1	25	2→0.4	40

형광강도의 측정

단백질 전사후의 고체지지체(1)의 형광강도를 FLA8000(후지 샤신 필름 가부시키가이샤 제품)으로 측정한 결과, 형광강도가 28270으로서 측정되고, Cy3-프로테인A가 고체지지체 표면에 고정화된 것이 확인되었다(도2). 계속해서, 상기 고체지지체를 PBS로 10분간 세정한 후, 마찬가지로 형광강도를 측정한 결과, 형광강도는 9766이며, 약 1/3정도까지 저하되었다(도3). 블록킹 시약(Roche사 제품)으로 1시간 블록킹하고, 형광강도를 측정한 결과, 형광강도에 변화는 없었다. 계속해서, 500μl의 0.05μg/μl Cy3-IgG를 첨가해서 실온에서 1시간 반응시킨 후, PBS로 실온에서 12시간 세정하고, 형광강도를 측정했다(도4). 형광강도는 16448이며, 증가하고 있는 것으로부터, 프로테인A와 IgG이 결합한 것, 즉, 고정화된 단백질의 결합능이 유지된 것을 알 수 있다.

(실시예2)스텐레스-DLC 고체지지체에의 단백질의 전사

스텐레스-DLC 고체지지체의 제작

스텐레스 기판에 다이아몬드 라이크 카본층을 형성했다. 스텐레스 기판은 평활성과 형광 백그라운드를 낮추기 위해서, 미리 버프 연마후, 또한 전해 연마를 실시했다. 다이아몬드 라이크 카본층의 형성은 이온화 증착법에 의해 이하의 조건으로 행했다. 생성한 다이아몬드 라이크 카본층의 두께는 20nm였다.

표4 다이아몬드 라이크 카본층의 형성조건

H2(체적%)	CH4(체적%)	압력(Pa)	Vb(V)	Va(V)	시간(초)
2.5	47.5	3	500	50	30

Vb:가속전압 Va:애노드전압

이온 교환수 300ml에, 6.76g의 N-히드록시숙신이미드 및 12g의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드하이드로클로리드를 용해한 용액에, 고체지지체를 20분간 침지함으로써 스텐레스―DLC 기판을 활성화하고, 고체지지체(2)를 제작했다.

Cy3-프로테인A(0.2μg, SIGMA사 제품)를 실시예1과 마찬가지로 SDS-PAGE법(ATTO사 제품 AE-6530형)으로 영동하고, 영동 종료후, 15분간 CBB염색하고, 탈염색한 후, LAS1000(후지 샤신 필름 가부시키가이샤 제품)으로 화상촬영했다(도5).

영동후의 겔을 꺼내고, 고체지지체(2)에 탑재되는 크기로 자른 후, 전사용 버퍼B(25mM Tris, 5% 메탄올)에 침지했다. 미리 고체지지체(2)의 크기로 잘라 둔 여과지(ATTO사 제품)를 각각, 전사용 버퍼A(0.3M Tris, 5% 메탄올), C(25mM Tris, 40mM ε-아미노카프론산, 5% 메탄올) 또는 이온 교환수에 침지했다. 계속해서, 기포가 들어가지 않도록, 여과지, 겔, 고체지지체를 도6과 같이 겹쳐서 세미드라이 블로팅장치에 설치하고, 8V, 4mA에서 60분간 통전하고, 단백질을 고체지지체(2)에 전사했다. 전사후의 고체지지체(2)를 이온 교환수로 실온에서 30분간 세정하고, 건조시킨 후, 전사후의 고체지지체와 겔을 FLA8000(후지 샤신 필름 가부시키가이샤 제품)으로 화상촬영했다(도7).

①은 음극측 및 양극측의 여과지의 쌍방에 이온 교환수를 함유시켜서 전사를 행한 경우의 결과이다. Cy3-프로테인A는 겔로부터 거의 빠져 나오지 않고, 또 고체지지체에도 고정화되어 있지 않았다.

