CN104090114A - 一种用于提高maldi靶板上蛋白酶解的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生命科学领域，具体涉及一种用于提高MALDI靶板上蛋白酶解的方法。一种用于提高MALDI靶板上蛋白酶解的方法，包括下列步骤：按照介孔材料、样品蛋白、胰蛋白酶、CHCA基质的顺序，依次取0.5-1μL的溶液点在MALDI靶板上，后一种溶液点在前一种溶液溶剂挥发后的靶点上；其中介孔材料、样品蛋白、胰蛋白酶间质量比为35ng～350ng∶5ng～10ng∶2ng～16ng。本发明所建立的靶上蛋白酶解方法可以直接进行蛋白分离后的靶上快速酶解及质谱鉴定，能够提高酶解效率，简化操作，节约时间，显示出有序介孔材料在高通量蛋白靶上酶解、鉴定中具有一定的应用价值。

Description

一种用于提高MALDI靶板上蛋白酶解的方法
技术领域
本发明属于生命科学领域，具体涉及一种用于提高MALDI靶板上蛋白酶解的方法。
背景技术
蛋白质组研究以大规模分析生物体内蛋白质为主要内容，其目的是实现对一个基因组全部编码蛋白质及其相互作用的研究。由于研究对象复杂，尤其是对低丰度蛋白质检测所面临的难度，蛋白质组学所必需的高灵敏度、高鉴定速度使得传统方法远远不能满足要求。如何对生物体内成千上万种蛋白质进行快速鉴定，是蛋白质组研究需要解决的重要问题。
蛋白质的分析鉴定主要有两种路线：一种是传统的二维凝胶电泳蛋白质分离、胶上酶解与质谱(MS)鉴定相结合的方法；另一种则先将混合蛋白质酶解，经过适当的色谱分离之后，对肽段进行MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解解析电离飞行时间质谱,英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time ofFlight Mass Spectrometry)分析并据此实现蛋白质的鉴定。其中蛋白质的酶解效率成为了蛋白质高通量分析、鉴定的一个关键因素。发展快速酶解新技术有重要的价值和意义。
蛋白酶解是实施肽质量指纹谱技术的关键步骤，胰蛋白酶是该过程中的常用酶，能够选择性地在精氨酸和赖氨酸残基处进行酶切形成特异性肽段。目前蛋白质组学研究中最普遍的蛋白质酶解手段主要有两种，即胶上酶解和溶液酶解。胶上酶解是第一个蛋白质组学分析技术平台中联系双向电泳和质谱鉴定的桥梁，而溶液酶解过程一般为先使用一定的变性剂或通过加热使蛋白质变性，然后以一定的酶/底物比例加入胰蛋白酶，pH7-8条件下37℃酶解过夜。由于酶/底物比必须保持很低来避免多余酶的自降解所产生的肽段碎片的生成，因此一般溶液酶解的反应时间都要多于5小时，不利于蛋白质组学中高通量的蛋白鉴定、分析。
固定化酶技术的出现为蛋白酶解带来了新的思路，已有多种不同的胰蛋白酶的固化材料应用于蛋白酶解，包括多孔硅、玻璃、薄膜、硅胶、多聚体、多孔整体柱，取得了良好的效果，但是这些材料存在一定的缺陷：1)在制备固定载体过程中酶的固定，因制备条件和部分有机试剂造成酶变形失活；2)多孔载体易被蛋白阻塞。
发明内容
本发明的目的在于解决蛋白MALDI-TOF-MS分析中蛋白酶解难题，以实现提高酶解效率，简化操作，节约时间。
为此，本发明公开了一种用于提高MALDI靶板上蛋白酶解的方法，包括下列步骤：
按照介孔材料、样品蛋白、胰蛋白酶、CHCA基质的顺序，依次取0.5-1μL的溶液点在MALDI靶板上，后一种溶液点在前一种溶液溶剂挥发后的靶点上；
其中介孔材料、样品蛋白、胰蛋白酶间质量比为35～350∶5～10∶2～16。
在一些实施例中，所述介孔材料为有序硅基介孔材料。所述介孔材料的上样浓度优选为35ng/μL。
在一些实施例中，所述酶为胰蛋白酶。
在一些实施例中，所述酶与样品蛋白质量比为0.8∶1
另一方面，本发明还公开一种有序硅基介孔材料，其电镜下呈现面心立方的笼状介孔结构，介孔笼孔径尺寸为25nm，孔穴之间的窗口大小为15nm。
本发明所述的有序硅基介孔材料，合成步骤为：Pluronic F127(EO106PO70EO106)、2M HCl、TMB和KCl按照质量比1：60：1.2：4于40℃混匀，再加入1：4倍硅源TEOS搅拌24小时后，550℃焙烧6小时形成。
本发明以一种新合成的有序硅基介孔材料作为催化剂，能有效提高MALDI-TOF-MS蛋白靶上酶解效率。利用优化的上样介孔材料量、胰蛋白酶量等反应条件，所建立的靶上蛋白酶解方法可以直接进行蛋白分离后的靶上快速酶解及质谱鉴定，能够提高酶解效率，简化操作，节约时间，显示出有序介孔材料在高通量蛋白靶上酶解、鉴定中具有一定的应用价值。
附图说明
图1介孔材料的透射电镜照片。
图2未加入介孔材料的牛血清白蛋白(30ng/μL)靶上酶解质谱图。
图3加入介孔材料的牛血清白蛋白(30ng/μL)靶上酶解质谱图。