②는 여과지I에 전사용 버퍼C, 여과지II에 전사용 버퍼S, 여과지III에 전사용 버퍼A를 함유시켜서 전사를 행한 경우의 결과이다. Cy3-프로테인A는 겔로부터 다소 감소하고 있지만, 고체지지체에는 고정되어 있지 않았다.

③은 여과지I에 전사용 버퍼C, 여과지II 및 III에 이온 교환수를 함유시켜서 전사를 행한 경우의 결과이다. 겔은, 고체지지체에 겹치기 전에, 수분을 닦아냈다. 그 결과, Cy3-프로테인A는, 균일하지는 않지만 겔로부터 빠져 나오고 있는 것이 확인되었다. 또한, 고체지지체상에는 형상은 좋지 않지만 고정화가 보여졌다.

④는 여과지I에 전사용 버퍼C, 여과지II 및 III에 이온 교환수를 함유시키고, 겔의 수분을 닦아내지 않고 고체지지체에 겹쳐서 전사를 행한 경우의 결과이다. 그 결과, Cy3-프로테인A는, 균일하지는 않지만 겔로부터 빠져 나오고 있는 것이 확인되었다. 또한, 고체지지체상에는 Cy3-프로테인A가 형상좋게 고정화되어 있었다.

이상으로부터, 겔중의 단백질의 고체지지체에의 전사에 있어서는, 음극측의 여과지에는 전사용 버퍼를, 양극측의 여과지에는 이온 교환수를 함유시키고, 영동후의 겔의 수분을 닦아내지 않고 전사를 행하는 것이 바람직하다고 생각된다.

(실시예3) 스텐레스-DLC 고체지지체에의 단백질의 전사

Cy3-프로테인A(50ng, SIGMA사 제품) 및 Cy3-IgA(100ng, SIGMA사 제품)를 실시예1과 마찬가지로 SDS-PAGE법(ATTO사 제품 AE-6530형)으로 영동하고, 영동 종료후, 15분간 CBB염색하고, 탈염색한 후, LAS1000(후지 샤신 필름 가부시키가이샤 제품)으로 화상촬영했다(도8). 또, Cy3-IgA의 영동에 대해서는, 12% 폴리아크릴아미드겔을 사용했다. 또한, 실시예2와 동일하게 해서 고체지지체(2)를 제작했다.

영동후의 겔을 꺼내고, 고체지지체(2)에 탑재되는 크기로 자른 후, 전사용 버퍼(25mM Tris, 5% 메탄올)에 침지했다. 미리 고체지지체의 크기로 잘라 둔 여과지(ATTO사 제품)를 각각 전사용 버퍼C1(25mM Tris, 40mM ε-아미노카프론산, 5% 메탄올), C2(25mM Tris, 40OmM ε-아미노카프론산, 5% 메탄올) 또는 이온 교환수에 침지했다. 계속해서, 기포가 들어가지 않도록, 여과지, 겔, 고체지지체를 실시예2의 도6과 마찬가지로 겹쳐서 세미드라이 블로팅장치에 설치했다. 이 때, 음극측의 여과지 3장에는, 전사용 버퍼C1 또는 C2를 함유시킨 것을 사용하고, 양극측의 여과지 3장에는, 이온 교환수를 함유시킨 것을 사용했다. 그리고, 2V, 2μA에서 60분간 통전하고, 단백질을 고체지지체(2)에 전사했다. 전사후의 고체지지체(2)를 이온 교환수로 실온에서 30분간 세정하고, 건조시켰다. 그리고 상기 고체지지체와 전사후의 겔을 FLA8000(후지 샤신 필름 가부시키가이샤 제품)으로 화상촬영했다(도9).

그 결과, 고체지지체에의 전사시에 음극측의 여과지에 함유시키는 전사용 버퍼는, C1, 즉, ε-아미노카프론산의 농도가 40mM인 쪽이 고정화 효율이 좋은 것을 알 수 있었다.

(실시예4) PVDF 멤브레인으로부터 Ti-Pt-DLC 고체지지체에의 단백질전사

실시예1과 마찬가지로 해서 기판1에 다이아몬드 라이크 카본층을 형성하고, 염소가스중에서 기판표면에 1분간 자외선을 조사함으로써 염소화한 후, 이온화 증착장치를 이용해서 암모니아 플라즈마중에서 처리함으로써 표면을 아미노화했다. 그 후, 무수 숙신산으로 처리후 다시 폴리아크릴산으로 처리했다. 그리고, N-히드록시숙신이미드에 의해 활성화해서 고체지지체(3)를 제작했다.

또 실시예1과 마찬가지로 해서 폴리아크릴아미드겔로 Cy3-프로테인A를 전기영동했다. 영동 종료후, 15분간 CBB염색하고, 탈염색한 후, LAS1000(후지 샤신 필름 가부시키가이샤 제품)으로 화상촬영을 행했다(도10). 약 50kDa부근에 Cy3-프로테인A의 밴드가 검출되었다.

전사용 버퍼A(0.3M Tris, 5% 메탄올), B(25mM Tris, 5% 메탄올) 및 C(25mM Tris, 40mMε-아미노카프론산, 5% 메탄올)를 조제했다. 영동후의 겔을 꺼내고, 약200ml의 전사용 버퍼B에 담그고, 5분간 가볍게 흔들었다. 미리 겔의 크기로 잘라 둔 PVDF 멤브레인(ATTO사 제품)을 소량의 메탄올에 5초간 담근 후, 약 100ml의 전사용 버퍼B에 담그고, 5분이상 흔들었다. 전사용 버퍼A, B 또는 C의 각 200ml에, 미리 겔의 크기로 잘라 둔 여과지를 각각 2장, 1장 및 3장씩 침지했다. 계속해서, 세미드라이 블로팅장치(니혼 에이드)에, 상기의 여과지, 겔 및 PVDF 멤브레인을, 기포가 들어가지 않도록 도11과 같이 겹쳐서 설치하고, 전압 15V에서 60분간 통전했다. 전사후, PVDF 멤브레인을 200ml의 PBS에 담그고, 5분간 침투시켰다.

전사후의 PVDF 멤브레인을 고체지지체3에 탑재하는 크기로 자르고, 도12와 같은 순서로 겹쳐서, 35g/㎠의 싱크를 올려놓았다. 실온에서 1시간 간격으로, 멤브레인상의 Cy3-프로테인A를 고체지지체(3)상에 전사했다. 계속해서 상기 고체지지체(3)를 PBS로 실온에서 20분간 세정한 후, 건조시켰다. 그리고, 고체지지체를 FLA8000(후지 샤신 필름 가부시키가이샤 제품)으로 화상촬영했다. 촬영 화상을 도13에 나타낸다. 화상중에 둘러싸여진 부분이 멤브레인을 밀착시킨 부분이다. 대응하는 위치에 형광이 검출된 점에서, Cy3-프로테인A가 고체지지체상에 고정화되어 있는 것을 알 수 있다.

(실시예5) TOF-MS에 의한 분석

실시예2에서 제작한 스텐레스-DLC 고체지지체에 1μl의 레그인슐린결합 단백질 수용액(112.5ng/μl)을 스폿팅해서 10분간 방치했다. 계속해서, 초순수로 10분간 흔들어 세정한 후, 건조시켜, 레그인슐린결합 단백질 고정화 고체지지체를 제작했다.

상기에서 얻어진 레그인슐린결합 단백질 고정화 고체지지체의 스폿상에 1μl의 레그인슐린 수용액(37.5ng/μl)을 스폿팅해서 5분간 방치했다. 계속해서, 초순수로 5분간 세정한 후, 건조시켜, 레그인슐린결합 단백질-레그인슐린 고정화 고체지지체를 제작했다.