图4靶上酶解中加入介孔材料的浓度是3.5μg/μL时的肌红蛋白酶解质谱图。
图5靶上酶解中加入介孔材料的浓度是0μg/μL时的肌红蛋白酶解质谱图。
图6靶上酶解中加入介孔材料的浓度是35ng/μL时的肌红蛋白酶解质谱图。
图7胰蛋白酶上样量与样品蛋白比例为8ng：10ng，介孔材料为35ng时的肌红蛋白酶解质谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
实施例1硅基大孔径介孔材料的合成及电镜下形态
Pluronic F127(EO106PO70EO106)、2M HCl、TMB和KCl按照质量比1：60：1.2：4于40℃混匀，再加入4倍硅源TEOS搅拌24小时后，550℃焙烧6小时形成有序硅基介孔材料。JEOL-2011型高分辨透射电子显微镜下，该介孔材料具有整齐划一的面心立方的笼状介孔结构，介孔笼孔径尺寸为25nm，而连接孔穴之间的窗口为15nm，开放的大孔窗口有利于蛋白分子的出入。
实施例2介孔材料用于靶上酶解蛋白
将一定量的介孔材料加入水溶液中，超声5分钟形成悬浮液；将样品蛋白溶于水中配成蛋白水溶液；胰蛋白酶溶于0.1％的三氟乙酸溶液中，然后用NH4HCO3溶液稀释至所需浓度。按照介孔材料、标准蛋白、胰蛋白酶、CHCA基质(10mg/mL)的顺序，依次取0.5μL的溶液点在MALDI靶板上，后一种溶液点在前一种溶液溶剂挥发后的靶点上。待点样液干燥、结晶后，将靶板放进质谱仪，进行MALDI-TOF质谱测定：质谱操作在4700Proteomics Analyzer(Applied Biosystems)上完成；激光器为Nd-YAG激光，波长355nm，激光脉冲频率200Hz；加速电压20kV，正离子模式，反射式TOF条件下检测。胰蛋白酶浓度为4ng/μL
以大分子量的牛血清白蛋白为样品，对未加介孔材料和加入介孔材料的靶上酶解效率进行考察，结果如图2所示。图a、b中，肽段的氨基酸覆盖率分别为12％、34％，b图的谱图质量明显要高于a图，说明介孔材料可以有效地提高靶上酶解的效率。原因在于加入介孔材料后，蛋白分子被快速吸附到介孔材料富含硅羟基孔道表面，使样品蛋白分子变性，从而催化了酶解反应。
实施例3介孔材料、样品蛋白和酶上样量的考察
以5ng标准肌红蛋白为上样品，酶上样量2ng，靶上酶解中加入介孔材料的浓度分别为0μg/μL、35ng/μL和3.5μg/μL时，考察肌红蛋白酶解质谱图。如图3所示，当介孔材料的上样量为3.5μg/μL时，靶上酶解反应后所测到的氨基酸覆盖率(13％)比未加介孔材料时的低(21％)，而当的上样量降为35ng/μL时，靶上酶解谱图的信噪比提高，氨基酸覆盖率增加到61％。较多的介孔材料上样量形成的信号峰较低，原因是较多的使得上样品分子分布过于分散，不利于基质的解吸离子化。
酶用量在一定范围内的变化，影响酶解产量。本发明考察了酶与样品蛋白质量比分别为1.6：1，0.8：1，0.4：1，0.2：1的条件下的酶解效率。当酶与底物比为0.8：1时，所得肽产物信号强度最高，酶自降解弱。酶自降解峰强度低源于酶解肽产量多，较强的信号峰抑制了酶降解峰。
本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。

Claims (7)

1.一种用于提高MALDI靶板上蛋白酶解的方法，包括下列步骤：
按照介孔材料、样品蛋白、酶、CHCA基质的顺序，依次取0.5-1μL的溶液点MALDI靶板上，后一种溶液点在前一种溶液溶剂挥发后的靶点上；
其中介孔材料、样品蛋白、酶间质量比为35～350∶5～10∶2～16。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述介孔材料为有序硅基介孔材料。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述介孔材料的上样浓度为35ng/μL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述酶为胰蛋白酶。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述酶与样品蛋白质量比为0.8∶1。
6.一种有序硅基介孔材料，其特征在于其电镜下呈现面心立方的笼状介孔结构，介孔笼孔径尺寸为25nm，孔穴之间的窗口大小为15nm。
7.如权利要求6所述的有序硅基介孔材料，其特征在于其由下列步骤制备：Pluronic F127、2M HCl、TMB和KCl按照质量比1：60：1.2：4于40℃混匀，再加入1：4倍硅源TEOS搅拌24小时后，550℃焙烧6小时形成。
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