상기한 바와 같이 해서 얻어진 레그인슐린결합 단백질 고정화 고체지지체 및 레그인슐린결합 단백질-레그인슐린 고정화 고체지지체에, 0.5μl의 매트릭스 용액(α-시아노히드록시 계피산용액)을 첨가해서 건조시켰다.

이들의 고체지지체를 MALDI-TOF-MS(TofSpec-2E, Micromass사 제품)의 플랫 타겟에 설치했다. 그리고 MassLynx 소프트웨어를 이용한 질량분석을 실시했다. MassLynx 소프트웨어에 의해 측정과 해석 모두를 컨트롤할 수 있다. 측정시에, 자동측정의 파라미터 파일과, 측정후에 행하는 데이터 프로세스 및 데이터베이스 해석의 프로세스 및 데이터베이스 해석의 프로세스 파일, 및 시료 리스트 등을 작성했다.

데이터의 프로세싱은 ProteinLynx 소프트웨어를 이용해서 MassLynx상에서 행했다. 입력된 데이터로부터 질량 스펙트럼을 제작하고, 제작된 스펙트럼을 MaxEnt3(Micromass사) 소프트웨어에 의해, 정밀도를 높인 후, 모노아이소토픽·피크 데이터로 변환했다. 계속해서, 캘리브레이션을 행하여, 질량오차 50ppm의 최종 데이터로 했다. 이 데이터로부터 상호작용한 단백질의 정확한 질량을 구했다. 레그인슐린결합 단백질 고정화 지지체의 TOF-MS분석의 결과를 도14에 나타낸다. 레그인슐린결합 단백질-레그인슐린 고정화 고체지지체의 TOF-MS분석의 결과를 도15에 나타낸다.

TOF-MS의 챠트로부터, 392Da의 레그인슐린의 피크가 검출된 것을 알 수 있다. 이상으로부터, 본 발명의 고체지지체에 고정화된 단백질을 TOF-MS로 분석할 수 있는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 방법에 의해, 시료중에 함유되는 다수의 물질을 전기영동으로 분리한 후, 각각의 밴드에 함유되는 물질을 고체지지체상에 고정화할 수 있고, 복수의 물질을 정제하지 않고 동시에 직접적으로 질량분석하는 것이 가능하게 되므로, 다수의 시료를 신속하게 해석할 수 있다.

따라서, 본 발명은 핵산 및 단백질 등의 생체분자의 해석에 있어서 매우 유용한 수단으로 된다.

Claims (9)

1. 시료중의 물질을 겔 전기영동으로 분리한 후, 겔중에 분리된 물질을 전사함으로써 상기 물질이 고정화되어 이루어지며, 표면에 카본층을 갖는 것을 특징으로 하는 고체지지체.
2. 시료중의 물질을 겔 전기영동으로 분리한 후, 겔중에 분리된 물질을 멤브레인에 전사하고, 상기 멤브레인상에 전사된 물질을 다시 전사함으로써 상기 물질이 고정화되어서 이루어지며, 표면에 카본층을 갖는 것을 특징으로 하는 고체지지체.
3. 제1항 또는 제2항에 기재된 고체지지체상에 고정화된 물질에, 이것과 상호작용하는 다른 물질을 첨가해서 복합체를 형성시켜서 이루어지는 것을 특징으로 하는 고체지지체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 카본층이 다이아몬드 라이크 카본층인 것을 특징으로 하는 고체지지체.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 카본층의 두께가 단분자층∼100㎛인 것을 특징으로 하는 고체지지체.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 카본층의 표면이 화학수식에 의해 활성화되어 있는 것을 특징으로 하는 고체지지체.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 고정화된 물질이 핵산 또는 펩티드인 것을 특징으로 하는 고체지지체.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 고체지지체상에 고정화된 복수의 물질 또는 복합체를 탈리/이온화함으로써 질량분석하는 방법.
9. 제8항에 기재된 방법에 있어서 사용하기 위한, 표면에 카본층을 갖는 것을 특징으로 하는 고체지지체.